Formułowanie i charakteryzowanie nanocząstek lipidowych do dostarczania genów przy użyciu platformy mieszania mikroprzepływowego

Protokół ten może być stosowany do wytwarzania nanocząstek lipidowych zamkniętych w kapsułkach z kwasami nukleinowymi o wysokiej odtwarzalności i szybkości oraz małych objętościach. Parametry preparatu można dostosować, aby osiągnąć pożądaną dystrybucję biologiczną w zależności od zastosowania klinicznego. Standardowa konstrukcja wkładu mikroprzepływowego w jodełkę umożliwia szybki, precyzyjny i kontrolowany przepływ laminarny podczas mieszania.

Metoda ta jest podatna na skalowanie w górę i generuje jednolite, wysoce zamknięte cząstki. W przypadku większości zatwierdzonych na rynku produktów terapii genowej opartych na metodach wirusowych, procedura ta może dostarczyć informacji na temat dostarczania genów, ponieważ jej niewirusowe podejście pozwala na zastosowania, w przypadku których konieczne jest powtórzenie dawkowania. Rozpocząć od dodania odpowiedniej ilości każdego płynnego roztworu podstawowego do szklanej fiolki z przerywanym wirowaniem.

jak wskazano w tabeli, a następnie dodać 200 proof etanolu do końcowej objętości 533 mikrolitrów. Następnie dodaj odpowiednią ilość zapasu mRNA i rozcieńcz buforem cytrynianowym, aby uzyskać końcową objętość 1,5 mililitra w pożądanym stężeniu. Aby zalać kanały mikroprzepływowe, należy najpierw wprowadzić parametr zalewania do oprogramowania urządzenia, jak opisano w tabeli.

Następnie otwórz pokrywę instrumentu i umieść wkład mikroprzepływowy w obracającym się bloku. Załaduj co najmniej 500 mikrolitrów etanolu do strzykawki o pojemności 1 mililitra, uważając, aby na końcówce strzykawki nie było pęcherzyków ani szczelin powietrznych i włóż strzykawkę do prawego wlotu wkładu. Załadować pięciomililitrową strzykawkę 1,5 mililitra buforu cytrynianowego, uważając, aby nie było pęcherzyków powietrza ani szczelin, a następnie włożyć strzykawkę do lewego wlotu wkładu.

Umieść dwie stożkowe rurki o pojemności 15 mililitrów w uchwytach klipsów, aby służyły jako pojemniki na odpady i kliknij Go", aby wymieszać roztwory. Gdy instrument przestanie zalewać, jak wskazuje wyłączenie dolnego niebieskiego światła, otwórz późno i odpowiednio zutylizuj stożkowe rurki i strzykawki. Do tworzenia nanocząstek lipidowych należy ustawić odpowiednie parametry formulacji zgodnie ze wskazaniami w tabeli i załadować strzykawkę o pojemności 1 mililitra wcześniej przygotowaną mieszanką lipidów.

Usunąć wszelkie szczeliny powietrzne lub pęcherzyki powietrza z końcówki strzykawki i włożyć strzykawkę po prawej stronie wkładu. Załaduj wcześniej przygotowany roztwór kwasu nukleinowego do 3-mililitrowej strzykawki, uważając, aby w końcówce strzykawki nie było pęcherzyków ani szczelin powietrznych, a następnie włóż strzykawkę do lewego wlotu wkładu. Umieść 15-mililitrową stożkową probówkę wolną od RNAaz oznaczoną nazwą próbki w lewym zacisku probówki i umieść stożkową rurkę o pojemności 15 mililitrów w prawym zacisku probówki.

Zamknij pokrywę instrumentu i kliknij przycisk Go.Roztwory lipidów i mRNA przepłyną przez wkład mikroprzepływowy, a roztwór nanocząstek lipidowych zostanie zebrany w stożkowych probówkach. Zachowaj stożkową rurkę na końcu procesu formułowania, a następnie rozcieńczyć nanocząstki lipidowe za pomocą 5 mililitrów PBS i komory bezpieczeństwa biologicznego. Aby przeprowadzić wymianę buforu, najpierw umyj wstępnie filtr ultrawirówkowy o wielkości porów 100 kilodaltonów 2 mililitrami PBS, odwiruj, a następnie opróżnij PBS z dolnej komory.

Dodaj rozcieńczone nanocząstki lipidowe do górnej komory wstępnie umytego filtra ultrawirówkowego na trzy płukania wirówki, odrzucając przepływ i dodając 5 mililitrów PBS do filtra ultrawirówkowego po pierwszych dwóch płukaniach. Po ostatnim płukaniu kilkakrotnie odpipetować roztwór nanocząstek lipidowych do ścianek filtra ultrawirówkowego, aby zminimalizować utratę nanocząstek przed przeniesieniem roztworu nanocząstek do fiolki bez nukleaz. Następnie dodać PBS, aby doprowadzić zawiesinę nanocząstek do odpowiedniego eksperymentalnego stężenia i objętości, jeśli to konieczne.

Aby ocenić skuteczność enkapsulacji nanocząstek lipidowych, najpierw przygotuj dwukrotne seryjne rozcieńczenia roboczego roztworu kwasu nukleinowego w PBS, aby wygenerować krzywą wzorcową, zaczynając od 500 nanogramów na mililitr i wykonując co najmniej pięć rozcieńczeń. Następnie należy przygotować rozcieńczenia próbki nanocząstek w PBS, aby uzyskać odpowiednie stężenie teoretyczne, które leży w pobliżu punktu środkowego krzywej wzorcowej. Następnie przygotuj odczynnik RNA z zielenią rybo, aby wykryć obecność RNA zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz nanocząstki lipidowej, mieszając odpowiednie ilości odczynnika RNA, Triton X100 i PBS.

Następnie, aby wykryć obecność RNA na zewnątrz ciekłej nanocząstki, należy wymieszać odpowiednie ilości odczynników RNA i tylko PBS. Załaduj powtórzenia roztworów wzorca kwasu nukleinowego i nanocząstek lipidowych do czarnej płytki 96-dołkowej zdolnej do fluorescencji, a następnie dodaj równą objętość odczynnika do oznaczania ilościowego RNA z Triton X100 i bez niego do wzorca i powtórzeń próbki. Potrząsać płytką w czytniku płytek przez pięć minut w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem w celu uzyskania dokładnego wymieszania próbek, a następnie zmierzyć fluorescencję na czytniku mikropłytek przy długości fali wzbudzenia 480 nanometrów i długości fali emisji 520 nanometrów.

Aby zmierzyć rozmiar hydrodynamiczny i polidyspersyjność nanocząstek lipidowych, najpierw rozcieńczyć roztwór nanocząstek 40 razy w PBS i dodać roztwór do półmikrokuwety. Załaduj kuwetę do Zetasizera i wybierz standardową procedurę operacyjną, aby ustawić przyrząd do pomiaru nanocząstek zgodnie z ich materiałem, dyspergatorem, temperaturą i typem ogniwa. Następnie kliknij Start"aby zmierzyć rozmiar hydrodynamiczny i polidyspersyjność nanocząstek lipidowych.

Aby zmierzyć potencjał Zeta nanocząstek lipidowych, należy rozcieńczyć roztwór nanocząstek 40 razy w wodzie wolnej od nukleaz i załadować roztwór do kuwety na linię napełniania. Załaduj kuwetę do analizatora potencjału Zeta, uważając, aby elektrody stykały się z instrumentem, i ustaw przyrząd tak, aby mierzył potencjał Zeta zgodnie z określonym składem nanocząstek lipidowych. Następnie kliknij Start"aby zmierzyć potencjał nanocząstek lipidowych Zeta.

W tej analizie opracowano wiele partii nanocząstek lipidowych o tym samym składzie lipidowym i stosunku amin do fosforanów w oddzielnych dniach, aby wykazać odtwarzalność techniki. Jak zaobserwowano, partie pierwsza i druga wykazywały nakładające się rozkłady wielkości o podobnej dyspersji polidyspersyjnej, przy czym nie zaobserwowano istotnych różnic w wielkości lub skuteczności enkapsulacji między partiami. Zazwyczaj zmiany parametrów preparatu wywołują niewielkie, ale statystycznie istotne różnice.

Na przykład zmniejszenie stosunku amin do fosforanów powoduje 4% spadek wydajności kapsułkowania, przy jednoczesnym wzroście średnicy hydrodynamicznej nanocząstek. Nanocząstki lipidowe sformułowane z różnymi jonizowalnymi lipidami, ale o tym samym stosunku amin do fosforanów, wykazują znaczącą zmianę w wydajności kapsułkowania, a także niewielkie różnice w średnicy cząstek. Enkapsulacja plazmidowego DNA powoduje powstanie większych cząstek w porównaniu z mRA otaczającymi nanocząstki lipidowe, chociaż oba typy nanocząstek wykazują podobną skuteczność enkapsulacji.

Zmiany parametru procesu natężenia przepływu nie mają jednak wpływu na rozwój nanocząstek lipidowych. Nanocząstki lipidowe mają świetne zastosowanie, czego doskonałym przykładem są niedawno zatwierdzone szczepionki przeciwko COVID-19. Technika ta służy jako doskonały zestaw narzędzi i toruje drogę do przyszłych zastosowań, umożliwiając badania przesiewowe preparatów kończyn dolnych.