Metoda ochrony korzeni i ryzosfer mokradeł do obrazowania pierwiastków
February 15th, 2021
Opisujemy protokół pobierania próbek, konserwacji i sekcji nienaruszonych korzeni i otaczającej je gleby ryzosfery ze środowisk podmokłych przy użyciu ryżu (Oryza sativa L.) jako gatunku modelowego. Po zakonserwowaniu próbka może być analizowana przy użyciu technik obrazowania elementarnego, takich jak obrazowanie specjacji chemicznej za pomocą synchrotronowej fluorescencji rentgenowskiej (XRF).
Metoda ta zapewnia naukowcom nowy sposób przygotowania korzeni roślin wodnych, otaczającej je ryzosfery i gleby do technik obrazowania pierwiastków. Główną zaletą tej metody jest to, że jest stosunkowo szybka i niedroga, a jednocześnie dokładnie zachowuje rozmieszczenie i specjację interesujących elementów. Technika ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące wielu elementów i systemów roślinnych, od składników odżywczych w systemach rolniczych po los i transport zanieczyszczeń w systemach płodowych.
Pamiętaj, aby pracować szybko, zwracając jednocześnie uwagę na żądany obszar lub obszary systemu korzeniowego do pobierania próbek. I weź wiele próbek na system korzeniowy. Aby przygotować sprzęt do zamrażania zatrzaskowego do eksperymentu, umieść dwa, pięć na pięć na 15 centymetrów bloki miedzi poziomo w czystej chłodnicy zdolnej do przechowywania ciekłego azotu.
Nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, wlej tyle ciekłego azotu do chłodnicy, aby zanurzyć bloki. Gdy bulgotanie ustąpi, umieść po jednym fragmencie na każdym końcu jednego bloku miedzianego. Następnie, za pomocą szczypiec i rękawic kriogenicznych, ustaw drugi miedziany blog na jego końcu, aby ułatwić pobieranie, gdy próbka jest na miejscu.
Aby pobrać próbkę, użyj rośliny doniczkowej lub łopaty, aby rozpocząć wydobywanie pożądanej rośliny i ryzosfery z mokrej gleby, uważając, aby wykopany dołek był znacznie większy niż pożądana objętość korzenia. Użyj stalowego ostrza, aby odciąć nadmiar ziemi, uważając, aby nie naruszyć gleby w żądanym obszarze. Gdy dotrą do pożądanych obszarów, wytnij kostkę korzeniową o wymiarach około trzy na trzy na dwa centymetry i natychmiast umieść kostkę między dwoma przekładkami na poziomym bloku miedzianym.
W celu całkowitego zamrożenia próbki użyto rękawic kriogenicznych, aby umieścić pionowy blok miedzi na przekładkach na około pięć minut. Gdy bulgotanie ustąpi, przenieś zamrożoną próbkę kostki ryzosfery na kawałek wstępnie oznaczonego kwadratu z folii aluminiowej. Aby wysuszyć kostki gleby na zimno, gdy liofilizator osiągnie odpowiednie ciśnienie i temperaturę podciśnienia, umieść jedną zamrożoną próbkę kostki ryzosfery do czystej i umytej kwasem probówki o pojemności 50 mililitrów lub bezpośrednio do liofilizatora i użyj czystej jednorazowej chusteczki, aby zapobiec przedostawaniu się kurzu do pompy próżniowej.
Umieścić próbki w naczyniu liofilizatora na co najmniej kilka dni, aż wyschną. Po liofilizacji tkanek należy użyć stalowego ostrza do wysuszenia kostek gleby do odpowiedniej wielkości do analizy przed umieszczeniem kostek w oznakowanych formach wewnątrz eksykatora próżniowego. Po przygotowaniu żywicy epoksydowej zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą zakraplacza powoli dodawać żywicę epoksydową do formy po jednej stronie gleby, aż żywica epoksydowa całkowicie pokryje próbkę.
Gleba ciemnieje, gdy żywica epoksydowa zwilży glebę. Po wypełnieniu form żywicą epoksydową zamknij eksykator i włącz próżnię. Sprawdzaj poziom żywicy epoksydowej co 30 do 90 minut przez pierwszą do czterech godzin, w razie potrzeby dodając dodatkową żywicę epoksydową.
Gdy żywica epoksydowa stwardnieje, usuń próbkę. Po osadzeniu użyj precyzyjnej piły na mokro z diamentowym ostrzem, aby przeciąć próbkę. Przeciąć próbkę w innym kierunku, jeśli w poprzednim cięciu nie uzyskano korzeni
.Po przycięciu ręcznie przeszlifuj ciętą stronę każdej próbki stopniowo drobniejszym papierem ściernym przez 30 sekund na ziarno. Na tym rysunku można zaobserwować kilka średnic korzeni w osnowie glebowej jako przekroje poprzeczne. Korzenie mogą wykazywać różny poziom jakości.
Na przykład na tym obrazie można zaobserwować dobrze zachowany korzeń, korzeń zniekształcony w procesie liofilizacji oraz korzeń, który został wyrwany podczas procesu cienkiego cięcia. Analiza tego przekroju poprzecznego korzenia z korzeniem bocznym w przekroju podłużnym za pomocą synchrotronowego obrazowania fluorescencji rentgenowskiej, jak pokazano, pozwala na wykrycie żelaza, manganu i arsenu. Obecność żelaza w glebie i otaczającej korzeń w żelaznej płytce jest również widoczna na świetlnych obrazach mikrograficznych.
Mangan jest wyjątkowo obecny w korze korzenia bocznego, ale również kolokalizuje się z żelazem w niektórych obszarach w żelaznej płytce nazębnej jako zielono-niebieski odcień. Arsen znajduje się głównie w unaczynieniu korzenia bocznego, łącząc się z unaczynieniem korzenia pierwotnego. Obrazowanie specjacji chemicznej ujawnia zmienność lokalizacji gatunków arsenu.
Jak zaobserwowano na tym trójkolorowym wykresie, arsenit i glutation arsenitowy są ściśle związane w układzie naczyniowym, podczas gdy arsenian lokalizuje się głównie na zewnątrz korzenia, związanego z płytką żelazną. Przed pobraniem próbki należy określić żądaną część systemu korzeniowego do obrazowania pierwiastków. Będzie to dyktować orientację lokalizacji usuniętego klucza głównego.
Zgodnie z tym protokołem próbki mogą być obrazowane w skali mikronowej lub grubszej przy użyciu różnych technik, w zależności od konkretnych pytań badawczych, elementów zainteresowania lub dostępnego oprzyrządowania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół pobierania próbek, przechowywania i przekrojów całych korzeni i otaczającej glebę rezonansową z środowisk podmokłych z wykorzystaniem ryżu (Oryza sativa L.) jako gatunku modelowego. Metoda pozwala na dokładne zachowanie dystrybucji pierwiastków i ich form, ułatwiając analizę za pomocą technik obrazowania pierwiastków.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Neuronauki
- Biologia roślin
- Nauki środowiskowe
Tło
- Zrozumienie dystrybucji pierwiastków w systemach roślinnych jest kluczowe dla różnych badań ekologicznych.
- Techniki obrazowania pierwiastków, takie jak spektroskopia rentgenowska (XRF), dostarczają informacji na temat speciacyjności chemicznej.
- Metody konserwacji są niezbędne dla dokładnej analizy próbek biologicznych.
- Ten protokół koncentruje się na środowiskach podmokłych, które są ważne dla bioróżnorodności i cyklu składników odżywczych.
Cel badania
- Opracowanie szybkiej i przystępnej metody przygotowywania korzeni roślin wodnych i próbek rezonansowych.
- Zapewnienie dokładnego przechowywania dystrybucji pierwiastków dla kolejnej analizy obrazowej.
- Ułatwienie badań nad dynamiką składników odżywczych i transportem zanieczyszczeń w ekosystemach podmokłych.
Stosowane metody
- Pobieranie całych korzeni i otaczającej gleby z środowisk podmokłych.
- Zachowanie próbek za pomocą techniki szybkiej zamrażania.
- Przygotowanie bloków miedzianych do skutecznego zamrażania.
- Wykorzystanie spektroskopii rentgenowskiej (XRF) do obrazowania pierwiastków.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na zachowanie dystrybucji i form pierwiastków o interesujących nas cechach.
- Próbki mogą być analizowane szybko i przystępnie, poprawiając zdolności badawcze.
- Wiele próbek można pobierać z każdego systemu korzeniowego dla kompleksowej analizy.
- Technika jest stosowana do różnych pytań badawczych dotyczących dynamiki składników odżywczych i transportu zanieczyszczeń.
Wnioski
- Ten protokół dostarcza cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się ekosystemami podmokłymi.
- Dokładne przechowywanie próbek jest kluczowe dla niezawodnej analizy pierwiastków.
- Metoda może być dostosowana do różnych systemów roślinnych i celów badawczych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Preserving the native structure and elemental chemistry of wetland plant roots and rhizospheres is critical for accurate mechanistic studies in environmental and agricultural R&D. This protocol enables high-fidelity imaging of micron-scale elemental distributions, supporting predictive confidence in studies of nutrient cycling, contaminant fate, and phytoremediation. Rapid, cost-effective sample preparation enhances throughput and reproducibility at key discovery and translational inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of plant-soil interactions relevant to nutrient uptake and contaminant sequestration.
- Supports mechanistic de-risking by preserving in situ chemical gradients and elemental speciation.
- Facilitates functional validation of plant-based remediation targets in complex wetland environments.
Screening & Assay Development
- Prepares validated root and rhizosphere samples for quantitative elemental imaging workflows.
- Standardizes sample preservation to minimize distortion and maximize reproducibility across studies.
- Enables scalable, high-throughput screening of multiple plant systems and environmental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns micron-scale imaging outputs with translational biomarker discovery in phytoremediation and nutrient cycling.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by preserving both structure and chemistry.
- Supports risk-adjusted advancement of plant-based environmental intervention strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum for plant-environment interaction studies, supporting both hypothesis-driven research and screening applications.
- Discovery Biology: Preserves native root and rhizosphere chemistry for robust hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative elemental imaging outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables micron-scale mapping of elemental distributions and chemical speciation in plant tissues.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment in phytoremediation and nutrient cycling studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, adaptable protocol for diverse plant-soil systems and research objectives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in plant-soil mechanistic studies and target validation.
- Operational Value: Delivers rapid, scalable, and reproducible sample preparation for elemental imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for environmental intervention strategies and portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of plant-based remediation and nutrient management programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and elemental imaging techniques.
- Needs access to liquid nitrogen, freeze drying, and synchrotron or advanced microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample collection, processing, and imaging protocols.
- Adaptable to various plant and soil systems with attention to sample orientation and preservation quality.
- Sample distortion risk necessitates multiple replicates to ensure high-quality imaging outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:43
Slam-Freezing Equipment Preparation
1:26
Sample Collection and Slam-Freezing
2:22
Rhizosphere Cube Freeze-Drying and Embedding
3:53
Rhizosphere Cubes Trimming and Sectioning
4:18
Results: Elemental Wetland Root and Rhizosphere Preservation and Imaging
5:53
Conclusion
