Skuteczna dyssekcja i hodowla pierwotnych komórek nabłonka barwnikowego siatkówki myszy

Protokół ten pozwala na efektywną izolację i hodowlę mysich komórek RPE. Zdrowe pierwotne hodowle myszy RPE są cennymi modelami pozwalającymi zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw chorób oczu. Zlewające się i żywotne kultury RPE uzyskuje się w ciągu trzech dni i można je uprawiać przez tygodnie.

Protokół ten został z powodzeniem wykorzystany do zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw zwyrodnienia plamki żółtej związanego z wczesnym wiekiem, które jest główną przyczyną ślepoty wśród osób starszych w krajach rozwiniętych. Ważne jest, aby zwizualizować etapy sekcji. Szczegóły mają kluczowe znaczenie dla powodzenia protokołu, na przykład, jak obchodzić się z gałkami ocznymi, aby twardówka nie została przebita, gdzie dokładnie należy wykonać nacięcia i jak osadzić muszle oczne w trypszynie, aby pozostały otwarte.

Zacznij od przygotowania wszystkich niezbędnych odczynników do protokołu. Następnie zacznij czyścić gałkę oczną, ostrożnie usuwając całą tkankę łączną, krew i mięśnie, używając kleszczy numer pięć Dumonta i nożyczek kątowych, nie wykonując żadnych nacięć w twardówce. Regularnie przenoś gałkę oczną do świeżego naczynia zawierającego trzy mililitry buforu HBSS wolnego od HEPES, aby oko było świeże i czyste oraz aby uniknąć zanieczyszczenia.

Użyj nerwu wzrokowego jako uchwytu do przytrzymania gałki ocznej i zrób otwór w środku rogówki za pomocą ostrego ostrza ze stali węglowej numer 11. Wykonaj trzy nacięcia w rogówce przez otwór nożyczkami Dumont numer pięć, upewniając się, że jest wystarczająco dużo miejsca na wyjęcie soczewki. Przytrzymaj nerw wzrokowy i lekko dociśnij ora serrata podstawą kątowych nożyczek, aż soczewka całkowicie wyjdzie.

Utrzymuj nabłonek tęczówki w stanie nienaruszonym, aby zapobiec odwarstwieniu się siatkówki nerwowej i RPE podczas inkubacji. Umieść oko w buforze HBSS wolnym od HEPES. Inkubuj oczy bez soczewek w roztworze hialuronidazy w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut w inkubatorze napowietrzonym 5% dwutlenkiem węgla, aby odłączyć siatkówkę nerwową od RPE.

Umieść każde oko w nowej studzience z 1,5 mililitra zimnego buforu HBSS HEPES na studzienkę i inkubuj je na lodzie przez 30 minut. Po umyciu umieść każde oko w 35-milimetrowym naczyniu hodowlanym ze świeżym buforem HBSS HEPES. Przetnij rogówkę przez pierwotne nacięcia ośmiocentymetrowymi nożyczkami Vannas, aż dojdziesz do ora serrata, a następnie przetnij poniżej ora serrata, aby usunąć nabłonek tęczówki i rogówkę.

Przytrzymaj ora serrata zakrzywioną pęsetą i za pomocą kątowych mikrokleszczyków odciągnij siatkówkę nerwową, upewniając się, że warstwa RPE nie została przecięta. Następnie odetnij wewnętrzne przyczep do nerwu wzrokowego. Przeciąć nerw wzrokowy i przenieść każdą muszlę oczną na inną 12-dołkową płytkę zawierającą 1,5 mililitra świeżej trypsyny-EDTA na dołek.

Upewnij się, że muszle oczne pozostają otwarte i całkowicie zanurzone w trypszynie. Inkubuj gałązki oczne w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 45 minut w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla. Zebrać każdą muszlę oczną razem z wszelkimi arkuszami RPE oderwanymi podczas inkubacji trypsyny i przenieść je do 12-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra roztworu FBS na studzienkę.

Jeśli arkusze RPE pozostaną w roztworze trypsyny, użyj mikropipety, aby przenieść je do studzienki z roztworem FBS. Chwyć każdą muszlę oczną za nerw wzrokowy i potrząśnij nią skierowaną w dół do 12-dołkowej płytki zawierającej 1,5 mililitra 20% FBS w buforze HBSS HEPES, aż do całkowitego oderwania arkuszy RPE. Zbierz wszelkie arkusze RPE i klastry RPE za pomocą mikropipety, unikając białych kawałków twardówki lub naczyniówki, które mogłyby zanieczyścić kultury, i umieść je w 15-mililitrowej probówce.

Wyciągnij dwoje oczu z tej samej myszy w jednej tubce. Następnie odwirować mieszaninę RPE o sile 340 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant. Delikatnie zawieś ponownie granulat RPE w jednomililitrowej mieszaninie 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj go przez jedną minutę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zdezagregować arkusze RPE na pojedyncze komórki.

Następnie delikatnie pipetuj w górę i w dół 10 razy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Dodać dziewięć mililitrów świeżo przygotowanej pożywki RPE, aby rozcieńczyć i dezaktywować trypsynę, a następnie odwirować mieszaninę przy 340 x g przez dwie minuty w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad komórkowy w 150 mikrolitrach pożywki RPE z 5% FBS.

Następnie należy wyjąć PBS z dolnej komory wcześniej przygotowanego wkładu membranowego pokrytego lamininą i dodać do niego 700 mikrolitrów pożywki RPE. Usuń lamininę z górnej komory wkładu membranowego i rozprowadź zawiesinę komórek RPE kroplami i równomiernie do środka komory. Umieść wkładkę membranową w spokoju w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej 24 godziny.

Następnie sprawdź wkładkę membranową pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek RPE jest przymocowana do wkładki, a zbieg wynosi co najmniej 50%Nie zmieniaj podłoża w ciągu pierwszych 72 godzin. Komórki RPE wyizolowane przy użyciu tego protokołu wykazywały typowy rozmiar, morfologię i pigmentację RPE. Po tygodniu zaobserwowano silnie spolaryzowaną monowarstwę RPE z dwoma jądrami połączonymi ścisłymi połączeniami, wraz z obecnością mikrokosmków wierzchołkowych i fałdów podstawnych.

Polaryzacja monowarstwy RPE została potwierdzona wartościami TER, przy średniej wyższej niż 200 omów centymetra kwadratowego, która pozostała stabilna w czasie. W testach fagocytozy przeprowadzonych na bydlęcym POS znakowanym FITC zaobserwowano pochłanianie i trawienie POS, co wskazuje na tworzenie funkcjonalnej zlewającej się monowarstwy komórek RPE. Żywotne kultury wymagają krótkiego czasu preparacji, który osiąga się wraz z doświadczeniem.

Niektóre komórki RPE mogą pozostać przyczepione do siatkówki nerwowej, ale jeśli kilka arkuszy RPE pozostanie podłączonych, protokół nie powiedzie się. Aby zapobiec temu problemowi, należy za każdym razem stosować świeżą hialuronidazę. Te funkcjonalne pierwotne hodowle komórek myszy RPE są cennym narzędziem do badania patobiologii RPE w wielu chorobach oczu.

Na przykład protokół ten umożliwił zbadanie patobiologii RPE w mysim modelu zwyrodnienia plamki żółtej.