Name: Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-04T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Poznaj generowanie iPSC z fibroblastów tkanek płodowych z zespołem Turnera metodą nukleofekcji plazmidów epizomalnych. Protokół obejmuje charakteryzację komórek i różnicowanie neuronalne do modelowania deficytów neurologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wsparcie finansowe dla powyższych badań zostało zapewnione przez Manipal Academy of Higher Education. Charakterystykę linii przeprowadzono częściowo w laboratorium M. M. Panickera z NCBS. Dziękujemy Laboratorium Diagnostycznemu Anand za pomoc w kariotypowaniu.

<ol><li>Verlinsky, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell+lines+with+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell lines with genetic disorders.</a> Reproductive BioMedicine Online. 10, 105-110 (2005).</li>
<li>Eiges, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+Study+of+Fragile+X+Syndrome+Using+Human+Embryonic+Stem+Cells+Derived+from+Preimplantation+Genetically+Diagnosed+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental Study of Fragile X Syndrome Using Human Embryonic Stem Cells Derived from Preimplantation Genetically Diagnosed Embryos.</a> Cell Stem Cell. 1, 568-577 (2007).</li>
<li>Biancotti, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Embryonic+Stem+Cells+as+Models+for+Aneuploid+Chromosomal+Syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Human Embryonic Stem Cells as Models for Aneuploid Chromosomal Syndromes.</a> STEM CELLS. 28, 1530-1540 (2010).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+abnormal+early+development+with+induced+pluripotent+stem+cells+from+aneuploid+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Modeling abnormal early development with induced pluripotent stem cells from aneuploid syndromes.</a> Human Molecular Genetics. 21, 32-45 (2012).</li>
<li>Gravholt, C. H., Viuff, M. H., Brun, S., Stochholm, K., Andersen, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turner+syndrome%3A+mechanisms+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Turner syndrome: mechanisms and management.</a> Nature Reviews Endocrinology. 15, 601-614 (2019).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniparental+disomy+of+the+entire+X+chromosome+in+Turner+syndrome+patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Discovery%22%5BJournal%5D)">Uniparental disomy of the entire X chromosome in Turner syndrome patient-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell Discovery. 1, 15022(2015).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+an+adult+male+with+45%2CX%2F46%2CXY+mosaicism%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line from an adult male with 45,X/46,XY mosaicism.</a> Stem Cell Research. 27, 42-45 (2018).</li>
<li>Parveen, S., Panicker, M. M., Gupta, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+induced+pluripotent+stem+cell+line+from+chorionic+villi+of+a+Turner+syndrome+spontaneous+abortion%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Generation of an induced pluripotent stem cell line from chorionic villi of a Turner syndrome spontaneous abortion.</a> Stem Cell Research. 19, (2017).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Soldner, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+Disease+Patient-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Viral+Reprogramming+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's Disease Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells Free of Viral Reprogramming Factors.</a> Cell. 136, 964-977 (2009).</li>
<li>Somers, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Transgene-Free+Lung+Disease-Specific+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Using+a+Single+Excisable+Lentiviral+Stem+Cell+Cassette%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Generation of Transgene-Free Lung Disease-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette.</a> STEM CELLS. 28, 1728-1740 (2010).</li>
<li>Woltjen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac+transposition+reprograms+fibroblasts+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 458, 766-770 (2009).</li>
<li>Stadtfeld, M., Nagaya, M., Utikal, J., Weir, G., Hochedlinger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+Without+Viral+Integration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration.</a> Science. 322, 945-949 (2008).</li>
<li>Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+induction+of+transgene-free+human+pluripotent+stem+cells+using+a+vector+based+on+Sendai+virus%2C+an+RNA+virus+that+does+not+integrate+into+the+host+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Japan+Academy%2C+Series+B%22%5BJournal%5D)">Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.</a> Proceedings of the Japan Academy, Series B. 85, 348-362 (2009).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Efficient+Reprogramming+to+Pluripotency+and+Directed+Differentiation+of+Human+Cells+with+Synthetic+Modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Kim, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+direct+delivery+of+reprogramming+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins.</a> Cell Stem Cell. 4, 472-476 (2009).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324, 797-801 (2009).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8, 409-412 (2011).</li>
<li>Martí, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 8, 223-253 (2013).</li>
<li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).</li>
<li>Ambartsumyan, G., Clark, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aneuploidy+and+early+human+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aneuploidy and early human embryo development.</a> Human Molecular Genetics. 17, 10-15 (2008).</li>
<li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+cerebral+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 9, 2329-2340 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Generowanie stabilnych modeli komórkowych cytogenetycznie nieprawidłowej tkanki płodu jest niezbędne do utrwalenia wadliwego fenotypu. Droga iPSC jest najskuteczniejszą metodą przygotowania komórek do wiecznej konserwacji wadliwych właściwości20.
Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) wykazują właściwości samoodnawiania i różnicowania się w wyspecjalizowane komórki, przypominające zarodki o wczesnym rozszczepieniu21. W związku z tym PSC mogą ...

Aneuploidie prowadzą do wad wrodzonych/wad wrodzonych i utraty ciąży u ludzi. ~50%-70% próbek z powodu utraty ciąży wykazuje nieprawidłowości cytogenetyczne. Zarodki aneuploidalne utracone we wczesnym okresie ciąży nie mogą być łatwo pozyskane do analizy eksperymentalnej, co rodzi potrzebę opracowania innych modeli ściśle reprezentujących ludzką embriogenezę. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek, u których zdiagnozowano zaburzenia genetyczne, wykorzystano do modelowania reprezentatywnych nieprawidłowości genetycznych i ich wpływu na rozwój płodu1,2,3,4. Te iPSC przypominają komórki epiblastu rozwijającego się zarodka i mogą podsumowywać wczesne zdarzenia tworzenia się zarodka. Pozwalają one zrozumieć i scharakteryzować program rozwojowy linii komórkowych i wzorce we wczesnych zarodkach ssaków. iPSC pochodzące wcześniej z fibroblastów skóry i amniocytów z prenatalnych testów diagnostycznych zespołów aneuploidalnych, takich jak monosomia X (zespół Turnera), trisomia 8 (zespół Warkany'ego 2), trisomia 13 (zespół Pataua) i częściowa trisomia 11; 22 (zespół Emanuela) dostarczyły cennych spostrzeżeń na temat nieudanego rozwoju4.
Zespół Turnera (TS) jest rzadkim schorzeniem charakteryzującym się niepłodnością kobiet, niskim wzrostem, zaburzeniami endokrynologicznymi i metabolicznymi, zwiększonym ryzykiem chorób autoimmunologicznych oraz predyspozycjami do chorób sercowo-naczyniowych5. Chociaż jest to jedyny możliwy do przeżycia zespół monosomii, jest on również śmiertelny dla rozwijającego się zarodka, powodując samoistne poronienia6. Osoby, które przeżyły z TS, mają różne zmiany materiału chromosomu X w swoich komórkach. Kariotypy wahają się od całkowitej utraty jednego chromosomu X (45,XO) do mozaik, takich jak 45,XO/46,XX; 45,XO/47,XXX, obecność chromosomów pierścieniowych, obecność materiału chromosomu Y, itd5.
Diagnoza zespołu jest zazwyczaj przeprowadzana poprzez kariotypowanie krwi osób z objawami i pobieranie próbek kosmówek (CVS) w celu wykrycia wczesnych zespołów aneuploidii. Ponieważ zespoły aneuploidii stanowią ~ 30% poronień spontanicznych, rutynowe jest kariotypowanie produktu poczęcia (POC) po poronieniu spontanicznym. Te komórki płodowe, w tym kosmki kosmówkowe posiadające nieprawidłowości cytogenetyczne i pochodzące z nich iPSC, stanowią cenne źródło materiału biologicznego do badania zespołów aneuploidii4,6. TS iPSC zostały wcześniej utworzone z amniocytów poprzez retrowirusowe przeprogramowanie4, fibroblasty kosmków kosmówkowych (uzyskane w diagnostyce prenatalnej) poprzez retrowirusowe przeprogramowanie6, z komórek jednojądrzastych krwi7 poprzez przeprogramowanie wirusa Sendai oraz z fibroblastów skóry osób z TS poprzez przeprogramowanie lentiwirusowe4. Ponieważ głównym celem naszego laboratorium jest zrozumienie niepowodzeń rozwojowych, wygenerowaliśmy TS iPSC z POC, a konkretnie komponent kosmków kosmówkowych samoistnego poronienia8. Wszystkie komórki wyizolowane z tej tkanki płodowej miały kariotyp 45XO i dały iPSC o tym samym kariotypie. Te iPSC są wyjątkowe, ponieważ są pierwszymi, które są generowane z abortowanego płodu i stanowią cenne źródło do badania niepowodzeń ciąży związanych z aneuploidią. W artykule przedstawiono szczegółową metodologię generowania iPSC z tego unikalnego źródła komórek poprzez przeprogramowanie episomalne.
Wczesne metody generowania iPSC wykorzystywały transdukcję wirusa i transpozony do dostarczania czynników przeprogramowujących. Metody indukowania komórek do pluripotencji ewoluowały od stosowania integrujących wektorów retrowirusowych9, wektorów lentiwirusowych podlegających akcyzie10,11 i metod opartych na transpozonach12 do nieintegrujących wektorów adenowirusowych13 i wektorów opartych na wirusie Sendai14. Przeprogramowanie oparte na retrowirusach i lentiwirusach, choć skuteczne, obejmuje integrację czynników przeprogramowujących z chromosomami gospodarza, powodując mutacje insercyjne, które mają nieprzewidziane skutki w iPSC. Co więcej, przeprogramowanie oparte na wirusach zapobiega translacyjnemu zastosowaniu iPSC. Systemy oparte na RNA15 i bezpośrednie dostarczanie białek16 zostały zbadane w celu całkowitego wyeliminowania potencjalnych zagrożeń związanych z użyciem wirusów i transfekcji DNA. Jednak te metody okazały się nieskuteczne.
W 2011 roku, Okita i wsp. poinformowali o poprawie efektywności przeprogramowania za pomocą plazmidów episomalnych wzmocnionych supresją TP53 przez shRNA. Zastąpili również cMYC nietransformującym LMYC (MYC związanym z drobnokomórkowym rakiem płuca) w celu zwiększenia bezpieczeństwa hiPSC. Te plazmidy episomalne wyrażają 5 czynników przeprogramowujących: OCT4, LIN28, SOX2, KLF4, LMYC i shRNA dla TP5317,18. Wektory te są utrzymywane poza chromosomem i tracone z przeprogramowanych komórek po ciągłej hodowli, dzięki czemu linie są wolne od transgenów w ciągu 10-15 pasaży. Nukleofekcja to wyspecjalizowana forma elektroporacji, która dostarcza kwasy nukleinowe bezpośrednio do jądra komórek gospodarza. Jest to skuteczna metoda dostarczania plazmidów przeprogramowujących do różnych typów komórek. Plazmidy episomalne są opłacalne i rekompensują wysokie koszty nukleofekcji. Metoda ta jest skuteczna i powtarzalna w zoptymalizowanych warunkach, dając stabilne iPSC z różnych komórek somatycznych. W niniejszym protokole opisano metodę wytwarzania iPSC z fibroblastów wyizolowanych z tkanki płodu poprzez nukleofekcję plazmidów przeprogramowujących episomalne. Oto szczegółowe protokoły izolacji fibroblastów z kosmków kosmówkowych płodu, oczyszczania plazmidu, nukleofekcji, pobierania kolonii z płytki przeprogramowującej i tworzenia stabilnych iPSC.
Konieczne jest potwierdzenie obecności cech pluripotencji w nowo wygenerowanych iPSC. Obejmuje to wykazanie czynników związanych z pluripotencją (np. ekspresja fosfatazy alkalicznej, NANOG, SSEA4, Tra 1-80, Tra 1-81, E-kadheryna; zwykle wykazywane za pomocą testów immunofluorescencyjnych lub ekspresji genów), identyfikację trzech listków zarodkowych za pomocą testów różnicowania in vitro w celu potwierdzenia ich potencjałów różnicowania, kariotypowanie w celu określenia zawartości chromosomów, typowanie STR w celu ustalenia tożsamości z komórkami rodzicielskimi, weryfikacja utraty genów egzogennych, oraz bardziej rygorystyczne testy in vivo, takie jak tworzenie potworniaków i komplementacja tetraploidalna. Tutaj opisujemy protokoły charakterystyki kariotypowania, barwienia fosfatazą alkaliczną żywych komórek, wykrywania biomarkerów związanych z pluripotencją za pomocą immunofluorescencji, testów różnicowania in vitro oraz metody wykazywania utraty genów egzogennych19.

<table><tbody><tr><td>0,15% trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>27250018</td><td>G Banding</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21985023</td><td>Pluripotencja i pożywka dla embrionów</td></tr><tr><td>4', 6 diamidino-2-fenyloindol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8417</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Aktywina A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3003</td><td>Testy</td></tr> <tr><td>różnicowaniaFosfataza alkaliczna Live Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A14353</td><td>Barwienie AP</td></tr><tr><td>AMAXA Nucleofector II</td><td></td> Lonza-Nucleofection <td></td><td></td></tr><tr><td>AmnioMAX II kompletne podłoża</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>11269016</td><td>Podłoże specyficzne dla hodowli komórek kosmków kosmówkowych płodu</td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>HiMedia</td><td>TC021</td><td>Oczyszczanie plazmidu</td></tr><tr><td>Anty mysie IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11059</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty królik IgG (H+L) Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A11035</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Antybiotyk-Antybiotyk Grzybicze</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>15240096</td><td>Kontrola zanieczyszczeń</td></tr><tr><td>Anty-E-Kadheryna</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>610181</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-Nanog</td><td>BD Biosciences</td><td>560109</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-OCT3/4</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>611202</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-SOX17</td><td>BD Biosciences</td><td>561590</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-SOX2</td><td>BD Biosciences</td><td>561469</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-SSEA4</td><td>BD Nauki biologiczne</td><td>560073</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Anty-TRA 1-81</td><td>Milipore</td><td>MAB4381</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>podstawowa Czynnik wzrostu fibroblastów [FGF2]</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>F0291</td><td>Pożywka pluripotencji</td></tr><tr><td>Czynnik morfogenetyczny kości 4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SRP3016</td><td>Testy różnicujące</td></tr><tr><td>Bydło Albumina surowicy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3059</td><td>Kolagen blokujący</td></tr><tr><td>Ludzki typ IV</td><td>BD Biosciences</td><td>354245</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>Mieszanka kolagenazy</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8051</td><td>Trawienie kosmków kosmówkowych płodu</td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4902</td><td>Testy różnicujące</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11320033</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>FastDigest EcoR1</td><td>Thermo Scientific</td><td>FD0274</td><td>Trawienie restrykcyjne</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2518</td><td>Testy różnicujące</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>HiMedia</td><td>S011</td><td>G Pasaż</td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy</td><td>HiMedia</td><td>AS001</td><td>Utrwalacz do kariotypowania</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7528</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Pluripotencja i pożywka dla embrionów</td></tr><tr><td>Heparyna sodowa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3149</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>Roztwór insuliny ludzkiej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9278</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>Insulina Transferyna Selenit</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1884</td><td>Testy różnicujące</td></tr><tr><td>Zestaw KAPA HiFi PCR</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KR0368</td><td>OriP, EBNA1 PCR</td></tr><tr><td>KaryoMAX Colcemid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15210040</td><td>Zatrzymanie mitotyczne do kariotypowania</td></tr><tr><td>Nokaut DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10829018</td><td>Pluripotencja i zarodek</td></tr> ciała <tr><td>podłoże KnockOut Wymiana surowicy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10828028</td><td>Pożywka dla pluripotencji i zarodków</td></tr><tr><td>Luria Bertani agar</td><td>HiMedia</td><td>M1151F</td><td>Oczyszczanie plazmidu</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td>Testy różnicowania</td></tr><tr><td>MEM Aminokwasy endogenne</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Pluripotencja i pożywka dla embrionów</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>HiMedia MB113</td><td>Utrwalacz do kariotypowania</td></tr><tr><td>Miozyna komorowy łańcuch ciężki &alfa;/&beta;</td><td>Millipore</td><td>MAB1552</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>NHDF Zestaw nukleofektorów</td><td>Lonza</td><td>VAPD-1001</td><td>Nucleofekcja</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Mocowanie komórek</td></tr><tr><td>pCXLE-hOCT3/ 4-SHP53-F</td><td>Addgene</td><td>27077</td><td>Przeprogramowanie epizodyczne Plazmid</td></tr><tr><td>pCXLE-hSK</td><td>Addgene</td><td>27078</td><td>Plazmid przeprogramowania epizodycznego</td></tr><tr><td>pCXLE-hUL</td><td>Addgene</td><td>27080</td><td>Przeprogramowanie episomalne Penicylina plazmidowa</td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>&nbsp; Thermo Fisher Naukowy,</td><td>&nbsp; 15070063</td><td>Pluripotencja i pożywka dla embrionów</td></tr><tr><td>Phalloidyna- Tetrametylorodamina B izotiocyjanian</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1951</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>1 X PBS 1 tabletka PBS rozpuszczona w 200 ml wody dejonizowanej i wysterylizowana w autoklawie Przechowywanie: Temperatura pokojowa. PBST- 0,05% Tween 20 in 1X PBS. Przechowywanie: Temperatura pokojowa.</td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania plazmidu - Midi prep</td><td>QIAGEN</td><td>12143</td><td>Oczyszczanie plazmidu</td></tr><tr><td>Roztwór chlorku potasu</td><td>HiMedia</td><td>MB043</td><td>Hipotoniczny roztwór do kariotypowania</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Zestaw krwi</td><td>Qiagen</td><td>51104</td><td>Izolacja genomowego DNA</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td>Pożywka do różnicowania hepatocytów</td></tr><tr><td>Cytrynian sodu</td><td>HiMedia</td><td>RM255</td><td>Hipotoniczny roztwór do kariotypowania</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>HiMedia</td><td>MB031</td><td>Permeabilizacja</td></tr><tr><td>Trypsyna-EDTA (0,05%)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Gibco</td><td>25300054</td><td>Subkultura &nbsp; fibroblasty kosmków kosmówkowych płodu</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>HiMedia</td><td>MB067</td><td>Przygotowanie PBST&</td></tr><tr><td>beta; III tubulina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8578</td><td>Immunocytochemia</td></tr><tr><td>Y-27632 dichlorowodorek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y0503</td><td>Testy różnicujące</td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu turnera (45xo) komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Turner Syndrome (45XO) Fetal Cells for Downstream Modelling of Neurological Deficits Associated with the Syndrome

Aneuploidie chromosomowe powodują poważne wady wrodzone, w tym wady rozwojowe ośrodkowego układu nerwowego i śmierć płodu. Prenatalne badania genetyczne mają charakter czysto diagnostyczny i nie wyjaśniają mechanizmu choroby. Chociaż komórki z płodów aneuploidalnych są cennym materiałem biologicznym zawierającym aneuploidię chromosomową, komórki te żyją krótko, co ogranicza ich wykorzystanie w dalszych eksperymentach badawczych. Generowanie modeli indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) jest skuteczną metodą przygotowania komórek do wiecznego zachowania cech aneuploidalnych. Są samoodnawiające się i różnicują w wyspecjalizowane komórki, co przypomina rozwój embrionalny. W związku z tym iPSC służą jako doskonałe narzędzia do badania wczesnych zdarzeń rozwojowych. Zespół Turnera (TS) jest rzadkim schorzeniem związanym z całkowitym lub częściowym brakiem chromosomu X. Zespół charakteryzuje się niepłodnością, niskim wzrostem, zaburzeniami endokrynologicznymi, metabolicznymi, autoimmunologicznymi i sercowo-naczyniowymi oraz defektami neuropoznawczymi. Poniższy protokół opisuje izolację i hodowlę fibroblastów z tkanki płodowej TS (45XO), generowanie wolnych od integracji TSiPSC poprzez dostarczenie plazmidów przeprogramowujących epizodyczne przez nukleofekcję, a następnie charakteryzację. Przeprogramowanie TSiPSC poddano początkowo badaniom przesiewowym za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną żywych komórek, a następnie przeprowadzono szeroko zakrojone badania pod kątem biomarkerów pluripotencji. Wybrane kolonie poddano mechanicznej sekcji, kilkukrotnej pasażacji, a do dalszych eksperymentów wykorzystano stabilne, samoodnawiające się komórki. W komórkach stwierdzono ekspresję czynników transkrypcyjnych pluripotencji OCT4, NANOG, SOX2, markerów powierzchniowych komórek SSEA 4 i TRA1-81 typowych dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. Oryginalny kariotyp 45XO został zachowany po przeprogramowaniu. TSiPSC były zdolne do tworzenia ciał zarodkowych i różnicowania się w komórki endodermy, mezodermy i ektodermy wyrażające biomarkery specyficzne dla linii ((SRY BOX17), (MIOZYNOWY KOMOROWY ŁAŃCUCH CIĘŻKI α/β), (βIII TUBULINA)). Egzogenne plazmidy episomalne zostały utracone spontanicznie i nie zostały wykryte po pasażie 15 w komórkach. Te TSiPSC są cennym zasobem komórkowym do modelowania wadliwego rozwoju molekularnego i komórkowego powodującego deficyty neurokognitywne związane z zespołem Turnera.

Generowanie wolnych od integracji iPSC z płodu po samoistnym poronieniu z kariotypem 45XO 
Wyizolowano fibroblasty z FCV z kariotypem 45XO charakterystycznym dla zespołu Turnera (TS) i poddano je nukleofekcji episomalnymi plazmidami reprogramującymi w celu wygenerowania TSiPSC, które mogą być wykorzystane do dalszego modelowania zespołu, a w szczególności związanych z nim deficytów neurologicznych (Rycina 1a&amp;b). Do eksperymentów z transfekcją wykorzys...

Ten protokół opisuje generowanie wolnych od integracji iPSC z fibroblastów tkanek płodu poprzez dostarczanie plazmidów epizodycznych przez nukleofekcję, a następnie opisuje metody używane do charakterystyki iPSC i różnicowania neuronów.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem

Chromosomal aneuploidies cause severe congenital malformations including central nervous system malformations and fetal death. Prenatal genetic screening ...

Zespół Turnera jest rzadkim schorzeniem związanym z całkowitym lub częściowym brakiem chromosomu X. Zespół charakteryzuje się niepłodnością, niskim wzrostem, zaburzeniami sercowo-naczyniowymi i defektami neuropoznawczymi. W niektórych przypadkach powoduje śmierć płodu.Chociaż komórki somatyczne płodów aneuploidalnych są cenne biologicznie, są krótkotrwałe, co ogranicza ich wykorzystanie w badaniach. Wytwarzanie iPSC jest zatem skuteczną metodą przygotowania komórek do trwałego zachowania cech aneuploidalnych. Są samoodnawiające się i mogą różnicować się w wyspecjalizowane typy komórek, przypominające wczesny rozwój embrionalny.Dostarczanie nieintegrujących plazmidów przeprogramowujących episomalne za pomocą fikcji jądrowej jest wydajną i powtarzalną metodą generowania całkowicie przeprogramowanych i stabilnych iPSC. Metoda ta może być również stosowana na komórkach, które są trudne do zaprogramowania. W niniejszym protokole opisana jest regeneracja iPSC z materiału płodowego za pomocą aneupliodu.Przenieś zebrane kosmki kosmówkowe płodu na sterylną szalkę Petriego. Przemyj go kilka razy PBS zawierającym 1X antybiotykowy roztwór przeciwgrzybiczy. Całkowicie usunąć PBS przez pipetowanie.Dodaj 1 ml mieszanki kolagenazy do kosmków i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut lub do momentu, gdy tkanka się rozpadnie. Po inkubacji zneutralizować kolagenazę, dodając pożywkę zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej. Przenieść zawartość płytki Petriego do probówki o pojemności 15 ml.Odwirować trawienie, aby zebrać rozpadnięte kosmki i uwolnione komórki. Ostrożnie zdekantować supernatant. Płytki rozpadły kosmki wraz z uwolnionymi komórkami w kolbie hodowlanej T25 i pożywce AmnioMAX i rosną aż do uzyskania zlewającej się kultury fibroblastów.Rozbuduj fibroblasty i hodowlę, aby przygotować zapasy do wykorzystania w kolejnych eksperymentach transfekcji i charakteryzacji. Przygotuj kultury alkaliów zawierające plazmidy przeprogramowujące. Wyizoluj plazmidy za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidów Midi, zgodnie z instrukcjami producenta.Ponownie zawiesić każdą paletę w odpowiedniej objętości wody wolnej od RNAZ DNA, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mikrograma na mililitr. Sprawdź plazmidy za pomocą zestawu do trawienia restrykcyjnego ECoR1, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Trypsynizuj fibroblasty kosmówek kosmówkowych.Zneutralizować i odwirować, aby zebrać komórki. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 5 ml OPTI-MEM. Policz komórki za pomocą hemocytometru i usuń 1 milion komórek do nukleofekcji.Wirówka w celu uzyskania palety komórek. Wykonaj nukleofekcję za pomocą zestawu neukleofactor Amaxa NHDF. Przygotuj odczynnik neukleofaktora, mieszając 0,5 ml suplementu i 2,25 ml roztworu nukleofaktora dołączonego do zestawu.Usuń 100 mikrolitrów roztworu nukleofaktora i dodaj do niego 1 mikrogram każdego plazmidu. Delikatnie ponownie zawieś 1 milion komórek w tej mieszance. Przenieś zawiesinę DNA komórki do kuwety, upewniając się, że próbka pokrywa dno kuwety bez pęcherzyków powietrza.Zakręć kuwetę i włóż do uchwytu. Wybierz program nukleofaktora D-23 dla wysokiej wydajności i zastosuj. Wyjmij kuwetę z uchwytu i dodaj 1 ml pożywki AmnioMAX.Delikatnie przenieść zawartość na szalkę Petriego poddaną działaniu kultur tkankowych, używając pipety dołączonej do zestawu. Inkubuj komórki w nawilżonym inkubatorze dwutlenku węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Utrzymuj komórki w pożywce AmnioMAX przez 10 dni, a następnie przejdź na pożywkę pluripotencjjną przez 20 dni.W celu ekspansji iPSC należy ręcznie wypreparować embrionalne kolonie przypominające komórki macierzyste utworzone w naczyniu do przeprogramowywania za pomocą wyciągniętej szklanej pipety. Odpowiednio propaguj iPSC i masuj co pięć do siedmiu dni. iPCS były dodatnie dla markera pluripotencji fosfatazy alkalicznej.Wytwarzanie ciał zarodkowych poprzez cięcie kolonii iPSC na małe kawałki i posiewanie ich na szalkach Petriego o niskim przyleganiu w pożywce dla ciał zarodków. Różnicowanie ektodermy jest indukowane przez posiew ciał zarodkowych czwartego dnia w pożywce różnicującej ektodermę. Podobnie, różnicowanie mezodermy jest indukowane przez posiew ciał zarodkowych w ósmym dniu w pożywce do różnicowania mezodermy.W celu indukowania różnicowania endodermy, hoduj iPSC w monowarstwie w pożywce do różnicowania endodermy. Zmiany morfologiczne w fibroblastach monitorowano w trakcie przeprogramowywania. Wyrażają morfologię podobną do komórek nabłonkowych i tworzą zwarte kolonie.Komórki miały również stosunek wysokości jądra do cytoplazmy, typowy dla komórek pluripotencjalnych w hodowli. IPSC posiadały typ nosicielstwa 45 XO i były dodatnie dla markerów pluripotencji OCT4, NANOG, SOX 2, SSEA 4, TRA-1-81 i E-CADHERIN. Komórki wybarwiono pod kątem reprezentatywnych markerów listka rozrodczego.W związku z tym w zespole Turnera rozwijają się deficyty neurokognitywne. Neurony wywodzące się z iPSC zespołu Turnera mogą być doskonałym modelem. Jest to modelowane na płytce Petriego, aby zrozumieć nową linię normalnego dysocjacyjnego zespołu Turnera.

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-turner-syndrome-45xo

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ten protokół zawiera szczegółowe procedury izolacji komórek pochodzących z moczu od pacjentów z dystrofią mięśniową; ich skuteczne i szybkie przeprogramowanie poprzez transdukcję wirusa Sendai.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych od pacjentów z dystrofią mięśniową: skuteczne przeprogramowanie komórek pochodzących z moczu bez integracji

Ten protokół opisuje, jak neuronalne komórki progenitorowe mogą być odróżniane od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, w celu uzyskania solidnej i replikacyjnej populacji komórek nerwowych, która może być wykorzystana do identyfikacji ścieżek rozwojowych przyczyniających się do patogenezy choroby w wielu zaburzeniach neurologicznych.

Przewodnik po generowaniu i wykorzystywaniu NPC pochodzących z hiPSC do badania chorób neurologicznych

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Modelowanie rozwoju ludzkiego mózgu zostało utrudnione z powodu bezprecedensowej złożoności tkanki nabłonka nerwowego. W tym artykule opisano metodę wytwarzania organoidów mózgowych w celu wyznaczenia wczesnych zdarzeń rozwoju ludzkiego mózgu i modelowania małogłowia in vitro.

Generowanie organoidów ludzkiego mózgu pochodzących z iPSC w celu modelowania wczesnych zaburzeń neurorozwojowych

Ten protokół opisuje przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i błonowych mezenchymalnych komórek macierzystych na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste przy użyciu nieintegrującego podejścia epizodycznego w pełni zdefiniowanych chemicznie warunkach. Szczegółowo opisano procedury ekstrakcji, hodowli, przeprogramowania i charakterystyki powstałych indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą rygorystycznych metod.

Przeprogramowanie pierwotnego płynu owodniowego i komórek błonowych do pluripotencji w warunkach wolnych od ksenotypów

Opisujemy protokół przeprogramowania fibroblastów pochodzących z ludzkiej skóry w indukowane neuronalne komórki progenitorowe (iNPC), a następnie ich różnicowanie w indukowane astrocyty (iAs). Metoda ta prowadzi do szybkiego i powtarzalnego generowania iNPC i iA w dużych ilościach.

Modelowanie in vitro chorób neurologicznych z wykorzystaniem bezpośredniej konwersji z fibroblastów do neuronalnych komórek progenitorowych i różnicowania w astrocyty

Ten protokół przedstawia metodologię rekapitulacji upośledzonej neurogenezy zespołu Downa (DS) przy użyciu ludzkich iPSC DS. W protokole zidentyfikowano dwufazowy defekt cyklu komórkowego jako przyczynę upośledzenia neurogenezy w zespole Downa. Stanowi solidną platformę do zrozumienia mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw nieprawidłowej neurogenezy związanej z ZD.

In vitro Modelowanie neurogenezy zespołu Downa przy użyciu indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy protokół, który ułatwia różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w funkcjonalne astrocyty specyficzne dla przodomózgowia. Umożliwia to badania nad rolą komórek glejowych w patogenezie zaburzeń neurorozwojowych, takich jak zespół łamliwego chromosomu X, oraz modelowanie innych zaburzeń mózgu.

Wytwarzanie i charakterystyka indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych astrocytów pochodzących z komórek macierzystych, pozbawionych kruchej rybonukleoproteiny przekaźnika X

Poznaj generowanie iPSC z fibroblastów tkanek płodowych z zespołem Turnera metodą nukleofekcji plazmidów epizomalnych. Protokół obejmuje charakteryzację komórek i różnicowanie neuronalne do modelowania deficytów neurologicznych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem (Wideo) | JoVE Journal

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zespołu Turnera (45XO) Komórki płodowe do dalszego modelowania deficytów neurologicznych związanych z zespołem

Przeglądaj więcej filmów