Name: Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych (nanoostrzy) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę dostarczania kompleksu Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pomocą cząstek wirusopodobnych "nanoostrza". Ta technika umożliwia przejściową edycję genomu z minimalnym ryzykiem efektów pozatargetowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Labex Ecofect (ANR-11-LABX-0048) z Université de Lyon, w ramach programu Investissements d'Avenir (ANR-11-IDEX-0007) prowadzonego przez Francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR), Fondation FINOVI, Agence Nationale des Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) oraz przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERC-StG-LS6-805500 do E.P.R.) w ramach programów Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji.

<ol><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zuris, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationic+lipid-mediated+delivery+of+proteins+enables+efficient+protein-based+genome-editing+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome-editing in vitro and in vivo.</a> Nature Biotechnology. 33, 73-80 (2015).</li>
<li>Mangeot, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+primary+cells+and+in+vivo+using+viral-derived+Nanoblades+loaded+with+Cas9-sgRNA+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genome editing in primary cells and in vivo using viral-derived Nanoblades loaded with Cas9-sgRNA ribonucleoproteins.</a> Nature Communications. 10 (1), 45(2019).</li>
<li>Cai, Y., Bak, R. O., Mikkelsen, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+editing+by+lentiviral+protein+transduction+of+zinc-finger+and+TAL-effector+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Targeted genome editing by lentiviral protein transduction of zinc-finger and TAL-effector nucleases.</a> eLife. 3, 01911(2014).</li>
<li>Choi, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+pre-packed+with+Cas9+protein+for+safer+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentivirus pre-packed with Cas9 protein for safer gene editing.</a> Gene Therapy. 23 (7), 627-633 (2016).</li>
<li>Gee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+nanovesicles+for+packaging+of+CRISPR-Cas9+protein+and+sgRNA+to+induce+therapeutic+exon+skipping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Extracellular nanovesicles for packaging of CRISPR-Cas9 protein and sgRNA to induce therapeutic exon skipping.</a> Nature Communications. 11, 1334(2020).</li>
<li>Indikova, I., Indik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing+with+unconcentrated+lentivectors+carrying+Vpr.Prot.Cas9+protein+produced+from+RRE-containing+transcripts%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Highly efficient 'hit-and-run' genome editing with unconcentrated lentivectors carrying Vpr.Prot.Cas9 protein produced from RRE-containing transcripts.</a> Nucleic Acids Research. 48 (14), 8178-8187 (2020).</li>
<li>Lyu, P., Javidi-Parsijani, P., Atala, A., Lu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivering+Cas9%2FsgRNA+ribonucleoprotein+%28RNP%29+by+lentiviral+capsid-based+bionanoparticles+for+efficient+%27hit-and-run%27+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Delivering Cas9/sgRNA ribonucleoprotein (RNP) by lentiviral capsid-based bionanoparticles for efficient 'hit-and-run' genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47 (17), 99(2019).</li>
<li>Gheysen, D., Jacobs, E., de Foresta, F., Thiriart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+release+of+HIV-1+precursor+Pr55gag+virus-like+particles+from+recombinant+baculovirus-infected+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Assembly and release of HIV-1 precursor Pr55gag virus-like particles from recombinant baculovirus-infected insect cells.</a> Cell. 59 (1), 103-112 (1989).</li>
<li>Hanna, R. E., Doench, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+analysis+of+CRISPR-Cas+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Design and analysis of CRISPR-Cas experiments.</a> Nature Biotechnology. 38 (7), 813-823 (2020).</li>
<li>Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+a+laboratory+manual.+Third+edition%22">Molecular cloning a laboratory manual. Third edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+high-titer+lentivirus+preparations+without+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An optimized method for high-titer lentivirus preparations without ultracentrifugation.</a> Scientific Reports. 5, 13875(2015).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>O'Doherty, U., Swiggard, W. J., Malim, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+spinoculation+enhances+infection+through+virus+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding.</a> Journal of Virology. 74 (21), 10074-10080 (2000).</li>
<li>Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantitative+assessment+of+genome+editing+by+sequence+trace+decomposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition.</a> Nucleic Acids Research. 42 (22), 168(2014).</li>
<li>Bollen, Y., Post, J., Koo, B. -K., Snippert, H. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+create+state-of-the-art+genetic+model+systems%3A+strategies+for+optimal+CRISPR-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">How to create state-of-the-art genetic model systems: strategies for optimal CRISPR-mediated genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (13), 6435-6454 (2018).</li>
<li>Brinkman, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Easy+quantification+of+template-directed+CRISPR%2FCas9+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Easy quantification of template-directed CRISPR/Cas9 editing.</a> Nucleic Acids Research. 46 (10), 58(2018).</li>
<li>Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+mediated+production+of+transgenic+mice%3A+a+simple+and+highly+efficient+method+for+direct+study+of+founders%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lentiviral mediated production of transgenic mice: a simple and highly efficient method for direct study of founders.</a> Journal of Visualized Experiments. (140), e57609(2018).</li>
<li>Montagna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSV-G-enveloped+vesicles+for+traceless+delivery+of+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">VSV-G-enveloped vesicles for traceless delivery of CRISPR-Cas9.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 12, 453-462 (2018).</li>
<li>Marnef, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cohesin%2FHUSH-+and+LINC-dependent+pathway+controls+ribosomal+DNA+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">A cohesin/HUSH- and LINC-dependent pathway controls ribosomal DNA double-strand break repair.</a> Genes & Development. 33 (17-18), 1175-1190 (2019).</li>
</ol>

Philippe E. Mangeot i Emiliano P. Ricci są wymienieni jako wynalazcy patentu dotyczącego technologii Nanoblades (zgłaszający patenty: Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Ecole Normale Superieure de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, Villeurbanne Cedex; numer wniosku: WO 2017/068077 Al; status patentu: data publikacji: 27 kwietnia 2017 r.; Wszystkie aspekty manuskryptu są objęte zgłoszeniem patentowym. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Nanoostrza pozwalają na szybkie i zależne od dawki dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA RNP do linii komórkowych i komórek pierwotnych. W przeciwieństwie do klasycznej transfekcji i innych wektorów dostarczania wirusa, ale podobnie jak elektroporacja białek, Nanoblades mają tę zaletę, że przejściowo dostarczają Cas9 / sgRNA RNP w sposób wolny od transgenu. Nanoostrza oferują bardzo wszechstronną, prostą i niedrogą platformę do dostarczania białka, którą można łatwo i szybko dostosować do stale powiększającej się rodziny wariantów CRISPR. Nanoostrza mogą być wytwarzane w linii komórkowej HEK293T lub jej pochodnych. HEK293T zastosowane tutaj linie komórkowe zostały opracowane w celu maksymalizacji produkcji cząstek retrowirusowych i lentiwirusowych (patrz tabela materiałów). Jednakże, chociaż inne źródła komórek HEK293T mogą być odpowiednie, użytkownicy muszą testować i porównywać HEK293T komórek z różnych źródeł, ponieważ zaobserwowano duże różnice w produkcji cząstek w zależności od źródła HEK293T komórek. Komórki muszą być również często sprawdzane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma i pasażowane co trzy dni (klasycznie rozcieńczenie 1/8), aby uniknąć nadmiernej konfluencji, która ma negatywny wpływ na produkcję cząstek.
Komórki nie powinny być utrzymywane przez więcej niż 20 pasaży. Do hodowli komórkowych zastosowano DMEM uzupełniony glukozą, penicyliną/streptomycyną, glutaminą i 10% zdekomplementowaną płodową surowicą bydlęcą. Ze względu na to, że pochodzenie surowicy może mieć wpływ na jakość preparatu Nanoblade, przed rozpoczęciem produkcji na dużą skalę należy przebadać różne partie surowicy. Nanoostrza mogą być efektywnie wytwarzane w innych mediach, takich jak RPMI lub modyfikacje minimalnej niezbędnej pożywki bez surowicy, które mogą zastąpić DMEM następnego dnia po transfekcji. Jak wskazano poniżej, chociaż zastąpienie pożywki po transfekcji niektórymi odczynnikami do transfekcji DNA jest opcjonalne, korzystna może być modyfikacja pożywki, do której uwalniane są VLP, zwłaszcza w celu ograniczenia śladów surowicy w preparacie cząstek. Jednakże hodowla komórek w pożywce o zmniejszonej surowicy w dniu poprzedzającym transfekcję nie została jeszcze podjęta.
Jak wspomniano, nanoostrza są wytwarzane w wyniku nadekspresji mieszaniny plazmidów w komórkach produkcyjnych. Wydaje się, że nadekspresja jest wymagana dla optymalnej produkcji. Rzeczywiście, laboratorium to opracowało linię komórkową producenta, w której konstrukt wyrażający Gag-Pol został ustabilizowany przez selekcję antybiotyków; jednak system ten nie był w stanie wyprodukować znacznych ilości Nanoostrzy. Podobną obserwację poczyniono, gdy konstrukt kodujący sgRNA został stabilnie zintegrowany z genomem komórek produkcyjnych. Jak opisano w przypadku innych systemów produkcji cząstek, przydatna może być stabilna linia komórkowa wyrażająca przynajmniej niektóre konstrukty zaangażowane w produkcję nanoostrzy; Wymagałoby to jednak z pewnością przetwarzania dużych ilości supernatantu i odpowiedniej techniki oczyszczania cząstek. Powyższy protokół przedstawia preferowaną procedurę produkcji nanoostrzy, która wykorzystuje określone odczynniki do transfekcji (patrz tabela materiałów).
Chociaż odczynniki do transfekcji innych producentów również zostały przetestowane z sukcesem, zdecydowana większość wyników tej grupy z Nanoblades jest zgodna z procedurą opisaną w niniejszym dokumencie. Tanie transfekcja może być osiągnięta przy użyciu odczynników fosforanu wapnia i zapewnia dobrą wydajność produkcji; Jednak metoda ta bezwzględnie wymaga wymiany pożywki transfekcyjnej następnego dnia po transfekcji i może pozostawić pozostałości fosforanu wapnia w preparacie osadzonych cząstek. Z koniecznością wysokiego poziomu ekspresji składników Nanoblade w komórkach produkcyjnych spójna jest obserwacja, że ilość sgRNA związanych z białkiem Cas9 może być czynnikiem ograniczającym efektywną edycję genomu. Aby poprawić ładowanie sgRNA, niezależne grupy opracowały ostatnio dwa podejścia techniczne wykorzystujące wektory dostarczania białek podobne do Nanoblades. Polegają one na wykorzystaniu zależnej od polimerazy T7 cytoplazmatycznej ekspresji sgRNA6 lub poprzez dodanie retrowirusowego sygnału enkapsydacji do sekwencji sgRNA w celu pośredniczenia w wiązaniu z poliproteiną Gag6. Podejścia te mogą rzeczywiście poprawić ładowanie sgRNA w nanoostrzach, chociaż nie zostały jeszcze przetestowane.
Transdukcja komórek docelowych jest kluczowym etapem procedury. W większości unieśmiertelnionych linii komórkowych transdukcja za pomocą nanoostrzy ma niewielki lub żaden efekt cytopatyczny lub nie ma go wcale. Jednak w komórkach pierwotnych toksyczność może stanowić problem. Dlatego transdukcja musi być zoptymalizowana dla każdego typu komórki. W szczególności czas ekspozycji na nanoostrza jest ważnym czynnikiem, który należy zmodyfikować podczas optymalizacji protokołu transdukcji. W przypadku wrażliwych komórek, takich jak neurony pierwotne lub komórki szpiku kostnego, 4-6 godzin inkubacji z nanoostrzami przed wymianą pożywki pozwala na efektywne dostarczanie białka Cas9 przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności komórek. Ponadto adiuwanty, takie jak między innymi polimery kationowe, mogą znacznie poprawić wydajność transdukcji w niektórych komórkach (patrz tabela materiałów). Ważne jest, aby pamiętać, że Nanoostrza są VLP i mogą indukować odpowiedź immunogenną. Może to stanowić ograniczenie w przypadku pracy z niektórymi typami komórek pierwotnych, takimi jak makrofagi lub komórki dendrytyczne, w których inkubacja z nanoostrzami może wywołać ważne zmiany w ekspresji genów i fenotypie komórek. Jeśli makrofagi i komórki dendrytyczne pochodzą z prekursorów hematopoetycznych komórek macierzystych (takich jak komórki szpiku kostnego myszy), lepiej jest transdukować komórki za pomocą nanoostrzy, zanim zostaną w pełni zróżnicowane, aby uniknąć wywoływania odpowiedzi komórkowej przeciwko nanoostrzy. W przeciwnym razie elektroporacja białka Cas9 może stanowić realną alternatywę podczas pracy ze zróżnicowanymi komórkami odpornościowymi.
Nanoostrza mogą być używane in vivo do transdukcji mysich zygot lub embrionów w celu wytworzenia transgenicznych zwierząt. Podobnie jak klasyczne wektory retrowirusowe lub lentiwirusowe, mogą być również wstrzykiwane bezpośrednio do tkanek pochodzących od dorosłych zwierząt. Jednak nanoostrza (podobne do wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych) mogą być inaktywowane przez odpowiedź immunologiczną zwierzęcia gospodarza; W związku z tym dawka do wstrzyknięcia musi być zoptymalizowana dla każdego zastosowania. Ta odpowiedź immunologiczna może również ograniczać dystrybucję funkcjonalnych VLP do tkanek w pobliżu miejsca wstrzyknięcia. Wreszcie, w przeciwieństwie do wektorów lentiwirusowych, nanoostrza są wolne od transgenów i dostarczają Cas9 w ograniczonym czasie. W związku z tym nie można ich używać do wykonywania funkcjonalnych badań przesiewowych całego genomu, które wymagają wysokoprzepustowego sekwencjonowania sgRNA po selekcji komórek. Nanoostrza są przydatne, gdy wymagana jest szybka, zależna od dawki i wolna od transgenów edycja genomu20. Ponadto, podobnie jak w przypadku elektroporacji białek, nanoostrza prowadzą do mniejszej liczby efektów poza celem niż przedłużona ekspresja Cas9 / sgRNA poprzez transfekcję DNA lub klasyczne wektory wirusowe3. Przyszły rozwój nanoostrzy koncentruje się na wykorzystaniu wariantów Cas9 do różnych zastosowań technologicznych, takich jak edycja zasad i celowanie w RNA.

W porównaniu do innych programowalnych nukleaz, system CRISPR-Cas radykalnie uprościł i zdemokratyzował procedurę celowania i dzielenia genomu w komórkach eukariotycznych na podstawie sekwencji. Dzięki prostemu wyrażeniu sgRNA, użytkownicy mogą zaprogramować białko Cas9 (lub zoptymalizowane warianty) dla prawie każdego locus1. W tym scenariuszu dostarczanie białka Cas9 i sgRNA staje się głównym ograniczeniem podczas przeprowadzania mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. W unieśmiertelnionych komórkach sgRNA i białko Cas mogą być łatwo wyrażane z transfekowanych plazmidów, aby osiągnąć skuteczne celowanie w genom w większości komórek. Jednak konstytutywna ekspresja kompleksu Cas9 / sgRNA może zwiększyć aktywność białka Cas9 poza celem i wprowadzić niepożądane zmiany w niespecyficznych loci2. W komórkach pierwotnych transfekcja DNA może być technicznie trudna do osiągnięcia i prowadzić do słabej ekspresji lub niewielkiego odsetka transfekowanych komórek. Alternatywa dla klasycznej transfekcji DNA polega na wykorzystaniu wektorów wirusowych, które dostarczają transgen kodujący Cas9 i sgRNA lub elektroporacja rekombinowanego białka Cas9 sprzężonego z syntetycznym sgRNA. Jednak podejścia te mogą prowadzić do integracji transgenu w genomie gospodarza komórki (jak ma to miejsce w przypadku klasycznych wektorów ekspresyjnych retrowirusowych i lentiwirusowych), ograniczenia przez czynniki komórkowe i prowadzić do konstytutywnej ekspresji białka Cas9 i sgRNA.
Elektroporacja kompleksu RNP Cas9/sgRNA może przezwyciężyć większość tych problemów i doprowadzić do efektywnego i przejściowego dostarczania w komórkach pierwotnych i in vivo, a także umożliwić odpowiedź zależną od dawki. Niemniej jednak zwykle opiera się na drogim sprzęcie i odczynnikach, a także jest trudny do przeskalowania, jeśli trzeba poddać obróbce dużą liczbę komórek. Jako alternatywę dla wyżej wymienionych technik, autorzy ci opracowali "Nanoblades" - retrowirusowy wektor dostarczania białka Cas9 i sgRNA3, który jest koncepcyjnie podobny do innych systemów dostarczania białek kapsydu pochodzących z wirusa4,5,6,7,8. Nanoostrza wykorzystują naturalną zdolność poliproteiny Gag z retrowirusów do wytwarzania, gdy ulegają ekspresji samodzielnie w hodowanych komórkach, VLP, które są uwalniane w podłożu zewnątrzkomórkowym9. Poprzez fuzję białka Cas9 z C-końcowym końcem poliproteiny Gag wirusa białaczki mysiej (MLV) i koekspresję sgRNA i glikoprotein otoczki wirusa, białko Cas9 może być zamknięte w uwolnionych VLP lub Nanoostrzach. Po oczyszczeniu Nanoostrza mogą być inkubowane z komórkami docelowymi lub wstrzykiwane in vivo, aby pośredniczyć w szybkim, przejściowym i zależnym od dawki dostarczaniu kompleksu Cas9 / sgRNA RNP 3.
Nanoostrza mogą być zaprogramowane za pomocą wielu sgRNA do jednoczesnej edycji w różnych loci lub za pomocą wariantów Cas9 do wykonywania innych zastosowań, takich jak aktywacja lub represja transkrypcji specyficznej dla celu3. W przeciwieństwie do elektroporacji białek, która opiera się na ekspresji rekombinowanej, nowo opisane warianty Cas z literatury można łatwo sklonować do wektora ekspresji fuzji Gag, co czyni go wszechstronną platformą. Nanoostrza mogą być dodatkowo skompleksowane lub załadowane jednoniciowymi i dwuniciowymi oligodeoksynukleotydami (ssODN) w celu przeprowadzenia naprawy ukierunkowanej na homologię3. Produkcja nanoostrzy jest stosunkowo prosta i tania. Co więcej, Nanoblades mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez wiele dni lub w temperaturze -80 °C w przypadku długotrwałego przechowywania. Zazwyczaj nanoostrza pośredniczą w wydajnej, wolnej od transgenów edycji genomu w większości unieśmiertelnionych i pierwotnych hodowanych komórek. Jednak niektóre komórki pierwotne mogą być wrażliwe na obecność cząstek wirusa, co powoduje zwiększoną śmiertelność. Komórki wrodzonego układu odpornościowego mogą również reagować na obecność nanoostrzy (ze względu na ich wirusowe pochodzenie) i ulegać aktywacji. W takich przypadkach protokół transdukcji musi zostać zoptymalizowany, aby ograniczyć czas ekspozycji na Nanoblades i zminimalizować efekty niespecyficzne. Nanoostrza stanowią realną i łatwą do wdrożenia alternatywę dla innych dostępnych metod dostarczania CRISPR.

<table><tbody><tr><td>13,2 mL, cienkościenne probówki polipropylenowe, 14 x 89 mm - 50 szt.</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331372</td><td>Ultrawirówki do oczyszczania Nanoostrzy</td></tr><tr><td>Membrany do bibułki Amersham Protran Premium Premium, nitroceluloza</td><td></td><td>Membrana nitrocelulozowa Merck GE10600004 do ilościowego oznaczania poziomów Cas9 w oczyszczonych nanoostrzach</td><td></td></tr><tr><td>BIC-Gag-CAS9</td><td>Addgene</td><td>119942</td><td>Koduje fuzję GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Umożliwia wytwarzanie cząstek podobnych do wirusa GAG-CAS9 z komórek produkcyjnych w połączeniu z nadekspresją gRNA i odpowiednimi otoczkami</td></tr><tr><td>BICstim-Gag-dCAS9-VPR</td><td>Addgene</td><td>120922</td><td>koduje fuzję GAG-dCAS9-VPR w celu ukierunkowanej aktywacji transkrypcyjnej</td></tr><tr><td>BLADE</td><td>Addgene</td><td>134912</td><td>Pusty szkielet do klonowania sekwencji sgRNA do użycia w systemie Nanoblades</td></tr><tr><td>BsmBI-v2</td><td>New England Biolabs</td><td>R0739S</td><td>Enzym restrykcyjny do trawienia wektorów BLADE i SUPERBLADES do klonowania sgRNA</td></tr><tr><td>Cas9 (7A9-3A3) Mysie mAb (koniugat HRP) #97982</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>Przeciwciało anty-Cas9 97982S</td><td>do oznaczania ilościowego Cas9 za pomocą</td></tr><tr><td>nukleazy Cas9 dot-blot, S. pyogenes</td><td>New England Biolabs</td><td>M0386T</td><td>Rekombinowane białko Cas9 do wykorzystania jako odniesienie do bezwzględnej kwantyfikacji ilości Cas9 załadowanego w Nanoblades</td></tr><tr><td>Roztwór bromku etydyny (10 mg / ml w H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Do barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA</td></tr><tr><td>Wytrząsarki Fisherbrand Wave Motion</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-028</td><td>Stół mieszający do ponownego zawieszenia nanoostrzy po odwirowaniu</td></tr><tr><td>żeluAnalyzer</td><td></td><td></td><td>http://www.gelanalyzer.com; ilościowe określanie intensywności pasma po trawieniu</td></tr><tr><td>Gesicle Producer 293T</td><td>Producent Takara</td><td>632617</td><td>Nanoblades linia komórkowa</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, wysoka glukoza, pirogronian</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>41966052</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych dla Gesicle Cell Producer Komórki 293T</td></tr><tr><td>GoTaq G2 Polimeraza DNA</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>Polimeraza Taq do amplifikacji genomowego DNA przed testami endonukleazy</td></tr><tr><td>T7 jetPRIME Zestaw odczynników transfekcyjnych do DNA i DNA/ siRNA</td><td>Polyplus</td><td>POL114-15</td><td>Odczynnik do transfekcji do produkcji Nanoostrzy w komórkach Gesicle Producer 293T</td></tr><tr><td>Millex-AA, 0,80 &micro; m, filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLAA033SS</td><td>Filtr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed zagęszczeniem Nanoostrzy</td></tr><tr><td>Millex-GS, 0,22 i mikro; m, filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td>Filtr strzykawkowy do sterylizacji roztworu poduszki sacharozowej</td></tr><tr><td>Millex-HP, 0,45 &micro; m, polieterosulfon, filtr strzykawkowy</td><td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td>Filtr strzykawkowy do usuwania zanieczyszczeń komórkowych przed koncentracją Nanoostrzy</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji żelu DNA Monarch New</td><td>England Biolabs</td><td>T1020L</td><td>do ekstrakcji żelu DNA do oczyszczania fragmentu plazmidu pBLADES lub pSUPERBLADES po trawieniu za pomocą BsmBI</td></tr><tr><td>NEB Stabilny kompetentny E. coli (wysoka wydajność)</td><td>New England Biolabs</td><td>C3040I</td><td>Kompetentne bakterie do transformacji i amplifikacji plazmidu</td></tr><tr><td>Zestaw NucleoBond Xtra Midi do transfekcji plazmidowego DNA</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.50</td><td>Zestaw Maxipreparation do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii</td></tr><tr><td>Zestaw do ekstrakcji gDNA nukleospiny</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td>Ekstrakcja genomowego DNA z transdukowanych komórek</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid, Mini zestaw do plazmidowego DNA</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>Minizestaw do przygotowania do oczyszczania plazmidowego DNA z hodowanych bakterii</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue, Mini zestaw do DNA z komórek i tkanek</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>Zestaw do ekstrakcji genomowego DNA</td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A94471</td><td>Ultrawirówka</td></tr><tr><td>pBaEVRless</td><td>Els Verhoeyen (Inserm U1111)</td><td>Prośby osobiste należy przesyłać na adres: els.verhoyen@ens-lyon.fr</td><td>Endogenny retrowirus pawiana Rless glikoproteina opisana w Girard-Gagnepain, A. i wsp. Pseudotypowane LV otoczki pawiana przewyższają VSV-G-LV pod względem transferu genów do wcześnie stymulowanych cytokinami i spoczynkowych HSC. Krew 124, 1221&ndash; 1231 (2014)</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>Enocdes wirusa białaczki mysiej geny gag i pol</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Białko otoczki do produkcji retrowirusowych cząstek lentiwirusowych i MuLV</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200091</td><td>10X PBS do rozcieńczania w miliporowej wodzie</td></tr><tr><td>Odczynnik</td> <td>do transfekcji polibrenuMillipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>Polimer kationowy, który zwiększa efektywność transdukcji retrowirusowej w określonych komórkach ssaków. Może również umożliwić zależne od wirusa wejście oligodeoksynukleotydu (ODN) do naprawy ukierunkowanej na homologię</td></tr><tr><td>sacharozy, dla biologii molekularnej, &ge; 99,5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-5KG</td><td>Sacharoza do przygotowania poduszki do oczyszczania Nanoblade poprzez ultrawirowanie</td></tr><tr><td>SUPERBLADE5</td><td>Addgene</td><td>134913</td><td>Pusta sieć szkieletowa do klonowania sekwencji sgRNA do wykorzystania w systemie nanoostrzy (zoptymalizowana pod kątem zwiększenia wydajności edycji genomu przez Chen B i in., 2013)</td></tr> <tr><td>Substrat SuperSignal West Dura o przedłużonym czasie trwania</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34076</td><td>Ulepszony substrat HRP do chemiluminescencji (ECL) do kropek Cas9</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Rotor z łyżką wahadłową</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331362</td><td>Rotor do ultrawirowania</td></tr><tr><td>SYBR Bezpieczny barwnik żelowy DNA</td><td>ThermoFisher</td><td>Scientific S33102</td><td>Alternatywa dla bromku etydyny do barwienia żeli agarozowych i wizualizacji DNA</td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>Ligaza DNA do ligacji wektorów BLADE lub SUPERBLADES z dupleksowanymi oligonukleotydami DNA odpowiadającymi zmiennemu regionowi</td></tr><tr><td>endonukleazy sgRNA T7 I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302S</td><td>T7 I rozpoznaje i rozszczepia nieidealnie dopasowane DNA. Pozwala monitorować zakres edycji genomu w określonym locus</td></tr><tr><td>Bufor do lizy zawierający tryton</td> Bufor do lizy <td>Promega</td><td>E291A</td><td>w celu rozbicia Nanoblades i umożliwienia kwantyfikacji Cas9</td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>Do przygotowania TBST</td></tr></tbody></table>

dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego cas9/sgrna do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

System CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas zdemokratyzował edycję genomu w komórkach eukariotycznych i doprowadził do rozwoju wielu innowacyjnych zastosowań. Jednak dostarczenie białka Cas9 i jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) do komórek docelowych może być wyzwaniem technicznym. Klasyczne wektory wirusowe, takie jak te pochodzące z lentiwirusów (LV) lub wirusów związanych z adenowirusami (AAV), pozwalają na skuteczne dostarczanie transgenów kodujących białko Cas9 i związane z nim sgRNA w wielu komórkach pierwotnych i in vivo. Niemniej jednak wektory te mogą mieć wady, takie jak integracja transgenu w genomie komórki docelowej, ograniczona pojemność ładunkowa oraz długotrwała ekspresja białka Cas9 i przewodnika RNA w komórkach docelowych.
Aby przezwyciężyć niektóre z tych problemów, opracowano wektor dostarczania oparty na wirusie mysiej białaczki (MLV), który pakuje białko Cas9 i związane z nim przewodnikowe RNA w przypadku braku jakiegokolwiek kodującego transgenu. Poprzez fuzję białka Cas9 z C-końcem białka strukturalnego Gag z MLV, powstały cząsteczki wirusopodobne (VLP) załadowane białkiem Cas9 i sgRNA (nazwane "Nanoostrza"). Nanoostrza można pobrać z pożywki hodowlanej komórek produkcyjnych, oczyścić, określić ilościowo i wykorzystać do transdukcji komórek docelowych i dostarczenia aktywnego kompleksu Cas9 / sgRNA. Nanoostrza dostarczają ładunek rybonukleoprotein (RNP) przejściowo i szybko do szerokiej gamy komórek pierwotnych i nieśmiertelnych, i mogą być programowane do innych zastosowań, takich jak przejściowa aktywacja transkrypcji docelowych genów przy użyciu zmodyfikowanych białek Cas9. Nanoostrza są zdolne do edycji genomu in vivo w wątrobie dorosłych myszy, którym wstrzyknięto implanty, oraz w oocytach w celu wytworzenia zwierząt transgenicznych. Wreszcie, mogą być skompleksowane z DNA dawcy w celu "wolnej od transfekcji" naprawy ukierunkowanej na homologię. Przygotowanie nanoostrzy jest proste, stosunkowo tanie i można je łatwo przeprowadzić w każdym laboratorium biologii komórki.

Protokół przygotowania Nanoblade jest dość prosty i wymaga jedynie podstawowego sprzętu laboratoryjnego, poza dostępem do dygestorium do hodowli tkankowych, inkubatora CO2 oraz wirówki z koszem wahadłowym lub ultrawirówki. Niektóre etapy wymagają jednak szczególnej uwagi, takie jak źródło i obchodzenie się z komórkami producentami, a także warunki transdukcji. Jak pokazano na Rysunku 1A, ważne jest wysianie komórek w taki sposób, aby były one jednorodnie rozmieszczone w płytce i osiągnęły ~70-80% konfluencji w dniu transfekcji (należy unikać powstawania skupisk komórek). Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji (Rysunek 1B,C) komórki producenta utworzą syncytia, co prowadzi do powstania komórek o większym rozmiarze z wieloma jądrami. Czterdzieści godzin po transfekcji (Rysunek 1D>) większość komórek w płytce utworzy syncytia i zacznie odrywać się od powierzchni płytki.
Jest to zjawisko całkowicie normalne i jest spowodowane ekspresją glikoproteiny otoczki, która indukuje fuzję pomiędzy sąsiednimi komórkami. Po zagęszczeniu poprzez wirowanie (lub nawet bezpośrednio z supernatantu komórek producentów), ilość Cas9 załadowana do Nanoblades może zostać określona ilościowo w sposób bezwzględny za pomocą metody dot-blot na membranie nitrocelulozowej, wykorzystując rekombinowane Cas9 jako referencję (Rycina 2). Krok ten jest istotny dla ustalenia prawidłowej ilości Nanoblades do zastosowania w transdukcji komórek docelowych. Podczas przeprowadzania analizy dot-blot należy brać pod uwagę wyłącznie odczyty mieszczące się w zakresie liniowym krzywej wzorcowej. Niezależnie od ilości Cas9 obecnej w Nanoblades, niezbędne jest jednak przetestowanie wydajności edycji genomu bezpośrednio na komórkach docelowych przy użyciu testu endonukleazy T7 (Rycina 3) lub sekwencjonowania metodą Sangera.
Jak pokazano na Rysunku 3, wydajność Nanoblades może różnić się między partiami, choć zazwyczaj jest ona skorelowana z ilością Cas9. W przykładzie przedstawionym na Rysunku 3, partia z linii 1 prowadzi do 20% całkowitej wydajności edycji, podczas gdy partia z linii 3 prowadzi do 60% wydajności. W takim przypadku możliwe jest zwiększenie objętości użytych Nanoblades z partii 1, aby osiągnąć wydajność edycji podobną do tej z partii 3. Rysunek 4 przedstawia maksymalną wydajność edycji uzyskaną przy użyciu Nanoblades w różnych typach komórek pierwotnych. Należy zauważyć, że wydajność może różnić się w zależności od sekwencji użytego sgRNA oraz dostępności celu.
<img alt="Obrazy z mikroskopii hodowli komórkowych przedstawiające zmienność gęstości komórek w skali 400 μm, analiza eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Morfologia komórek producentów podczas produkcji Nanoblade. (A) Komórki HEK293T przy 70-80% konfluencji 24 h po wysianiu. (B i C) Morfologia komórek HEK293T 24 h po transfekcji. (D) Morfologia komórek HEK293T 40 h po transfekcji. Paski skali = 400 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza dot blot, krzywa kalibracyjna dla stężenia Cas9 na wykresie, wykres słupkowy dawki nanoblade Cas9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Ilościowe oznaczenie załadunku Cas9 w Nanoblades metodą dot-blot. (A) Rekombinowane Cas9 lub próbki Nanoblade skoncentrowane 100x (poprzez ultrawirowanie) (#1, #2 i #3) są rozcieńczane sekwencyjnie 2-krotnie i nanoszone na membranę nitrocelulozową przed inkubacją z przeciwciałami anty-Cas9 sprzężonymi z HRP. Sygnał jest wykrywany za pomocą wzmocnionej chemiluminescencji. (B) Sygnał chemiluminescencji jest rejestrowany i ilościowo oznaczany dla rozcieńczeń rekombinowanego Cas9, a natężenie sygnału jest naniesione na wykres w zależności od znanej ilości Cas9 naniesionej na membranę nitrocelulozową. Krzywa regresji jest obliczana dla rozcieńczeń mieszczących się w zakresie liniowym (patrz. niebieskie krzyżyki), z wyłączeniem wszystkich stężeń poza zakresem liniowym (patrz. czerwone krzyżyki). (C) Stężenie Cas9 (nM) w każdej preparacji Nanoblade zostało wyznaczone metodą ekstrapolacji przy użyciu równania regresji liniowej otrzymanego w (B). W tym celu ważne jest, aby użyć wyłącznie ilościowo oznaczonego sygnału z rozcieńczeń Nanoblade, które mieszczą się w zakresie liniowym krzywej regresji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza endonukleazą T7 i analiza Western blot; wydajność edycji DNA i detekcja białek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Monitorowanie wydajności edycji po transdukcji. (A) Analiza endonukleazą T7 mierząca wydajność cięcia w komórkach traktowanych Nanoblades. Komórki transdukowane Nanoblades celującymi w gen EMX1 zostały poddane analizie endonukleazą T7. Ścieżka 1: preparat Nanoblade partia nr 1 (wydajność cięcia 20%); Ścieżka 2: komórki kontrolne; Ścieżka 3: preparat Nanoblade partia nr 2 (wydajność cięcia 60%). (B) Knock-in sekwencji znacznika Flag w otwartej ramce odczytu DDX3. Skoncentrowane Nanoblades zaprogramowane z sgRNA celującym w locus DDX3 zostały wytworzone z różnych klonów HEK293T (#1, #2) i połączone z rosnącymi dawkami matrycy ssODN Flag-DDX3, a otrzymane kompleksy wykorzystano do transdukcji docelowych komórek HEK293T. Po transdukcji komórki hodowano przez trzy dni przed ich zebraniem w celu ekstrakcji DNA genomowego i białek całkowitych. Białka Flag-DDX3 zostały immunoprecypitowane przy użyciu kulek agarozowych anty-Flag, a następnie odzyskane białka poddano analizie western-blot z użyciem przeciwciała anty-Flag (panel górny). Celowana insercja znacznika Flag w locus Ddx3 była również badana metodą PCR z użyciem starterów flankujących miejsce insercji (panel środkowy) lub startera forward rozpoznającego sekwencję znacznika Flag i startera reverse specyficznego dla locus Ddx3 poniżej miejsca insercji Flag (panel dolny). Skróty: EMX1 = Empty Spiracles Homeobox 1; DDX3 = DEAD-box RNA helicase 3; PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy; ODN = oligodeoksynukleotyd; ssODN = jednoniciowy ODN; sgRNA = pojedyncze przewodniczące RNA; IP = immunoprecypitacja. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Tabela wydajności edycji genów, typy komórek, schemat, nanoblasty, badanie na myszach z immunosupresją." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Wydajność edycji uzyskana w różnych typach komórek pierwotnych przy użyciu Nanoblades. Skróty: PBL = limfocyt krwi obwodowej; IL = interleukina; CD = klaster różnicowania; iPSC = indukowana pluripotencjalna komórka macierzysta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Opracowaliśmy prosty i tani protokół ładowania kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/jednoprowadnicowego RNA (sgRNA) w cząsteczkach wirusopodobnych. Cząstki te, zwane "nanoostrzami", umożliwiają skuteczne dostarczanie kompleksu Cas9/sgRNA w komórkach unieśmiertelnionych i pierwotnych, a także in vivo.

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

Nanoostrza umożliwiły szybkie, wydajne i zależne od dawki dostarczanie kompleksu Cas9 i prowadzącego RNA, zarówno w komórkach unieśmiertelnionych, jak i pierwotnych, przy braku antytransgenu. Główną zaletą tej metody jest to, że nanoostrza są łatwe i stosunkowo niedrogie w przygotowaniu. Mogą one dostarczać kompleks Cas9 i kierować RNA w sposób zależny od dawki i przejściowy, ograniczając w ten sposób efekty niezgodne z celem, jednocześnie umożliwiając wydajną edycję genomu.Protokół przygotowania nanoostrzy jest bardzo prosty. Jednak jakość komórek produkcyjnych, a także ich pochodzenie i wysiew przed transfekcją mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokich plonów cząstek wirusopodobnych. Procedurę zademonstruje Laura Guiguettaz, inżynier z mojego laboratorium.Pierwszego dnia wysiewaj od 3,5 do 4 milionów komórek HEK 293T w 10 mililitrach zmodyfikowanego DMEM i streptomycyny penicyliny w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną 70% konfluencji, zastąp pożywkę świeżym DMEM i użyj pipety P-1000, aby dodać roztwór odczynnika do transfekcji w sposób kroplowy. Rozpocznij zbieranie nanoostrzy czwartego dnia, zbierając supernatant pożywki hodowlanej za pomocą 10-mililitrowej pipety.To normalne, że na tym etapie kolor pożywki hodowlanej zmienia kolor na żółty. Odwirować zebrany supernatant w temperaturze 500 G przez pięć minut w celu usunięcia resztek komórkowych i odzyskać dziewięć mililitrów supernatantu bez naruszania osadu komórkowego. Granulować nanoostrza w ultrawirówce o temperaturze 209, 490 G przez 75 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po odwirowaniu powoli zassać pożywkę i ponownie zawiesić biały granulat ze 100 mikrolitrami zimnego PBS. Przykryj probówkę parafilmem i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Następnie, ponownie zawiesić granulkę, pipetując w górę i w dół.Przygotuj 10% roztwór sacharozy w PBS i przefiltruj go przez 0,2-mikrometrowy filtr strzykawkowy. Umieść 2,5 mililitra 10% sacharozy w probówce ultrawirówkowej. Przechyl probówkę i powoli dodaj dziewięć mililitrów próbki zawierającej VLP za pomocą pipety o niskiej prędkości, stopniowo podnosząc probówkę do pozycji pionowej.Umieścić probówki w wiadrach wirnika, a następnie odwirować próbki o stężeniu 209,490 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usuń supernatant i umieść probówkę do góry nogami na bibułce, aby usunąć pozostały płyn. Dla celów dydaktycznych i lepszej wizualizacji osadu wirusowego można przygotować nanoostrza wypełnione białkiem fluorescencyjnym mCherry.Po minucie dodaj 100 mikrolitrów PBS. Umieścić probówkę z osłoną parafilmową w uchwycie probówki na stole mieszalnym na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę iw dół. Przygotować bufor rozcieńczający, dodając jedną objętość buforu do lizy zawierającego niejonowy środek powierzchniowo czynny w czterech objętościach PBS.Rozcieńczyć dwa mikrolitry skoncentrowanych nanoostrzy w 50 mikrolitrach buforu rozcieńczającego i krótko odwirować. Przenieść 25 mikrolitrów mieszaniny do nowej probówki zawierającej 25 mikrolitrów buforu rozcieńczającego i powtórzyć procedurę, aby uzyskać sześć probówek rozcieńczeń nanoostrzy. Wykonaj standardową kontrolę, dodając dwa mikrolitry rekombinowanej nukleazy Cas9 do 50 mikrolitrów buforu rozcieńczającego, krótko go zwirować i wykonać osiem seryjnych rozcieńczeń.Ostrożnie nanieść 2,5 mikrolitra każdego rozcieńczenia VLP i 2,5 mikrolitra każdego wzorca na membranę nitrocelulozową za pomocą wielokanałowej pipety. Po wchłonięciu cząstek zablokuj membranę TBST uzupełnionym 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku na 45 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć TBST i inkubuj błonę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z przeciwciałem peroksydazy chrzanowej Cas9.Umyj membranę trzykrotnie za pomocą TBST i zwizualizuj sygnał za pomocą ulepszonego zestawu substratów chemiluminescencyjnych. W celu transdukcji komórek docelowych za pomocą nanoostrzy należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami pożywki zawierającej oczyszczone nanoostrza. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji komórek wymień pożywkę na normalną ilość świeżej pożywki.W protokole komórki zostały wysiane w celu jednorodnej dystrybucji z 70 do 80% konfluencją w dniu transfekcji, tworząc syncytię prowadzącą do większych komórek z wieloma jądrami po 24 godzinach. 40 godzin po transfekcji większość komórek utworzyła syncytię i zaczęła odłączać się od płytki. Ilość Cas9 załadowanego w nanoostrzach określono ilościowo za pomocą kropki na membranie nitrocelulozowej, która wykazywała zwiększoną chemiluminescencję w porównaniu z referencyjnym rekombinowanym Cas9.Wykreślono krzywą kalibracyjną dla ilościowo określonego sygnału chemiluminescencji dla rekombinowanych rozcieńczeń Cas9 w stosunku do znanej ilości Cas9. Następnie zmapowano stężenie białka Cas9 w każdym preparacie nanoostrzy, ujawniając różne stężenia Cas9 w zależności od partii. Test endonukleazy T7 wykazał, że wydajność nanoostrzy może się różnić w zależności od partii.Na przykład zaobserwowano, że jedna partia ma 20% ogólną wydajność edycji, podczas gdy druga partia wykazuje 60% wydajności. Białka Flag-DDX3 poddano immunoprecypitacji za pomocą antyflagowych kulek agarozowych, a następnie analizie Western blot odzyskanych białek przy użyciu przeciwciała antyflagowego. Ukierunkowana na miejsce insercja znacznika flagi w locus DDX3 została również przetestowana za pomocą PCR przy użyciu starterów otaczających miejsce wprowadzenia lub starterów do przodu i do tyłu specyficznych dla locus DDX3 poniżej miejsca wprowadzenia flagi.Ważne jest, aby umieścić komórki w prawidłowym zbiegu i uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek. Po odwirowaniu nanoostrzy ważne jest również ponowne zawieszenie osadu i uzyskanie jednorodnej próbki skoncentrowanych cząstek wirusa. Nanoostrza umożliwiły naukowcom zbadanie mechanizmu naprawy pęknięć dwuniciowego DNA poprzez dostarczanie kompleksu Cas9 i kierowanego RNA do określonych loci genomowych w szybki i skoordynowany sposób.Umożliwiły one również inaktywację długich, niekodujących RNA w pierwotnych komórkach wrodzonego układu odpornościowego w celu zbadania ich roli.

delivery-cas9sgrna-ribonucleoprotein-complex-immortalized-primary

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

Ten film demonstruje technikę dostarczania kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9-sgRNA do komórek docelowych w celu edycji genomu za pomocą nanoostrzy. Nanoostrza to cząsteczki wirusopodobne pozbawione zdolności do namnażania się i infekowania sąsiednich komórek, dlatego są bardzo przydatne do szybkiego i zależnego od dawki transportu bio- i nanomateriałów.

Dostarczanie kwasu nukleinowego w oparciu o nanoostrza: technika dostarczania kompleksu Cas9-sgRNA do komórek docelowych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych

System CRISPR/Cas9 oferuje potencjał, aby uczynić ukierunkowaną edycję genomu dostępną i przystępną cenowo dla społeczności naukowej. Protokół ten ma na celu zademonstrowanie, jak tworzyć wirusy, które znokautują interesujący nas gen za pomocą systemu CRISPR/Cas9, a następnie wstrzykną je stereotaktycznie do mózgu dorosłej myszy.

Projektowanie, pakowanie i dostarczanie wysokomianowych CRISPR Retro i lentiwirusów poprzez iniekcję stereotaktyczną

Opisujemy strategię produkcji wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy (IDLV) jako nośników dostarczania CRISPR/Cas9 do komórek. Dzięki zdolności do pośredniczenia w szybkiej i niezawodnej edycji genów w komórkach, IDLV stanowią bezpieczniejszą i równie skuteczną platformę wektorową do dostarczania genów w porównaniu z wektorami kompetentnymi do integrazy.

Protokół wytwarzania wektorów lentiwirusowych z niedoborem integrazy do nokautu genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w dzielących się komórkach

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy protokół genetycznej modyfikacji pierwotnych lub rozszerzonych komórek NK (ang. human natural killer) za pomocą rybonukleoprotein Cas9 (Cas9/RNPs). Korzystając z tego protokołu, wygenerowaliśmy ludzkie komórki NK z niedoborem receptora 2 czynnika wzrostu b (TGFBR2) i fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1).

Generowanie nokautujących pierwotnych i ekspandowanych ludzkich komórek NK przy użyciu rybonukleoprotein Cas9

Tradycyjne techniki nadekspresji oparte na cDNA mają ograniczone zastosowanie do nadekspresji długich, niekodujących RNA, ze względu na ich liczne formy splicingowe z potencjalną funkcjonalnością. W niniejszym przeglądzie opisano protokół wykorzystujący technologię CRISPR do nadekspresji wielu wariantów splicingu długiego, niekodującego RNA.

Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Ukierunkowana edycja epigenomu DNA reprezentuje potężne podejście terapeutyczne. Protokół ten opisuje produkcję, oczyszczanie i koncentrację wektorów lentiwirusowych typu "wszystko w jednym" zawierających transgen CRISPR-dCas9-DNMT3A do zastosowań w edycji epigenomu w neuronach pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC).

Platforma wektorów lentiwirusowych do efektywnego dostarczania narzędzi do edycji epigenomu do modeli chorób pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Genom wirusa grypy typu A składa się z ośmiu oddzielnych kompleksów RNA i białek, zwanych wirusowymi kompleksami rybonukleoproteinowymi (vRNP). Niniejsza praca opisuje oczyszczanie vRNP wirusa grypy A w gradiencie glicerolu oraz ich wizualizację za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Oczyszczanie i wizualizacja kompleksów rybonukleoprotein wirusa grypy A

Poznaj metodę dostarczania kompleksu Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pomocą cząstek wirusopodobnych "nanoostrza". Ta technika umożliwia przejściową edycję genomu z minimalnym ryzykiem efektów pozatargetowych.

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych (nanoostrzy) (Wideo) | JoVE Journal

Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

Przeglądaj więcej filmów