Dostarczanie kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9/sgRNA do komórek unieśmiertelnionych i pierwotnych za pośrednictwem cząstek wirusopodobnych ("nanoostrzy")

Nanoostrza umożliwiły szybkie, wydajne i zależne od dawki dostarczanie kompleksu Cas9 i prowadzącego RNA, zarówno w komórkach unieśmiertelnionych, jak i pierwotnych, przy braku antytransgenu. Główną zaletą tej metody jest to, że nanoostrza są łatwe i stosunkowo niedrogie w przygotowaniu. Mogą one dostarczać kompleks Cas9 i kierować RNA w sposób zależny od dawki i przejściowy, ograniczając w ten sposób efekty niezgodne z celem, jednocześnie umożliwiając wydajną edycję genomu.

Protokół przygotowania nanoostrzy jest bardzo prosty. Jednak jakość komórek produkcyjnych, a także ich pochodzenie i wysiew przed transfekcją mają zasadnicze znaczenie dla uzyskania wysokich plonów cząstek wirusopodobnych. Procedurę zademonstruje Laura Guiguettaz, inżynier z mojego laboratorium.

Pierwszego dnia wysiewaj od 3,5 do 4 milionów komórek HEK 293T w 10 mililitrach zmodyfikowanego DMEM i streptomycyny penicyliny w 10-centymetrowym naczyniu do hodowli komórek. Po 24 godzinach, gdy komórki osiągną 70% konfluencji, zastąp pożywkę świeżym DMEM i użyj pipety P-1000, aby dodać roztwór odczynnika do transfekcji w sposób kroplowy. Rozpocznij zbieranie nanoostrzy czwartego dnia, zbierając supernatant pożywki hodowlanej za pomocą 10-mililitrowej pipety.

To normalne, że na tym etapie kolor pożywki hodowlanej zmienia kolor na żółty. Odwirować zebrany supernatant w temperaturze 500 G przez pięć minut w celu usunięcia resztek komórkowych i odzyskać dziewięć mililitrów supernatantu bez naruszania osadu komórkowego. Granulować nanoostrza w ultrawirówce o temperaturze 209, 490 G przez 75 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po odwirowaniu powoli zassać pożywkę i ponownie zawiesić biały granulat ze 100 mikrolitrami zimnego PBS. Przykryj probówkę parafilmem i inkubuj przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, delikatnie mieszając. Następnie, ponownie zawiesić granulkę, pipetując w górę i w dół.

Przygotuj 10% roztwór sacharozy w PBS i przefiltruj go przez 0,2-mikrometrowy filtr strzykawkowy. Umieść 2,5 mililitra 10% sacharozy w probówce ultrawirówkowej. Przechyl probówkę i powoli dodaj dziewięć mililitrów próbki zawierającej VLP za pomocą pipety o niskiej prędkości, stopniowo podnosząc probówkę do pozycji pionowej.

Umieścić probówki w wiadrach wirnika, a następnie odwirować próbki o stężeniu 209,490 G przez 90 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usuń supernatant i umieść probówkę do góry nogami na bibułce, aby usunąć pozostały płyn. Dla celów dydaktycznych i lepszej wizualizacji osadu wirusowego można przygotować nanoostrza wypełnione białkiem fluorescencyjnym mCherry.

Po minucie dodaj 100 mikrolitrów PBS. Umieścić probówkę z osłoną parafilmową w uchwycie probówki na stole mieszalnym na jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ponownie zawiesić osad, pipetując w górę iw dół. Przygotować bufor rozcieńczający, dodając jedną objętość buforu do lizy zawierającego niejonowy środek powierzchniowo czynny w czterech objętościach PBS.

Rozcieńczyć dwa mikrolitry skoncentrowanych nanoostrzy w 50 mikrolitrach buforu rozcieńczającego i krótko odwirować. Przenieść 25 mikrolitrów mieszaniny do nowej probówki zawierającej 25 mikrolitrów buforu rozcieńczającego i powtórzyć procedurę, aby uzyskać sześć probówek rozcieńczeń nanoostrzy. Wykonaj standardową kontrolę, dodając dwa mikrolitry rekombinowanej nukleazy Cas9 do 50 mikrolitrów buforu rozcieńczającego, krótko go zwirować i wykonać osiem seryjnych rozcieńczeń.

Ostrożnie nanieść 2,5 mikrolitra każdego rozcieńczenia VLP i 2,5 mikrolitra każdego wzorca na membranę nitrocelulozową za pomocą wielokanałowej pipety. Po wchłonięciu cząstek zablokuj membranę TBST uzupełnionym 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku na 45 minut w temperaturze pokojowej. Odrzuć TBST i inkubuj błonę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza z przeciwciałem peroksydazy chrzanowej Cas9.

Umyj membranę trzykrotnie za pomocą TBST i zwizualizuj sygnał za pomocą ulepszonego zestawu substratów chemiluminescencyjnych. W celu transdukcji komórek docelowych za pomocą nanoostrzy należy zastąpić pożywkę do hodowli komórkowej 500 mikrolitrami pożywki zawierającej oczyszczone nanoostrza. Po czterech do sześciu godzinach inkubacji komórek wymień pożywkę na normalną ilość świeżej pożywki.

W protokole komórki zostały wysiane w celu jednorodnej dystrybucji z 70 do 80% konfluencją w dniu transfekcji, tworząc syncytię prowadzącą do większych komórek z wieloma jądrami po 24 godzinach. 40 godzin po transfekcji większość komórek utworzyła syncytię i zaczęła odłączać się od płytki. Ilość Cas9 załadowanego w nanoostrzach określono ilościowo za pomocą kropki na membranie nitrocelulozowej, która wykazywała zwiększoną chemiluminescencję w porównaniu z referencyjnym rekombinowanym Cas9.

Wykreślono krzywą kalibracyjną dla ilościowo określonego sygnału chemiluminescencji dla rekombinowanych rozcieńczeń Cas9 w stosunku do znanej ilości Cas9. Następnie zmapowano stężenie białka Cas9 w każdym preparacie nanoostrzy, ujawniając różne stężenia Cas9 w zależności od partii. Test endonukleazy T7 wykazał, że wydajność nanoostrzy może się różnić w zależności od partii.

Na przykład zaobserwowano, że jedna partia ma 20% ogólną wydajność edycji, podczas gdy druga partia wykazuje 60% wydajności. Białka Flag-DDX3 poddano immunoprecypitacji za pomocą antyflagowych kulek agarozowych, a następnie analizie Western blot odzyskanych białek przy użyciu przeciwciała antyflagowego. Ukierunkowana na miejsce insercja znacznika flagi w locus DDX3 została również przetestowana za pomocą PCR przy użyciu starterów otaczających miejsce wprowadzenia lub starterów do przodu i do tyłu specyficznych dla locus DDX3 poniżej miejsca wprowadzenia flagi.

Ważne jest, aby umieścić komórki w prawidłowym zbiegu i uzyskać równomierne rozmieszczenie komórek. Po odwirowaniu nanoostrzy ważne jest również ponowne zawieszenie osadu i uzyskanie jednorodnej próbki skoncentrowanych cząstek wirusa. Nanoostrza umożliwiły naukowcom zbadanie mechanizmu naprawy pęknięć dwuniciowego DNA poprzez dostarczanie kompleksu Cas9 i kierowanego RNA do określonych loci genomowych w szybki i skoordynowany sposób.

Umożliwiły one również inaktywację długich, niekodujących RNA w pierwotnych komórkach wrodzonego układu odpornościowego w celu zbadania ich roli.