Druk 3D mikronośników hydrożelowych in vitro metodą natryskiwania naprzemienną siłą lepko-inepunktualną
21 kwietnia 2021
Prezentowana tutaj jest łagodna technika druku 3D napędzana zmiennymi siłami lepko-inercyjnymi, aby umożliwić budowę mikronośników hydrożelowych. Dysze domowej roboty oferują elastyczność, umożliwiając łatwą wymianę dla różnych materiałów i średnic. Można uzyskać mikronośniki wiążące komórki o średnicy 50-500 μm i pobrać je do dalszej hodowli.
Oferujemy łagodny proces biodruku do przygotowania mikronośników o dobrej sterowalności i biokompatybilności. Po enkapsulacji przez komórki, nośniki mogą być również wykorzystywane w ekspansji komórek in vitro i funkcjonalnej budowie mikrotkanek. Ograniczone przemieszczenie, a nie silne siły w podobnych warunkach, działają na dyszę podczas procesu drukowania, zachowując w maksymalnym stopniu pierwotne właściwości fizyczne/chemiczne biotuszu.
Oprócz konwencjonalnych mikronośników, jednostki z wewnętrznym rozkładem komórek lub strukturami kapsułkowymi otoczonymi trytozyną mogą być konstruowane i stosowane do składania różnych struktur tkankowych. W celu przygotowania dyszy należy załadować szklane mikropipety na ściągacz zgodnie z instrukcją producenta i ustawić parametry ciągnięcia dla ściągacza. Za pomocą mikrokuźni odciąć dyszę o wyznaczonej średnicy, aby uzyskać określoną średnicę końcówki do eksperymentu, a następnie sterylizować dyszę w alkoholu przez pięć minut.
Następnie trzykrotnie przepłucz dyszę sterylną wodą, aby usunąć resztki alkoholu. Aby przygotować hydrożelowy biotusz, rozcieńczyć wysterylizowany 4% roztwór podstawowy alginianu sodu w 0,9% chlorku sodu w stężeniach wagowych 0,5, 1, 1,5 i 2%. W celu utworzenia mikrokropelek załaduj pięć mililitrów biotuszu do jednorazowej sterylnej strzykawki i zainstaluj strzykawkę na pompie strzykawkowej.
Za pomocą węża o średnicy wewnętrznej jednego milimetra połącz strzykawkę i dyszę drukarską. Dokręć mocującą, aby zamocować dyszę na miejscu i szybko wciśnij pompę strzykawkową, aby załadować biotusz do dyszy. Ustaw parametry generatora sygnału i ustaw ścieżkę ruchu i tryb wyzwalania wibracji, aby spadały na żądanie.
Następnie wydrukuj kropelki zgodnie z wcześniej zaprojektowanymi wzorami. W celu utworzenia mikronośników dodaj pięć mililitrów roztworu sieciującego do szalki Petriego i umieść naczynie pod dyszą drukującą jako podłoże. Po wydrukowaniu należy usieciować mikronośniki przez trzy minuty przed przeniesieniem zawiesiny mikronośnika do probówki wirówkowej.
Następnie należy wzbogacić mikronośniki przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w odpowiedniej pożywce hodowlanej w ilości około 600 mikronośników na mililitr. Przed ich inokulacją zastąp supernatant hodowli komórkowej A549 pięcioma mililitrami pożywki bez surowicy uzupełnionej 10-mikromolowym zielonym barwnikiem CMFDA do śledzenia komórek na 30-minutową inkubację w inkubatorze do hodowli komórkowych. Pod koniec inkubacji zastąp roztwór barwnika świeżą pożywką i ponownie zawieś komórki o gęstości 1,6 razy 10 do sześciu komórek na mililitr pożywki.
Dodaj jeden mililitr zawiesiny mikronośnika do komórek i jeden mililitr komórek A549 do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej o niskiej przyczepności. Umieścić płytkę na wytrząsarce w inkubatorze do hodowli komórkowych z prędkością 30 obrotów na minutę. Pod koniec inkubacji wyjąć płytkę z wytrząsarki i pozostawić mikronośniki do osiadania na 30 minut przed obserwacją i pomiarem dyszy drukującej, szalek Petriego i komórek zaszczepionych mikronośnikami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w jasnym polu i konfokalnej
.Za pomocą dyszy z końcówką o długości 30 mikrometrów można stabilnie drukować na szalkach Petriego wiele rodzajów biotuszu, w tym PBS, 1,5% alginian i 1,5% żelatynę. Wraz ze wzrostem lepkości farb proces drukowania staje się coraz trudniejszy i potrzebne są większe siły napędowe do uzyskania większych kropel. Parametry drukowania można ustawić tak, aby drukowały kropelki w określonych układach 2D, jak zaobserwowano w tym eksperymencie drukowania.
Średnica końcówki dyszy ma bezpośredni wpływ na wielkość mikronośnika, który można wydrukować. Jak zaobserwowano na tych obrazach jasnego pola i konfokalnych, komórki A549 przylegają do mikronośników alginianowo-kolagenowych po dwóch dniach hodowli. Po sześciu dniach komórki A549 prawie całkowicie pokrywają powierzchnię mikronośnika.
Po tej procedurze pokryliśmy powierzchnię mikronośnika chitozanem i użyliśmy glukonianu do rozpuszczenia żelu alginianowego, aby utworzyć torbielowatą strukturę, którą można zastosować do budowy pustych struktur, takich jak pęcherzyki płucne. Proces drukowania mikronośników jest dość delikatny, dlatego metoda ta może być szeroko stosowana do drukowania mikronośników zawierających komórki.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia łagodną technikę biodruku służącą do tworzenia mikronośników hydrożelowych o doskonałej sterowalności i biokompatybilności. Proces ten umożliwia enkapsulację komórek wewnątrz mikronośników, które mogą być wykorzystywane do ekspansji komórek in vitro oraz konstrukcji funkcjonalnych mikrotkanek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biodruk
- Hodowla komórkowa
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Mikronośniki są niezbędne w zastosowaniach związanych z hodowlą komórek i inżynierią tkankową.
- Konwencjonalne metody mogą pogarszać właściwości fizyczne i chemiczne biotuszów.
- Istnieje zapotrzebowanie na ulepszone techniki, które utrzymają żywotność i funkcjonalność komórek.
- Niniejsze badanie analizuje nowatorskie podejście z wykorzystaniem łagodnych sił drukowania.
Cel badania
- Opracowanie metody biodruku do produkcji mikronośników.
- Zapewnienie wysokiej biokompatybilności i kontroli podczas procesu drukowania.
- Ułatwienie enkapsulacji komórek do późniejszych zastosowań.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie własnoręcznie wykonanych dysz w celu zapewnienia elastyczności w doborze materiału i średnicy.
- Proces drukowania sterowany przez naprzemienne siły lepkościowe i bezwładnościowe.
- Przygotowanie dysz przy użyciu szklanych mikropipet oraz technik mikrokucia.
- Sterylizacja dysz w celu zapewnienia czystego środowiska pracy.
Główne wyniki
- Pomyślnie wyprodukowano mikronośniki o średnicach w zakresie 50-500 µm.
- Proces drukowania pozwolił na zachowanie pierwotnych właściwości bio-tuszu.
- Osiągnięto wewnętrzną dystrybucję komórek oraz struktur enkapsulowanych.
- Metoda ta umożliwia montaż różnych struktur tkankowych.
Wnioski
- Łagodna technika biodruku jest skuteczna w tworzeniu funkcjonalnych mikronośników.
- Stanowi ona obiecujące podejście do zastosowań in vitro w namnażaniu komórek i inżynierii tkankowej.
- Przyszłe badania mogą zgłębić zastosowanie tych mikronośników w złożonych modelach tkankowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wtryskiwanie z naprzemienną siłą lepkościowo-bezwładnościową umożliwia precyzyjne wytwarzanie mikronośników hydrożelowych do skalowalnej ekspansji komórek o wysokiej żywotności oraz modułów inżynierii tkankowej. Metoda ta rozwiązuje kluczowe problemy w produkcji mikronośników, oferując elastyczną kontrolę dyszy, delikatne przetwarzanie oraz kompatybilność z różnorodnymi materiałami bioaktywnymi. Podejście to wspiera intensywne wczesne etapy odkrywania, opracowywanie testów oraz przepływy pracy translacyjne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym.&Portfele D.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia kontrolowane tworzenie mikrośrodowisk do funkcjonalnych testów komórkowych i badania szlaków sygnałowych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zachowanie integralności bioatramentu i żywotności komórek podczas wytwarzania mikronośników.
- Zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celu dzięki powtarzalnym modelom opartym na mikronośnikach.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje standaryzowane, biokompatybilne mikronośniki do późniejszego wysokoprzepustowego przesiewania i oceny związków.
- Poprawia powtarzalność i skalowalność testów poprzez umożliwienie precyzyjnej kontroli wielkości i składu mikronośników.
- Umożliwia elastyczne dostosowanie systemów mikronośników do różnych platform analitycznych i potrzeb przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wspiera konstrukcję modułów istotnych dla tkanki oraz struktur pustych w kształcie rurek do modelowania chorób i badań nad biomarkerami.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej, umożliwiając łagodne enkapsulowanie funkcjonalnych komórek.
- Zmniejsza ryzyko niepowodzenia biologicznego na późnym etapie poprzez zachowanie właściwości komórek i macierzy podczas procesu wytwarzania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda wytwarzania mikronośników integruje procesy od wczesnej fazy odkryć, poprzez rozwój testów, aż po badania translacyjne, wspierając skalowalną ekspansję komórek oraz montaż modułów tkankowych.
- Biologia odkrywcza: Zapewnia platformę do testowania hipotez i analizy szlaków sygnałowych z wykorzystaniem zaprojektowanych mikrośrodowisk.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe systemy mikronośników do niezawodnego przesiewania związków.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar adhezji komórek, proliferacji oraz jednorodności mikronośników.
- Badania translacyjne: Jest zgodne z wymaganiami modeli przedklinicznych dla inżynierii tkankowej i systemów istotnych w przebiegu chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną i powtarzalną możliwość zastosowania dla różnych typów komórek i materiałów bioaktywnych w ramach programów B&R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i walidację celu poprzez zachowanie funkcji komórek i macierzy.
- Wartość operacyjna: Usprawnia produkcję mikronośników dzięki elastycznej wymianie dysz i łagodnym warunkom przetwarzania.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji typu go/no-go i zmniejsza ryzyko późnoetapowej utraty biologicznej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój projektów translacyjnych i odkrywczych opartych na komórkach.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie biodruku, mikrofluidyki oraz technik hodowli komórkowych.
- Wymagany jest dostęp do precyzyjnych pomp strzykawkowych, generatorów sygnałów oraz narzędzi do sterylizacji i przygotowania dysz.
- Niezbędna jest międzyzespołowa standaryzacja parametrów drukowania i składów bioatramentów.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do różnych typów komórek i systemów hydrożelowych po odpowiedniej optymalizacji.
- W celu uzyskania optymalnych wyników lepkość druku oraz średnica dyszy muszą być dopasowane do właściwości bioatramentu.
