Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania w sposób zintegrowany dla analizy pojedynczych cząstek w cryo-EM w celu uzyskania rekonstrukcji próbki biologicznej w wysokiej rozdzielczości. Ramy te umożliwiają stworzenie przepływu pracy przetwarzania przy użyciu kilku pakietów przetwarzania obrazu, sprzyjając interoperacyjności, identyfikowalności, odtwarzalności i połączeniu informacji przekazywanych różnymi metodami w celu wygenerowania dokładniejszych danych wyjściowych. Scipion stale się rozwija, dołączając nowe metody i pakiety.

Co więcej, została rozszerzona o tomografię krioelektronową i modelowanie atomowe, co pozwala również na tworzenie przepływów pracy w celu przetwarzania tych danych. Aby utworzyć projekt w programie Scipion, kliknij przycisk Utwórz projekt, aby utworzyć projekt. Aby zaimportować filmy z mikroskopu, wybierz opcję Importuj filmy.

Pojawi się nowe okno. W tym oknie wprowadź ścieżkę do danych i ustaw napięcie mikroskopu na 300 kilowoltów, aberrację sferyczną na dwa milimetry, kontrast amplitudy na 0,1, współczynnik powiększenia na 50 000, tryb częstotliwości próbkowania na Od obrazu i rozmiar piksela na 1,34 angstremów. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk Execute (Wykonaj).

Po zakończeniu metody otwórz kartę Podsumowanie i kliknij pozycję Analizuj wyniki. Pojawi się nowe okno z listą danych wyjściowych wygenerowanych przez metodę. Aby uruchomić metodę przepływu optycznego do wyrównywania filmu, otwórz metodę wyrównywania optycznego xmipp3 i wybierz zaimportowane filmy jako filmy wejściowe, a następnie ustaw zakres Klatki na WYRÓWNAJ w zakresie od 2 do 13.

W obszarze Parametry dodatkowe ustaw opcję Użyj poprzedniego wyrównania filmu do klatek SUMA na Nie.Pozostaw wszystkie inne opcje ustawione na wartości domyślne i uruchom program. Kliknij przycisk Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane mikrofotografie i trajektorię szacowanych przesunięć. Dla każdej mikrofotografii możliwe jest sprawdzenie gęstości widmowej mocy, trajektorii uzyskanych w celu wyrównania filmu zarówno we współrzędnych kartezjańskich, jak i biegunowych oraz nazwy pliku uzyskanego mikrografu.

Zauważ, że cząstki próbki są znacznie bardziej widoczne na mikrofotografii w porównaniu z pojedynczą klatką filmu. W przypadku wybierania cząstek otwórz metodę ręcznego pobierania xmipp3 i wybierz wcześniej uzyskane mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj).

Pojawi się nowe interaktywne okno. W tym oknie zmień rozmiar piksela na 150. Wybrana mikrofotografia pojawi się w większym oknie.

Wybierz wszystkie widoczne cząstki w jednym obszarze. Gdy wszystkie cząstki zostaną ręcznie pobrane, kliknij przycisk Aktywuj szkolenie, aby rozpocząć naukę. Pozostałe obszary mikrofotografii zostaną wybrane automatycznie.

Sprawdź zebrane cząstki. Aby dołączyć dodatkową cząstkę, kliknij na interesującą Cię cząstkę. Aby usunąć nieprawidłowe cząstki, przytrzymaj Shift i kliknij je w razie potrzeby.

Gdy wszystkie cząstki zostaną automatycznie pobrane, wybierz kolejne cztery mikrofotografie pojedynczo, aby utworzyć reprezentatywny zestaw treningowy. Cząstki na każdym wybranym mikrozdjęciu zostaną automatycznie wybrane, sprawdzając każdą mikrofotografię pod kątem uwzględnienia lub usunięcia cząstek w razie potrzeby. Po uzyskaniu zestawu treningowego kliknij przycisk Współrzędne, aby zapisać współrzędne wszystkich pobranych cząstek.

Po zdobyciu zestawu treningowego otwórz automatyczne pobieranie xmipp3, aby wskazać poprzednie ręczne pobieranie w przebiegu pobierania cząstek Xmipp i ustaw opcję Mikrografie do pobierania na Taki sam zgodnie z nadzorem. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj), aby wygenerować zestaw około 100 000 współrzędnych. Aby zastosować podejście oparte na konsensusie, otwórz pobieranie kriolograficzne sphire i ustaw wstępnie przetworzone mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe w modelu kompletacji na wartość domyślną.

Ustaw próg ufności na 0,3, a rozmiar pola na 150, a następnie kliknij przycisk Wykonaj. Metoda powinna również wygenerować około 100 000 współrzędnych. Następnie otwórz pobieranie głębokiego konsensusu xmipp3 i ustaw współrzędne wejściowe tak, aby obejmowały dane wyjściowe automatycznego wybierania sphire cryolo i xmipp3, Wybierz typ modelu do wstępnie wytrenowanego oraz Pomiń trenowanie i wynik bezpośrednio ze wstępnie wytrenowanym modelem na Tak, a następnie kliknij przycisk Wykonaj.

Po zakończeniu wykonywania kliknij przycisk Analizuj wyniki. W nowym oknie kliknij ikonę oka. Otworzy się drugie nowe okno z listą wszystkich cząstek.

Wartości Z-score w kolumnie dadzą wgląd w jakość każdej cząstki, ponieważ niska wartość wskazuje na niską jakość. Aby uporządkować cząstki od najwyższego do najniższego wskaźnika Z, kliknij pozycję Xmipp Z-score deep learning i wybierz cząstki o wskaźniku Z wyższym niż 0,75. Następnie kliknij przycisk Współrzędne, aby utworzyć nowy podzbiór z około 50 000 współrzędnych.

Aby obliczyć rozdzielczość lokalnie, otwórz xmipp3 local MonoRes i ustaw głośność wejściową na dane wyjściowe ostatniego kroku uściślania, Czy chcesz użyć połowy objętości na Tak, a zakres rozdzielczości od 1 do 10 angstremów. Po ustawieniu parametrów kliknij przycisk Execute (Wykonaj). Po obliczeniu rozdzielczości kliknij przycisk Analizuj wyniki i wybierz opcję Pokaż histogram rozdzielczości i Pokaż kolorowe plasterki.

Zostanie pokazana rozdzielczość w różnych częściach woluminu. Większość wokseli centralnych części struktur powinna reprezentować rozdzielczości około trzech angstremów, podczas gdy najgorsze rozdzielczości będą obserwowane w zewnętrznych obszarach struktur. Pokazany zostanie również histogram rozdzielczości na woksel ze szczytem około lub poniżej trzech angstremów.

Aby zastosować wyostrzanie, otwórz xmipp3 localdeblur sharpening i wybierz dane wyjściowe ostatniego kroku zagęszczenia jako Input Map, a następnie ustaw mapę rozdzielczości na uzyskaną mapę MonoRes. Po wykonaniu polecenia kliknij dwukrotnie zestaw woluminów wygenerowanych jako dane wyjściowe na karcie Podsumowanie. Woluminy wygenerowane w każdej iteracji można sprawdzić.

Zaleca się również otwarcie woluminu za pomocą innych narzędzi, takich jak UCSF Chimera, aby lepiej obserwować cechy woluminu w 3D. Na tym rysunku można zaobserwować korelację powłoki Fouriera wynoszącą trzy angstremy, która jest bardzo bliska granicy Nyquista. Jak pokazano na ilustracji, zrekonstruowane wycinki objętości 3D wykazują wysoki poziom szczegółowości i dobrze zdefiniowane struktury.

Po analizie lokalnej większość centralnych wokseli osiąga rozdzielczość poniżej trzech angstremów. Zewnętrzne obszary lokalnych wycinków rozdzielczości wykazują jednak niższą rozdzielczość, co jest zgodne z rozmyciem obserwowanym w tych obszarach. Po przetworzeniu końcowym można zaobserwować wyższe częstotliwości objętości mapy 3D, odsłaniając więcej szczegółów i poprawiając odwzorowanie.

Gdy osiągnięta rozdzielczość jest wystarczająco wysoka, można zaobserwować nawet niektóre biochemiczne części struktury. Jeśli otrzymana struktura ma niską rozdzielczość i nie jest w stanie wyewoluować w lepszą, można zaobserwować rozmytą objętość z niską korelacją powłoki Fouriera, krzywą rozdzielczości i histogramem estymacji lokalnej. Po pobraniu można sprawdzić klasyfikację 2D w celu oceny jakości cząstek.

Na przykład w tej klasyfikacji cząstki są hałaśliwe, niewyśrodkowane lub sprzężone, co wskazuje, że wybieranie było nieprawidłowe. Kolejny punkt kontrolny można wykonać podczas początkowego szacowania objętości. W tym przykładzie utworzono nieprawidłowe oszacowanie przy użyciu nieprawidłowej konfiguracji metody.

Po utworzeniu mapy 3D o wystarczającej rozdzielczości, następnym krokiem jest zaproponowanie modelu atomowego mapy. Można to zrobić w Scipion za pomocą wtyczek do modelowania. Technika ta może być wykorzystana do skutecznej rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych w celu oceny ich interakcji molekularnych i funkcji zespołu biologicznego jako podstawy do projektowania leków.