Name: Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Naucz się analizy pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej za pomocą platformy Scipion. Poznaj metody importu filmów, wyrównywania optycznego i automatycznego wybierania cząstek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować za wsparcie finansowe od: Hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Innowacji poprzez granty: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, "Comunidad Autónoma de Madrid" poprzez Grant: S2017/BMD-3817, Instituto de Salud Carlos III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), Unia Europejska (UE) oraz Horyzont 2020 poprzez grant: INSTRUCT - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, Wniosek: 731005), EOSC Life (INFRAEOSC-04-2018, Propozycja: 824087), iNEXT - Discovery (Propozycja: 871037) oraz HighResCells (ERC - 2018 - SyG, Propozycja: 810057). Projekt, który doprowadził do uzyskania tych wyników, otrzymał wsparcie w postaci stypendium Fundacji "la Caixa" (ID 100010434). Kod stypendium to LCF/BQ/DI18/11660021. Projekt ten otrzymał dofinansowanie z programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 w ramach umowy grantowej nr 713673 w ramach działania "Maria Skłodowska-Curie". Autorzy dziękują za wsparcie i wykorzystanie zasobów Instruct, przełomowego projektu ESFRI.

<ol><li>Nogales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+cryo-EM+into+a+mainstream+structural+biology+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique.</a> Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).</li>
<li>Kühlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Resolution+Revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Resolution Revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Yip, K. M., Fischer, N., Chari, A., Stark, H. 1.15 A structure of human apoferritin obtained from Titan Mono- BCOR microscope. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.rcsb.org/structure/7A6A">https://www.rcsb.org/structure/7A6A</a> (2021).</li>
<li>Arnold, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturizing+EM+Sample+Preparation%3A+Opportunities%2C+Challenges%2C+and+%22Visual+Proteomics%22%5BTitle%5D)+AND+%22PROTEOMICS%22%5BJournal%5D)">Miniaturizing EM Sample Preparation: Opportunities, Challenges, and "Visual Proteomics".</a> PROTEOMICS. 18 (5-6), 1700176(2018).</li>
<li>Faruqi, A. R., McMullan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+imaging+detectors+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nuclear+Instruments+and+Methods+in+Physics+Research+Section+A%3A+Accelerators%2C+Spectrometers%2C+Detectors+and+Associated+Equipment%22%5BJournal%5D)">Direct imaging detectors for electron microscopy.</a> Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 878, 180-190 (2018).</li>
<li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+image+processing+for+single-particle+analysis+by+electron+cryomicroscopy+and+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Advances in image processing for single-particle analysis by electron cryomicroscopy and challenges ahead.</a> Current Opinion in Structural Biology. 52, 127-145 (2018).</li>
<li>Martinez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+Cryo-EM+Model+Building+Software+in+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Information+and+Modeling%22%5BJournal%5D)">Integration of Cryo-EM Model Building Software in Scipion.</a> Journal of Chemical Information and Modeling. 60, 2533-2540 (2020).</li>
<li>de la Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195, 93-99 (2016).</li>
<li>de la Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xmipp+3.0%3A+an+improved+software+suite+for+image+processing+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Xmipp 3.0: an improved software suite for image processing in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 184, 321-328 (2013).</li>
<li>Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScheres%2C+SHW+%22Methods+in+Enzymology.+The+Resolution+Revolution%3A+Recent+Advances+In+cryoEM%22">Methods in Enzymology. The Resolution Revolution: Recent Advances In cryoEM</a>. , Academic Press. 125-157 (2016).</li>
<li>Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cryoSPARC%3A+algorithms+for+rapid+unsupervised+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination.</a> Nature Methods. 14, 290-296 (2017).</li>
<li>Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+structures+of+macromolecules+using+single-particle+analysis+in+EMAN%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3-D structures of macromolecules using single-particle analysis in EMAN.</a> Methods in Molecular Biology. 673, 157-173 (2010).</li>
<li>Shaikh, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPIDER+image+processing+for+single-particle+reconstruction+of+biological+macromolecules+from+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs.</a> Nature Protocols. 3, 1941-1974 (2008).</li>
<li>Wagner, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPHIRE-crYOLO+is+a+fast+and+accurate+fully+automated+particle+picker+for+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">SPHIRE-crYOLO is a fast and accurate fully automated particle picker for cryo-EM.</a> Communications Biology. 2, (2019).</li>
<li>Mindell, J. A., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+local+defocus+and+specimen+tilt+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 142, 334-347 (2003).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+crystallographica.+Section+D%2C+Biological+crystallography%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 67, 235-242 (2011).</li>
<li>Liebschner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+structure+determination+using+X-rays%2C+neutrons+and+electrons%3A+recent+developments+in+Phenix%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%22%5BJournal%5D)">Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix.</a> Acta Crystallographica Section D. 75, 861-887 (2019).</li>
<li>Wong, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+Plasmodium+falciparum+80S+ribosome+bound+to+the+anti-protozoan+drug+emetine%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the Plasmodium falciparum 80S ribosome bound to the anti-protozoan drug emetine.</a> eLife. 3, 03080(2014).</li>
<li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alignment+of+direct+detection+device+micrographs+using+a+robust+Optical+Flow+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Alignment of direct detection device micrographs using a robust Optical Flow approach.</a> Journal of Structural Biology. 189, 163-176 (2015).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., Jonic, S., Nunez Ramirez, R., Boisset, N., Carazo, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+robust+and+accurate+determination+of+transmission+electron+microscopy+contrast+transfer+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Fast, robust and accurate determination of transmission electron microscopy contrast transfer function.</a> Journal of Structural Biology. 160, 249-262 (2007).</li>
<li>Abrishami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pattern+matching+approach+to+the+automatic+selection+of+particles+from+low-contrast+electron+micrographs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A pattern matching approach to the automatic selection of particles from low-contrast electron micrographs.</a> Bioinformatics. 29, 2460-2468 (2013).</li>
<li>Sanchez-Garcia, R., Segura, J., Maluenda, D., Carazo, J. M., Sorzano, C. O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+Consensus%2C+a+deep+learning-based+approach+for+particle+pruning+in+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Deep Consensus, a deep learning-based approach for particle pruning in cryo-electron microscopy.</a> IUCrJ. 5, 854-865 (2018).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clustering+approach+to+multireference+alignment+of+single-particle+projections+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 171, 197-206 (2010).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+approach+to+the+initial+volume+problem+in+Single+Particle+Analysis+by+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A statistical approach to the initial volume problem in Single Particle Analysis by Electron Microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 189, 213-219 (2015).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Swarm+optimization+as+a+consensus+technique+for+Electron+Microscopy+Initial+Volume%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Analysis+and+Optimization%22%5BJournal%5D)">Swarm optimization as a consensus technique for Electron Microscopy Initial Volume.</a> Applied Analysis and Optimization. 2, 299-313 (2018).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+Chimera--a+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+computational+chemistry%22%5BJournal%5D)">UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis.</a> Journal of computational chemistry. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Sorzano, C. O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+algorithm+for+high-resolution+reconstruction+of+single+particles+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 204, 329-337 (2018).</li>
<li>Vilas, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MonoRes%3A+Automatic+and+Accurate+Estimation+of+Local+Resolution+for+Electron+Microscopy+Maps%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">MonoRes: Automatic and Accurate Estimation of Local Resolution for Electron Microscopy Maps.</a> Structure. 26, 337-344 (2018).</li>
<li>Ramirez-Aportela, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+local+resolution-based+sharpening+of+cryo-EM+maps%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Automatic local resolution-based sharpening of cryo-EM maps.</a> Bioinformatics. 36, 765-772 (2020).</li>
<li>Heymann, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+3D+EM+Reconstructions%3A+The+Phantom+in+the+Noise%5BTitle%5D)+AND+%22AIMS+Biophys%22%5BJournal%5D)">Validation of 3D EM Reconstructions: The Phantom in the Noise.</a> AIMS Biophys. 2, 21-35 (2015).</li>
<li>Lander, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Appion%3A+An+integrated%2C+database-drive+pipeline+to+facilitate+EM+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Appion: An integrated, database-drive pipeline to facilitate EM image processing.</a> Journal of Structural Biology. 166, 95-102 (2009).</li>
<li>Suloway, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+molecular+microscopy%3A+The+new+Leginon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated molecular microscopy: The new Leginon system.</a> Journal of Structural Biology. 151, 41-60 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecnie cryo-EM jest kluczowym narzędziem do ujawniania struktury 3D próbek biologicznych. Gdy za pomocą mikroskopu zbierzemy dobre dane, dostępne narzędzia przetwarzania pozwolą nam uzyskać rekonstrukcję 3D badanej makrocząsteczki. Przetwarzanie danych Cryo-EM jest w stanie osiągnąć rozdzielczość bliską atomowi, co jest kluczem do zrozumienia funkcjonalnego zachowania makrocząsteczki, a także ma kluczowe znaczenie w odkrywaniu leków.
Scipion to oprogramowanie, które umożliwia tworzenie całego przepływu pracy łączącego najważniejsze pakiety przetwarzania obrazu w sposób zintegrowany, co pomaga w śledzeniu i odtwarzalności całego przepływu pracy przetwarzania obrazu. Scipion zapewnia bardzo kompletny zestaw narzędzi do przeprowadzenia przetwarzania; Jednak uzyskanie rekonstrukcji w wysokiej rozdzielczości zależy całkowicie od jakości pozyskanych danych i sposobu ich przetwarzania. 
Aby uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości, pierwszym wymogiem jest uzyskanie dobrych filmów z mikroskopu, które zachowują informacje strukturalne w wysokiej rozdzielczości. Jeśli tak nie jest, przepływ pracy nie będzie w stanie wyodrębnić z danych informacji w wysokiej rozdzielczości. Następnie, pomyślny proces przetwarzania powinien być w stanie wyodrębnić cząstki, które naprawdę odpowiadają strukturze i znaleźć orientacje tych cząstek w przestrzeni 3D. Jeśli którykolwiek z kroków przepływu pracy zakończy się niepowodzeniem, jakość zrekonstruowanego woluminu ulegnie pogorszeniu. Scipion pozwala na użycie różnych pakietów w każdym z etapów przetwarzania, co pomaga znaleźć najbardziej odpowiednie podejście do przetwarzania danych. Ponadto, dzięki dostępności wielu pakietów, można stosować narzędzia konsensusu, które zwiększają dokładność poprzez znalezienie zgodności w szacowanych wynikach różnych metod. Ponadto szczegółowo omówiono w sekcji Reprezentatywne wyniki kilka narzędzi walidacji oraz sposób identyfikowania dokładnych i niedokładnych wyników na każdym etapie przepływu pracy, wykrywania potencjalnych problemów i sposobów ich rozwiązywania. Wzdłuż protokołu znajduje się kilka punktów kontrolnych, które mogą pomóc w uświadomieniu sobie, czy protokół działa poprawnie, czy nie. Niektóre z najistotniejszych to: kompletacja, klasyfikacja 2D, początkowe szacowanie objętości i wyrównanie 3D. Sprawdzanie danych wejściowych, powtarzanie kroku inną metodą lub korzystanie z konsensusu to opcje dostępne w Scipion, których użytkownik może użyć, aby znaleźć rozwiązania, gdy pojawią się problemy. 
Jeśli chodzi o poprzednie podejścia do integracji pakietów w dziedzinie Cryo-EM, Appion31 jest jedynym, który pozwala na rzeczywistą integrację różnych pakietów oprogramowania. Jednak Appion jest ściśle powiązany z Leginon32, systemem do automatycznego zbierania obrazów z mikroskopów elektronowych. Główna różnica w stosunku do Scipion polega na tym, że model danych i pamięć masowa są mniej sprzężone. W ten sposób, aby stworzyć nowy protokół w Scipion, wystarczy opracować skrypt w Pythonie. Jednak w Appion programista musi napisać skrypt i zmienić bazową bazę danych. Podsumowując, Scipion został opracowany w celu uproszczenia konserwacji i rozbudowy.
W tym manuskrypcie przedstawiliśmy kompletny przebieg procesu przetwarzania Cryo-EM, wykorzystując rzeczywisty zestaw danych przypadków rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Omówione i omówione tutaj kroki można podsumować jako wyrównanie filmu, estymacja CTF, wybieranie cząstek, klasyfikacja 2D, wstępna estymacja mapy, klasyfikacja 3D, udoskonalanie 3D, ocena i przetwarzanie końcowe. W kilku z tych etapów wykorzystano różne pakiety, a narzędzia konsensusu zostały zastosowane. Ostateczna objętość zrekonstruowana w 3D osiągnęła rozdzielczość 3 A, a w objętości przetworzonej można wyróżnić niektóre struktury drugorzędowe, takie jak alfa-helisy, co pomaga opisać, jak atomy są ułożone w przestrzeni.
Przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie pokazuje, w jaki sposób Scipion może być używany do łączenia różnych pakietów Cryo-EM w prosty i zintegrowany sposób, aby uprościć przetwarzanie i jednocześnie uzyskać bardziej wiarygodne wyniki.
W przyszłości rozwój nowych metod i pakietów będzie się rozwijał, a oprogramowanie takie jak Scipion, które pozwoli na łatwą integrację wszystkich z nich, będzie jeszcze ważniejsze dla badaczy. Podejścia oparte na konsensusie będą bardziej odpowiednie nawet wtedy, gdy dostępnych będzie wiele metod o różnych podstawach, co pomoże uzyskać dokładniejsze oszacowania wszystkich parametrów zaangażowanych w proces rekonstrukcji w Cryo-EM. Śledzenie i odtwarzalność są kluczowe w procesie badawczym i łatwiejsze do osiągnięcia w przypadku Scipion dzięki wspólnej strukturze do wykonywania kompletnych przepływów pracy.

W mikroskopii krioelektronowej (cryo-EM), analiza pojedynczych cząstek (SPA) zeszklonych próbek mrożono-uwodnionych jest jednym z najczęściej stosowanych i udanych wariantów obrazowania makrocząsteczek biologicznych, ponieważ pozwala zrozumieć interakcje molekularne i funkcję zespołów biologicznych1. Dzieje się tak dzięki niedawnym postępom w tej technice obrazowania, które dały początek "rewolucji rozdzielczości"2 i umożliwiły pomyślne określenie biologicznych struktur 3D z rozdzielczością bliską atomowi. Obecnie najwyższa rozdzielczość osiągnięta w SPA cryo-EM wyniosła 1,15 A dla apoferrytyny3 (wpis EMDB: 11668). Na te osiągnięcia technologiczne składają się ulepszenia w przygotowaniu próbek4, akwizycji obrazu5 oraz metodach przetwarzania obrazu6. Ten artykuł skupia się na tym ostatnim punkcie. 
Krótko mówiąc, celem metod przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie wszystkich parametrów akwizycji, aby odwrócić proces obrazowania mikroskopu i odzyskać strukturę 3D badanej próbki biologicznej. Parametry te to wzmocnienie kamery, ruch wywołany wiązką, aberracje mikroskopu (głównie rozogniskowanie), orientacja kątowa 3D i translacja każdej cząstki oraz stan konformacyjny w przypadku posiadania próbki ze zmianami konformacyjnymi. Jednak liczba parametrów jest bardzo wysoka, a cryo-EM wymaga stosowania obrazów o niskiej dawce, aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, co znacznie zmniejsza stosunek sygnału do szumu (SNR) pozyskiwanych obrazów. W związku z tym problemu nie można jednoznacznie rozwiązać, a wszystkie parametry, które mają zostać obliczone, mogą być jedynie szacunkami. W całym procesie przetwarzania obrazu należy zidentyfikować prawidłowe parametry, odrzucając pozostałe, aby ostatecznie uzyskać rekonstrukcję 3D w wysokiej rozdzielczości.
Dane generowane przez mikroskop są zebrane w ramkach. Upraszczając, ramka zawiera liczbę elektronów, które dotarły do określonej pozycji (piksela) na obrazie, za każdym razem, gdy używane są detektory zliczające elektrony. W określonym polu widzenia zbieranych jest kilka klatek i nazywa się to filmem. Ponieważ niskie dawki elektronów są stosowane w celu uniknięcia uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem, które mogłyby zniszczyć próbkę, SNR jest bardzo niski, a klatki odpowiadające temu samemu filmowi muszą zostać uśrednione, aby uzyskać obraz ujawniający informacje strukturalne o próbce. Jednak nie tylko prosta średnia jest stosowana, próbka może ulegać przesunięciom i innym rodzajom ruchów w czasie obrazowania z powodu ruchu wywołanego wiązką, który należy skompensować. Klatki z kompensacją przesunięcia i uśrednione tworzą mikrofotografię.
Po uzyskaniu mikrofotografii, musimy oszacować aberracje wprowadzone przez mikroskop dla każdej z nich, zwane Funkcją Transferu Kontrastu (CTF), która reprezentuje zmiany kontrastu mikrofotografii w funkcji częstotliwości. Następnie cząstki można wybrać i wyekstrahować, co nazywa się wybieraniem cząstek. Każda cząstka powinna być małym obrazem zawierającym tylko jedną kopię badanej próbki. Istnieją trzy rodziny algorytmów wybierania cząstek: 1) te, które wykorzystują tylko podstawową parametryzację wyglądu cząstki, aby znaleźć je w całym zestawie mikrofotografii (np. rozmiar cząstek), 2) te, które uczą się, jak wyglądają cząstki od użytkownika lub wstępnie wytrenowanego zestawu, oraz 3) te, które używają szablonów obrazów. Każda rodzina ma inne właściwości, które zostaną pokazane później.
Wyodrębniony zestaw cząstek znalezionych na mikrofotografiach zostanie wykorzystany w procesie klasyfikacji 2D, który ma dwa cele: 1) oczyszczenie zestawu cząstek poprzez odrzucenie podzbioru zawierającego obrazy czystego szumu, nakładające się na siebie cząstki lub inne artefakty, oraz 2) uśrednione cząstki reprezentujące każdą klasę mogą być użyte jako początkowe informacje do obliczenia początkowej objętości 3D. 
Początkowe obliczenie objętości 3D to kolejny kluczowy krok. Problem uzyskania struktury 3D może być postrzegany jako problem optymalizacyjny w wielowymiarowym krajobrazie rozwiązań, gdzie globalnym minimum jest najlepsza objętość 3D, która reprezentuje oryginalną strukturę, ale można znaleźć kilka lokalnych minimów reprezentujących nieoptymalne rozwiązania i gdzie bardzo łatwo jest wpaść w pułapkę. Początkowy wolumen stanowi punkt wyjścia dla procesu wyszukiwania, więc złe oszacowanie początkowego wolumenu może uniemożliwić nam znalezienie globalnego minimum. Począwszy od początkowej objętości, etap klasyfikacji 3D pomoże odkryć różne stany konformacyjne i ponownie oczyścić zestaw cząstek; Celem jest uzyskanie strukturalnie jednorodnej populacji cząstek. Następnie etap udoskonalania 3D będzie odpowiedzialny za dopracowanie parametrów kątowych i translacyjnych dla każdej cząstki, aby uzyskać najlepszą możliwą objętość 3D. 
Na koniec, w ostatnich krokach, uzyskana rekonstrukcja 3D może zostać wyostrzona i wypolerowana. Ostrzenie to proces wzmacniania wysokich częstotliwości zrekonstruowanej objętości, a polerowanie jest krokiem w kierunku dalszego dopracowania niektórych parametrów, takich jak CTF lub kompensacja ruchu wywołanego wiązką, na poziomie cząstek. Ponadto niektóre procedury walidacji mogą być wykorzystane do lepszego zrozumienia osiągniętej rozdzielczości na końcu przepływu pracy. 
Po wszystkich tych krokach, procesy śledzenia i dokowania7 pomogą nadać biologiczne znaczenie uzyskanej rekonstrukcji 3D, budując modele atomowe de novo lub dopasowując istniejące modele. Jeśli osiągniemy wysoką rozdzielczość, procesy te powiedzą nam o położeniu struktur biologicznych, a nawet różnych atomów, w naszej strukturze.
Scipion8 pozwala na stworzenie całego przepływu pracy, łącząc najważniejsze pakiety przetwarzania obrazów w sposób integracyjny. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 i wiele innych pakietów można dołączyć do Scipion. Zawiera również wszystkie niezbędne narzędzia, które zapewniają integrację, interoperacyjność, identyfikowalność i odtwarzalność, aby w pełni śledzić cały przepływ pracy przetwarzania obrazu8.
Jednym z najpotężniejszych narzędzi, które Scipion pozwala nam używać, jest konsensus, który oznacza porównywanie wyników uzyskanych za pomocą kilku metod w jednym kroku przetwarzania, tworząc kombinację informacji przekazywanych różnymi metodami w celu wygenerowania dokładniejszego wyniku. Może to przyczynić się do zwiększenia wydajności i poprawy osiągniętej jakości w szacowanych parametrach. Należy pamiętać, że prostszy przepływ pracy można zbudować bez użycia metod konsensusu; Widzieliśmy jednak moc tego narzędzia22,25, a przepływ pracy przedstawiony w tym manuskrypcie będzie z niego korzystał w kilku krokach. 
Wszystkie kroki, które zostały podsumowane w poprzednich akapitach, zostaną szczegółowo wyjaśnione w następnej sekcji i połączone w kompletny przepływ pracy za pomocą Scipion. Pokazane zostanie również, w jaki sposób korzystać z narzędzi konsensusu, aby osiągnąć wyższą zgodność w generowanych produktach. W tym celu wybrano przykładowy zbiór danych rybosomu Plasmodium falciparum 80S (wpis EMPIAR: 10028, wpis EMDB: 2660). Zestaw danych składa się z 600 filmów składających się z 16 klatek o rozmiarze 4096x4096 pikseli o rozmiarze piksela 1,34Å wykonanych przy użyciu FEI POLARA 300 za pomocą kamery FEI FALCON II, o rozdzielczości zgłoszonej w EMDB to 3,2Å18 .

<table><tbody><tr><td>w tym artykule nie wykorzystano żadnego materiału</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

cryo-em i analiza pojedynczych cząstek za pomocą scipion

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Mikroskopia krioelektronowa stała się jednym z najważniejszych narzędzi w badaniach biologicznych, pozwalającym na ujawnienie informacji strukturalnych makromolekuł w rozdzielczości zbliżonej do atomowej. W analizie pojedynczej cząstki zeszklona próbka jest obrazowana za pomocą wiązki elektronów, a detektory na końcu kolumny mikroskopowej wytwarzają filmy tej próbki. Filmy te zawierają tysiące obrazów identycznych cząstek w losowych orientacjach. Dane muszą przejść przez proces przetwarzania obrazu składający się z wielu kroków, aby uzyskać ostateczną objętość zrekonstruowaną w 3D. Celem procesu przetwarzania obrazu jest zidentyfikowanie parametrów akwizycji, aby móc zrekonstruować badaną próbkę. Scipion zapewnia wszystkie narzędzia do stworzenia tego przepływu pracy przy użyciu kilku pakietów przetwarzania obrazów w zintegrowanej strukturze, umożliwiając również śledzenie wyników. W tym artykule przedstawiono i omówiono cały proces przetwarzania obrazu w Scipion z danymi pochodzącymi z rzeczywistego przypadku testowego, podając wszystkie szczegóły niezbędne do przejścia od filmów uzyskanych przez mikroskop do końcowej rekonstrukcji 3D w wysokiej rozdzielczości. Omówiono również moc stosowania narzędzi konsensusu, które umożliwiają łączenie metod i potwierdzanie wyników na każdym etapie przepływu pracy, poprawiając dokładność uzyskanych wyników.

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania w sposób zintegrowany dla analizy pojedynczych cząstek w cryo-EM w celu uzyskania rekonstrukcji próbki biologicznej w wysokiej rozdzielczości. Ramy te umożliwiają stworzenie przepływu pracy przetwarzania przy użyciu kilku pakietów przetwarzania obrazu, sprzyjając interoperacyjności, identyfikowalności, odtwarzalności i połączeniu informacji przekazywanych różnymi metodami w celu wygenerowania dokładniejszych danych wyjściowych. Scipion stale się rozwija, dołączając nowe metody i pakiety.Co więcej, została rozszerzona o tomografię krioelektronową i modelowanie atomowe, co pozwala również na tworzenie przepływów pracy w celu przetwarzania tych danych. Aby utworzyć projekt w programie Scipion, kliknij przycisk Utwórz projekt, aby utworzyć projekt. Aby zaimportować filmy z mikroskopu, wybierz opcję Importuj filmy.Pojawi się nowe okno. W tym oknie wprowadź ścieżkę do danych i ustaw napięcie mikroskopu na 300 kilowoltów, aberrację sferyczną na dwa milimetry, kontrast amplitudy na 0,1, współczynnik powiększenia na 50 000, tryb częstotliwości próbkowania na Od obrazu i rozmiar piksela na 1,34 angstremów. Po ustawieniu wszystkich parametrów kliknij przycisk Execute (Wykonaj).Po zakończeniu metody otwórz kartę Podsumowanie i kliknij pozycję Analizuj wyniki. Pojawi się nowe okno z listą danych wyjściowych wygenerowanych przez metodę. Aby uruchomić metodę przepływu optycznego do wyrównywania filmu, otwórz metodę wyrównywania optycznego xmipp3 i wybierz zaimportowane filmy jako filmy wejściowe, a następnie ustaw zakres Klatki na WYRÓWNAJ w zakresie od 2 do 13.W obszarze Parametry dodatkowe ustaw opcję Użyj poprzedniego wyrównania filmu do klatek SUMA na Nie.Pozostaw wszystkie inne opcje ustawione na wartości domyślne i uruchom program. Kliknij przycisk Analizuj wyniki, aby sprawdzić uzyskane mikrofotografie i trajektorię szacowanych przesunięć. Dla każdej mikrofotografii możliwe jest sprawdzenie gęstości widmowej mocy, trajektorii uzyskanych w celu wyrównania filmu zarówno we współrzędnych kartezjańskich, jak i biegunowych oraz nazwy pliku uzyskanego mikrografu.Zauważ, że cząstki próbki są znacznie bardziej widoczne na mikrofotografii w porównaniu z pojedynczą klatką filmu. W przypadku wybierania cząstek otwórz metodę ręcznego pobierania xmipp3 i wybierz wcześniej uzyskane mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj).Pojawi się nowe interaktywne okno. W tym oknie zmień rozmiar piksela na 150. Wybrana mikrofotografia pojawi się w większym oknie.Wybierz wszystkie widoczne cząstki w jednym obszarze. Gdy wszystkie cząstki zostaną ręcznie pobrane, kliknij przycisk Aktywuj szkolenie, aby rozpocząć naukę. Pozostałe obszary mikrofotografii zostaną wybrane automatycznie.Sprawdź zebrane cząstki. Aby dołączyć dodatkową cząstkę, kliknij na interesującą Cię cząstkę. Aby usunąć nieprawidłowe cząstki, przytrzymaj Shift i kliknij je w razie potrzeby.Gdy wszystkie cząstki zostaną automatycznie pobrane, wybierz kolejne cztery mikrofotografie pojedynczo, aby utworzyć reprezentatywny zestaw treningowy. Cząstki na każdym wybranym mikrozdjęciu zostaną automatycznie wybrane, sprawdzając każdą mikrofotografię pod kątem uwzględnienia lub usunięcia cząstek w razie potrzeby. Po uzyskaniu zestawu treningowego kliknij przycisk Współrzędne, aby zapisać współrzędne wszystkich pobranych cząstek.Po zdobyciu zestawu treningowego otwórz automatyczne pobieranie xmipp3, aby wskazać poprzednie ręczne pobieranie w przebiegu pobierania cząstek Xmipp i ustaw opcję Mikrografie do pobierania na Taki sam zgodnie z nadzorem. Kliknij przycisk Execute (Wykonaj), aby wygenerować zestaw około 100 000 współrzędnych. Aby zastosować podejście oparte na konsensusie, otwórz pobieranie kriolograficzne sphire i ustaw wstępnie przetworzone mikrofotografie jako mikrofotografie wejściowe w modelu kompletacji na wartość domyślną.Ustaw próg ufności na 0,3, a rozmiar pola na 150, a następnie kliknij przycisk Wykonaj. Metoda powinna również wygenerować około 100 000 współrzędnych. Następnie otwórz pobieranie głębokiego konsensusu xmipp3 i ustaw współrzędne wejściowe tak, aby obejmowały dane wyjściowe automatycznego wybierania sphire cryolo i xmipp3, Wybierz typ modelu do wstępnie wytrenowanego oraz Pomiń trenowanie i wynik bezpośrednio ze wstępnie wytrenowanym modelem na Tak, a następnie kliknij przycisk Wykonaj.Po zakończeniu wykonywania kliknij przycisk Analizuj wyniki. W nowym oknie kliknij ikonę oka. Otworzy się drugie nowe okno z listą wszystkich cząstek.Wartości Z-score w kolumnie dadzą wgląd w jakość każdej cząstki, ponieważ niska wartość wskazuje na niską jakość. Aby uporządkować cząstki od najwyższego do najniższego wskaźnika Z, kliknij pozycję Xmipp Z-score deep learning i wybierz cząstki o wskaźniku Z wyższym niż 0,75. Następnie kliknij przycisk Współrzędne, aby utworzyć nowy podzbiór z około 50 000 współrzędnych.Aby obliczyć rozdzielczość lokalnie, otwórz xmipp3 local MonoRes i ustaw głośność wejściową na dane wyjściowe ostatniego kroku uściślania, Czy chcesz użyć połowy objętości na Tak, a zakres rozdzielczości od 1 do 10 angstremów. Po ustawieniu parametrów kliknij przycisk Execute (Wykonaj). Po obliczeniu rozdzielczości kliknij przycisk Analizuj wyniki i wybierz opcję Pokaż histogram rozdzielczości i Pokaż kolorowe plasterki.Zostanie pokazana rozdzielczość w różnych częściach woluminu. Większość wokseli centralnych części struktur powinna reprezentować rozdzielczości około trzech angstremów, podczas gdy najgorsze rozdzielczości będą obserwowane w zewnętrznych obszarach struktur. Pokazany zostanie również histogram rozdzielczości na woksel ze szczytem około lub poniżej trzech angstremów.Aby zastosować wyostrzanie, otwórz xmipp3 localdeblur sharpening i wybierz dane wyjściowe ostatniego kroku zagęszczenia jako Input Map, a następnie ustaw mapę rozdzielczości na uzyskaną mapę MonoRes. Po wykonaniu polecenia kliknij dwukrotnie zestaw woluminów wygenerowanych jako dane wyjściowe na karcie Podsumowanie. Woluminy wygenerowane w każdej iteracji można sprawdzić.Zaleca się również otwarcie woluminu za pomocą innych narzędzi, takich jak UCSF Chimera, aby lepiej obserwować cechy woluminu w 3D. Na tym rysunku można zaobserwować korelację powłoki Fouriera wynoszącą trzy angstremy, która jest bardzo bliska granicy Nyquista. Jak pokazano na ilustracji, zrekonstruowane wycinki objętości 3D wykazują wysoki poziom szczegółowości i dobrze zdefiniowane struktury.Po analizie lokalnej większość centralnych wokseli osiąga rozdzielczość poniżej trzech angstremów. Zewnętrzne obszary lokalnych wycinków rozdzielczości wykazują jednak niższą rozdzielczość, co jest zgodne z rozmyciem obserwowanym w tych obszarach. Po przetworzeniu końcowym można zaobserwować wyższe częstotliwości objętości mapy 3D, odsłaniając więcej szczegółów i poprawiając odwzorowanie.Gdy osiągnięta rozdzielczość jest wystarczająco wysoka, można zaobserwować nawet niektóre biochemiczne części struktury. Jeśli otrzymana struktura ma niską rozdzielczość i nie jest w stanie wyewoluować w lepszą, można zaobserwować rozmytą objętość z niską korelacją powłoki Fouriera, krzywą rozdzielczości i histogramem estymacji lokalnej. Po pobraniu można sprawdzić klasyfikację 2D w celu oceny jakości cząstek.Na przykład w tej klasyfikacji cząstki są hałaśliwe, niewyśrodkowane lub sprzężone, co wskazuje, że wybieranie było nieprawidłowe. Kolejny punkt kontrolny można wykonać podczas początkowego szacowania objętości. W tym przykładzie utworzono nieprawidłowe oszacowanie przy użyciu nieprawidłowej konfiguracji metody.Po utworzeniu mapy 3D o wystarczającej rozdzielczości, następnym krokiem jest zaproponowanie modelu atomowego mapy. Można to zrobić w Scipion za pomocą wtyczek do modelowania. Technika ta może być wykorzystana do skutecznej rekonstrukcji makrocząsteczek biologicznych w celu oceny ich interakcji molekularnych i funkcji zespołu biologicznego jako podstawy do projektowania leków.

cryo-em-and-single-particle-analysis-with-scipion

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Ten protokół pokazuje, jak obrazować biologiczne próbki kriokonserwowane za pomocą kriostrukturalnej mikroskopii świetlnej. Demonstrujemy metodologię, obrazując cytoszkielet komórek U2OS.

Mikroskopijne gromadzenie danych z komórek zakonserwowanych kriogenicznie

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Zaawansowana metoda selekcji cząstek dla cryo-EM, a mianowicie CryoSieve, poprawia rozdzielczość mapy gęstości, usuwając większość cząstek z końcowych stosów, co zostało zademonstrowane poprzez jej zastosowanie na rzeczywistym zestawie danych.

Ulepszanie map gęstości poprzez usuwanie większości cząstek z końcowych stosów kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Naucz się analizy pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej za pomocą platformy Scipion. Poznaj metody importu filmów, wyrównywania optycznego i automatycznego wybierania cząstek.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Przeglądaj więcej filmów