Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów
7 maja 2021
Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.
Rozwój nowych terapii przerzutów do OUN jest utrudniony ze względu na brak dobrych modeli przedklinicznych. Nasze modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów podsumowują przerzuty do OUN lepiej niż historycznie stosowane modele linii komórkowych. Wykorzystując różne drogi inokulacji nowotworu, można badać różne aspekty kaskady przerzutowej.
Każda trasa ma zalety, które można wykorzystać w swoim badaniu. Procedurę zademonstruje Ben Yi Tew, doktor habilitowany z mojego laboratorium. W celu podskórnej implantacji boków kriokonserwowanych guzów PDX, szybko rozmrozić kriokonserwowaną tkankę nowotworową w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie opłucz go w pięciu mililitrach DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej. Następnie, po potwierdzeniu znieczulenia u trzy- do ośmiotygodniowej samicy myszy NOG, wykonaj nacięcie o długości od 0,5 do jednego centymetra na lewym lub prawym boku i włóż jeden kawałek tkanki nowotworowej o wymiarach 2x2x2 milimetry głęboko do kieszonki. Po zamknięciu nacięcia pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu z monitorowaniem, aż będzie w stanie ambulatoryjnym.
Gdy guz zacznie rosnąć, mierz guz trzy razy w tygodniu za pomocą suwmiarki. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy zidentyfikować przerzuty poprzez sekcję zwłok i potwierdzić obecność guzów w narządzie docelowym za pomocą analizy histologicznej. Umieść wycięty guz PDX w DMEM na lodzie.
Umyj guz w pięciu mililitrach DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej i usuń martwicze obszary, jeśli takie istnieją. Pokrój guz na małe kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów i przenieś je do probówki zawierającej roztwór dysocjacyjny. Używając odpowiedniego programu na dysocjatorze, mechanicznie zdysocjuj tkankę i przecedź powstałą zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów.
Użyj 20 mililitrów DMEM, aby zmyć wszelkie pozostałe komórki z sitka i odwirować zdysocjowaną zawiesinę komórek. Następnie ponownie zawieś komórki i DPBS do liczenia i dostosuj komórki do stężenia od pięciu do 10 razy 10 do czwartych komórek na jeden do dwóch mikrolitrów DPBS. Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść na głowie myszy, aby odsłonić skórę głowy.
Następnie umieść mysz w ramce stereotaktycznej, mocno zabezpieczając głowę myszy za pomocą nauszników. Upewnij się również, że podajesz odpowiedni środek przeciwbólowy. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami z jodonu powidonu i 70% etanolu.
Wykonaj podłużne nacięcie o długości od pięciu do siedmiu milimetrów, aby odsłonić czaszkę i cofnąć skórę głowy. Zeskrob okostną kleszczami, aby zlokalizować bregmę. Umieść igłę ramy stereotaktycznej na górze bregmy i zresetuj współrzędne do zera.
Przesuń ramię o jeden milimetr do tyłu i jeden milimetr w bok na prawo od linii środkowej i zaznacz to miejsce trwałym markerem. Następnie wywierć mały otwór w czaszce w zaznaczonym miejscu, uważając, aby nie wwiercić się w mózg. Załaduj do pięciu mikrolitrów strzykawki Hamiltona o rozmiarze 26 z jednym do dwóch mikrolitrów komórek i przymocuj strzykawkę do ramienia stereotaktycznego.
Powoli wbij igłę na dwa milimetry do mózgu i zacznij wstrzykiwać komórki z pożądaną szybkością. Kiedy wszystkie komórki zostaną dostarczone, powoli wycofaj igłę, wypełnij otwór w zadziorach woskiem kostnym i zamknij nacięcie. Umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.
Po uśpieniu zwierzęcia w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy potwierdzić obecność guzów w mózgu za pomocą analizy histologicznej. Aby wszczepić guzy PDX przez wstrzyknięcie dosercowe, przygotuj komórki nowotworowe, jak pokazano, i umieść znieczuloną mysz biorcy w pozycji leżącej. Ogol sierść na klatce piersiowej zwierzęcia i zdezynfekuj odsłoniętą skórę jodonem i 70% etanolem.
Narysuj 0,5 do 10 razy 10 do piątej komórki nowotworowej i do 100 mikrolitrów DPBS do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 28. Zlokalizować miejsce wstrzyknięcia nieco na lewo od mostka, w połowie odległości między wcięciem mostka a wyrostkiem mieczykowatym. Następnie należy wprowadzić igłę pionowo do myszy w miejscu wstrzyknięcia.
Po zaobserwowaniu przepływu wstecznego, wskazującego na pomyślne wprowadzenie igły do lewej komory, powoli dozuj zawiesinę guza do lewej komory, nie przesuwając igły. Po dostarczeniu wszystkich komórek powoli i pionowo wycofaj igłę i przyłóż kawałek sterylnej gazy do miejsca wstrzyknięcia na około jedną minutę, aż krwawienie ustanie. Pozwól myszy odzyskać sprawność na podgrzewanej podkładce z monitorowaniem, aż zacznie chodzić.
W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy zidentyfikować przerzuty poprzez sekcję zwłok i potwierdzić obecność guzów w narządzie docelowym za pomocą analizy histologicznej. Pomimo różnic w mikrośrodowisku guza, guzy PDX wykazują podobną morfologię zawierającą komórki o małych jądrach i skąpej cytoplazmie, niezależnie od miejsca implantacji. W tej analizie wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek czerniaka spowodowało przerzuty komórek nowotworowych do mózgu myszy, podczas gdy wstrzyknięcie dosercowe komórek nowotworowych ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc do mózgu spowodowało przerzuty do jamy brzusznej myszy i wątroby.
Protokoły te umożliwiają rozpoczęcie badań przedklinicznych w celu przetestowania nowych metod leczenia i kombinacji leczenia oraz mogą pomóc w badaniu procesów biologicznych i przerzutów nowotworowych.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokoły tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) dla przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), z wykorzystaniem trzech odrębnych podejść do implantacji: podskórnej implantacji w okolicy boku, ortotopowego wstrzyknięcia do mózgu oraz wstrzyknięcia wewnątrzsercowego. Modele te dokładniej odtwarzają cechy fenotypowe i molekularne ludzkich przerzutów do OUN w porównaniu z tradycyjnymi modelami opartymi na liniach komórkowych, co umożliwia prowadzenie bardziej relewantnych badań przedklinicznych nad biologią nowotworów i skutecznością terapeutyczną.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia raka
- Neuronauka
- Modelowanie przedkliniczne
Wstęp
- Rozwój terapii przerzutów do OUN jest ograniczony przez niewystarczające modele przedkliniczne.
- Modele PDX lepiej odzwierciedlają heterogenność i dynamikę klonalną ludzkich nowotworów niż modele oparte na liniach komórkowych.
- Różne drogi implantacji umożliwiają badanie różnych aspektów kaskady przerzutowej.
- Wybór miejsca implantacji wpływa na użyteczność i istotność modelu w odniesieniu do konkretnych pytań badawczych.
Cel badania
- Opisanie protokołów tworzenia modeli PDX przerzutów do OUN z wykorzystaniem trzech metod implantacji.
- Porównanie zastosowań i ograniczeń każdego z podejść.
- Pomoc badaczom w wyborze najodpowiedniejszego modelu dla ich celów eksperymentalnych.
Zastosowane metody
- Podskórna implantacja kriotrzafowanego tkankowego modelu PDX w obrębie boku u myszy z niedoborem odporności.
- Ortotopowe wstrzyknięcie dysocjowanych komórek nowotworowych do mózgu myszy z wykorzystaniem chirurgii stereotaktycznej.
- Wtrysk wewnątrzsercowy komórek nowotworowych do lewej komory w celu ułatwienia przerzutowania systemowego.
- Monitorowanie wzrostu guza, nekropsja oraz histologiczne potwierdzenie przerzutów.
Główne wyniki
- Implantacja podskórna w okolicy boku jest łatwa do monitorowania i może prowadzić do przerzutów do mózgu oraz innych narządów, co pozwala modelować wieloetapowy proces metastazy.
- Ortotopowe wstrzykiwanie do mózgu najlepiej odtwarza mikrośrodowisko guza mózgu i jest odpowiednie do badania przenikania przez barierę krew-mózg, ale pomija wczesne etapy przerzutowania.
- Wstrzykiwanie wewnątrzsercowe umożliwia badanie tropizmu narządowego i późniejszych etapów przerzutowania, przy czym obserwowane przerzuty zależą od typu komórek nowotworowych.
- Guzy PDX zachowują podobną morfologię niezależnie od miejsca implantacji, co potwierdza spójność modelu.
Wnioski
- Modele PDX opracowane za pomocą różnych dróg implantacji stanowią wszechstronne platformy do przedklinicznych badań nad przerzutami do OUN.
- Wybór metody inokulacji powinien być zgodny z konkretnym pytaniem badawczym oraz celami eksperymentalnymi.
- Niniejsze protokoły ułatwiają badanie biologii nowotworów, przerzutowania oraz testowanie terapeutyków w modelach istotnych klinicznie.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) w badaniach przerzutów do OUN wypełniają krytyczną lukę w onkologii przedklinicznej, dokładniej odzwierciedlając heterogenność ludzkich nowotworów oraz mechanizmy przerzutowania. Modele te umożliwiają translacyjnie istotną ocenę skuteczności terapeutycznej, przenikalności bariery krew-mózg oraz progresji przerzutów, co wspiera podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka we wczesnych etapach odkrywania leków i w badaniach przedklinicznych. Strategiczny dobór drogi implantacji pozwala dopasować wyniki modelu do konkretnych pytań badawczych w ramach portfela projektów, zwiększając pewność prognostyczną w rozwoju leków celowanych w OUN.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów przerzutowania oraz interakcji między guzem a gospodarzem w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów terapeutycznych w przerzutach do OUN poprzez odtworzenie fenotypów guzów pacjentów.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie dynamiki klonalnej i heterogeniczności obserwowanej w warunkach klinicznych.
Przesiew i opracowanie testu
- Zapewnia zwalidowane układy in vivo do ilościowej oceny wzrostu guza i szerzenia się przerzutów.
- Umożliwia powtarzalne monitorowanie odpowiedzi terapeutycznej i punktów końcowych przerzutowania dla różnych dróg implantacji.
- Wspiera standaryzację testów służących do oceny przenikania przez barierę krew-mózg oraz tropizmu narządowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przedkliniczne badania skuteczności do złożoności klinicznego obrazu choroby, poprawiając ciągłość translacyjną.
- Umożliwia badanie kombinacji terapeutycznych oraz procesów biologicznych w modelach odzwierciedlających różnorodność pacjentów.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka poprzez modelowanie progresji przerzutowej i odpowiedzi na leczenie.
Integracja potoku i przepływu pracy
Modele PDX przerzutów do OUN integrują się z kontinuum od etapu odkrywania do badań przedklinicznych, umożliwiając testowanie hipotez, walidację celów terapeutycznych oraz ocenę translacyjną potencjalnych terapii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania mechanistyczne nad przerzutowaniem, mikrośrodowiskiem guza i ewolucją klonalną.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych odczytów wzrostu guza i przerzutowania do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia histologiczne i fenotypowe potwierdzenie punktów końcowych przerzutowania do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki przedkliniczne z scenariuszami klinicznymi poprzez modelowanie wyzwań związanych z barierą krew-mózg oraz przerzutowaniem specyficznym dla narządów.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje wszechstronną platformę, którą można dostosować do różnych typów nowotworów i celów doświadczalnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność biologiczną w badaniach nad przerzutami do OUN.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje modelowanie in vivo i umożliwia powtarzalne, skalowalne badania przedkliniczne.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostosowanie modeli do klinicznej złożoności choroby.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów ukierunkowanych na OUN.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość w chirurgii zwierząt, technikach stereotaktycznych oraz analizie histologicznej.
- Wymagany jest dostęp do kolonii myszy z niedoborem odporności oraz specjalistycznego sprzętu chirurgicznego.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów implantacji i analiz punktów końcowych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do różnych typów nowotworów i miejsc przerzutów może wymagać optymalizacji protokołu.
- Wybór drogi implantacji musi być zgodny z pytaniem badawczym i celami eksperymentu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:47
Subcutaneous Flank Implantation of Patient Derived Xenograft (PDX) Tumor
1:48
Orthotopic Implantation of PDX Tumor
4:24
Intracardiac Implantation of PDX Tumor
5:47
Results: Morphology and Metastasis of Implanted PDX Tumors
6:23
Conclusion
