Name: Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Poznaj trzy metody implantacji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów w celu badania przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego. Protokoły obejmują podskórną, ortotopową i wewnątrzsercową iniekcję komórek nowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rysunek 3A został zaczerpnięty z naszej poprzedniej publikacji12 i został wygenerowany w laboratorium dr Janna Sarkarii w Klinice Mayo.

Poniżej znajduje się seria protokołów krok po kroku, używanych zarówno do tworzenia modeli PDX przez podskórną implantację boku, jak i do zakładania badań przedklinicznych, które umożliwiają testowanie terapii, które mogą pomóc w ocenie zmian biologicznych i różnych etapów kaskady przerzutowej. We wszystkich badaniach i modelach wykorzystano 3-8 tygodniowe samice myszy NOG. Wszystkie próbki tkanek zostały pobrane za świadomą zgodą zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną (IRB). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania (IACUC).
1. Tworzenie i propagacja modeli PDX przez implantację boczną
<ol>
	<li>Ustanowienie modeli PDX
	<ol>
		<li>Po chirurgicznym wycięciu guza od pacjenta na sali operacyjnej, świeże tkanki nowotworowe należy przechowywać w odpowiednim roztworze (takim jak DMEM) i natychmiast umieścić je na lodzie. Użyj nadmiaru roztworu do przechowywania (>10 ml), aby upewnić się, że tkanka jest całkowicie zanurzona.</li>
		<li>Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS. 
		UWAGA: Ten krok należy przeprowadzić w komorze bezpieczeństwa biologicznego przy użyciu technik aseptycznych. Należy podjąć środki ostrożności poprzez noszenie odpowiednich środków ochrony osobistej (PPE) w celu ochrony przed możliwymi czynnikami zakaźnymi dla ludzi.</li>
		<li>Usuń martwicze obszary z guza. 
		UWAGA: Można to rozpoznać jako biały, papkowaty obszar w kierunku środka tkanki.</li>
		<li>Pokrój pozostałą tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki</li>.
		<li>Przenieś tkanki do probówki mikrowirówkowej zawierającej matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu i przechowuj je na lodzie. Upewnij się, że użyto wystarczającej ilości macierzy błony podstawnej (>200 μl), aby całkowicie zanurzyć każdy fragment tkanki.</li>
		<li>Kriokonserwować pozostałe tkanki, które nie zostaną wszczepione, zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.3.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Zastosuj weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje. </li>
		<li>Zidentyfikuj miejsce implantacji na myszy. 
		UWAGA: Powinien znajdować się na prawej lub lewej stronie myszy, zwykle oznaczony z boku po stronie brzucha, ogonowo do klatki piersiowej.</li>
		<li>Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść i zdezynfekuj ją trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy podnieś skórę myszy i wykonaj 0,5-1 cm nacięcie na skórze.</li>
		<li>Powoli włóż nożyczki chirurgiczne pod skórę w miejscu nacięcia, aby utworzyć kieszeń (o głębokości 0,5-1 cm) w przestrzeni podskórnej.</li>
		<li>Ostrożnie umieść jeden kawałek guza w kieszeni i popchnij go, wepchnij na dno kieszeni, aby zapobiec wysunięciu się guza.</li>
		<li>Zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4-0. 
		UWAGA: Można również stosować inne metody zamykania ran, takie jak niewchłanialne lub wchłanialne szwy i klipsy do ran.</li>
		<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj powrót zwierzęcia do zdrowia po znieczuleniu, aż będzie w stanie ambulatoryjnym. 
		UWAGA: Leki przeciwbólowe nie są wymagane, ale można je podawać, jeśli u myszy obserwuje się ból.</li>
		<li>Monitoruj wzrost guza co tydzień. Oczekuje się, że na mysz przypada jeden guz. 
		UWAGA: Objętość guza po przeszczepie początkowo wydaje się zmniejszać, ale nie jest to powód do niepokoju. Uważa się, że guz przyjął, gdy staje się wyczuwalny palpacyjnie i wchodzi w logarytmiczną fazę wzrostu. Ten pierwszy fragment reprezentuje pokolenie F0.</li>
		<li>Gdy guzy zaczną rosnąć, mierz je trzy razy w tygodniu. Zmierz długość i szerokość guzów za pomocą suwmiarki. Aby obliczyć objętość guza, użyj wzoru: długość x szerokość x szerokość / 2.</li>
		<li>Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO2 w komorze indukcyjnej CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.</li>
		<li>Wytnij guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie. Delikatnie wyciąć guz nożyczkami i kleszczami. Aby to zrobić, najpierw odetnij skórę na wierzchu guza, a następnie odetnij guz od warstwy mięśniowej poniżej.</li>
		<li>Przenieść tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM). Natychmiast umieść go na lodzie. Guz ten może być kriokonserwowany lub przenoszony do innego zestawu myszy. Rozważ ten fragment jako F1. 
		UWAGA: Ponowne pasażowanie spowodowałoby przejście guza F2 i tak dalej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Propagacja modeli PDX
	<ol>
		<li>Zacznij od wyciętego guza przechowywanego w roztworze do przechowywania z kroku 1.1.19.</li>
		<li>Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS.</li>
		<li>Usuń martwicze obszary z guza.</li>
		<li>Pokrój tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki</li>.
		<li>Przenieść tkanki do probówki mikrowirówkowej zawierającej matrycę błony podstawnej o zredukowanym czynniku wzrostu (>200 μl) i przechowywać na lodzie.</li>
		<li>Kriokonserwować pozostałą tkankę, która nie jest używana do rozmnażania, zgodnie z protokołem opisanym w kroku 1.3.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.</li>
		<li>Zidentyfikuj miejsce implantacji na myszy. 
		UWAGA: Powinien znajdować się na prawej lub lewej stronie myszy, zwykle w okolicy brzucha, ogonowo do klatki piersiowej.</li>
		<li>Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść i zdezynfekuj ją trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.</li>
		<li>Wykonaj nacięcie 0,5-1 cm na jednym boku myszy.</li>
		<li>Powoli włóż nożyczki chirurgiczne pod skórę w miejscu nacięcia, aby utworzyć kieszeń (o głębokości 0,5-1 cm) w przestrzeni podskórnej.</li>
		<li>Ostrożnie umieść jeden kawałek guza w kieszeni i wepchnij go na dno kieszeni, aby zapobiec wyślizgnięciu się guza.</li>
		<li>Zamknij nacięcie za pomocą nylonowych szwów chirurgicznych 4-0 lub innych metod zamykania rany.</li>
		<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj jej powrót do zdrowia po znieczuleniu, aż będzie w stanie ambulatoryjnym. 
		UWAGA: Leki przeciwbólowe nie są wymagane, ale można je podawać, jeśli u myszy obserwuje się ból.</li>
		<li>Podczas utajenia (faza bez wzrostu) monitoruj wzrost guza co tydzień. Oczekuje się, że na mysz przypada jeden guz. 
		UWAGA: Objętość guza po przeszczepie początkowo wydaje się zmniejszać, ale nie jest to powód do niepokoju. Uważa się, że guz jest przyjmowany, gdy staje się wyczuwalny palpacyjnie i zaczyna stale rosnąć.</li>
		<li>Gdy guzy zaczną rosnąć, mierz je trzy razy w tygodniu. Zmierz długość i szerokość guzów za pomocą suwmiarki. Oblicz objętość guza za pomocą wzoru: długość x szerokość x szerokość / 2.</li>
		<li>Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO2 w komorze indukcyjnej CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.</li>
		<li>Wyciąć guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie i delikatnie wycinając guz nożyczkami i kleszczami.</li>
		<li>Przenieś tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM), a następnie natychmiast umieść na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kriokonserwacja guzów PDX
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, gdy guzy mają średnicę większą niż 15 mm, używając najdłuższej strony guza. Przeprowadzić eutanazję poprzez wdychanie CO2 w komorze indukcyjnej CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako metodę wtórną.</li>
		<li>Wyciąć guz z boku zwierzęcia, wykonując nacięcie i delikatnie wycinając guz nożyczkami i kleszczami.</li>
		<li>Przenieś tkankę nowotworową do >10 ml odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM), a następnie natychmiast umieść na lodzie.</li>
		<li>Przenieść tkankę do naczynia do hodowli tkankowej i spłukać 5 ml DPBS.</li>
		<li>Usuń martwicze obszary z guza.</li>
		<li>Pokrój tkankę na około 2 x 2 x 2 mm kawałki</li>.
		<li>Przenieś tkankę do krioprobówek zawierających 20% DMEM, 70% FBS i 10% DMSO.</li>
		<li>Przenieś krioprobówki do pojemnika do krioprezerwacji i umieść w zamrażarce o temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Gdy krioprobówki zostaną schłodzone do temperatury -80 °C, przenieś je do magazynu ciekłego azotu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Drogi inokulacji w badaniach przedklinicznych
<ol>
	<li>Podskórna implantacja boku. 
	UWAGA: Podskórna implantacja boku może być stosowana w celu ułatwienia i może być pomocna w badaniu wszystkich etapów kaskady przerzutowej.
	<ol>
		<li>Użyj rosnących guzów PDX lub kriokonserwowanych guzów PDX do początkowej implantacji boku.</li>
		<li>W przypadku rosnących guzów PDX, należy poddać myszy eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez IACUC, gdy guzy mają więcej niż 15 mm długości; wyciąć guz i przenieść tkankę nowotworową do odpowiedniego roztworu do przechowywania (takiego jak DMEM) i natychmiast umieścić na lodzie.</li>
		<li>W przypadku kriokonserwowanych guzów PDX należy szybko rozmrozić kriokonserwowaną tkankę PDX, zanurzając ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Wykonaj kroki 1.2.2-1.2.19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja ortotopowa przez wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe do mózgu. 
	UWAGA: Model ten może być używany do testowania skuteczności leków przekraczających barierę krew-mózg i do badania kolonizacji guza. Ta sekcja odnosi się przede wszystkim do stosowania zestawu do dysocjacji guza (patrz tabela materiałów). Różne typy tkanek wymagają różnych protokołów dysocjacji. Zaleca się, aby użytkownik przetestował i zoptymalizował protokół, aby zmaksymalizować skuteczność dysocjacji.
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji myszy, którym wszczepiono guzy PDX, przy użyciu metody zatwierdzonej przez IACUC, gdy guzy mają więcej niż 15 mm długości.</li>
		<li>W sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego chirurgicznie wyciąć guzy PDX i przechowywać w DMEM na lodzie.</li>
		<li>Przygotować roztwór dysocjacyjny w odpowiedniej probówce, dodając mieszaninę enzymów do DMEM, jak wskazano w protokole producenta.</li>
		<li>Umyj guz w 5 ml DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej.</li>
		<li>Usuń martwicze obszary z guza.</li>
		<li>Pokrój guz na małe kawałki o długości 2-4 mm.</li>
		<li>Przenieś kawałki guza do probówki zawierającej mieszankę enzymów.</li>
		<li>Podłącz rurkę do dysocjatora tkankowego i uruchom program odpowiedni dla typu tkanki. Zapoznaj się z protokołem producenta, aby uzyskać informacje o odpowiednim programie do uruchomienia i wymaganym czasie dysocjacji.</li>
		<li>Po zakończeniu programu przecedź komórki przez sitko o średnicy 70 μm.</li>
		<li>Umyj sitko komórkowe 20 ml DMEM.</li>
		<li>Odwirować zdysocjowane komórki przy 300 x g przez 7 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w DPBS.</li>
		<li>Policz komórki i rozcieńcz do wymaganego stężenia.</li>
		<li>Ustaw ramkę stereotaktyczną zgodnie z instrukcjami producenta i przygotuj poduszkę grzewczą dla myszy. Zdezynfekuj wszystkie obszary 70% etanolem.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.</li>
		<li>Przygotuj obszar operacyjny, goląc sierść na głowie myszy, aby odsłonić skórę głowy.</li>
		<li>Należy podać myszom odpowiednie leki przeciwbólowe, takie jak jedna dawka 1 mg/kg buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (SR) podawana we wstrzyknięciu podskórnym.</li>
		<li>Przenieś mysz do ramki stereotaktycznej. Upewnij się, że mysz gryzie blok gryzienia. Użyj nauszników, aby mocno zabezpieczyć głowę myszy. 
		UWAGA: Mysz jest odpowiednio zabezpieczona, jeśli głowa nie porusza się po delikatnym popchnięciu kleszczami.</li>
		<li>Zdezynfekuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi peelingami z jodonu powidonu i 70% etanolu.</li>
		<li>Wykonaj podłużne nacięcie o długości 5-7 mm na skórze głowy, aby odsłonić czaszkę i cofnąć skórę głowy.</li>
		<li>Zeskrob okostną narzędziem chirurgicznym, takim jak kleszcze.</li>
		<li>Zlokalizuj bregmę na czaszce.</li>
		<li>Umieść igłę ramy stereotaktycznej na górze bregmy i zresetuj współrzędne do 0 lub zanotuj współrzędne na ramieniu.</li>
		<li>Przesuń ramię o 1 mm do tyłu (doogonowo) i 1 mm w bok, na prawo od linii środkowej.</li>
		<li>Zaznacz to miejsce trwałym markerem. Jeśli na ramieniu znajduje się szczelina na strzykawkę, przymocuj znacznik do szczeliny strzykawki, aby zaznaczyć miejsce.</li>
		<li>Wywierć mały otwór w czaszce w tym miejscu. Nie wywieraj zbyt dużego nacisku, aby zapobiec wwiercaniu się w mózg.</li>
		<li>Załaduj strzykawkę Hamiltona o pojemności 5 μl, 26 g z 5-10 x 104 ogniwami, w objętości 1-2 μl i przymocuj do ramienia stereotaktycznego.</li>
		<li>Powoli wprowadzić igłę strzykawki Hamilton na 2 mm do mózgu.</li>
		<li>Rozpocznij wstrzykiwanie komórek z żądaną szybkością, zwykle 0,2-0,5 μl/min.</li>
		<li>Po zakończeniu wstrzyknięcia należy powoli wycofać igłę z mózgu.</li>
		<li>Wypełnij otwór zadziorów woskiem kostnym.</li>
		<li>Zamknij nacięcie szwami chirurgicznymi lub klejem chirurgicznym.</li>
		<li>Przenieś mysz z powrotem do klatki i monitoruj jej powrót do zdrowia po znieczuleniu.</li>
		<li>Regularnie monitoruj stan zwierząt i poddawaj je eutanazji, gdy zostaną spełnione kryteria humanitarnego punktu końcowego określone w zatwierdzonym protokole. 
		UWAGA: Pomyślny wzrost guza w mózgu skutkuje pogorszeniem stanu zwierzęcia, co często objawia się pochyleniem głowy, szorstką sierścią, zgarbionym ciałem, zmrużonymi oczami, zmniejszoną aktywnością i niską oceną kondycji ciała (BCS < 2).</li>
		<li>Przeprowadzić sekcję zwłok zwierząt poddanych eutanazji, a następnie analizę histologiczną w celu potwierdzenia obecności guzów w mózgu. Rejestruj czas potrzebny od implantacji do eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Implantacja modeli PDX metodą iniekcji dosercowej 
	UWAGA: Model ten może być używany do badania tropizmu narządów, gdy komórki nowotworowe są w krążeniu. W tej sekcji używany jest również zestaw do dysocjacji guza i wymaga optymalizacji pod kątem typu tkanki.
	<ol>
		<li>Wykonaj kroki 2.2.1-2.2.13.</li>
		<li>Znieczulić zwierzę w komorze indukcyjnej z 2-5% izofluranem i tlenem. Po znieczuleniu przenieś zwierzę do stożka nosowego, aby utrzymać znieczulenie na poziomie 1,5-2,5% izofluranu przy ciągłym dopływie tlenu. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez brak odruchu pedałowania. Nałóż weterynaryjną maść okulistyczną, aby zapobiec suchości oczu podczas zabiegu. Zapewnij zwierzęciu wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu, aż zwierzę wyzdrowieje.</li>
		<li>Następnie ustaw mysz w pozycji leżącej.</li>
		<li>Aby przygotować obszar operacyjny na klatce piersiowej, ogol futro i zdezynfekuj je trzema naprzemiennymi peelingami jodu powidonu i 70% etanolu.</li>
		<li>Pobrać 0,5-10 x 105 komórek do strzykawki na igle 28 G, do objętości 100 μl. 
		UWAGA: Liczba wymaganych komórek różni się w zależności od agresywności modelu, a optymalna liczba komórek powinna być empirycznie określona dla każdego modelu.</li>
		<li>Zlokalizuj miejsce wstrzyknięcia (nieco na lewo od mostka myszy i w połowie odległości między wcięciem mostka a wyrostkiem ksylowym).</li>
		<li>Wbić igłę pionowo do myszy w miejscu wstrzyknięcia.</li>
		<li>Obserwuj pomyślne wejście do lewej komory przez cofanie się krwi wpływającej do strzykawki. Powoli dozuj komórki do lewej komory, nie przesuwając igły.</li>
		<li>Powoli wyciągnij igłę pionowo z myszy.</li>
		<li>Nałożyć kawałek sterylnej gazy na miejsce wstrzyknięcia i uciskać przez około 1 minutę, aż krwawienie ustanie, nadal umożliwiając ruchy klatki piersiowej w celu oddychania.</li>
		<li>Wyjmij mysz ze znieczulenia i pozwól jej dojść do siebie na rozgrzanej podkładce. 
		UWAGA: Pomyślny wzrost guza skutkuje pogorszeniem stanu zwierzęcia, co często objawia się potarganą sierścią, zgarbionym ciałem, zmrużonymi oczami, zmniejszoną aktywnością i niską oceną kondycji ciała (BCS < 2).</li>
		<li>Regularnie monitoruj stan zwierząt i poddawaj je eutanazji, gdy zostaną spełnione kryteria humanitarnego punktu końcowego określone w zatwierdzonym protokole.</li>
		<li>Przeprowadzić sekcję zwłok w celu zidentyfikowania przerzutów u zwierząt poddanych eutanazji, a następnie analizę histologiczną w celu potwierdzenia obecności guzów w narządzie docelowym. Zapisz czas potrzebny od wstrzyknięcia dosercowego do eutanazji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+approaches+to+study+the+biology+and+treatment+of+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases.</a> Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).</li>
<li>Owonikoko, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+the+treatment+of+metastatic+brain+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours.</a> Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).</li>
<li>Salhia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+genomic+and+epigenomic+analysis+of+breast+cancer+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis.</a> PLoS One. 9 (1), 85448(2014).</li>
<li>Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+managing+brain+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Recent advances in managing brain metastasis.</a> F1000Research. 7, 1000(2018).</li>
<li>DeRose, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+grafts+derived+from+women+with+breast+cancer+authentically+reflect+tumor+pathology%2C+growth%2C+metastasis+and+disease+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes.</a> Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).</li>
<li>Klinghammer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensively+characterized+large+panel+of+head+and+neck+cancer+patient-derived+xenografts+identifies+the+mTOR+inhibitor+everolimus+as+potential+new+treatment+option%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option.</a> International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+from+non-small+cell+lung+cancer+brain+metastases+are+valuable+translational+platforms+for+the+development+of+personalized+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clincal+Cancer+Research%3A+An+Official+journal+of+the+American+Association+of+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy.</a> Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).</li>
<li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+inhibition+of+PI3K+and+mTORC1+yields+durable+remissions+in+mice+bearing+orthotopic+patient-derived+xenografts+of+HER2-positive+breast+cancer+brain+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases.</a> Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).</li>
<li>Oshi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+breast+cancer+brain+metastasis+patient-derived+orthotopic+xenograft+model+for+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies.</a> Cancers (Basel). 12 (2), 444(2020).</li>
<li>Garman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+genomic+characterization+of+462+melanoma+patient-derived+xenografts%2C+tumor+biopsies%2C+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines.</a> Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).</li>
<li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+patient-derived+xenograft+collection+representing+the+heterogeneity+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li>
<li>Tew, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenografts+of+central+nervous+system+metastasis+reveal+expansion+of+aggressive+minor+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones.</a> Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+orthotopic+mouse+models+of+patient-derived+breast+cancer+brain+metastases+by+a+modified+intracarotid+injection+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method.</a> Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).</li>
<li>Davies, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+clonal+cytogenetic+architecture+during+progression+of+chronic+lymphocytic+leukemia+in+patients+and+patient-derived+murine+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts.</a> Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).</li>
<li>Eirew, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+genomic+clones+in+breast+cancer+patient+xenografts+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution.</a> Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).</li>
<li>Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+and+blood-tumour+barrier+in+brain+tumours+and+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases.</a> Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).</li>
<li>Choi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescence+imaging+for+leptomeningeal+dissemination+of+medulloblastoma+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models.</a> BMC Cancer. 16 (1), 723(2016).</li>
<li>Hidalgo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models%3A+an+emerging+platform+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research.</a> Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).</li>
<li>Bradford, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+transcriptome+profiling+of+patient-derived+xenograft+models+as+a+tool+to+identify+both+tumor+and+stromal+specific+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers.</a> Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).</li>
<li>Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+for+immune+checkpoint+blockade+in+human+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+and+Experimental+Urology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors.</a> American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

W niniejszym manuskrypcie szczegółowo opisano metody tworzenia i rozmnażania PDX. Wykazano również trzy różne metody inokulacji, które można wykorzystać do rozpoczęcia badań przedklinicznych podczas oceny przerzutów do OUN. Wybrana metoda powinna zależeć od celów eksperymentu. W niektórych przypadkach korzystne byłoby zastosowanie więcej niż jednej drogi inokulacji. Na przykład podskórna implantacja boku zapewnia proste podejście do badania skuteczności leku na wzrost guza i oceny leku pod kątem jego celu, a także zapewnia wizualizację wielkości guza, którą można łatwo monitorować i mierzyć. Jednak po ustaleniu docelowej wykonalności i właściwości przeciwnowotworowych wzrostu, można przeprowadzić badanie ortotopowe, aby ocenić skuteczność leku biologicznego w przekraczaniu bariery krew-mózg i zbadać jego wpływ w mikrośrodowisku guza mózgu. Ponadto przeżycie jest lepiej oceniane w badaniach ortotopowych i dosercowych.
Iniekcja śródczaszkowa modeli PDX z przerzutami do mózgu jest często modelem przedklinicznym z wyboru ze względu na obecność mikrośrodowiska mózgu i bariery krew-mózg. Jednak badania wykazały, że przerzuty do mózgu mają zdolność modyfikowania bariery krew-mózg, co wpływa na przepuszczalność cząsteczek do guza16. Te zmiany w BBB nie byłyby odzwierciedlone przez guzy zagnieżdżone wewnątrzczaszkowo, a z tego powodu przedkliniczne badania leków mogą nie w pełni odzwierciedlać odpowiedzi guzów pacjenta. Nawet z tym zastrzeżeniem, wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe pozostaje najlepszą metodą testowania przepuszczalności i skuteczności leków przekraczających barierę krew-mózg w modelach przedklinicznych. Innym wyzwaniem związanym z modelami wewnątrzczaszkowymi jest to, że są one trudne do monitorowania wzrostu guza i wymagają zastosowania technik obrazowania. Transdukcja wirusowa PDX za pomocą markerów fluorescencyjnych lub bioluminescencyjnych jest tradycyjnie stosowana, ale może być trudna do przeprowadzenia. Jednak opracowywanych jest kilka technik obrazowania do stosowania u myszy, które nie wymagają wprowadzania markerów, co może poprawić łatwość monitorowania tych ortotopowych guzów mózgu w badaniach przedklinicznych. Należą do nich technologie obrazowania, takie jak obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MRI) i pozytonowa tomografia emisyjna (PET) oraz mikrotomografia komputerowa (micro-CT). Wreszcie, wstrzyknięcie wewnątrzczaszkowe może nie odzwierciedlać dokładnie mikrośrodowiska przerzutów do OUN poza mózgiem, na przykład w przypadku przerzutów do opon mózgowo-rdzeniowych. W takim przypadku można wykonać wstrzyknięcie do cisterna magna, aby dokładniej odwzorować przerzuty do opon mózgowo-rdzeniowych17.
Charakterystyka zarówno cech fenotypowych, jak i molekularnych modelu PDX jest istotna dla wyboru najlepszych modeli do badań przedklinicznych. Latencja guza może wynosić od 7 do 140 dni, a wskaźniki przyjmowania mogą być również bardzo zmienne12. Optymalna liczba zwierząt do wszczepienia implantu i czas rozpoczęcia leczenia musiałyby opierać się na charakterystyce każdego modelu PDX i muszą być określone empirycznie. Co więcej, profil molekularny nowotworów PDX jest również ważny dla wyboru najbardziej reprezentatywnych modeli PDX do badań przedklinicznych. Im bardziej model molekularnie reprezentuje tkankę dawcy, tym bardziej prawdopodobne jest, że będzie predykcyjny w odpowiedzi klinicznej. Kluczowe znaczenie ma również zapewnienie, że cele wybrane na podstawie danych z badań na ludziach są obecne w PDX wybieranych do badań i utrzymują się przez kilka pokoleń, jak wykazano, sukcesja klonalna jest związana z innym profilem genomowym dominującego klonu. W związku z tym profile fenotypowe i molekularne guzów PDX z przerzutami do OUN zostały szeroko scharakteryzowane przez wiele pokoleń12.
Pomimo wielu zalet stosowania modeli PDX z przerzutami do OUN, istnieje kilka ograniczeń związanych z ich stosowaniem. Po pierwsze, alternatywne mikrośrodowisko guza, a zwłaszcza brak układu odpornościowego, są dobrze udokumentowanymi ograniczeniami modeli PDX18. Ksenoprzeszczep ludzkiego guza u myszy powoduje zastąpienie ludzkiego zrębu przez zrąb myszy przy każdym kolejnym pasażu, a ludzki zrąb jest na ogół całkowicie zastąpiony po kilku przejściach19. Jednak różnice w mikrośrodowisku guza nie skutkują dużymi różnicami w profilu molekularnym guzów PDX implantowanych z boku w porównaniu z pierwotnym guzempacjenta 12, co sugeruje, że modele boczne nadal stanowią dobre modele eksperymentalne do badania przerzutów do OUN. Po drugie, wykorzystanie zwierząt z obniżoną odpornością skutkuje brakiem infiltracji komórek odpornościowych w guzie i ogólną odpowiedzią immunologiczną gospodarza, ograniczając podstawowy sposób, w jaki gospodarz próbuje zwalczać wzrost raka12. Podczas gdy humanizowane myszy wszczepione ludzkimi komórkami odpornościowymi są dostępne do badania interakcji określonych komórek odpornościowych z guzem, nadal istnieje wiele pytań i kontrowersji dotyczących podejść, metod i interpretacji tych wyników20.
Podczas gdy wykazano, że większość PDX jest genetycznie stabilna, my i inni wykazaliśmy, że w rzadkich przypadkach, nawet przy braku leczenia lub innych zewnętrznych nacisków selekcyjnych, mogą wystąpić zmiany w klonach guzów, takie jak niewielkie przejęcie klonów 12,14,15. Może to spowodować dramatyczne zmiany w profilu molekularnym, co ostatecznie sprawi, że guz nie będzie odzwierciedlał dominujących klonów w guzie pacjenta12. Podczas gdy PDX wykazujące sukcesję klonalną mogą być wykorzystywane w badaniach przedklinicznych, wiele genów przeznaczonych do celowania (np. Her2) może zostać utraconych wraz z sukcesją klonalną. Dlatego zachęca się do częstych badań przesiewowych modeli PDX w celu ustalenia, czy nadal utrzymują one profil molekularny pożądanego klonu.
Podsumowując, modele PDX stanowią doskonały system modelowy do badania nie tylko przerzutów do OUN, ale także innych typów nowotworów. Opracowanie tych modeli wykazało, że w dużej mierze odzwierciedlają one profil fenotypowy, molekularny i niejednorodność przerzutów do ośrodkowego układu nerwowegou ludzi 8,9,10,12. Służą one jako skuteczne modele do badania zarówno biologii przerzutów do OUN, jak i służą również jako fizjologicznie istotne modele przedkliniczne, zastępując nadużywane modele linii komórkowych historycznie używane do badań in vivo przerzutów do OUN. Niewątpliwie istnieją różnice między PDX a guzem pacjenta dawcy12,18. Wiedza o tych różnicach jest ważna dla prawidłowego planowania i realizacji badań przedklinicznych. Wreszcie, wybierając między kilkoma ścieżkami inokulacji, modele PDX są wszechstronne w swoim zastosowaniu, umożliwiając badanie wielu aspektów choroby. Modele PDX bez wątpienia odegrają ważną rolę w pogłębianiu naszej wiedzy na temat przerzutów do OUN i opracowywaniu nowych terapii.

Częstość występowania przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) wzrosła w ostatnich latach1,2,3. Tradycyjne terapie przerzutów do OUN, takie jak resekcja guza, radioterapia całego mózgu i radiochirurgia stereotaktyczna, były w dużej mierze paliatywne i rzadko lecznicze, i mogą prowadzić do wyniszczających skutków ubocznych, takich jak pogorszenie funkcji poznawczych1. Ostatnio opracowywanych jest wiele nowych terapii celowanych i immunologicznych do leczenia przerzutów do OUN, które dają nadzieję na zwiększenie skuteczności leczenia, a jednocześnie mają mniej skutków ubocznych4.
Przełożenie wyników przedklinicznych na znaczące kliniczne punkty końcowe często wymaga skutecznych i predykcyjnych strategii modelowania. Historycznie rzecz biorąc, modele ksenoprzeszczepów linii komórkowych były standardem w badaniach przedklinicznych w badaniach nad przerzutami do OUN. Jednak te modele linii komórkowych nie odzwierciedlają prawdziwego zachowania guza gospodarza ani nie reprezentują histologicznej lub molekularnej heterogeniczności choroby. Co więcej, modele linii komórkowych są w stanie przystosować się do warunków wzrostu in vitro, a tym samym utracić pierwotne właściwości guza gospodarza. Ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjenta (PDX), które wszczepiają guz pacjenta do myszy z niedoborem odporności lub humanizowanej, są coraz częściej stosowane w translacyjnych badaniach nad rakiem. Naukowcy wykazali, że modele PDX mogą zwykle wiernie odtworzyć wzrost guza, charakterystykę histologiczną, utrzymać niejednorodność guza, potencjał przerzutowy i molekularne cechy genetyczne. Ponadto modele PDX są prognostyczne i charakteryzują się okresem utajenia guza PDX z całkowitym przeżyciem pacjenta, a także wykazano, że dokładnie przewidują odpowiedź terapeutyczną w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów5,6.
Pojawiły się PDX z przerzutami do OUN. W większości przypadków zostały one opracowane jako nowotwory pochodzące z jednego źródła, takie jak niedrobnokomórkowy rak płuc (NSCLC)7, rak piersi8,9 i czerniak10,11. Ostatnio opracowano i scharakteryzowano dużą i zróżnicowaną kolekcję modeli PDX, reprezentujących osiem różnych podtypów histologicznych12. Wykazano, że modele PDX dla przerzutów do OUN bardzo przypominają pierwotny guz pacjenta, zarówno histologicznie, jak i molekularnie, a także wykazały histologiczne unikalne różnice i podobieństwa10,12. Ponadto, podczas gdy większość modeli PDX z przerzutami do OUN utrzymuje heterogeniczność klonalną ludzkich nowotworów, niektóre wykazywały dowody na sukcesję klonalną12, co czyni je również idealnymi do badania oporności na terapie poprzez monitorowanie zmian klonalnych po leczeniu.
Opisane tutaj protokoły opisują metody tworzenia PDX i różne drogi inokulacji stosowane w badaniach przedklinicznych nad przerzutami do OUN (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Te metody implantacji różnią się zdolnością do naśladowania wzrostu i przerzutów. W tym miejscu protokół podkreśla zastosowania dla każdej drogi implantacji i pokazuje, w jaki sposób można je wykorzystać do badania przerzutów do OUN.

<table><tbody><tr><td>Igła 25G</td><td>VWR</td><td>BD305122</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro; m Sitko do komórek</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki 70% etanolu</td><td>VWR</td><td>470106-486</td><td></td></tr><tr><td>Wosk kostny</td><td>MedVet</td><td>W31G-RL</td><td></td></tr><tr><td>Mysz CIEA NOG</td><td>Taconic</td><td>NOG-F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Ethiqa XR (buprenorfina SR)</td><td>MWI</td><td>072117</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>16000044</tr><tr><td>gentleMACS C Tube</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo Disocation</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Hamilton</td><td>Sigma</td><td>20919</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o obniżonym czynniku wzrostu (GFR)</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>MedVet</td><td>PH-PURALUBE-VET</td><td></td></tr><tr><td>PBS/DPBS</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Waciki jodowe Povidone</td><td>VWR</td><td>15648-906</td><td></td></tr><tr><td>Ramka stereotaktyczna</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td></td></tr><tr><td>Wiertło chirurgiczne</td><td>Stoelting</td><td>58610</td><td></td></tr><tr><td>Klej chirurgiczny</td><td>MedVet</td><td>VG3</td><td></td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne</td><td>MedVet</td><td>MMV-661-V</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>VWR</td><td>53548-001</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji guza</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-929</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

The Establishment and Utilization of Patient Derived Xenograft Models of Central Nervous System Metastasis

Rozwój nowych terapii przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego (OUN) został zahamowany przez brak modeli przedklinicznych, które dokładnie reprezentują chorobę. Wykazano, że modele ksenoprzeszczepów (PDX) przerzutów do OUN pochodzące od pacjentów lepiej reprezentują fenotypowe i molekularne cechy choroby ludzkiej, a także lepiej odzwierciedlają heterogeniczność i dynamikę klonalną nowotworów pacjentów u ludzi w porównaniu z historycznymi modelami linii komórkowych. Istnieje wiele miejsc, które można wykorzystać do wszczepienia tkanki pobranej od pacjenta podczas organizowania badań przedklinicznych, z których każde ma swoje zalety i wady, a każde nadaje się do badania różnych aspektów kaskady przerzutowej. W tym miejscu protokół opisuje, jak ustanowić modele PDX i przedstawia trzy różne podejścia do wykorzystania modeli PDX z przerzutami do OUN w badaniach przedklinicznych, omawiając każde z ich zastosowań i ograniczeń. Należą do nich implantacja boku, iniekcja ortotopowa do mózgu i iniekcja dosercowa. Podskórna implantacja boczna jest najłatwiejsza do monitorowania, a zatem najwygodniejsza w badaniach przedklinicznych. Ponadto zaobserwowano przerzuty do mózgu i innych tkanek po implantacji boku, co wskazuje, że guz przeszedł wiele etapów przerzutów, w tym wynaczynienie, wynaczynienie i kolonizację. Wstrzyknięcie ortotopowe do mózgu jest najlepszą opcją do rekapitulacji mikrośrodowiska guza mózgu i jest przydatne do określenia skuteczności leków biologicznych w przekraczaniu bariery krew-mózg (BBB), ale omija większość etapów kaskady przerzutów. Wstrzyknięcie dosercowe ułatwia przerzuty do mózgu, a także jest przydatne do badania tropizmu narządów. Chociaż ta metoda pomija wcześniejsze etapy kaskady przerzutowej, komórki te nadal będą musiały przetrwać krążenie, wynaczynić i skolonizować. Na użyteczność modelu PDX ma zatem wpływ droga inokulacji nowotworu, a wybór, który z nich wykorzystać, powinien być podyktowany pytaniem naukowym i ogólnymi celami eksperymentu.

Guzy PDX propagowane podskórnie w obrębie boku są najłatwiejsze do implantacji, monitorowania i resekcji, co czyni je ogólnie zalecanymi do wstępnego ustanawiania i propagacji guzów PDX (Rycina 1). Podczas ustanawiania lub propagowania guzów PDX zasadne jest implantowanie ich u wielu zwierząt, ponieważ wskaźnik przyjęcia guza może się różnić i nie każdy fragment tkanki nowotworowej zawsze zostanie przyjęty przez myszy. Opracowano metody ustanawiania i propagowania PDX przerzutów OUN bezpośrednio w mózgu13. Jednakże metody te są wciąż bardziej wymagające, charakteryzują się niższymi wskaźnikami przyjęcia, a guzy są znacznie trudniejsze do propagowania i monitorowania niż w przypadku implantacji podskórnej.
Jeśli guzy pacjentów nie są łatwo dostępne, guzy PDX z przerzutów do OUN można również pozyskać z różnych źródeł, w tym z repozoriów laboratoriów akademickich lub firm komercyjnych. Po pozyskaniu guzów priorytetem powinno być namnożenie i kriokonserwacja jak największej ilości materiału, aby zapewnić zachowanie dużej liczby guzów o niskim numerze pasażu. Gwarantuje to dostępność wystarczającej ilości materiału do nieokreślonej liczby kolejnych badań z wykorzystaniem modeli PDX. Podobnie jak w przypadku unieśmiertelnionych linii komórkowych, guzy PDX powinny być kriokonserwowane i wykorzystywane przy niskich numerach pasażu, ponieważ dryf genetyczny prowadzi z czasem do zmian w fenotypie i genotypie modeli PDX12,14,15. Niezależnie od źródła guzów PDX, ważne jest przeprowadzanie częstych badań przesiewowych kolonii PDX i myszy w kierunku patogenów ludzkich i mysich, takich jak HIV i zapalenie wątroby u ludzi oraz Corynebacterium bovis u myszy. Ograniczy to rozprzestrzenianie się niepożądanych patogenów z modelu PDX zarówno na osoby nimi manipulujące, jak i na inne myszy w badaniu oraz w wirsarium.
Opisane tutaj metody implantacji mogą być wykorzystywane do badania biologii nowotworów, oceny wielu aspektów kaskady przerzutowej oraz w badaniach przedklinicznych. Główną zaletą implantacji w okolicach bocznych brzucha jest łatwość monitorowania guza w czasie, ponieważ nowotwory są widoczne, a ich wzrost można łatwo zmierzyć za pomocą suwmiarki. Metoda ta może być dobrym punktem wyjścia do ustalenia wykonalności celowania w dany punkt uchwytu leku. Implantacji wewnątrzczaszkowej preferuje się w sytuacjach, gdy obecność mikrośrodowiska mózgu jest istotna i może zmienić wzrost lub profil molekularny guza. Ponadto implantacja wewnątrzczaszkowa umieszcza guz za barierą krew-mózg (BBB), co czyni ją niezbędną w badaniach przedklinicznych sprawdzających skuteczność leków, które muszą pokonać BBB. Jednak monitorowanie wzrostu guzów PDX jest utrudnione i wymaga obrazowania radiologicznego lub obrazowania bioluminescencyjnego, jeśli komórki są znakowane. Określenie momentu rozpoczęcia leczenia przedklinicznego wymagałoby albo danych z obrazowania w celu monitorowania wzrostu, albo wiedzy o średnim przeżyciu myszy z konkretnym guztem PDX. Co więcej, implantacja wewnątrzczaszkowa omija wszystkie istotne etapy kaskady przerzutowej, przez co nadaje się wyłącznie do badania skuteczności leków i mikrośrodowiska nowotworowego w obrębie mózgu. Pomimo różnic w mikrośrodowisku nowotworowym, morfologia guzów PDX jest podobna niezależnie od miejsca implantacji, co można zaobserwować w przypadku tego guza PDX (CM04) pochodzącego z przerzutu do mózgu, który wyewoluował z pierwotnego nowotworu drobnokomórkowego raka płuca (Ryc. 2). Morfologia drobnokomórkowego raka płuca, charakteryzująca się komórkami nowotworowymi z małymi jądrami i skąpą cytoplazmą, jest widoczna w guzie w okolicy bocznej, guzie wewnątrzczaszkowym oraz w przerzucie do jamy brzusznej powstałym w wyniku iniekcji wewnątrzsercowej. Co więcej, wcześniej obserwowano przerzuty spontaniczne z guzów implantowanych w okolicach bocznych12, co sugeruje, że procesy przerzutowe, takie jak intrawasacja, ekstrawasacja i kolonizacja, mogą być odwzorowane i badane w guzach w okolicach bocznych, co w innym przypadku nie byłoby możliwe przy guzach ortotopowych w mózgu. Ogólnie stwierdza się, że implantacja w okolicach bocznych jest odpowiednią metodą badania biologii przerzutów do OUN oraz prowadzenia badań przedklinicznych.
Wtryskiwanie wewnątrzsercowe jest najczęściej stosowane do badania tropizmu narządowego i potencjału przerzutowego nowotworów. Wstrzyknięte komórki nowotworowe muszą przejść przez kilka etapów kaskady przerzutowej, w tym przetrwanie w krwiobiegu, ekstrawazację i kolonizację miejsca przerzutu. Podobnie jak w przypadku wstrzykiwania ortotopowego do mózgu, monitorowanie postępu przerzutowania nowotworu bez obrazowania radiologicznego lub znakowania komórek może być trudne. Jednak, podobnie jak przy implantacji ortotopowej, udana inokulacja prowadzi do stopniowego pogarszania się stanu zwierząt w miarę rozprzestrzeniania się guza. Rycina 3A przedstawia przerzuty do mózgu po wtryskiwaniu wewnątrzsercowym w modelu PDX przerzutów do OUN, M2, wywodzącym się z czerniaka. Wstrzyknięcie wewnątrzsercowe guza PDX (CM04) doprowadziło do powstania przerzutów w jamie brzusznej i wątrobie (Rycina 3B). W innych ocenianych narządach, takich jak płuca, nerki i jajniki, nie stwierdzono widocznych przerzutów.
<img alt="Schemat modelu PDX: przetwarzanie tkanki nowotworowej, tworzenie, propagacja i wykorzystanie w badaniach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schemat blokowy przedstawiający ogólny przebieg procesu tworzenia, propagacji i wykorzystania PDX w badaniach przedklinicznych. Dla każdej metody inokulacji poniżej wymieniono zaangażowane etapy kaskady przerzutowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie histologiczne metod iniekcji w przekrojach tkanek: boczna, wewnątrzczaszkowa, wewnątrzsercowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Histologia guzów PDX po różnych metodach inokulacji. Barwienie hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) guza PDX z przerzutu do OUN, pochodzącego z raka drobnokomórkowego płuca (CM04), wszczepionego myszom z niedoborem odporności trzema metodami; wykazują one podobne cechy patohistologiczne i morfologiczne raków drobnokomórkowych płuca, z małymi jądrami i skąpą cytoplazmą. Panel iniekcji wewnątrzsercowej przedstawia przerzut do jamy brzusznej. W trzech obrazach widoczne są gniazda małych komórek oraz wysoki stosunek jądra do cytoplazmy. Obrazy wykonano za pomocą skanera slajdów przy powiększeniu 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Histologia przerzutów w mózgu, jamie brzusznej i wątrobie; badanie mikroskopowe, analiza tkanek, rozprzestrzenianie się guza." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62264/62264fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Przerzuty zaobserwowane po wstrzyknięciu wewnątrzsercowym. Barwienie H&amp;E tkanek z widocznymi przerzutami podczas oceny sekcyjnej po wstrzyknięciu wewnątrzsercowym (A) M2 oraz (B) CM04. Obrazy wykonano (A) za pomocą skanera preparatów przy powiększeniu 1x (lewo) lub 20x (prawo) lub (B) za pomocą zwykłego mikroskopu przy powiększeniu 10x. Rycina ta została zmodyfikowana z naszej poprzedniej publikacji12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62264/62264fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

The development of novel therapies for central nervous system (CNS) metastasis has been hindered by the lack of preclinical models that accurately ...

Rozwój nowych terapii przerzutów do OUN jest utrudniony ze względu na brak dobrych modeli przedklinicznych. Nasze modele ksenoprzeszczepów pochodzące od pacjentów podsumowują przerzuty do OUN lepiej niż historycznie stosowane modele linii komórkowych. Wykorzystując różne drogi inokulacji nowotworu, można badać różne aspekty kaskady przerzutowej.Każda trasa ma zalety, które można wykorzystać w swoim badaniu. Procedurę zademonstruje Ben Yi Tew, doktor habilitowany z mojego laboratorium. W celu podskórnej implantacji boków kriokonserwowanych guzów PDX, szybko rozmrozić kriokonserwowaną tkankę nowotworową w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie opłucz go w pięciu mililitrach DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej. Następnie, po potwierdzeniu znieczulenia u trzy- do ośmiotygodniowej samicy myszy NOG, wykonaj nacięcie o długości od 0,5 do jednego centymetra na lewym lub prawym boku i włóż jeden kawałek tkanki nowotworowej o wymiarach 2x2x2 milimetry głęboko do kieszonki. Po zamknięciu nacięcia pozwól myszy dojść do siebie po znieczuleniu z monitorowaniem, aż będzie w stanie ambulatoryjnym.Gdy guz zacznie rosnąć, mierz guz trzy razy w tygodniu za pomocą suwmiarki. W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy zidentyfikować przerzuty poprzez sekcję zwłok i potwierdzić obecność guzów w narządzie docelowym za pomocą analizy histologicznej. Umieść wycięty guz PDX w DMEM na lodzie.Umyj guz w pięciu mililitrach DPBS w naczyniu do hodowli tkankowej i usuń martwicze obszary, jeśli takie istnieją. Pokrój guz na małe kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów i przenieś je do probówki zawierającej roztwór dysocjacyjny. Używając odpowiedniego programu na dysocjatorze, mechanicznie zdysocjuj tkankę i przecedź powstałą zawiesinę komórek przez sitko o średnicy 70 mikrometrów.Użyj 20 mililitrów DMEM, aby zmyć wszelkie pozostałe komórki z sitka i odwirować zdysocjowaną zawiesinę komórek. Następnie ponownie zawieś komórki i DPBS do liczenia i dostosuj komórki do stężenia od pięciu do 10 razy 10 do czwartych komórek na jeden do dwóch mikrolitrów DPBS. Aby przygotować obszar operacyjny, ogol sierść na głowie myszy, aby odsłonić skórę głowy.Następnie umieść mysz w ramce stereotaktycznej, mocno zabezpieczając głowę myszy za pomocą nauszników. Upewnij się również, że podajesz odpowiedni środek przeciwbólowy. Zdezynfekuj skórę głowy trzema naprzemiennymi peelingami z jodonu powidonu i 70% etanolu.Wykonaj podłużne nacięcie o długości od pięciu do siedmiu milimetrów, aby odsłonić czaszkę i cofnąć skórę głowy. Zeskrob okostną kleszczami, aby zlokalizować bregmę. Umieść igłę ramy stereotaktycznej na górze bregmy i zresetuj współrzędne do zera.Przesuń ramię o jeden milimetr do tyłu i jeden milimetr w bok na prawo od linii środkowej i zaznacz to miejsce trwałym markerem. Następnie wywierć mały otwór w czaszce w zaznaczonym miejscu, uważając, aby nie wwiercić się w mózg. Załaduj do pięciu mikrolitrów strzykawki Hamiltona o rozmiarze 26 z jednym do dwóch mikrolitrów komórek i przymocuj strzykawkę do ramienia stereotaktycznego.Powoli wbij igłę na dwa milimetry do mózgu i zacznij wstrzykiwać komórki z pożądaną szybkością. Kiedy wszystkie komórki zostaną dostarczone, powoli wycofaj igłę, wypełnij otwór w zadziorach woskiem kostnym i zamknij nacięcie. Umieść mysz z powrotem w klatce z monitorowaniem do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia.Po uśpieniu zwierzęcia w odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy potwierdzić obecność guzów w mózgu za pomocą analizy histologicznej. Aby wszczepić guzy PDX przez wstrzyknięcie dosercowe, przygotuj komórki nowotworowe, jak pokazano, i umieść znieczuloną mysz biorcy w pozycji leżącej. Ogol sierść na klatce piersiowej zwierzęcia i zdezynfekuj odsłoniętą skórę jodonem i 70% etanolem.Narysuj 0,5 do 10 razy 10 do piątej komórki nowotworowej i do 100 mikrolitrów DPBS do strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 28. Zlokalizować miejsce wstrzyknięcia nieco na lewo od mostka, w połowie odległości między wcięciem mostka a wyrostkiem mieczykowatym. Następnie należy wprowadzić igłę pionowo do myszy w miejscu wstrzyknięcia.Po zaobserwowaniu przepływu wstecznego, wskazującego na pomyślne wprowadzenie igły do lewej komory, powoli dozuj zawiesinę guza do lewej komory, nie przesuwając igły. Po dostarczeniu wszystkich komórek powoli i pionowo wycofaj igłę i przyłóż kawałek sterylnej gazy do miejsca wstrzyknięcia na około jedną minutę, aż krwawienie ustanie. Pozwól myszy odzyskać sprawność na podgrzewanej podkładce z monitorowaniem, aż zacznie chodzić.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym należy zidentyfikować przerzuty poprzez sekcję zwłok i potwierdzić obecność guzów w narządzie docelowym za pomocą analizy histologicznej. Pomimo różnic w mikrośrodowisku guza, guzy PDX wykazują podobną morfologię zawierającą komórki o małych jądrach i skąpej cytoplazmie, niezależnie od miejsca implantacji. W tej analizie wstrzyknięcie dosercowe ludzkich komórek czerniaka spowodowało przerzuty komórek nowotworowych do mózgu myszy, podczas gdy wstrzyknięcie dosercowe komórek nowotworowych ludzkiego drobnokomórkowego raka płuc do mózgu spowodowało przerzuty do jamy brzusznej myszy i wątroby.Protokoły te umożliwiają rozpoczęcie badań przedklinicznych w celu przetestowania nowych metod leczenia i kombinacji leczenia oraz mogą pomóc w badaniu procesów biologicznych i przerzutów nowotworowych.

the-establishment-utilization-patient-derived-xenograft-models

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Przeszczepianie komórek nowotworowych jest ważnym narzędziem do identyfikacji mechanizmów nowotworowych i odpowiedzi terapeutycznych. Obecne techniki opierają się na zwierzętach niekompetentnych immunologicznie. W tym miejscu opisujemy metodę przeszczepiania komórek nowotworowych danio pręgowanego do zarodków kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowej analizy zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki in vivo.

Przeszczepianie pediatrycznych guzów mózgu danio pręgowanego do gospodarzy kompetentnych immunologicznie w celu długoterminowego badania zachowania komórek nowotworowych i odpowiedzi na leki

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Modele ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) bardziej solidnie rekapitulują molekularne i biologiczne cechy czerniaka i są bardziej predykcyjne dla odpowiedzi na terapię w porównaniu do tradycyjnych testów opartych na hodowli tkanek plastycznych. W tym miejscu opisujemy nasz standardowy protokół operacyjny do tworzenia nowych modeli PDX oraz charakteryzacji/eksperymentowania z istniejącymi modelami PDX.

Model ksenoprzeszczepu pobrany od pacjenta z czerniakiem

Obecny protokół opisuje metody tworzenia modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta (PDX) i pierwotnych linii komórek rakowych z próbek chirurgicznego raka żołądka. Metody te stanowią użyteczne narzędzie do opracowywania leków i badań w zakresie biologii nowotworów.

Opracowanie modeli ksenoprzeszczepów i pierwszorzędowych linii komórkowych pochodzących od pacjentów z rakiem żołądka

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Obecny protokół ustanawia i charakteryzuje model ksenoprzeszczepu (PDX) anaplastycznego raka tarczycy (ATC) oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC) pochodzącego od pacjenta, ponieważ modele PDX szybko stają się standardem w dziedzinie onkologii translacyjnej.

Opracowanie i charakterystyka modeli ksenoprzeszczepów anaplastycznego raka tarczycy oraz raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzących od pacjentów

Obecny protokół opisuje metodę tworzenia mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta (PDX) przy użyciu ludzkiej tkanki kostniakomięsaka.

Opracowanie mysiego modelu ksenoprzeszczepu pochodzącego od pacjenta z tkankami ludzkiego kostniakomięsaka

Tutaj prezentujemy protokół generowania organoidów pochodzących od pacjentów z czerniakiem poprzez hodowlę oddzielonych zawiesin komórkowych ze świeżych tkanek czerniaka. Organoidy te wiernie odwzorowują specyficzne dla pacjenta nowotwory in vitro, oferując innowacyjne podejście do badania mechanizmów immunosupresyjnych nowotworów, badań przesiewowych leków, mechanizmów oporności na leki i podejść do nadzoru nad rakiem.

Odkrywanie możliwości terapeutycznych dzięki modelom organoidowym pochodzącym od pacjentów z czerniakiem

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj trzy metody implantacji ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów w celu badania przerzutów do ośrodkowego układu nerwowego. Protokoły obejmują podskórną, ortotopową i wewnątrzsercową iniekcję komórek nowotworowych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Przeglądaj więcej filmów