Name: Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Poznaj procedurę kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie myszy. Ta metoda umożliwia długoterminowe obrazowanie węglanów wapnia i napięcia z rozdzielczością pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować wszystkim członkom Grupy BioInżynierii Molekularnej na Uniwersytecie Westlake za wszelką pomoc i pożyteczną dyskusję. Dziękujemy również Jinze Li i Jie-Min Jia z Uniwersytetu Westlake za pomoc w filmowaniu zabiegu chirurgicznego.
Ta praca była wspierana przez fundusze start-upowe z Fundacji Uniwersytetu Westlake, 2020 BBRF Young Investigator Grant oraz grant National Natural Science Foundation of China 32050410298 wszystko dla K.D.P.

<ol><li>Leutgeb, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+Codes+for+Spatial+and+Episodic+Memory+in+Hippocampal+Neuronal+Ensembles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent Codes for Spatial and Episodic Memory in Hippocampal Neuronal Ensembles.</a> Science. 309 (5734), 619-623 (2005).</li>
<li>Harvey, C. D., Collman, F., Dombeck, D. A., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+dynamics+of+hippocampal+place+cells+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracellular dynamics of hippocampal place cells during virtual navigation.</a> Nature. 461 (7266), 941-946 (2009).</li>
<li>Polanco, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+and+tau+complexity+-+towards+improved+biomarkers+and+targeted+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neurology%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β and tau complexity - towards improved biomarkers and targeted therapies.</a> Nature Reviews Neurology. 14 (1), 22-39 (2018).</li>
<li>Henneman, W. J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+atrophy+rates+in+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Added+value+over+whole+brain+volume+measures%22%5BJournal%5D)">Hippocampal atrophy rates in Alzheimer disease.</a> Added value over whole brain volume measures. 72 (11), 999-1007 (2009).</li>
<li>Camicioli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease+is+associated+with+hippocampal+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease is associated with hippocampal atrophy.</a> Mov Disord. 18 (7), 784-790 (2003).</li>
<li>Piatkevich, K. D., Murdock, M. H., Subach, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Engineering+and+Application+of+Optogenetic+Indicators+for+Neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Advances in Engineering and Application of Optogenetic Indicators for Neuroscience.</a> Applied Sciences. 9 (3), 562(2019).</li>
<li>Piatkevich, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+imaging+of+neural+activity+in+awake+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Population imaging of neural activity in awake behaving mice.</a> Nature. 574 (7778), 413-417 (2019).</li>
<li>Fan, L. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-Optical+Electrophysiology+Reveals+the+Role+of+Lateral+Inhibition+in+Sensory+Processing+in+Cortical+Layer+1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">All-Optical Electrophysiology Reveals the Role of Lateral Inhibition in Sensory Processing in Cortical Layer 1.</a> Cell. 180 (3), 521-535 (2020).</li>
<li>Shemesh, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+Calcium+Imaging+of+Dense+Neural+Populations+via+a+Cell-Body-Targeted+Calcium+Indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Precision Calcium Imaging of Dense Neural Populations via a Cell-Body-Targeted Calcium Indicator.</a> Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).</li>
<li>Villa, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+Synapses+Are+Repeatedly+Assembled+and+Removed+at+Persistent+Sites+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Inhibitory Synapses Are Repeatedly Assembled and Removed at Persistent Sites In Vivo.</a> Neuron. 89 (4), 756-769 (2016).</li>
<li>Franklin, K. B. J., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+KBJ+%22Paxinos+and+Franklin%27s+The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">Paxinos and Franklin's The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , (2013).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> Journal of Visualized Experiments. (12), e680(2008).</li>
<li>Subach, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Genetically+Encoded+Bright+Positive+Calcium+Indicator+NCaMP7+Based+on+the+mNeonGreen+Fluorescent+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1644(2020).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Kaifosh, P., Lovett-Barron, M., Turi, G. F., Reardon, T. R., Losonczy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septo-hippocampal+GABAergic+signaling+across+multiple+modalities+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Septo-hippocampal GABAergic signaling across multiple modalities in awake mice.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1182-1184 (2013).</li>
<li>Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L., Tank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+of+hippocampal+place+cells+at+cellular+resolution+during+virtual+navigation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation.</a> Nature Neuroscience. 13 (11), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Kalmbach, A. S., Waters, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+surface+temperature+under+a+craniotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Brain surface temperature under a craniotomy.</a> Journal of neurophysiology. 108 (11), 3138-3146 (2012).</li>
<li>Roche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+with+a+water+immersion+objective+affects+brain+temperature%2C+blood+flow+and+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging with a water immersion objective affects brain temperature, blood flow and oxygenation.</a> eLife. 8, 47324(2019).</li>
<li>Watakabe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analyses+of+adeno-associated+viral+vector+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+8+and+9+in+marmoset%2C+mouse+and+macaque+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Comparative analyses of adeno-associated viral vector serotypes 1, 2, 5, 8 and 9 in marmoset, mouse and macaque cerebral cortex.</a> Neuroscience Research. 93, 144-157 (2015).</li>
<li>Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCastle%2C+MJ+%22Gene+Therapy+for+Neurological+Disorders%3A+Methods+and+Protocols%22">Gene Therapy for Neurological Disorders: Methods and Protocols</a>. Manfredssonn, F. P. , Springer. New York. 133-149 (2016).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Yashiro, H., Nakahara, I., Funabiki, K., Riquimaroux, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-endoscopic+system+for+functional+assessment+of+neural+circuits+in+deep+brain+regions%3A+Simultaneous+optical+and+electrical+recordings+of+auditory+responses+in+mouse%27s+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Micro-endoscopic system for functional assessment of neural circuits in deep brain regions: Simultaneous optical and electrical recordings of auditory responses in mouse's inferior colliculus.</a> Neuroscience Research. 119, 61-69 (2017).</li>
<li>Attardo, A., Fitzgerald, J. E., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impermanence+of+dendritic+spines+in+live+adult+CA1+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Impermanence of dendritic spines in live adult CA1 hippocampus.</a> Nature. 523 (7562), 592-596 (2015).</li>
<li>Mizrahi, A., Crowley, J. C., Shtoyerman, E., Katz, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Resolution+In+Vivo+Imaging+of+Hippocampal+Dendrites+and+Spines%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-Resolution In Vivo Imaging of Hippocampal Dendrites and Spines.</a> The Journal of Neuroscience. 24 (13), 3147(2004).</li>
<li>Busche, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+soluble+amyloid-%CE%B2+for+early+hippocampal+hyperactivity+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Critical role of soluble amyloid-β for early hippocampal hyperactivity in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8740(2012).</li>
<li>Attardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Consolidation+of+Ensemble+Neural+Plasticity+Patterns+in+Hippocampal+Area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-Term Consolidation of Ensemble Neural Plasticity Patterns in Hippocampal Area CA1.</a> Cell Reports. 25 (3), 640-650 (2018).</li>
<li>Castello-Waldow, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+neurons+with+stable+excitatory+connectivity+become+part+of+neuronal+representations%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">Hippocampal neurons with stable excitatory connectivity become part of neuronal representations.</a> PLOS Biology. 18 (11), 3000928(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy metodę długoterminowego obrazowania regionu CA1 hipokampa u zachowujących się myszy. Metoda opiera się na chronicznym wszczepianiu specjalnie dostosowanego okna obrazowania, które umożliwia również celowane podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do interesujących neuronów. Niniejszy protokół składa się z czterech głównych części: i) montażu implantu obrazowego; ii) instalacja implantu do obrazowania; iii) wstrzyknięcie wirusa za pomocą implantu do obrazowania; iv) obrazowanie funkcjonalne u zachowujących się myszy. Poniżej opisujemy i omawiamy krytyczne kroki w protokole, rozwiązywanie problemów, modyfikacje i ograniczenia metody. Omówiono również znaczenie metody i jej potencjalne alternatywne zastosowania.
W opisanym protokole znajduje się kilka krytycznych etapów, które są dość ważne dla udanej operacji: (i) przygotowanie wysokiej jakości implantu obrazowego; (ii) sterylne warunki chirurgiczne; (iii) aspiracja kory mózgowej; (iv) precyzyjne umieszczenie implantu do obrazowania; (v) wstrzyknięcie wirusa. Jak wskazuje krok 1.6, nadmiar cyny lutowniczej wymagałby większej kraniotomii, a tym samym zwiększa ryzyko stanu zapalnego. Bardzo ważne jest również, aby podczas mocowania szkła nakrywkowego do kaniuli obrazowej użyć odpowiedniej ilości kleju optycznego, jak wskazano w kroku 1.11, ponieważ niewystarczająca ilość może spowodować wyciek płynu mózgowo-rdzeniowego do kaniuli obrazowej i jej zmętnienie. Z drugiej strony, nadmiar kleju optycznego może skutkować zmniejszoną przezroczystością szklanego okna. Ewentualne zanieczyszczenie implantu obrazowego może spowodować aktywną proliferację tkanki łącznej pod oknem optycznym i/lub ciężki stan zapalny, który doprowadzi do przedwczesnego zakończenia eksperymentu. Dlatego obrazowanie, montaż implantu i przygotowanie przed zabiegiem jest prawie tak samo ważne, jak sam zabieg chirurgiczny.
Podczas operacji część kory pod kraniotomią jest ablowana przez delikatne aspiracje, co skutkuje nieuchronnym krwawieniem. Krew w miejscu operacji znacznie zmniejsza widoczność tkanki mózgowej, która musi zostać usunięta. Komplikuje to precyzyjną ocenę wymaganej głębokości ablacji tkanek. Ostrożne przepłukiwanie pola operacyjnego PBS za każdym razem przed zastosowaniem ssania w celu usunięcia następnej części tkanki zapewnia lepszą kontrolę głębokości. Tkanka mózgowa powinna być zawsze usuwana małymi porcjami, krok po kroku, potwierdzając głębokość ablowanej tkanki przed przystąpieniem do dalszego odsysania. Dokładniejszą kontrolę ssania można również osiągnąć za pomocą cieńszej, igły. Sugerujemy użycie igły o średnicy 26 G, jednak średnica mniejsza niż 26 G jest bardziej podatna na zapychanie. Co więcej, zwykle potrzeba dużo praktyki, aby określić dokładną głębokość aspiracji wymaganą dla każdego zwierzęcia, ponieważ kolor kory, ciała modzelowatego i hipokampa może się różnić w zależności od myszy (ryc. 3).
Wprowadzenie i zabezpieczenie implantu obrazowego powinno być wykonane bardzo precyzyjnie, aby zapewnić jak najbliższe położenie okienka obrazowego względem grzbietowej powierzchni hipokampa. Wielkość przygotowanej kraniotomii powinna ściśle przylegać do implantu i umożliwiać jego wprowadzenie bez znacznego oporu. Jednocześnie nie powinno być widocznej szczeliny między czaszką a implantem, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie i uniknąć odsłonięcia tkanki mózgowej. Na wierzch implantu należy wywierać delikatny i stabilny nacisk podczas jego uszczelniania do czaszki. Jest prawie nieuniknione, że podczas wszczepiania implantu pod okienkiem obrazowym znajduje się krew. Jeśli zabieg chirurgiczny zostanie wykonany prawidłowo, okno powinno się oczyścić w ciągu 3-7 dni, a unaczynienie mózgu stanie się wyraźnie widoczne. Ważne jest również, aby upewnić się, że wirus został prawidłowo wstrzyknięty pod okno. W przypadku nieudanego wyrażenia, wirus może zostać ponownie wstrzyknięty wiele razy.
Główną komplikacją, z którą spotkaliśmy się w niektórych przypadkach, jest zmniejszona widoczność okna obrazowania. Istnieje kilka możliwych przyczyn złej jakości obrazowania: i) trwający stan zapalny; ii) wyrostek tkanki łącznej na szkle; iii) duża szczelina między oknem a hipokampem. Stan zapalny jest zwykle spowodowany zanieczyszczeniem podczas operacji lub niewłaściwie wysterylizowanym implantem obrazowym. Sugerujemy autoklawowanie narzędzi chirurgicznych przed i po każdym zabiegu, dezynfekcję obszaru operacyjnego tuż przed zabiegiem oraz noszenie czystego sprzętu ochrony osobistej podczas zabiegu. Implanty obrazowe powinny być oczyszczone po złożeniu, wysterylizowane i przechowywane w sterylnych warunkach. Rozrost tkanki łącznej na szkle implantu obrazowego może być spowodowany zanieczyszczeniem mechanicznym powierzchni szkła lub nadmiernym urazem tkanki mózgowej podczas ablacji kory mózgowej. Po zamontowaniu implantu ważne jest, aby upewnić się, że szklana powierzchnia jest czysta i gładka. Ponadto wszystkie fragmenty uszkodzonej tkanki mózgowej muszą zostać ostrożnie usunięte przed wprowadzeniem implantu obrazowego do kraniotomii. W niektórych przypadkach szczelina między szklanym oknem a hipokampem powoduje gromadzenie się płynu mózgowo-rdzeniowego, co obniża jakość obrazowania. Dlatego podczas zakładania implantu ważne jest, aby wprowadzić go do końca, aby zapewnić dobry kontakt między hipokampem a szklanym okienkiem. Czasami trudno jest określić dokładną przyczynę nieprzezroczystego okna obrazowania. Sugerujemy przeprowadzenie analizy pośmiertnej w celu ujawnienia warunków pod oknem optycznym i odpowiedniego dostosowania kolejnych operacji.
Metoda ta ma kilka podstawowych i technicznych ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę przed i w trakcie obrazowania in vivo. Jednym z głównych ograniczeń jest ablacja kory mózgowej. Podczas operacji usuwana jest część kory wzrokowej i czuciowej. Chociaż trudno jest precyzyjnie ocenić wpływ ablacji kory mózgowej, ponieważ usunięta tkanka mózgowa nie rzutuje bezpośrednio na hipokamp, kilka badań nie wykazało zauważalnego upośledzenia uczenia się zależnego od hipokampa lub innych istotnych funkcji hipokampa15,16. Należy również wziąć pod uwagę ograniczenia optyczne, zwłaszcza gdy używane są soczewki obiektywowe o wysokim NA. Na przykład w tym badaniu użyliśmy kaniuli o długości 1,75 mm i średnicy wewnętrznej 1,9 mm. Geometria tej kaniuli nie zachowa pełnego NA obiektywu powietrznego z NA większym niż ~0,5 lub soczewki wodnej z NA większym niż ~0,6, ponieważ odetnie część światła. Innym ograniczeniem, wspólnym dla wszystkich implantów do obrazowania mózgu, jest to, że część mózgu jest odsłonięta, co sprzyja utracie ciepła17,18. Jednak fizjologiczną temperaturę mózgu można łatwo przywrócić podczas obrazowania poprzez perfuzję ciepłego bufora.
Opisana metoda może być łatwo modyfikowana lub dostosowywana do innych zastosowań. Na przykład preparat można dostosować do obrazowania prążkowia7. Ponieważ prążkowie leży nieco głębiej niż hipokamp, do montażu implantu obrazowego należy użyć dłuższej kaniuli obrazowej. Sugerujemy stosowanie kaniuli obrazowej 2,0 mm. Współrzędne kraniotomii należy odpowiednio dostosować (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Ponadto wstrzyknięcie wirusa za pomocą kaniuli infuzyjnej pozwala na osiągnięcie ekspresji transgenu w cienkiej warstwie neuronów przy użyciu serotypu AAV o ograniczonym rozprzestrzenianiusię 19,20. Jest to szczególnie korzystne w przypadku obrazowania jednofotonowego ze względu na zmniejszoną nieostrą fluorescencję z głębszych warstw, a w rezultacie lepsze obrazowanie w rozdzielczości pojedynczej komórki. Co więcej, kaniula iniekcyjna może być również używana podczas obrazowania funkcjonalnego do podawania leków lub innych substancji chemicznych bezpośrednio do neuronów w polu widzenia (ryc. 5B). Ogólnie rzecz biorąc, kaniula infuzyjna dodaje użyteczne funkcje do implantu obrazowania, poprawiając jakość obrazowania dzięki ukierunkowanej ekspresji wirusa i umożliwiając farmakologiczną stymulację neuronów w polu widzenia. Zastosowana płyta głowicy zapewnia niezwykłą stabilność obrazowania implantu, minimalizując artefakty ruchu nawet u aktywnie poruszających się zwierząt na bieżni. Płyta czołowa jest mała i lekka, co powoduje minimalny dyskomfort dla zwierząt i pozostaje stabilna przez kilka miesięcy po zamontowaniu. Implant obrazujący jest również kompatybilny z obrazowaniem wielofotonowym 15,16,21 i może być łączony z mikroendoskopami22,23. Podobny implant obrazowy zastosowano również do obrazowania wielofotonowego głębszych struktur hipokampa, w tym warstwy promieniowej, luknozy warstwowej i zakrętu zębatego 16,24,25,26,27. Jednak celowanie w głębsze struktury hipokampa za pomocą AAV za pomocą kaniuli infuzyjnej może wymagać dalszej optymalizacji serotypu AAV i objętości19.
Wierzymy, że opisany protokół ułatwi badania, które mają na celu zbadanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną w hipokampie zachowujących się myszy przy użyciu prostych i niedrogich zestawów obrazowania jednofotonowego.

Hipokamp to kluczowy obszar mózgu odpowiedzialny za uczenie się i pamięć1, a także za nawigację przestrzenną2. Zanik hipokampa jest związany z zaburzeniami neurologicznymi i psychiatrycznymi obejmującymi utratę pamięci i pogorszenie funkcji poznawczych3,4,5. U myszy hipokamp jest bardzo dobrze ugruntowanym modelem do badania przestrzennego, kontekstowego i asocjacyjnego uczenia się oraz tworzenia pamięci na poziomie komórkowym i sieciowym4,5. Mechanistyczne badania uczenia się i pamięci wymagają podłużnego badania struktury i funkcji neuronów u zachowujących się myszy. Obrazowanie fluorescencyjne w połączeniu z genetycznie kodowanymi sondami6 zapewnia bezprecedensowe możliwości rejestrowania dynamiki napięcia membrany7,8, calcium transients9, oraz zmiany strukturalne10 na dużych podzbiorach neuronów wewnątrzżyciowych. Jednak optyczny dostęp do hipokampa u myszy jest utrudniony przez korę, która może osiągnąć ponad 1 mm grubości. Tutaj opisaliśmy procedurę montażu wykonanego na zamówienie urządzenia do obrazowania i jego przewlekłego wszczepienia do głowy myszy w celu długotrwałego dostępu optycznego do podregionu CA1 grzbietowego hipokampa u zachowujących się myszy. Kaniula infuzyjna zintegrowana z implantem obrazowym umożliwia podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do neuronów w polu widzenia. Opisany preparat w połączeniu z mikroskopią szerokokątną umożliwia powtarzalne obrazowanie dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy w długich okresach czasu. Wykorzystaliśmy ten preparat do ekspresji genetycznie kodowanych wskaźników wapnia i napięcia w regionie CA1 hipokampa poprzez celowane wstrzyknięcie rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem (rAAV) do rejestracji aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki. Przeprowadziliśmy również podłużne obrazowanie wapnia odpowiednich podzbiorów neuronów w wysokiej rozdzielczości czasoprzestrzennej u zachowujących się zwierząt. Ponadto preparat ten jest kompatybilny z mikroskopią wielofotonową i mikroendoskopią, co jeszcze bardziej rozszerza zestaw technik obrazowania do badania sieci neuronalnych na poziomie komórkowym i subkomórkowym u zachowujących się myszy. Opisaliśmy krytyczne kroki i rozwiązywanie problemów z protokołem. Omówiliśmy również możliwe pułapki i ograniczenia metody.

<table><tbody><tr><td>Szkło nakrywkowe</td><td>Deckgl&auml; ser</td><td>72296-03</td><td></td></tr><tr><td>Proteza zębowa&nbsp; Żywica bazowa</td><td>ShangHai Nowy materiał Centery Dentel</td><td>Nie</td> dotyczy <td>typu I, samokrzepnąca</td></tr><tr><td>kaniula atrapy</td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62102</td><td>OD 0,30 mm</td></tr><tr><td>Kaniula prowadząca</td><td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62003</td><td>Widelec głowicy 26G</td></tr><tr><td></td><td>N/</td><td>A N/A</td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>płyta głowy</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wykonana na zamówienie</td></tr><tr><td>kaniula</td> <td>obrazowaN/A</td><td>N/A</td><td>wykonane na zamówienie; OD 3mm, ID 2.7mm, Wysokość 1.8mm, #108 Wewnętrzna</td></tr><tr><td>kaniula</td> ze stali nierdzewnej <td>RWD Life Science Co., LTD</td><td>62203</td><td>&nbsp; 0.30*0.14 (OD*ID, mm)</td></tr><tr><td>Kwik Sil</td><td>World Instrumenty precyzyjne</td><td>KWIK-SIL</td><td></td></tr><tr><td>SuperBond C& B</td><td>SUN MEDICAL</td><td>N/A</td><td>SuperBond C& Zestaw B</td></tr><tr><td>Zestaw</td><td>bieżni N/A</td><td>N/A</td><td>Wykonany na zamówienie</td></tr><tr><td>klej utwardzany promieniami UV</td><td>NORLAND PRODUCTS</td><td>NOA 60</td><td></td></tr></tbody></table>

procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Obrazowanie aktywności neuronalnej w rozdzielczości pojedynczej komórki u czuwających zwierząt jest bardzo skutecznym podejściem do badania funkcji obwodów nerwowych w neuronauce systemowej. Jednak wysoka absorbancja i rozpraszanie światła w tkance ssaków ograniczają obrazowanie przyżyciowe głównie do powierzchownych obszarów mózgu, pozostawiając głębokie obszary mózgu, takie jak hipokamp, poza zasięgiem mikroskopii optycznej. W tym filmie pokazujemy przygotowanie i implantację niestandardowego okna obrazowania, aby umożliwić przewlekłe obrazowanie in vivo grzbietowego regionu hipokampa CA1 u myszy zachowujących się jak głowa. Wykonane na zamówienie okienko jest uzupełnione o kaniulę infuzyjną, która umożliwia ukierunkowane dostarczanie wektorów wirusowych i leków do obszaru obrazowania. Łącząc ten preparat z obrazowaniem szerokokątnym, przeprowadziliśmy długoterminowe rejestrowanie aktywności neuronalnej za pomocą fluorescencyjnego wskaźnika wapnia z dużych podzbiorów neuronów u zachowujących się myszy przez kilka tygodni. Wykazaliśmy również przydatność tego preparatu do obrazowania napięcia z rozdzielczością pojedynczego skoku. Wysokowydajne, genetycznie kodowane wskaźniki aktywności neuronalnej i naukowe kamery CMOS pozwoliły na cykliczną wizualizację subkomórkowych szczegółów morfologicznych pojedynczych neuronów w wysokiej rozdzielczości czasowej. Omówiono również zalety i potencjalne ograniczenia opisywanej metody oraz jej kompatybilność z innymi technikami obrazowania.

Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej z użyciem genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia. Średnio obrazowanie in vivo rozpoczyna się 3–4 tygodnie po implantacji, jeśli osiągnięto wystarczający poziom ekspresji transgenu. Do tego czasu obrzęk mózgu i krwotoki zazwyczaj całkowicie ustępują, a naczynia krwionośne mózgu mogą być łatwo obserwowane przez okno optyczne. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy opisany preparat do wielokrotnych rejestracji aktywności neuronalnej w grzbietowej części obszaru CA1 hipokampa u myszy w stanie behawioralnym przy użyciu szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy jasnego genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia o nazwie NCaMP713, który wykazuje podobną czułość na wapń i rozdzielczość czasową co GCaMP6s14. Aby uzyskać ekspresję wskaźnika NCaMP7 w hipokampie, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7 za pomocą kaniuli infuzyjnej i rozpoczęliśmy obrazowanie podłużne 14 dni po iniekcji. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy obiektywu powietrznego 10x NA 0.3 oraz kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, która umożliwiła obrazowanie w polu widzenia (FOV) o rozmiarach ~1.5x1.5 mm z częstotliwością do 100 Hz. Fluorescencja zielona była wzbudzana za pomocą dostępnej komercyjnie diody LED 470 nm przy użyciu standardowego zestawu filtrów GFP. Średnia głębokość obrazowania osiągnięta w kanale zielonym wynosi około 50–120 µm, co pozwala na rejestrację aktywności neuronalnej głównie w stratum oriens i stratum pyramidale. Głębokość obrazowania w kanałach bliskiej podczerwieni może wynosić do 200 µm, docierając do głębszych warstw hipokampa8. Średni czas rejestracji na jedno FOV wynosił 6–12 min, choć możliwe są znacznie dłuższe sesje obrazowania, ponieważ NCaMP7 charakteryzuje się niezwykle wysoką fotostabilnością, a nie zaobserwowano wykrywalnej fototoksyczności (Rycina 6).
<img alt="Analiza aktywności neuronalnej; mikroskopia fluorescencyjna, śledzenie sygnału, dane elektrofizjologiczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig06.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa z wykorzystaniem genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia o zielonej fluorescencji. (A) Wybrany obszar widzenia (FOV) obrazowany za pomocą szerokopolowego mikroskopu fluorescencyjnego w kanale zielonym. (B) 15 obszarów zainteresowania (ROI) odpowiadających pojedynczym neuronom pokazanym na A, wybranych na podstawie projekcji odchylenia standardowego całego zapisu. (C) Reprezentatywne ślady fluorescencji z pojedynczych prób dla 15 wybranych neuronów z B. (D) Reprezentatywne powiększenie 2 śladów wapniowych pokazanych w odpowiadających im kolorowych polach na C. Pasek skali, 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>
W celu uzyskania śladów fluorescencji, obszary zainteresowania (ROI) odpowiadające somatom neuronów zostały wysegmentowane ręcznie i przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageJ. Przed analizą obrazów korekcja ruchu nie była wymagana, co jest typowe dla procedur po zapisie u zwierząt budzących się, ponieważ pozyskane zbiory danych nie wykazywały artefaktów ruchu dzięki wysokiej stabilności implantu obrazującego. Reprezentatywny zapis optyczny aktywności neuronów z hipokampa u budzącej się, wykazującej aktywność myszy w pojedynczej próbie przedstawiono na Ryc. 6. Ręcznie wybrano 15 ROI odpowiadających somatom neuronów z tego samego pola widzenia (FOV) pokazanego na Ryc. 6B, a ślady fluorescencji dla pojedynczej próby w każdym ROI przedstawiono na Ryc. 6C. Ryc. 6D przedstawia dwa reprezentatywne fragmenty śladów fluorescencji z dwóch różnych ROI. Przeprowadzono 4 kolejne sesje obrazowania tego samego FOV w odstępach 3-dniowych. Możliwa była identyfikacja i obrazowanie tych samych neuronów w określonych FOV przez co najmniej dwa tygodnie (w niniejszym badaniu nie przeprowadzono dłuższych sesji obrazowania, jednak ta sama metoda była wcześniej stosowana w badaniach obrazowania u myszy trwających do 6 miesięcy7; Ryc. 7). W badaniu tym zastosowano wektor AAV/DJ-CAG, który zapewniał silną ekspresję badanego genu nawet 21 dni po dostarczeniu wirusa (Ryc. uzupełniająca 1). Ciągła ekspresja utrudniała długoterminową identyfikację tych samych neuronów ze względu na zwiększone tło fluorescencyjne i pojawienie się nowych neuronów wykazujących ekspresję wskaźnika wapnia. W związku z tym wybór serotypu AAV oraz promotora sterującego ekspresją genu docelowego powinien być jednym z kluczowych aspektów podczas projektowania eksperymentu, szczególnie jeśli wymagane jest podłużne obrazowanie tego samego podzbioru neuronów. Jakość obrazowania pozwoliła na rozdzielenie dendrytów proksymalnych oraz wizualizację naczyń krwionośnych.
<img alt="Mikroskopia wzrostu komórek, obrazy fluorescencyjne, time-lapse, dni 25-34, śledzenie FOV1-4." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig07v2.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Sekwencja obrazów z czterech różnych pól widzenia (FOV) z obszaru hipokampa śledzonych przez 12 dni. Zwierzęciu wszczepiono okno w dniu 0, a w dniu 7 wstrzyknięto wirusa rAAV/DJ-CAG-NCaMP7. Groty strzałek wskazują neuron śledzony w obrębie FOV. Paski skali: 80 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Obrazowanie in vivo aktywności neuronalnej z wykorzystaniem genetycznie kodowanego czujnika napięcia. 
W niniejszym badaniu zastosowaliśmy również nowy genetycznie kodowany czujnik napięcia o nazwie SomArchon7, który umożliwia obrazowanie napięcia z rozdzielczością pojedynczej komórki i pojedynczego kolca u zwierząt wykazujących aktywność behawioralną7,8. Aby uzyskać ekspresję SomArchon, wstrzyknęliśmy wirusa rAAV/DJ-CAG-SomArchon za pomocą kaniuli infuzyjnej i przeprowadziliśmy obrazowanie napięcia u myszy z unieruchomioną głową podczas zachowań kilka dni po iniekcji. Do rejestracji aktywności neuronalnej użyliśmy obiektywu 40x NA 0.8 oraz kamery Hamamatsu OrcaFusion sCMOS, co pozwoliło nam na obrazowanie pola widzenia (FOV) 150x40 µm przy częstotliwości akwizycji do 830 Hz. Białko GFP, będące częścią konstruktu SomArchon w celu ułatwienia wizualizacji ekspresji w widzialnym zakresie widma, można łatwo obrazować w kanale zielonym (pobudzenie LED 470/20 nm, emisja 525/50 nm), aby zlokalizować komórki interesujące nas w obrazowaniu napięcia. Optyczne pomiary napięcia przeprowadzono w kanale bliskiej podczerwieni (pobudzenie laserem 637 nm przy 3.4 W/mm2, emisja long pass 665 nm) z binningiem 4 x 4 przy częstotliwości akwizycji 830 Hz. Zarejestrowaliśmy spontaniczną aktywność neuronu hipokampa u budzącej się myszy ze średnim stosunkiem sygnału do szumu (SNR) wynoszącym 7 na potencjał czynnościowy (Rycina 8). 
<img alt="Obraz mikroskopowy i wykres sygnału; analiza aktywności neuronalnej; przetwarzanie sygnałów w dziedzinie czasu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig08.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8: Rejestracja aktywności neuronalnej w neuronach hipokampa z wykorzystaniem genetycznie kodowanego wskaźnika napięcia SomArchon fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni. (A) Wybrany obszar widzenia (FOV) obrazowany za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego w kanale bliskiej podczerwieni. (B) Ślad fluorescencji z pojedynczej próby dla neuronu z panelu A. (C) Reprezentatywne powiększenie śladu napięcia w odpowiadającym mu obszarze zaznaczonym ramką w panelu B. Pasek skali: 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig08large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Histologia 
Po zakończeniu badania obrazowania funkcjonalnego przeprowadza się analizę pośmiertną w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia implantu, obszaru ekspresji wirusa oraz lokalizacji białka zainteresowania w obrazowanych neuronach. Do histologicznej weryfikacji ekspresji wirusa i położenia implantu wykorzystano przekroje czołowe mózgu utrwalonego w PFA, które badano pod fluorescencyjnym mikroskopem szerokopolowym (Rysunek 9A, C). Do pozyskania obrazów o wysokiej rozdzielczości pojedynczych neuronów wykazujących ekspresję wskaźnika wapnia, a także wskaźnika napięcia, użyto mikroskopu konfokalnego (Rysunek 9B, D). Do wizualizacji ogólnej morfologii skrawka mózgu zastosowano barwienie DAPI. Dodatkowo skrawki mózgu można ocenić za pomocą immunohistochemii w celu weryfikacji astrogliozy lub gliozy wywołanej implantacją okna i ekspresją wirusową. Nasze wcześniejsze badania wykazały, że procedura ta nie wywołała zauważalnej gliozy7.
<img alt="Obrazowanie fluorescencyjne tkanki mózgowej, zastosowanie okna optycznego, szczegóły komórkowe, analiza mikroskopowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62266/62266fig09.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9: Weryfikacja histologiczna położenia okna optycznego i ekspresji wirusa. (A) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny koronalnego przekroju mózgu pokazujący umiejscowienie okna optycznego u myszy wykazującej ekspresję NCaMP. Pasek skali: 1 mm. (B) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wykazujących ekspresję wskaźników NCaMP7. Pasek skali: 25 µm. (C) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny koronalnego przekroju mózgu pokazujący umiejscowienie okna optycznego u myszy wykazującej ekspresję SomArchon. Pasek skali: 1 mm. (D) Reprezentatywny obraz konfokalny neuronów wykazujących ekspresję wskaźników SomArchon. Pasek skali: 25 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/62266fig09large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Rycina uzupełniająca 1: Analiza ilościowa względnej intensywności fluorescencji w zależności od czasu ekspresji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62266/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Ten artykuł demonstruje przygotowanie specjalnego okna obrazowania uzupełnionego o kaniulę infuzyjną i jej implantację w regionie CA1 hipokampa u myszy.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Cześć, nazywam się Wang Yangdong i pracuję w laboratorium bioinżynierii molekularnej dr Kiryla Piatkiewicza na Uniwersytecie Westlake. Dzisiaj pokażę Wam procedurę obrazowania aktywności neuronalnej hipokampa u myszy, in vivo. Włącz spawarkę i podgrzej ją do wymaganej temperatury.Dostosuj położenie kaniuli obrazowej i kaniuli iniekcyjnej za pomocą pomocnych rąk, jak pokazano na rysunku. Za pomocą strzykawki z igłą nanieść niewielką ilość odpowiedniego rodzaju topnika na miejsca połączenia między obrazowaniem a wstrzykiwaniem kaniuli przez pięć sekund, a następnie usunąć kroplę. Zamontuj cynę lutowniczą i nałóż ją na miejsce połączenia potraktowane topnikiem.Unikaj nadmiaru cyny lutowniczej, ponieważ będzie to wymagało niepotrzebnie większej czaszki do wykonania podczas operacji. Poczekaj, aż cyna lutownicza ostygnie. Zwykle trwa to kilka sekund.Upewnij się, że kaniula iniekcyjna nie jest zablokowana, wkładając atrapę kaniuli z obu kierunków. Nałóż klej optyczny utwardzany promieniami UV na spodzie kaniuli obrazowej za pomocą wykałaczki lub igły strzykawkowej o rozmiarze 26. Za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie umieść szkło nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze na kaniuli obrazowej.Utwardzaj klej przez co najmniej godzinę za pomocą oświetlenia UV ze standardowej ręcznej lampy UV. Znieczulić mysz izofluranem zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce nad chirurgiczną poduszką grzewczą.Zabezpiecz głowę za pomocą nauszników. Lekko popchnij głowę we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że głowa jest mocno zamocowana. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu zwierzęcia podczas zabiegu.Użyj trymera lub kremu do depilacji, aby usunąć sierść od karku do oczu. Wysterylizuj miejsce operowane betadyną, a następnie trzykrotnie 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia. Usuń skórę z górnej części czaszki, zaczynając od poziomego cięcia wokół podstawy głowy, a następnie wykonaj dwa cięcia w kierunku rostralnym, prawie sięgając powiek.Następnie dwa ukośne cięcia, które zbiegają się w linii środkowej. Za pomocą dwóch sterylnych bawełnianych wacików cofnij tkankę łączącą, a także mięśnie tylnej części szyi do krawędzi czaszki. Nałóż kroplę roztworu lidokainy na powierzchnię okostnej na dwie minuty, aby uniknąć nadmiernego bólu.Delikatnie zeskrob cały odsłonięty obszar czaszki skalpelem, aby uzyskać suchą i szorstką powierzchnię. Umieść końcówkę igły na Lambda, aby sprawdzić, czy współrzędna AP wynosi zero, aby potwierdzić, że pozycja głowy jest pionowa, a także, czy współrzędna ML wynosi zero, aby potwierdzić, że głowica jest ustawiona poziomo. Jeśli nie, wyreguluj odpowiednie pokrętła na stacji stereotaktycznej, aż współrzędne AP i ML będą mieścić się w granicach 0.1 milimetra.Przesuń czubek igły, aby znaleźć odpowiednie punkty do kraniotomii i zaznacz ich położenie na czaszce za pomocą cienkiego markera. Narysuj okrąg na podstawie czterech zaznaczonych punktów, a także konturu obszaru kaniuli iniekcyjnej po stronie koła po stronie kaniuli. Użyj wiertarki pneumatycznej z prędkością 10 000 pocisków na minutę, aby delikatnie wiercić wzdłuż konturu zaznaczonego na czaszce.Wiercić czaszkę, aż pozostanie bardzo cienka warstwa kości, która zwykle zaczyna się poruszać pod delikatnym dotykiem w środku. Nałóż kroplę sterylnego PBS na środek kraniotomii. Podnieś płat kostny z czaszki za pomocą bardzo cienkich kleszczy z końcówką lub dwóch igieł o rozmiarze 26, zbliżając się do niego z przeciwnych stron.Zastosuj PBS, a następnie delikatne aspiracje, przez igłę o rozmiarze 26 kilka razy, aby oczyścić powierzchnię opony twardej. Zastosuj delikatne ssanie, aby usunąć korę, a także ciało modzelowate powyżej hipokampa. Kora jest często bardziej żółta niż ciało modzelowate.A ciało modzelowate jest zwykle szersze niż hipokamp. Poza tym ciało modzelowate jest naprawdę łatwe do odróżnienia po włóknach neuronalnych biegnących w kierunku pionowym i poziomym, gdy obserwuje się je z góry. Krwawienie w tym momencie wpłynie na widoczność tkanki mózgowej podczas kraniotomii.Zastosuj PBS, a następnie delikatnie odsysaj, podczas gdy zasysasz korę, aby pozbyć się krwi, ciało modzelowate można rozpoznać po kierunku białych włókien, jak schematycznie pokazano na schemacie. Usuń włókna ciała modzelowatego warstwa po warstwie, stosując delikatne ssanie okrężnymi ruchami. PBS jest stale stosowany w celu pozbycia się krwi gromadzącej się nad odsłoniętą tkanką mózgową.Delikatnie wprowadzić implant do kraniotomii. Mocno dociśnij górną część implantu igłą w kształcie litery L, aby ustawić okienko optyczne implantu jak najbliżej odsłoniętej powierzchni hipokampa. Kilkakrotnie nakładaj PBS na bliznę wokół implantu, a następnie odsysaj, aby usunąć jak najwięcej krwi podczas wprowadzania implantu.Nałóż cienką warstwę szybkiego uszczelnienia między implantem a czaszką, aby zapobiec wnikaniu cementu dentystycznego pod czaszkę. Po utwardzeniu szybkozłączki nałóż równomiernie super bond na powierzchnię czaszki, powierzchnię szybkiego uszczelnienia i powierzchnię implantu. Po utwardzeniu super bonda nałóż żywicę bazową protezy na super bond, a także na skórę wokół nacięcia wykonanego na początku operacji.Po utwardzeniu żywicy podstawy protezy należy umieścić płytkę głowicy na żywicy wokół implantu i skoncentrować ją za pomocą kaniuli obrazowej. Nałóż więcej żywicy bazowej protezy wokół i nad płytą główną, aby ustalić jej położenie. Pozwól mu utwardzić się przez kilka minut.Unikaj tworzenia grubej warstwy cementu wokół kaniuli, aby zapewnić lepszy dostęp do okienka obrazowania, jakim jest soczewka obiektywu. Rozcieńczyć żywicę bazy protezy, aby zmniejszyć jej lepkość, co pozwoli jej wypełnić ubytki, do których trudno dotrzeć aplikatorem. Delikatnie umieść izolacyjną gumową taśmę nad oknem, aby chronić okno przed możliwym zanieczyszczeniem przez opaski zwierząt.Dodać roztwór podstawowy barwnika Fast Green do roztworu wirusa, rozcieńczyć go do pożądanego miana w stosunku od jednego do dziewięciu w probówce PCR. Pobrać 600 nanolitrów roztworu wirusa, wyjąć atrapę kaniuli i włożyć kaniulę wewnętrzną, podłączyć ją do strzykawki iniekcyjnej do kaniuli prowadzącej. Podawaj wirusa z prędkością 15 nanolitrów na minutę, w sumie przez 10 minut.Trzymaj wewnętrzną kaniulę podłączoną przez 10 minut, aby wirus mógł rozprzestrzenić się pod oknem. Delikatnie wyjmij kaniulę wewnętrzną z kaniuli prowadzącej i zamknij ją ponownie kaniulą atrapą. Indukuj mysz 4% izofluranem przez kilka minut.Przymocuj jego główkę do widelca głównego, a następnie przymocuj widelec do bieżni. Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby znaleźć najlepszy widok do filtrowania do obrazowania funkcjonalnego. Następnie przełącz się na soczewkę o wyższym obiektywie, aby rejestrować aktywność neuronalną w rozdzielczości pojedynczej komórki.W przypadku obrazowania wapnia, zielona fluorescencyjna była wzbudzana przez dostępną na rynku diodę LED o długości 470 nanometrów przy użyciu standardowego czujnika filtra GFP. Aby uzyskać ślady fluorescencyjne, obszary zainteresowania, odpowiadające masie komórek neuronalnych, zostały ręcznie podzielone na segmenty i przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageJ. W przypadku obrazowania napięciowego za pomocą soczewki 40 X zapisy napięcia optycznego wykonano w kanale bliskiej podczerwieni z szybkością akwizycji 830 Hz.Spontaniczny zapis aktywności neuronalnej trwał nieprzerwanie do 25 000 klatek. W tym miejscu opisujemy metodę długoterminowego obrazowania hipokampa jako regionu A1 u zachowujących się myszy. Metoda opiera się na przewlekłej implantacji.Teraz dostępne jest niestandardowe okno obrazowania, które umożliwia również celowe podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do interesujących neuronów. Wierzymy, że opisany protokół ułatwi badania, które mają na celu zbadanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością przestrzenną czasową w hipokampie zachowujących się myszy przy użyciu prostych i niedrogich zestawów do obrazowania 1-fotonowego.

craniotomy-procedure-for-visualizing-neuronal-activities-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Niniejszy film i protokół demonstrują sposób implantacji pokrytego szkłem okna czaszkowego u gryzoni. Preparaty te mogą być wykorzystywane do przewlekłego obrazowania dwufotonowego neocortex in vivo w skalach czasowych obejmujących wiele miesięcy. Mogą one być również stosowane w innych rodzajach obrazowania, w tym w obrazowaniu sygnałów optycznie immanentnych.

Procedura kraniotomii w celu przewlekłego obrazowania mózgu

Opracowaliśmy in vitro rozkładany hipokamp, który zachowuje układ neuronów CA1-CA3. W połączeniu z penetrującym układem mikroelektrod, aktywność neuronalna może być monitorowana zarówno w orientacji podłużnej, jak i poprzecznej. Ta metoda ma przewagę nad preparatami plastrów hipokampa, ponieważ rozmnażanie w całym hipokampie może być rejestrowane jednocześnie.

Propagacja aktywności neuronalnej w rozłożonym preparacie hipokampa z penetrującym układem mikroelektrod

Ten protokół przedstawia metodę tworzenia dużej jednostronnej kraniotomii nad obszarami skroniowymi i ciemieniowymi kory mózgowej myszy. Jest to szczególnie przydatne do obrazowania w czasie rzeczywistym rozległego obszaru półkuli korowej.

Duży zabieg kraniotomii bocznej do mezoskalowego obrazowania optycznego o szerokim polu widzenia aktywności mózgu

Podczas gdy obrazowanie wielofotonowe jest skuteczne tylko na ograniczonych głębokościach od powierzchni tkanki, możliwe jest osiągnięcie obrazowania o rozdzielczości 3 μm na dowolnej głębokości za pomocą pCLE. W tym miejscu przedstawiamy protokół do przeprowadzania obrazowania pCLE w celu pomiaru dynamiki mikronaczyniowej w hipokampie myszy ictal i dzikich myszy.

Przedkliniczna konfokalna endomikroskopia laserowo-skaningowa (pCLE) in vivo sprzężona z włóknami światłowodowymi naczyń włosowatych hipokampa u obudzonych myszy

Ten protokół opisuje rejestrację lokalnych potencjałów pola za pomocą wielozębowych liniowych sond krzemowych. Konwersja sygnałów za pomocą analizy gęstości źródła prądu pozwala na rekonstrukcję lokalnej aktywności elektrycznej w hipokampie myszy. Dzięki tej technice można badać ograniczone przestrzennie oscylacje mózgu u swobodnie poruszających się myszy.

Rejestrowanie przestrzennie ograniczonych oscylacji w hipokampie zachowujących się myszy

Ta metoda opisuje chroniczne przygotowanie, które umożliwia optyczny dostęp do hipokampa żywych myszy. Preparat ten może być stosowany do wykonywania podłużnego obrazowania optycznego plastyczności strukturalnej neuronów i plastyczności komórkowej wywołanej aktywnością przez okres kilku tygodni.

Podłużne obrazowanie dwufotonowe grzbietowego hipokampa CA1 u żywych myszy

Użyliśmy elektrod rejestrujących i stymulujących w podłużnych wycinkach mózgu hipokampa oraz podłużnie rozmieszczonych elektrod rejestrujących i stymulujących w grzbietowym hipokampie in vivo, aby wywołać zewnątrzkomórkowe potencjały postsynaptyczne i wykazać długoterminową plastyczność synaptyczną wzdłuż podłużnego międzypłytkowego CA1.

Badanie długoterminowej plastyczności synaptycznej w międzypłytkowym hipokampie CA1 za pomocą zapisu pola elektrofizjologicznego

Obecny protokół demonstruje prostą metodę śledzenia projekcji glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) do hipokampa. Fotostymulację neuronów glutaminianu VTA połączono z zapisem CA1, aby zademonstrować, w jaki sposób zakończenia glutaminianu VTA modulują przypuszczalną szybkość wypalania CA1 w piramidzie in vivo.

Połączone anatomiczne i funkcjonalne śledzenie in vivo zakończeń glutaminianu w brzusznym obszarze nakrywki w hipokampie

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Ten artykuł opisuje metodę przewlekłej obserwacji in vivo spoczynkowego mikrogleju w mysim hipokampie CA1 przy użyciu precyzyjnie kontrolowanej chirurgii i mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Przewlekłe dwufotonowe obrazowanie mikrogleju w hipokampie myszy

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do rejestracji mikro-elektrokortykografii o wysokiej gęstości (μEcoG) u szczurów i myszy, w tym metody chirurgiczne, implantacyjne i rejestracyjne. Zapisy μECoG są wykonywane w połączeniu z zapisem laminarnej politrody w korze słuchowej szczura lub z optogenetycznym manipulowaniem aktywnością neuronalną w korze somatosensorycznej myszy.

Wieloskalowe badania przetwarzania kory mózgowej poprzez integrację politrod laminarnych i optogenetyki z mikroelektrokortykografią u gryzoni

Poznaj procedurę kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie myszy. Ta metoda umożliwia długoterminowe obrazowanie węglanów wapnia i napięcia z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Przeglądaj więcej filmów