Procedura kraniotomii do wizualizacji aktywności neuronalnej w hipokampie zachowujących się myszy

Cześć, nazywam się Wang Yangdong i pracuję w laboratorium bioinżynierii molekularnej dr Kiryla Piatkiewicza na Uniwersytecie Westlake. Dzisiaj pokażę Wam procedurę obrazowania aktywności neuronalnej hipokampa u myszy, in vivo. Włącz spawarkę i podgrzej ją do wymaganej temperatury.

Dostosuj położenie kaniuli obrazowej i kaniuli iniekcyjnej za pomocą pomocnych rąk, jak pokazano na rysunku. Za pomocą strzykawki z igłą nanieść niewielką ilość odpowiedniego rodzaju topnika na miejsca połączenia między obrazowaniem a wstrzykiwaniem kaniuli przez pięć sekund, a następnie usunąć kroplę. Zamontuj cynę lutowniczą i nałóż ją na miejsce połączenia potraktowane topnikiem.

Unikaj nadmiaru cyny lutowniczej, ponieważ będzie to wymagało niepotrzebnie większej czaszki do wykonania podczas operacji. Poczekaj, aż cyna lutownicza ostygnie. Zwykle trwa to kilka sekund.

Upewnij się, że kaniula iniekcyjna nie jest zablokowana, wkładając atrapę kaniuli z obu kierunków. Nałóż klej optyczny utwardzany promieniami UV na spodzie kaniuli obrazowej za pomocą wykałaczki lub igły strzykawkowej o rozmiarze 26. Za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie umieść szkło nakrywkowe o odpowiednim rozmiarze na kaniuli obrazowej.

Utwardzaj klej przez co najmniej godzinę za pomocą oświetlenia UV ze standardowej ręcznej lampy UV. Znieczulić mysz izofluranem zgodnie z procedurą zatwierdzoną przez IACUC. Umieść mysz w stereotaktycznej ramce nad chirurgiczną poduszką grzewczą.

Zabezpiecz głowę za pomocą nauszników. Lekko popchnij głowę we wszystkich kierunkach, aby upewnić się, że głowa jest mocno zamocowana. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec wysuszeniu oczu zwierzęcia podczas zabiegu.

Użyj trymera lub kremu do depilacji, aby usunąć sierść od karku do oczu. Wysterylizuj miejsce operowane betadyną, a następnie trzykrotnie 70% etanolem przed wykonaniem nacięcia. Usuń skórę z górnej części czaszki, zaczynając od poziomego cięcia wokół podstawy głowy, a następnie wykonaj dwa cięcia w kierunku rostralnym, prawie sięgając powiek.

Następnie dwa ukośne cięcia, które zbiegają się w linii środkowej. Za pomocą dwóch sterylnych bawełnianych wacików cofnij tkankę łączącą, a także mięśnie tylnej części szyi do krawędzi czaszki. Nałóż kroplę roztworu lidokainy na powierzchnię okostnej na dwie minuty, aby uniknąć nadmiernego bólu.

Delikatnie zeskrob cały odsłonięty obszar czaszki skalpelem, aby uzyskać suchą i szorstką powierzchnię. Umieść końcówkę igły na Lambda, aby sprawdzić, czy współrzędna AP wynosi zero, aby potwierdzić, że pozycja głowy jest pionowa, a także, czy współrzędna ML wynosi zero, aby potwierdzić, że głowica jest ustawiona poziomo. Jeśli nie, wyreguluj odpowiednie pokrętła na stacji stereotaktycznej, aż współrzędne AP i ML będą mieścić się w granicach 0.1 milimetra.

Przesuń czubek igły, aby znaleźć odpowiednie punkty do kraniotomii i zaznacz ich położenie na czaszce za pomocą cienkiego markera. Narysuj okrąg na podstawie czterech zaznaczonych punktów, a także konturu obszaru kaniuli iniekcyjnej po stronie koła po stronie kaniuli. Użyj wiertarki pneumatycznej z prędkością 10 000 pocisków na minutę, aby delikatnie wiercić wzdłuż konturu zaznaczonego na czaszce.

Wiercić czaszkę, aż pozostanie bardzo cienka warstwa kości, która zwykle zaczyna się poruszać pod delikatnym dotykiem w środku. Nałóż kroplę sterylnego PBS na środek kraniotomii. Podnieś płat kostny z czaszki za pomocą bardzo cienkich kleszczy z końcówką lub dwóch igieł o rozmiarze 26, zbliżając się do niego z przeciwnych stron.

Zastosuj PBS, a następnie delikatne aspiracje, przez igłę o rozmiarze 26 kilka razy, aby oczyścić powierzchnię opony twardej. Zastosuj delikatne ssanie, aby usunąć korę, a także ciało modzelowate powyżej hipokampa. Kora jest często bardziej żółta niż ciało modzelowate.

A ciało modzelowate jest zwykle szersze niż hipokamp. Poza tym ciało modzelowate jest naprawdę łatwe do odróżnienia po włóknach neuronalnych biegnących w kierunku pionowym i poziomym, gdy obserwuje się je z góry. Krwawienie w tym momencie wpłynie na widoczność tkanki mózgowej podczas kraniotomii.

Zastosuj PBS, a następnie delikatnie odsysaj, podczas gdy zasysasz korę, aby pozbyć się krwi, ciało modzelowate można rozpoznać po kierunku białych włókien, jak schematycznie pokazano na schemacie. Usuń włókna ciała modzelowatego warstwa po warstwie, stosując delikatne ssanie okrężnymi ruchami. PBS jest stale stosowany w celu pozbycia się krwi gromadzącej się nad odsłoniętą tkanką mózgową.

Delikatnie wprowadzić implant do kraniotomii. Mocno dociśnij górną część implantu igłą w kształcie litery L, aby ustawić okienko optyczne implantu jak najbliżej odsłoniętej powierzchni hipokampa. Kilkakrotnie nakładaj PBS na bliznę wokół implantu, a następnie odsysaj, aby usunąć jak najwięcej krwi podczas wprowadzania implantu.

Nałóż cienką warstwę szybkiego uszczelnienia między implantem a czaszką, aby zapobiec wnikaniu cementu dentystycznego pod czaszkę. Po utwardzeniu szybkozłączki nałóż równomiernie super bond na powierzchnię czaszki, powierzchnię szybkiego uszczelnienia i powierzchnię implantu. Po utwardzeniu super bonda nałóż żywicę bazową protezy na super bond, a także na skórę wokół nacięcia wykonanego na początku operacji.

Po utwardzeniu żywicy podstawy protezy należy umieścić płytkę głowicy na żywicy wokół implantu i skoncentrować ją za pomocą kaniuli obrazowej. Nałóż więcej żywicy bazowej protezy wokół i nad płytą główną, aby ustalić jej położenie. Pozwól mu utwardzić się przez kilka minut.

Unikaj tworzenia grubej warstwy cementu wokół kaniuli, aby zapewnić lepszy dostęp do okienka obrazowania, jakim jest soczewka obiektywu. Rozcieńczyć żywicę bazy protezy, aby zmniejszyć jej lepkość, co pozwoli jej wypełnić ubytki, do których trudno dotrzeć aplikatorem. Delikatnie umieść izolacyjną gumową taśmę nad oknem, aby chronić okno przed możliwym zanieczyszczeniem przez opaski zwierząt.

Dodać roztwór podstawowy barwnika Fast Green do roztworu wirusa, rozcieńczyć go do pożądanego miana w stosunku od jednego do dziewięciu w probówce PCR. Pobrać 600 nanolitrów roztworu wirusa, wyjąć atrapę kaniuli i włożyć kaniulę wewnętrzną, podłączyć ją do strzykawki iniekcyjnej do kaniuli prowadzącej. Podawaj wirusa z prędkością 15 nanolitrów na minutę, w sumie przez 10 minut.

Trzymaj wewnętrzną kaniulę podłączoną przez 10 minut, aby wirus mógł rozprzestrzenić się pod oknem. Delikatnie wyjmij kaniulę wewnętrzną z kaniuli prowadzącej i zamknij ją ponownie kaniulą atrapą. Indukuj mysz 4% izofluranem przez kilka minut.

Przymocuj jego główkę do widelca głównego, a następnie przymocuj widelec do bieżni. Użyj obiektywu o małym powiększeniu, aby znaleźć najlepszy widok do filtrowania do obrazowania funkcjonalnego. Następnie przełącz się na soczewkę o wyższym obiektywie, aby rejestrować aktywność neuronalną w rozdzielczości pojedynczej komórki.

W przypadku obrazowania wapnia, zielona fluorescencyjna była wzbudzana przez dostępną na rynku diodę LED o długości 470 nanometrów przy użyciu standardowego czujnika filtra GFP. Aby uzyskać ślady fluorescencyjne, obszary zainteresowania, odpowiadające masie komórek neuronalnych, zostały ręcznie podzielone na segmenty i przeanalizowane za pomocą oprogramowania ImageJ. W przypadku obrazowania napięciowego za pomocą soczewki 40 X zapisy napięcia optycznego wykonano w kanale bliskiej podczerwieni z szybkością akwizycji 830 Hz.

Spontaniczny zapis aktywności neuronalnej trwał nieprzerwanie do 25 000 klatek. W tym miejscu opisujemy metodę długoterminowego obrazowania hipokampa jako regionu A1 u zachowujących się myszy. Metoda opiera się na przewlekłej implantacji.

Teraz dostępne jest niestandardowe okno obrazowania, które umożliwia również celowe podawanie wirusów lub leków bezpośrednio do interesujących neuronów. Wierzymy, że opisany protokół ułatwi badania, które mają na celu zbadanie aktywności neuronalnej z wysoką rozdzielczością przestrzenną czasową w hipokampie zachowujących się myszy przy użyciu prostych i niedrogich zestawów do obrazowania 1-fotonowego.