Aktywacja 3D całego mózgu i mapowanie łączności funkcjonalnej u myszy przy użyciu przezczaszkowego funkcjonalnego obrazowania ultrasonograficznego

Funkcjonalne ultradźwięki to nowa metoda neuroobrazowania, która umożliwia mapowanie objętości krwi mózgowej w mózgu żywego gryzonia. Korzystając z ultraszybkiego obrazowania fal płaskich, możemy mierzyć reakcje hemodynamiczne całego mózgu z niezrównaną specjalną tymczasową rozdzielczością i czułością. Protokół ten wyjaśnia, jak wykonywać przezczaszkowe funkcjonalne obrazowanie ultrasonograficzne u myszy, zarówno w przypadku eksperymentów na zwierzętach znieczulonych, jak i na jawie.

W porównaniu z innymi technikami obrazowania funkcjonalnego całego mózgu, takimi jak FMRI, ultrasonografia funkcjonalna zapewnia wysoką przenośność, łatwość użycia i umożliwia eksperymenty na obudzonych i swobodnie poruszających się osobach, unikając stronniczości anestezjologicznej i umożliwiając badania behawioralne. Do niedawna obrazowanie FUS było stosowane wyłącznie we współpracy z ekspertem w dziedzinie ultrasonografii. Teraz technologia ta jest dostępna dla szerokiej społeczności neuronaukowej, dzięki dostępnym na rynku skanerom i dedykowanemu oprogramowaniu do przedklinicznego obrazowania mózgu, dzięki czemu FUS jest dość łatwy w użyciu bez żadnego doświadczenia w ultrasonografii.

W przypadku znieczulonej sesji obrazowania nałóż maść do oczu myszy, aby uniknąć uszkodzenia rogówki i ogol głowę myszy za pomocą drżenia. Nałóż krem do depilacji i spłucz po kilku minutach. Powtarzaj to, aż włosy zostaną całkowicie usunięte.

Wprowadzić szpilki podskórne w kończynach do zapisu elektrokardiogramu i umieścić odwirowany żel ultradźwiękowy na głowie. W przypadku eksperymentów na obudzonych myszach wymagana jest wstępna operacja w celu ustabilizowania głowy. Umieść znieczuloną mysz i ramkę stereotaktyczną na poduszce grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Nałóż żel ochronny na oczy i podskórnie podawaj lidokainę pod skórę głowy za pomocą igły o rozmiarze 26, a następnie odczekaj kilka minut. Wykonaj nacięcie wzdłuż szwu strzałkowego od tyłu kości potylicznej do początku kości nosowej, a następnie użyj nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć skórę na obu półkulach. Oczyść czaszkę jednoprocentowym roztworem jodu i usuń pozostałą okostną.

Używając płyty czołowej jako szablonu, zaznacz dwa otwory w czaszce, aby umieścić kotwiące. Umieść płytę głowicy za pomocą i użyj cementu dentystycznego do zamocowania i płyty głowicy z przodu iz tyłu ramy, aby utrzymać dobry chwyt implantu. Po wyschnięciu cementu należy usunąć zwierzę z ramy stereotaktycznej i odwrócić znieczulenie poprzez podskórne wstrzyknięcie jednego miligrama na kilogram atipamezolu.

Podawać profilaktyczny meloksykam w przypadku bólu pooperacyjnego. Umieść magnetyczną nasadkę wydrukowaną w 3D na płycie głowy dla ochrony i pozwól myszy dojść do siebie przez cztery do sześciu dni przed rozpoczęciem przyzwyczajania się do klatki domku mobilnego. Umieść zwierzę w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej na kilka godzin, a następnie umieść mysz z powrotem w klatce domowej z kolegami z miotu.

W czwartym i piątym dniu po powrocie do zdrowia kilkakrotnie przymocuj mysz do klatki domku mobilnego i stopniowo zwiększaj stały czas słuchania, zaczynając od pięciu minut do 30 minut. Nałóż trochę soli fizjologicznej i żelu ultradźwiękowego na okienko obrazowania, aby przyzwyczaić mysz. Powtórz ten proces w szóstym dniu po wyzdrowieniu.

Uruchom oprogramowanie i utwórz sesję eksperymentalną. Przejdź do menu przesuwania sondy, aby dostosować pozycję sondy ultradźwiękowej za pomocą klawiatury nawigacyjnej. Rozpocznij akwizycję podglądu na żywo i w razie potrzeby dostosuj położenie sondy poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym objętości krwi w mózgu zwierzęcia (CBV).

Ustaw mózg na środku obrazu, a następnie zoptymalizuj parametry obrazowania, aby uchwycić najwyższy stosunek sygnału do szumu. Otwórz opcję Angio 3D w oprogramowaniu do akwizycji. Na panelu ustawień wstępnych dostosuj parametry skanowania pierwszego i ostatniego wycinka oraz rozmiaru kroku, aby zeskanować cały mózg i rozpocząć akwizycję.

Pozostaw otwarte oprogramowanie do akwizycji i uruchom oprogramowanie do analizy i wizualizacji danych, a następnie załaduj skan 3D Angio. Poruszaj się po objętości akwizycji za pomocą panelu trzech widoków i wybierz kierunek skanowania koronalnego, przednio-tylny lub przedni. Przejdź do panelu rejestracji mózgu i załaduj szablon referencyjny myszy do procesu rejestracji.

Zarejestruj skan w Allen Mouse Common Coordinates Framework, korzystając z w pełni automatycznego lub ręcznego trybu rejestracji. Sprawdź wynik, patrząc na superpozycję skanu 3D Angio i szablonu referencyjnego lub patrząc na superpozycję skanu i atlasu referencyjnego Allen za pomocą panelu menedżera Atlas. Zapisz rejestrację jako plik BPS.

W oprogramowaniu ICO studio upewnij się, że skan angiograficzny i jego plik BPS są załadowane. Przejdź do panelu nawigacji mózgu. W panelu Menedżer atlasu nawiguj po atlasie mózgu Allena za pomocą nawigatora drzewa nadrzędnego i potomnego.

Znajdź anatomiczne obszary docelowe i wybierz je, aby nałożyć je na skan w trzech widokach. Zwizualizuj docelowe regiony w panelu trzech widoków i wybierz płaszczyznę obrazowania, która nakłada się na obszary docelowe eksperymentu, ręcznie ustawiając dwa znaczniki w pozycji koronalnej, która obejmuje obszar zainteresowania. Kliknij Brain Positioning System (BPS), aby wyodrębnić wynikowe współrzędne silnika, które odpowiadają pozycji sondy, aby zobrazować docelową płaszczyznę.

Sprawdź podgląd obrazu, który jest obliczany na podstawie skanu naczynia. W oprogramowaniu do skanowania ICO wejdź do panelu pozycjonowania sondy i kliknij wprowadź współrzędne BPS, a następnie zastosuj wyodrębnione współrzędne, powodując ruch sondy i wyrównanie na docelowej płaszczyźnie obrazowania. Wykonaj akwizycję w widoku na żywo i sprawdź, czy bieżąca płaszczyzna obrazowania odpowiada prognozie.

Wstępnie zdefiniuj sekwencję stymulacji, w tym czas stymulacji, czas stymulacji zainteresowań i liczbę powtórzeń. Uruchom sekwencję FUS 3D, definiując całkowity czas pozyskiwania, liczbę pozycji i czas martwy między pozycjami. Aby uzyskać automatyczną stymulację zsynchronizowaną z systemem akwizycji poprzez wejście TTL, wybierz opcję wyzwalacza przed rozpoczęciem akwizycji.

Otwórz akwizycję w oprogramowaniu ICO studio i wejdź do menu mapy aktywacji, a następnie wypełnij pole wzorca aktywacji godzinami rozpoczęcia i zakończenia oraz oblicz mapę aktywacji. Dostosuj parametry wyświetlania wizualizacji i wyeksportuj mapę aktywacji jako plik H5 do analizy w trybie offline. Uruchom sekwencję FUS 3D, definiując całkowity czas akwizycji, liczbę pozycji płaszczyzny obrazowania i czas martwy między pozycjami.

Zapisz akwizycję i załaduj ją do oprogramowania ICO studio. W razie potrzeby załaduj plik BPS i strukturę koordynacyjną mózgu myszy Allen. W Menedżerze atlasu wybierz regiony atlasu jako obszary zainteresowania.

Wejdź do menu przewodności funkcjonalnej i wybierz żądane regiony oraz menedżera ROI. Wizualizuj wyniki jako macierz połączeń lub mapę korelacji opartą na inicjatorach, a następnie wybierz i dostosuj filtry przepustowości zgodnie z potrzebami, a następnie wyeksportuj wyniki korelacji do analizy statystycznej. Protokół ten został wykorzystany do ilościowej identyfikacji 3D zmian hemodynamicznych mózgu przezczaszkowo w mózgu myszy.

Jako przykład stymulacji sensorycznej wywołanej reakcją wywołano stymulację wąsów. Istotną aktywację określono za pomocą rozdzielczości ogólnego modelu liniowego lub GLM, przy użyciu domyślnej funkcji odpowiedzi hemodynamicznej myszy. Całkowity czas próby wynosił 760 sekund, z 60-sekundową linią bazową, 80-sekundową stymulacją i 60-sekundowym czasem odzyskiwania powtórzonym pięć razy.

Korzystając z wokselowego przebiegu czasowego kontralateralnej pierwotnej kory somatosensorycznej, region pola beczkowego lub S1BF ujawnił od 15 do 20% wzrost CBV w porównaniu z wartością wyjściową. Ten sam paradygmat został zastosowany w myszy zachowującej się w nieruchomej głowie w klatce mobilnego domu przy użyciu ustawienia wstępnego wybudzenia skanowania ICO. Mapa aktywacji po eksperymencie z wielokrotną stymulacją wąsów jest pokazana tutaj.

Istotną aktywację określono z rozdzielczością GLM przy użyciu domyślnej funkcji odpowiedzi hemodynamicznej myszy. Korelacje czasowe znormalizowały spontaniczne fluktuacje CBV o niskiej częstotliwości między obszarami mózgu 3D u myszy znieczulonej ketaminą ksylazyną. Analiza oparta na nasionach i grzbietowym hipokampie ujawniła znaczną przewodnictwo międzypółkulowe między prawym i lewym hipokampem, a także głębsze retro regiony hipokampa i uprzejmości gruszkowate.

Region zalążkowy wybrany w S1BF również spowodował symetryczny wzorzec korelacji. Punktem krytycznym dla udanych eksperymentów jest przygotowanie zwierząt, w szczególności poziom znieczulenia w przypadku eksperymentów z udziałem znieczulonych zwierząt oraz ochrona czaszki w doświadczeniach na zwierzętach przytomnych. Gdyby badanie było możliwe w USA, badanie ważnych funkcji mózgu u obudzonych zwierząt zajmujących się fundamentalnymi pytaniami dotyczącymi snu, uczenia się i zachowania, ale także farmakologicznej modulacji połączeń funkcjonalnych w celu odkrywania leków.