Name: Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Poznaj protokoły barwienia i obrazowania w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów. Metody te umożliwiają analizę komórkową i subkomórkową w badaniach nad rozwojem, modelowaniem chorób oraz odkrywaniem leków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została wsparta przez St Baldrick's Robert J. Arceci Innovation Award #604303.

<ol><li>Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+system+methods+and+applications+for+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells.</a> Cells. 8 (12), 1-13 (2019).</li>
<li>Bartfeld, S., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+organoids+and+their+application+for+medical+research+and+patient+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived organoids and their application for medical research and patient treatment.</a> Journal of Molecular Medicine. 95 (7), 729-738 (2017).</li>
<li>Cui, X., Hartanto, Y., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+multicellular+spheroids+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society%2C+Interface%22%5BJournal%5D)">Advances in multicellular spheroids formation.</a> Journal of the Royal Society, Interface. 14 (127), (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
<li>Rezanejad, H., Lock, J. H., Sullivan, B. A., Bonner-Weir, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pancreatic+ductal+organoids+and+whole-mount+immunostaining+of+intact+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of pancreatic ductal organoids and whole-mount immunostaining of intact organoids.</a> Current Protocols in Cell Biology. 83 (1), 82(2019).</li>
<li>Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+and+their+applications+in+drug+discovery+and+cell-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors.</a> Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).</li>
<li>McCray, T., Richards, Z., Marsili, J., Prins, G. S., Nonn, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Handling+and+assessment+of+human+primary+prostate+organoid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Handling and assessment of human primary prostate organoid culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e59051(2019).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews: Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
<li>Lazzari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+versus+confocal+microscopy%3A+in+quest+of+a+suitable+tool+to+assess+drug+and+nanomedicine+penetration+into+multicellular+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutics+and+Biopharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy versus confocal microscopy: in quest of a suitable tool to assess drug and nanomedicine penetration into multicellular tumor spheroids.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 142, 195-203 (2019).</li>
<li>Gabriel, J., Brennan, D., Elisseeff, J. H., Beachley, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+embedding%2Fsectioning+for+parallel+analysis+of+3D+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Microarray embedding/sectioning for parallel analysis of 3D cell spheroids.</a> Scientific Reports. 9, 16287(2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Hodowla komórkowa jest niezbędnym narzędziem do odkrycia podstawowych mechanizmów biologicznych związanych z rozwojem, funkcjonowaniem, regeneracją i zakłóceniami tkanek i narządów, a także chorobami. Chociaż dominowała monowarstwowa hodowla komórkowa 2D, ostatnie badania przesunęły się w kierunku kultur generujących struktury 3D bardziej odzwierciedlające odpowiedzi komórkowe in vivo, w szczególności dzięki dodatkowej organizacji przestrzennej i kontaktom komórka-komórka, które wpływają na ekspresję genów i zachowanie komórki, a tym samym mogą dostarczyć więcej danych predykcyjnych7. Niemniej jednak nadal istnieje wiele wyzwań, w tym potrzeba przyjaznych dla użytkownika technik barwienia i obrazowania do szczegółowej wizualizacji mikroskopowej i oceny złożonych struktur 3D na poziomie komórkowym i subkomórkowym. W tym kontekście dostarczono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia oraz obrazowania w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro o rozmiarach od 100 μm do kilku milimetrów.
Procedura ta przedstawia dwie różne strategie radzenia sobie z dużą różnorodnością rozmiarów i typów modeli hodowli komórkowych 3D in vitro. Wybór jednej (analiza 3D całego montażu) lub drugiej (analiza przekrojów 2D) będzie zależał od użytego modelu i badanego problemu. Analiza 3D całego montażu za pomocą mikroskopii konfokalnej umożliwia wizualizację komórek o polu głębokości do 200 μm, niezależnie od całkowitej wielkości struktury 3D, podczas gdy przekroje 2D mają zastosowanie do próbek o dowolnej wielkości, ale wizualizacja pozostaje wymiarowa 2D. Poniżej znajduje się kilka sugestii dotyczących rozwiązywania problemów i kwestii technicznych.
Utrata struktur 3D podczas przepływu pracy jest najczęstszą wadą. Mogą one pozostać przylegające do końcówek i rurek, dlatego kluczowe znaczenie ma wstępne powlekanie końcówek i rurek 0,1% roztworem PBS-BSA. Co więcej, bardzo ważne jest, aby struktury 3D osiadły między zmianami odczynnika i aby wszystkie pipety były wykonywane bardzo ostrożnie. Jak wspomniano w procedurze, dla wszystkich etapów, jeśli sedymentacja struktury 3D jest zbyt długa, komórki można delikatnie wirować z prędkością 50 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. W zależności od celu badania, należy rozważyć zalety/wady takiego etapu wirowania, ponieważ wirowanie może zagrozić kształtowi struktur 3D. Ponadto należy zachować ostrożność w celu zachowania tej morfologii na etapie fiksacji, ponieważ organoidy torbielowate mają tendencję do zapadania się. Mocowanie konstrukcji o wielkości poniżej 400 μm powinno zapobiegać zmianom konstrukcyjnym.
Dla optymalnego znakowania immunologicznego kluczowym krokiem jest odzyskanie organoidów z ich matryc 3D. Macierz 3D może utrudniać odpowiednią penetrację przeciwciał lub prowadzić do wysokiego barwienia tła z powodu niespecyficznego wiązania z matrycą. Usunięcie ECM może zmienić morfologię zewnętrznych segmentów organoidów (szczególnie w przypadku małych wypukłości komórkowych wystających z badanych struktur 3D) i częściowo utrudnić analizy. W przypadku takich struktur 3D matryca może być zachowana przez cały czas trwania procedury; Jednakże warunki hodowli powinny być starannie dostosowane do wzrostu komórek w minimalnej ilości matrycy, aby zapobiec niedostatecznemu przenikaniu roztworów i przeciwciał oraz aby uniknąć kolejnych etapów płukania mających na celu zmniejszenie nadmiernego szumu tła 6,8.
Etap oczyszczania optycznego opisany w tym protokole w sekcji barwienia całego mocowania 3D jest istotny dla obrazowania struktur 3D o głębokości do 150-200 μm zamiast 50-80 μm bez oczyszczania. W porównaniu z innymi metodologiami oczyszczania, które często wymagały kilku tygodni i stosowania toksycznych środków czyszczących, w niniejszym protokole zastosowano wcześniej opublikowany szybki i bezpieczny etap usuwania 4,9. Ponadto ten etap oczyszczania jest odwracalny, a nowe przeciwciała mogą być dodawane do początkowego barwienia bez utraty rozdzielczości lub jasności4. Niemniej jednak, w zależności od badanego modelu hodowli komórkowej 3D, głębokość 150-200 μm może nie być wystarczająca do zobrazowania struktury 3D w sposób informacyjny, a ten protokół oczyszczania może spowodować zmiany w ogólnej morfologii sferycznych, jednowarstwowych organoidów o dużych prześwitach4. Użytkownicy powinni starannie zaprojektować swój eksperyment i, jeśli to konieczne, zoptymalizować czas etapu przepuszczalności/blokowania (aby umożliwić penetrację przeciwciał i roztworu), etapu oczyszczania (aby wniknąć głębiej niż 200 μm, próbki powinny zostać całkowicie oczyszczone) i akwizycji obrazu. Dwie najbardziej rozpowszechnione technologie dostępne w głównych obiektach to mikroskopia świetlna i mikroskopia konfokalna. Użytkownicy będą musieli starannie wybrać technologię w oparciu o rozmiar swoich struktur 3D i pytanie biologiczne10. Jednak w porównaniu z mikroskopią konfokalną, rozdzielczość mikroskopii arkuszowej światła uzyskana dla tak głębokich struktur pozostaje nieoptymalna dla uzyskania rozdzielczości subkomórkowej.
W tym przypadku opisano szczegółowy i solidny proces, który jest dedykowany do zatapiania parafiny w pojedynczych próbkach. Co ciekawe, Gabriel i in. opracowali niedawno protokół osadzania kultur komórkowych 3D w parafinie ze zwiększoną przepustowością. Wykorzystali formę polidimetylosiloksanu (PDMS) do uwięzienia 96 struktur 3D we wzorze mikromacierzy w jednym bloku, zapewniając nowe perspektywy dla badań nad modelami guzów 3D obejmującymi więcej grup, punktów czasowych, warunków leczenia i replik11. Jednak ta metoda wymaga rozległych umiejętności i maszyn, w szczególności do wytwarzania premoldu używanego do tworzenia form PDMS.
Podsumowując, w artykule opisano dwa różne, uzupełniające się i adaptowalne podejścia umożliwiające uzyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat składu architektonicznego i komórkowego modeli komórkowych 3D. Oba parametry mają kluczowe znaczenie dla badania procesów biologicznych, takich jak wewnątrznowotworowa heterogeniczność komórkowa i jej rola w oporności na leczenie.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci postępy w biologii komórek macierzystych oraz w technologiach 3D in vitro zapoczątkowały rewolucję w biologii i medycynie. Bardziej złożone modele komórkowe w 3D zyskały ogromną popularność, ponieważ pozwalają komórkom rosnąć i oddziaływać z otaczającą je strukturą zewnątrzkomórkową, co ściśle odwzorowuje aspekty żywych tkanek, w tym ich architekturę, organizację i oddziaływania komórkowe, a nawet charakterystykę dyfuzji. W związku z tym modele hodowli komórkowych 3D mogą dostarczać unikalnych informacji na temat zachowania komórek w rozwijających się lub chorych tkankach in vitro. Organoidy i sferoidy to wielokomórkowe struktury 3D o rozmiarach od kilku mikrometrów do milimetrów, które stanowią najistotniejsze struktury 3D in vitro. Obie mogą być hodowane w rusztowaniach wspierających, takich jak (i) hydrożele pochodzenia zwierzęcego (ekstrakt błony podstawnej, kolagen), roślinnego (alginian/agaroza) lub syntetyczne, czy (ii) macierze obojętne zawierające pory sprzyjające proliferacji i wzrostowi komórek.
Organoidy i sferoidy mogą rozwijać się również bez obecności wspierającego rusztowania, opierając się na zdolności komórek do samoorganizacji w klastry. Wykorzystuje się w tym celu różne techniki, takie jak stosowanie materiałów nieprzylepnych w celu zahamowania adhezji komórek, napięcie powierzchniowe i siłę grawitacji (np. technika wiszącej kropli) lub stałą rotację naczyń (np. hodowla w bioreaktorach typu spinner). W każdym z tych przypadków techniki te ułatwiają oddziaływania komórka-komórka oraz komórka-macierz, co pozwala przełamać ograniczenia tradycyjnych hodowli monowarstwowych1. Terminy „organoidy” i „sferoidy” były w przeszłości używane zamiennie, jednak istnieją kluczowe różnice między tymi dwoma modelami 3D hodowli komórkowych. Organoidy to 3D klastry komórkowe in vitro pochodzące z pluripotencjalnych komórek macierzystych lub tkankowo specyficznych komórek macierzystych, w których komórki spontanicznie samoorganizują się w progenitory i zróżnicowane typy komórek, odtwarzając co najmniej niektóre funkcje badanego organu2. Sferoidy obejmują szerszy zakres wielokomórkowych struktur 3D formowanych w warunkach braku adhezji, które mogą powstawać z dużej różnorodności typów komórek, takich jak unieśmiertelnione linie komórkowe lub komórki pierwotne3. Z uwagi na swoje pochodzenie z komórek macierzystych, organoidy wykazują większą skłonność do samoorganizacji, wyższą żywotność i stabilność niż sferoidy.
Niemniej jednak, w swej istocie oba te modele są strukturami 3D składającymi się z wielu komórek, a techniki opracowane w celu ich badania są zatem bardzo podobne. Na przykład potężne podejścia obrazowe na poziomie rozdzielczości pojedynczych komórek są niezbędne do badania złożoności komórkowej zarówno organoidów, jak i sferoidów. W niniejszym artykule, podsumowując doświadczenie tej grupy oraz liderów w dziedzinie organoidów4, opisano szczegółowe procedury przeprowadzania dwuwymiarowego (2D) i trójwymiarowego (3D) barwienia całych preparatów (whole-mount staining), obrazowania oraz analizy składu komórkowego i subkomórkowego oraz organizacji przestrzennej organoidów i sferoidów o rozmiarach od 100 µm do kilku milimetrów. W rzeczywistości procedura ta przedstawia dwa różne i komplementarne typy barwienia i akwizycji obrazu w celu analizy szerokiego zakresu rozmiarów i typów in vitro 3D modeli kultur komórkowych. Wybór jednej metody (analizy 3D całych preparatów) lub drugiej (analizy przekrojów 2D) będzie zależał od badanego modelu i poszukiwanych odpowiedzi. Analizę 3D całych preparatów za pomocą mikroskopii konfokalnej można na przykład zastosować do wizualizacji komórek w kulturze 3D do głębokości 200 µm, niezależnie od całkowitego rozmiaru struktury 3D, podczas gdy analiza przekrojów 2D dostarcza informacji o próbkach dowolnego rozmiaru, choć na poziomie 2D. Procedura ta została z powodzeniem zastosowana w różnych organoidach4,5 oraz sferoidach pochodzących z komórek ludzkich i mysich, wywodzących się z różnych zarodkowych listków embrionalnych. Przegląd procedury przedstawiono na Rysunku 1. Wskazano na nim główne etapy, relacje między nimi, kroki decyzyjne oraz przewidywany czas trwania.
<img alt="Schemat barwienia całego preparatu 3D i sekcji 2D; konfiguracja mikroskopowa dla analizy immunologicznej i obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schematyczny przegląd procedury. Modele 3D hodowli komórkowych in vitro są zbierane i utrwalane, a następnie przygotowywane do barwienia całego preparatu 3D (opcja a) lub zatapiane w parafinie do sekcjonowania 2D i barwienia (opcja b). W przypadku eksperymentów z barwieniem całego preparatu 3D, utrwalone struktury 3D są poddawane immunoznakowaniu po etapie utrwalania. Można przeprowadzić opcjonalny etap przejaśniania optycznego w celu poprawy jakości obrazowania i głębokości mikroskopii optycznej poprzez redukcję rozproszenia światła podczas przetwarzania obrazu. Obrazy są rejestrowane za pomocą odwróconego mikroskopu konfokalnego lub konfokalnego systemu wysokoprzepustowego (high content system) i analizowane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania. W przypadku zatapiania w parafinie, struktury 3D są przetwarzane bezpośrednio (opcja b.1 dla dużych struktur ≥ 400 µm) lub zawieszone w żelu (b.2; małe struktury ≤ 400 µm) w celu odwodnienia i zatopienia w parafinie. Bloki parafinowe są następnie cięte i barwione (barwienie histologiczne lub immunochemiczne). Obrazy sekcji 2D są pozyskiwane za pomocą cyfrowego skanera slajdów lub mikroskopu biologicznego i analizowane na platformie analizy obrazu z wykorzystaniem szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podkładka do biopsji Q Path niebieska</td><td>VWR</td><td>720-2254</td><td></td></tr><tr><td>Kasety macrostar III Blc couv. Char. x1500</td><td>VWR</td><td>720-2233</td><td></td></tr><tr><td>Kaseta microtwin biała</td><td>VWR</td><td>720-2183</td><td></td></tr><tr><td>Osłona chemiczna</td><td>Erlab</td><td>FI82 5585-06</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki filtrujące 1000 &micro; L</td><td>Star lab Tip-One</td><td>S1122-1730</td><td></td></tr><tr><td>Szczypce do drobnych robótek</td><td>Innowacja piramidy</td><td>R35002-E</td><td></td></tr><tr><td>Rurki szklane z płaskim dnem wyłożone PTFE 2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11784259</td><td>Doskonały&nbsp; dla środowiska&nbsp; &nbsp; &nbsp; próbki,&nbsp; &nbsp; &nbsp; farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. PTFE został zaprojektowany z myślą o najwyższym bezpieczeństwie produktu. PTFE zapewnia całkowicie obojętne uszczelnienie wewnętrzne i powierzchnię skierowaną w stronę próbki lub produktu.</td></tr><tr><td>Szklana płyta dolna 35 mm</td><td>Ibedi</td><td>2018003</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanie poziome</td><td>N-BIOTEK</td><td>NB-205</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator podgrzany do 65 &deg; C</td><td>Inkubator Memmert</td><td>LAB129</td><td></td></tr><tr><td>Formy Inox 15x15</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Matsunami TOMO-11/90</td><td>Diagnostyka Roche</td><td>8082286001</td><td>te szkiełka służą do lepszej przyczepności przekrojów</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Microm Microtech Francja</td><td>HM340E</td><td></td></tr><tr><td>Skan panoramiczny II</td><td>3dhistech</td><td>2397612</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do zatapiania parafiny</td><td>Leica</td><td>EG1150C</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta plastikowa Pasteur 2 ml</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td></td></tr><tr><td>Q Path flakon 150mL cape blanc x250</td><td>VWR</td><td>216-1308</td><td>Dobre dla środowiska&nbsp; &nbsp; &nbsp; próbki,&nbsp; &nbsp; &nbsp; farmaceutyki i odczynniki diagnostyczne. Polipropylen (PP) jest sztywny,&nbsp; solidny, zapewnia doskonałą&nbsp; stres&nbsp; spolszczenie&nbsp; oraz&nbsp; Wpływ&nbsp; odporność i&nbsp; dobra bariera olejowa i alkoholowa oraz odporność chemiczna. Nasadka wyłożona PE jest odporna na pękanie naprężeniowe i oferuje&nbsp; Doskonały&nbsp; Uszczelnianie&nbsp; Charakterystyka.</td></tr><tr><td>Zestaw mikropipetorów&nbsp; (P200, P1000)</td><td>Thermo Scientific</td><td>11877351 (20-200) 11887351(p1000)</td><td></td></tr><tr><td>OPERA PHENIX</td><td>PerkinElmer</td><td>HH14000000</td><td></td></tr><tr><td>SP5 odwrócony mikroskop konfokalny</td> Kaseta na tkanki <td>Leica</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>720-0228</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Zeiss Axiomager</td><td>Leica</td><td>SIP 60549</td><td></td></tr><tr><td>odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Cytoblok (zestaw)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10066588</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57648266</td><td>UWAGA: toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Eozyna wodna 1%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT110316</td><td></td></tr><tr><td>etanol 96%</td><td>VWR</td><td>83804.360</td><td>UWAGA: Powoduje silne działanie drażniące na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Etanol 100%</td> <td>VWR</td><td>20821.365</td><td>UWAGA: Działa silnie drażniąco na oczy. Łatwopalna ciecz i para. Działa drażniąco na drogi oddechowe. Manipulować w dygestorium. Nosić okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Formalina 4%</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/40877-36</td><td>UWAGA: Formalina zawiera formaldehyd, który jest niebezpieczny. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne</td></tr>.<tr><td>Fruktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina skrzelowa typu II</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/CP813</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>UWAGA: Podejrzewa się, że powoduje wady genetyczne.&nbsp; Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice i okulary ochronne</td></tr>.<tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>wosku parafinowego tek III</td><td>Sakura</td><td>4511</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy sól fizjologiczna (PBS) 1 X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) 10X</td><td>Microm Microtech France</td><td>F/00801</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td>UWAGA: Triton X&shy; 100 jest niebezpieczne. Unikać kontaktu ze skórą i oczami.</td></tr><tr><td>Ksylen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>UWAGA: Ksylen jest toksyczny i łatwopalny. Opary mogą powodować podrażnienia. Manipulować w dygestorium. Unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą. Nosić gumowe rękawice, okulary ochronne.</td></tr><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący</td><td>Roztwór oczyszczający glicerol-fruktoza to 60% (obj./w) glicerolu i 2,5 M fruktozy. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, wymieszaj 6 ml glicerolu i 4,5 g fruktozy. Uzupełnij do 10 ml z dH2O. Użyj mieszadła magnetycznego na noc. Współczynnik załamania światła = 1,4688 w temperaturze pokojowej (RT: 19&ndash; 23 &stopnie; Przechowywać w temperaturze 4 & stopni; C w ciemności do 1 miesiąca.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS-BSA 0,1% roztwór</td><td>Aby przygotować 0,1% (obj./wag.) 0,1% roztwór PBS-BSA, rozpuścić 500 mg BSA w 50 ml PBS-1X (przechowywać w temperaturze 4& C przez okres do 2 tygodni). I rozcieńczyć 1 ml tego roztworu w 9 ml PBS-1X. To rozwiązanie może być używane do wstępnego powlekania końcówki i probówki wirówkowej.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór blokujący przenikanie (roztwór PB)</td><td>Roztwór blokujący PBSDT to PBS-1X uzupełniony 0,1% &ndash; 1% Tritonx-100 (w zależności od lokalizacji błony/jądra białkowego), 1% DMSO, 1% BSA i 1% surowicy osła (lub ze zwierzęcia, u którego wyniesiono przeciwciała drugorzędowe). Roztwór ten może być przechowywany w temperaturze 4&deg; C przez okres do 1 miesiąca.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PB:PBS-1X &nbsp;( 1:10) rozwiązanie</td><td>PB:PBS-1X &nbsp;( 1:10) jest 10-krotnie rozcieńczonym roztworem PB. Aby przygotować 10 ml tego roztworu, rozcieńczyć 1 ml roztworu PB w 9 ml PBS-1X.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halo oprogramowanie</td><td>Indicalabs</td><td>NM 87114</td><td></td></tr><tr><td>Harmony oprogramowanie</td><td>PerkinElmer</td><td>HH17000010</td><td></td></tr></tbody></table>

barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Trójwymiarowe (3D) modele hodowli komórkowych in vitro, takie jak organoidy i sferoidy, są cennymi narzędziami do wielu zastosowań, w tym do rozwoju i modelowania chorób, odkrywania leków i medycyny regeneracyjnej. Aby w pełni wykorzystać te modele, konieczne jest ich badanie na poziomie komórkowym i subkomórkowym. Jednak scharakteryzowanie takich modeli hodowli komórkowych 3D in vitro może być trudne technicznie i wymaga specjalistycznej wiedzy w celu przeprowadzenia skutecznych analiz. W tym artykule przedstawiono szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej ustalonych modeli hodowli komórkowych 3D in vitro w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów. Protokoły te mają zastosowanie do szerokiej gamy organoidów i sferoidów, które różnią się pochodzeniem komórki, morfologią i warunkami hodowli. Od zbierania struktur 3D po analizę obrazu, protokoły te można ukończyć w ciągu 4-5 dni. Krótko mówiąc, struktury 3D są zbierane, utrwalane, a następnie mogą być przetwarzane albo poprzez zatapianie w parafinie i barwienie histologiczne/immunohistochemiczne, albo bezpośrednio znakowane immunologicznie i przygotowywane do optycznego oczyszczania i rekonstrukcji 3D (głębokość 200 μm) za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Niniejszy protokół przedstawia przegląd krytycznych etapów barwienia całych preparatów (whole-mount) w 2D i 3D, a także obrazowania i analiz ilościowych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych (Rycina 3 i Rycina 4). Jest on możliwy do zastosowania w szerokim zakresie modeli hodowli komórkowych 3D – od sferoidów po organoidy z różnych gatunków gospodarzy lub tkanek – i umożliwia pozyskanie dokładnych i ilościowych informacji na temat architektury, organizacji komórkowej oraz oddziaływań na poziomie komórkowym i subkomórkowym (Rycina 3 i Rycina 4). Laboratoria mogą potrzebować optymalizacji technik histologicznych i immunohistochemicznych 2D oraz stężeń przeciwciał zgodnie z własnymi potrzebami.
Obie metody dostarczają cennych informacji biologicznych. Barwienie całego preparatu w 3D oraz mikroskopia konfokalna zapewniają informacje wizualne na temat składu komórkowego i położenia przestrzennego z głębokością pola wynoszącą do 200 µm (Rysunek 3B)Jednakże sekcjonowanie 2D jest dogodne w przypadku większych struktur 3D, pozwalając na ujawnienie szczegółowych cech morfologicznych komórek w całym przekroju struktur 3D, które w przeciwnym razie mogłyby być trudne do zaobserwowania in situ ze względu na rozpraszanie światła, które obniża rozdzielczość w większych próbkach. Ponadto obie techniki mogą dostarczać danych ilościowych. W rzeczywistości uzyskana rozdzielczość umożliwia zastosowanie algorytmów segmentacji komórkowej i podkomórkowej w celu ilościowego oznaczenia liczby komórek oraz wykrycia obecności różnych markerów komórkowych w różnych podtypach komórek. (Rycina 3F i Rysunek 4)Podsumowując, opisane tutaj techniki obrazowania są powtarzalne, proste i komplementarne, stanowiąc wartościowe narzędzia do badania heterogeniczności komórkowej.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna glejaka wysokiego stopnia złośliwości; barwienia Ki67 i Olig2; analiza segmentacji komórek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Reprezentatywne wyniki dla całego preparatu 3D, obrazowania oraz analiz przekrojów optycznych 3D i 2D. (A) Obrazy konfokalne sferoidu ludzkiego (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) oraz aktyną (czerwony) (obiektyw wodny 20x). Dla wszystkich uzyskanych obrazów ustawienia mikroskopu ustalono przy użyciu kontroli pozytywnej (góra), a następnie wykonano obrazowanie kontroli negatywnej przy użyciu identycznych ustawień, aby potwierdzić brak fluorescencji w przypadku braku przeciwciała pierwszorzędowego (dół). (B) Ortogonalna reprezentacja 3D całego preparatu z barwieniem Ki67 wykonanym w sferoidzie (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanym przez tydzień (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 20x, konfokalnie). (C) Obrazy konfokalne sferoidu (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski), Olig2 (żółty) oraz faloidyną-488 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 20x). (D) Obrazy konfokalne sferoidów ludzkiego (h) rabdomyosarcoma (góra) oraz mysiej (m) komórki grzebienia neuronalnego (dół) hodowanych przez tydzień i znakowanych odpowiednio Hoechst (niebieski), aktyną (czerwony) i Ki67 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw suchy 20x). (E) Obrazy konfokalne sferoidu (h) glejaka wysokiego stopnia złośliwości hodowanego przez tydzień i znakowanego Hoechst (niebieski) oraz Ki67 (zielony) (klarowanie glicerolo-fruktozowe; obiektyw wodny 40x) (lewa góra). Obrazy segmentowane w kanale Hoechst oraz dodatnie (+) regiony jądrowe Ki67 w kanale zielonym zostały wygenerowane przy użyciu oprogramowania do analizy wysokoprzepustowej (zobacz Uzupełniający Rysunek 1 oraz Tabelę materiałów) (dół). Wynik przedstawia procent jądra Ki67+ na zsegmentowaną strukturę 3D (prawa góra). Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Analiza histologiczna, barwienie H&amp;E; ilościowe oznaczenie Ki67; rozkład wielkości komórek; wyniki przedstawione na wykresach słupkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62280/62280fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Reprezentatywne wyniki obrazowania i analizy 2D przekrojów optycznych. (A, D) Obrazy przekrojów 2D modelu komórkowego 3D (sferoidy rabdomyosarcoma człowieka hodowane przez miesiąc), uzyskane za pomocą cyfrowego skanera preparatów i analizowane na platformie do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej. (A) Barwienie H&amp;E i detekcja komórek w zależności od ich wielkości. Pasek skali = 500 µm. (B) Histogram przedstawia procent komórek &lt; 100 µm2 i &gt; 100 µm2 wykrytych przy użyciu oprogramowania do szybkiej cyfrowej analizy ilościowej (lewo: Halo) lub poprzez liczenie ręczne (prawo: MC). (C) Barwienie Ki67 i detekcja komórek w zależności od intensywności sygnału 3,3'-diaminobenzydyny (DAB). Negatywne (niebieskie), słabo dodatnie (żółte), dodatnie (czerwone). Pasek skali = 500 µm. (D) Histogram przedstawia procent komórek Ki67-ujemnych, słabo dodatnich i dodatnich. Skróty: H&amp;E = hematoksylina i eozyna; MC = liczenie ręczne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/62280fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Rysunek uzupełniający 1: Przegląd kroków w oprogramowaniu do analizy obrazowania. Analizy opierają się na powiązaniu bloków budulcowych. Każdy blok budulcowy odpowiada danej funkcji — segmentacji, obliczeniom, powiązaniu, definicji wyniku — i oferuje wiele algorytmów oraz opcji wyboru zmiennych, aby dopasować je do obrazowanej próbki biologicznej. Oprogramowanie zapewnia wiele gotowych protokołów analizy RMS (Ready Made Solution), które można łatwo wykorzystać i zmodyfikować. Zintegrowane protokoły analizy obrazu mogą być zapisywane, stosowane do różnych zestawów danych i udostępniane między użytkownikami. W skrócie, protokół analizy zakłada sekwencyjną segmentację obiektów: sferoidu, jąder komórkowych i na końcu obszarów Ki67 (A488). Następnie obliczana jest średnia intensywność obszarów Ki67, aby dalej odróżnić zdarzenia pozytywne. Na koniec jako pozytywne wybierane są jądra komórkowe zawierające pozytywne obszary Ki67. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl1_Harmony%20analysis_Revised.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Rycina uzupełniająca 2: Przegląd kroków procedury oprogramowania do analizy ilościowej. Krok 1. Prześlij pliki, korzystając z karty Studies. Pliki zostaną otwarte w sekcji Image Actions. Krok 2. Otwórz kartę Annotations, a następnie kliknij Layer Actions, aby zaprojektować nową warstwę wokół struktury, używając narzędzia circle z paska narzędzi. W przypadku struktur niekolistych można zamiast tego użyć narzędzia pen. Krok 3. Pasek narzędzi może być wykorzystany do projektowania adnotacji i wizualizacji ilościowej za pomocą narzędzia <img alt="spektroskopia przejściowa, ΣFx=0, wykres analizy optycznej, układ spektroskopowy, pomiar wzbudzenia" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">. Krok 4. Otwórz kartę Analysis i wybierz optymalne warunki do analizy próbki (może być konieczne przeprowadzenie kilku prób). Krok 4.1. Skorzystaj z sekcji Stain Selection, aby ustawić warunki barwienia. W przypadku kilku barwników można je dodać i zmienić ich nazwy, a także zmodyfikować kolor virtual. Można określić detekcję lokalizacji – barwienie jądrowe lub cytoplazmatyczne. Krok 4.2. Skorzystaj z sekcji Cell Detection, aby skonfigurować detekcję komórek. Ta sekcja będzie najważniejsza dla analizy. Sekcja Nuclear Contrast Threshold umożliwi wykrycie wszystkich jąder. Należy zwrócić uwagę, że w przypadku występowania wielu rozmiarów populacji oprogramowanie może wykryć kilka komórek zamiast jednej dużej. Sekcje Nuclear Size oraz Nuclear segmentation aggressiveness mogą służyć do ilościowego określania zakresów rozmiarów populacji komórek. Krok 5. Opis sposobu przeprowadzenia analizy próbki. Postępuj zgodnie z krokami przedstawionymi na rysunku. Sekcja Annotation Layer uruchomi ustawienia tylko dla tego slajdu. Ilościowe wyniki można wizualizować za pomocą narzędzia <img alt="spektroskopia przejściowa, ΣFx=0, wykres analizy optycznej, układ spektroskopowy, pomiar wzbudzenia" src="/files/ftp_upload/62280/62280eq01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Równanie 1">. Powtarzaj kroki 4.1–5, aż do uzyskania odpowiedniej analizy ilościowej. Kroki 6–6.1. Te kroki umożliwiają narysowanie rysunku za pomocą oprogramowania. Krok 7. Grafiki ilościowe uzyskane za pomocą oprogramowania mogą zostać zapisane. Krok 8. Dane mogą zostać wyeksportowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62280/Suppl2_Halo%20Images_revised.pdf" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Scharakteryzowanie modelu 3D in vitro w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej ma kluczowe znaczenie dla pełnego wykorzystania, ale może być trudne. W związku z tym udostępniliśmy bezpłatny protokół barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych modeli 3D in vitro w zakresie od 100 mikrometrów do kilku milimetrów. Struktury 3D są promieniste i należy nimi ostrożnie manipulować.Przed pipetowaniem należy sprawdzić położenie struktur 3D w probówce, aby uniknąć zachłyśnięcia. Ponieważ dostosowaliśmy klasyczne techniki osadzania małych struktur, takich jak organoidy lub sferoidy, wizualizowane instrukcje mogą pomóc początkującym użytkownikom w łatwiejszym wykonaniu zadania. Procedurę zademonstruje ze mną Laura Francols, technik laboratoryjny z Pathology Research Platform.Aby przygotować próbki do barwienia 3D w całości, użyj jednomililitrowej końcówki pipety wstępnie zakodowanej BSA, aby dodać jednomililitrową zawiesinę struktury 3D do 500-mikrolitrowej probówki PBS. Gdy struktury 3D osiądą na dnie probówki, ostrożnie zastąp PBS 500 mikrolitrami roztworu blokującego przepuszczalność na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem poziomym przy 30 do 50 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji pozwól strukturom 3D ponownie się osadzić, a następnie ostrożnie umyj struktury 3D dwa razy w jednym mililitrze 0,1% PBS uzupełnionym BSA przez trzy minuty na pranie.Po ostatnim praniu oznacz struktury 3D 250 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego w PBS przez dwa do trzech dni z delikatnym mieszaniem poziomym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć próbkę pięcioma trzyminutowymi i dwoma 15-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze 0,1% PBS BSA na przemycie. Po ostatnim praniu oznaczyć struktury 3D 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego w PBS przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem poziomym chronionym przed światłem.Następnego dnia oznacz struktury 3D 250 mikrolitrami odpowiedniego stężenia Hoechst 3342 na dwugodzinną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem poziomym. Pod koniec inkubacji przemyć struktury 3D pięć razy przez trzy minuty i dwa razy przez 15 minut w jednym mililitrze PBS na pranie, jak pokazano. Po ostatnim umyciu przenieś struktury 3D na 96-dołkową czarną mikropłytkę polistyrenową i delikatnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu klarującego na struktury, unikając pęcherzyków.Następnie umieść talerz przykryty folią aluminiową w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 48 godzin. Aby osadzić duże modele hodowli komórkowych 3D, użyj pokrytej przez BSA jednomililitrowej końcówki pipety, aby ostrożnie przenieść struktury 3D do szklanej rurki o płaskim dnie z nakrętką wyłożoną PTFE. Po ustabilizowaniu się struktur ostrożnie zastąp PBS 70% etanolem na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.Pod koniec inkubacji zastąp 70% etanol jednym mililitrem gotowego do użycia roztworu eozyny Y. Przesuń rurkę i poplam konstrukcje przez co najmniej 30 minut. Pod koniec inkubacji odwodnić struktury trzema kolejnymi 30-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze 100% etanolu na pranie.Po ostatnim odwodnieniu oczyść struktury 3D za pomocą trzech kolejnych 30-minutowych myć w jednym mililitrze ksylenu na pranie pod kapturem chemicznym. Po ostatnim zanurzeniu ksylenu umieść kawałek podkładki biopsyjnej nasączonej ksylenem w jednej komorze białej kasety na tkanki z mikrobliźniakami i użyj dwumililitrowej plastikowej pipety Pasteura pokrytej BSA, aby przenieść struktury 3D na podkładkę. Przykryj struktury 3D inną podkładką biopsyjną nasączoną ksylenem, aby utrzymać struktury 3D na miejscu i zamknij kasetę.Po przeniesieniu wszystkich próbek umieść kasety w kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie umieść kasety w świeżej kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka dodaj ciekłą parafinę do jednej formy do zatapiania o temperaturze 65 stopni Celsjusza na próbkę i umieść jedną próbkę zatopioną w parafinie w każdej formie. Delikatnie mieszaj formy, aż wszystkie struktury 3D opadną na dno, i użyj cienkich kleszczyków rozgrzanych w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby ustawić struktury 3D w środku każdej formy.Schłodź formę, aż parafina utworzy cienką stałą warstwę, zabezpieczając strukturę 3D na miejscu. Umieść kasetę na chusteczki higieniczne i dodaj gorącą parafinę na formę. Usuń formę, gdy parafina całkowicie zastygnie.Aby osadzić małe modele kultur komórkowych 3D, delikatnie umyj struktury 3D trzy razy w jednym mililitrze TBS na pranie. Po ostatnim praniu usuń jak najwięcej TBS bez dotykania struktur i dodaj dwie krople odczynnika dwa z dostępnego zestawu do zatapiania parafiny. Delikatnie wymieszaj, stukając i dodaj dwie krople odczynnika, jedną stukając, aż żel stwardnieje.Za pomocą cienkich kleszczyków przenieś żel z dołka wstępnie zmontowanej kasety z zestawu i odwodnić próbkę zatopioną w żelu za pomocą 30-minutowej inkubacji etanolu i ksylenu w dygestoriach, jak wskazano. Po ostatnim zanurzeniu w ksylenie umieść kasetę w kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc, a następnie użyj drobnych kleszczyków, aby przenieść próbkę zatopioną w parafinie do środka ciekłej parafiny załadowanej formą do zatapiania o temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie zabezpiecz strukturę 3D jeszcze jedną warstwą parafiny, jak pokazano w przypadku dużych modeli 3D hodowli komórkowych.Trójwymiarowe barwienie całego mocowania i mikroskopia konfokalna dostarczają wizualnych informacji o składzie komórkowym i położeniu przestrzennym modeli kultur 3D do pola o głębokości do 200 mikronów. Wysoka rozdzielczość, którą można uzyskać dla struktur 3D za pomocą tego protokołu, pozwala na zastosowanie algorytmów segmentacji komórkowej i subkomórkowej do ilościowego określania liczby komórek i wykrywania różnych markerów komórkowych w różnych podtypach komórek. Analiza całych mocowań 3D może być stosowana do wizualizowanych komórek o głębokości do 200 mikronów, niezależnie od całych struktur.Wręcz przeciwnie, analiza przekrojów 2D może zapewnić wgląd w komórki o dowolnym rozmiarze.

staining-high-resolution-imaging-three-dimensional-organoid-spheroid

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Optyczna tomografia koherentna (OCT), technologia obrazowania trójwymiarowego, została wykorzystana do monitorowania i charakteryzowania kinetyki wzrostu sferoid wielokomórkowych guzów. Wykazano precyzyjną wolumetryczną kwantyfikację sferoid guza przy użyciu metody liczenia wokseli oraz bezznacznikowe wykrywanie martwych tkanek w sferoidach w oparciu o wewnętrzny kontrast tłumienia optycznego.

Podłużne monitorowanie morfologiczne i fizjologiczne trójwymiarowych sferoid nowotworowych za pomocą optycznej koherentnej tomografii

Cała struktura 3D i zawartość komórkowa organoidów, jak również ich fenotypowe podobieństwo do oryginalnej tkanki, mogą być uchwycone za pomocą opisanego tutaj protokołu obrazowania 3D o rozdzielczości pojedynczej komórki. Protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy organoidów różniących się pochodzeniem, rozmiarem i kształtem.

Trójwymiarowe obrazowanie nienaruszonych organoidów w rozdzielczości pojedynczej komórki

Szczegółowy protokół jest tutaj przedstawiony w celu opisania modelu organoidowego in vitro z ludzkich komórek nabłonka nosa. Protokół posiada opcje pomiarów wymagających standardowego sprzętu laboratoryjnego, z dodatkowymi możliwościami dla specjalistycznego sprzętu i oprogramowania.

Hodowla i obrazowanie ludzkich organoidów nabłonkowych nosa

Ten artykuł przedstawia protokół produkcji nowego typu substratu hodowlanego z setkami mikropojemników namm2, w których organoidy mogą być hodowane i obserwowane za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości. Szczegółowo opisano również protokoły wysiewu komórek i barwienia immunologicznego.

Wysokoprzepustowa platforma do hodowli i obrazowania 3D organoidów

Niniejsze badanie opisuje metodologie hodowli, zamrażania, rozmrażania, przetwarzania, barwienia, etykietowania i badania całych sferoid i organoidów pod różnymi mikroskopami, podczas gdy pozostają one nienaruszone w hydrożelu w wielofunkcyjnym urządzeniu.

Hodowla, zamrażanie, przetwarzanie i obrazowanie całych organoidów i sferoidów jeszcze w hydrożelu

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Protokół ten łączy w sobie oczyszczanie optyczne i znakowanie immunologiczne w celu obrazowania konfokalnego całej objętości organoidów siatkówki z pełnym mocowaniem. Zachowuje strukturę 3D, umożliwiając szczegółową wizualizację kluczowych ścieżek neuronalnych, usprawniając badanie dojrzewania siatkówki, organizacji przestrzennej i jej potencjalnych zastosowań w modelowaniu chorób i medycynie spersonalizowanej.

Wizualizacja organoidów siatkówki w całości z rozdzielczością komórkową

Przedstawiamy krok po kroku protokół do wysokorozdzielczego, bezznacznikowego i trójwymiarowego obrazowania organoidów przy użyciu holotomografii o niskiej koherentności. Protokół ten szczegółowo opisuje przygotowanie hodowli organoidów, akwizycję obrazowania i obliczeniową analizę obrazu, umożliwiając wizualizację w czasie rzeczywistym dynamiki strukturalnej i reakcji leków w żywych organoidach.

Bezznacznikowe obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości i analiza organoidów jelitowych za pomocą uczenia maszynowego za pomocą holotomografii o niskiej koherentności

Neurony *Aplysia californica* w hodowli tworzą duże stożki wzrostu, które doskonale nadają się do obrazowania wysokiej rozdzielczości w badaniu motywności i prowadzenia stożków wzrostu. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół sekcji i wysiewu neuronów komórek torby *Aplysia* oraz przygotowania komory do obrazowania żywych komórek.

Kultury komórek neuronalnych z Aplysia do obrazowania stożków wzrostu w wysokiej rozdzielczości

Bezpieczna i humanitarna praca z gryzoniami laboratoryjnymi wymaga podstawowych kompetencji w zakresie metod chwytania i unieruchamiania. Niniejszy artykuł przedstawi podstawowe zasady niezbędne do bezpiecznego obchodzenia się z myszami i szczurami oraz efektywnego podawania im związków chemicznych.

Manualne unieruchamianie i powszechne drogi podawania związków u myszy i szczurów

Poznaj protokoły barwienia i obrazowania w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów. Metody te umożliwiają analizę komórkową i subkomórkową w badaniach nad rozwojem, modelowaniem chorób oraz odkrywaniem leków.

Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów

Przeglądaj więcej filmów