Barwienie i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości trójwymiarowych modeli organoidów i sferoidów
27 marca 2021
Tutaj udostępniamy szczegółowe, solidne i uzupełniające protokoły do wykonywania barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych trójwymiarowych modeli hodowli komórkowych w zakresie od 100 μm do kilku milimetrów, umożliwiając w ten sposób wizualizację ich morfologii, składu typu komórki i interakcji.
Scharakteryzowanie modelu 3D in vitro w rozdzielczości komórkowej i subkomórkowej ma kluczowe znaczenie dla pełnego wykorzystania, ale może być trudne. W związku z tym udostępniliśmy bezpłatny protokół barwienia i obrazowania w rozdzielczości subkomórkowej stałych modeli 3D in vitro w zakresie od 100 mikrometrów do kilku milimetrów. Struktury 3D są promieniste i należy nimi ostrożnie manipulować.
Przed pipetowaniem należy sprawdzić położenie struktur 3D w probówce, aby uniknąć zachłyśnięcia. Ponieważ dostosowaliśmy klasyczne techniki osadzania małych struktur, takich jak organoidy lub sferoidy, wizualizowane instrukcje mogą pomóc początkującym użytkownikom w łatwiejszym wykonaniu zadania. Procedurę zademonstruje ze mną Laura Francols, technik laboratoryjny z Pathology Research Platform.
Aby przygotować próbki do barwienia 3D w całości, użyj jednomililitrowej końcówki pipety wstępnie zakodowanej BSA, aby dodać jednomililitrową zawiesinę struktury 3D do 500-mikrolitrowej probówki PBS. Gdy struktury 3D osiądą na dnie probówki, ostrożnie zastąp PBS 500 mikrolitrami roztworu blokującego przepuszczalność na godzinną inkubację w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem poziomym przy 30 do 50 obrotach na minutę. Pod koniec inkubacji pozwól strukturom 3D ponownie się osadzić, a następnie ostrożnie umyj struktury 3D dwa razy w jednym mililitrze 0,1% PBS uzupełnionym BSA przez trzy minuty na pranie.
Po ostatnim praniu oznacz struktury 3D 250 mikrolitrami przeciwciała pierwszorzędowego w PBS przez dwa do trzech dni z delikatnym mieszaniem poziomym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji przemyć próbkę pięcioma trzyminutowymi i dwoma 15-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze 0,1% PBS BSA na przemycie. Po ostatnim praniu oznaczyć struktury 3D 250 mikrolitrami odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego w PBS przez 24 godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem poziomym chronionym przed światłem.
Następnego dnia oznacz struktury 3D 250 mikrolitrami odpowiedniego stężenia Hoechst 3342 na dwugodzinną inkubację w temperaturze czterech stopni Celsjusza z delikatnym mieszaniem poziomym. Pod koniec inkubacji przemyć struktury 3D pięć razy przez trzy minuty i dwa razy przez 15 minut w jednym mililitrze PBS na pranie, jak pokazano. Po ostatnim umyciu przenieś struktury 3D na 96-dołkową czarną mikropłytkę polistyrenową i delikatnie dodaj 200 mikrolitrów roztworu klarującego na struktury, unikając pęcherzyków.
Następnie umieść talerz przykryty folią aluminiową w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 48 godzin. Aby osadzić duże modele hodowli komórkowych 3D, użyj pokrytej przez BSA jednomililitrowej końcówki pipety, aby ostrożnie przenieść struktury 3D do szklanej rurki o płaskim dnie z nakrętką wyłożoną PTFE. Po ustabilizowaniu się struktur ostrożnie zastąp PBS 70% etanolem na 30-minutową inkubację w temperaturze pokojowej.
Pod koniec inkubacji zastąp 70% etanol jednym mililitrem gotowego do użycia roztworu eozyny Y. Przesuń rurkę i poplam konstrukcje przez co najmniej 30 minut. Pod koniec inkubacji odwodnić struktury trzema kolejnymi 30-minutowymi płukaniami w jednym mililitrze 100% etanolu na pranie.
Po ostatnim odwodnieniu oczyść struktury 3D za pomocą trzech kolejnych 30-minutowych myć w jednym mililitrze ksylenu na pranie pod kapturem chemicznym. Po ostatnim zanurzeniu ksylenu umieść kawałek podkładki biopsyjnej nasączonej ksylenem w jednej komorze białej kasety na tkanki z mikrobliźniakami i użyj dwumililitrowej plastikowej pipety Pasteura pokrytej BSA, aby przenieść struktury 3D na podkładkę. Przykryj struktury 3D inną podkładką biopsyjną nasączoną ksylenem, aby utrzymać struktury 3D na miejscu i zamknij kasetę.
Po przeniesieniu wszystkich próbek umieść kasety w kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na 30 minut, a następnie umieść kasety w świeżej kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc. Następnego ranka dodaj ciekłą parafinę do jednej formy do zatapiania o temperaturze 65 stopni Celsjusza na próbkę i umieść jedną próbkę zatopioną w parafinie w każdej formie. Delikatnie mieszaj formy, aż wszystkie struktury 3D opadną na dno, i użyj cienkich kleszczyków rozgrzanych w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby ustawić struktury 3D w środku każdej formy.
Schłodź formę, aż parafina utworzy cienką stałą warstwę, zabezpieczając strukturę 3D na miejscu. Umieść kasetę na chusteczki higieniczne i dodaj gorącą parafinę na formę. Usuń formę, gdy parafina całkowicie zastygnie.
Aby osadzić małe modele kultur komórkowych 3D, delikatnie umyj struktury 3D trzy razy w jednym mililitrze TBS na pranie. Po ostatnim praniu usuń jak najwięcej TBS bez dotykania struktur i dodaj dwie krople odczynnika dwa z dostępnego zestawu do zatapiania parafiny. Delikatnie wymieszaj, stukając i dodaj dwie krople odczynnika, jedną stukając, aż żel stwardnieje.
Za pomocą cienkich kleszczyków przenieś żel z dołka wstępnie zmontowanej kasety z zestawu i odwodnić próbkę zatopioną w żelu za pomocą 30-minutowej inkubacji etanolu i ksylenu w dygestoriach, jak wskazano. Po ostatnim zanurzeniu w ksylenie umieść kasetę w kąpieli parafinowej o temperaturze 65 stopni Celsjusza na noc, a następnie użyj drobnych kleszczyków, aby przenieść próbkę zatopioną w parafinie do środka ciekłej parafiny załadowanej formą do zatapiania o temperaturze 65 stopni Celsjusza. Następnie zabezpiecz strukturę 3D jeszcze jedną warstwą parafiny, jak pokazano w przypadku dużych modeli 3D hodowli komórkowych.
Trójwymiarowe barwienie całego mocowania i mikroskopia konfokalna dostarczają wizualnych informacji o składzie komórkowym i położeniu przestrzennym modeli kultur 3D do pola o głębokości do 200 mikronów. Wysoka rozdzielczość, którą można uzyskać dla struktur 3D za pomocą tego protokołu, pozwala na zastosowanie algorytmów segmentacji komórkowej i subkomórkowej do ilościowego określania liczby komórek i wykrywania różnych markerów komórkowych w różnych podtypach komórek. Analiza całych mocowań 3D może być stosowana do wizualizowanych komórek o głębokości do 200 mikronów, niezależnie od całych struktur.
Wręcz przeciwnie, analiza przekrojów 2D może zapewnić wgląd w komórki o dowolnym rozmiarze.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowe protokoły barwienia oraz obrazowania z rozdzielczością subkomórkową dla utrwalonych in vitro trójwymiarowych (3D) modeli kultur komórkowych, takich jak organoidy i sferoidy. Opisane metody umożliwiają badaczom analizę kultur 3D o rozmiarach od 100 µm do kilku milimetrów, co ułatwia charakterystykę komórkową i subkomórkową, niezbędną w procesach rozwojowych, modelowaniu chorób, poszukiwaniu nowych leków oraz w medycynie regeneracyjnej. Protokoły obejmują zarówno immunoznakowanie całych preparatów z zastosowaniem klarowania optycznego dla mikroskopii konfokalnej, jak i zatapianie w parafinie do analiz histologicznych i immunohistochemicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Histologia
- Techniki obrazowania
- Trójwymiarowa hodowla komórek
Wstęp
- Trójwymiarowe (3D) modele hodowli komórkowych, w tym organoidy i sferoidy, są coraz częściej wykorzystywane do modelowania rozwoju i chorób, przesiewania leków oraz w medycynie regeneracyjnej.
- Szczegółowa analiza komórkowa i subkomórkowa tych modeli jest technicznie trudna ze względu na ich rozmiar i złożoność.
- Niezbędne są zestandaryzowane, solidne protokoły, które umożliwią powtarzalne obrazowanie kultur 3D w wysokiej rozdzielczości.
- Zarówno analizy całych preparatów, jak i analizy oparte na przekrojach dostarczają komplementarnych informacji o składzie komórkowym i organizacji przestrzennej.
Cel badania
- Zapewnienie kompleksowych, szczegółowych protokołów barwienia i obrazowania utrwalonych trójwymiarowych (3D) modeli hodowli komórkowych in vitro.
- Umożliwienie wysokorozdzielczej analizy komórkowej i podkomórkowej organoidów oraz sferoidów o różnej wielkości i morfologii.
- Ułatwienie powtarzalnego przygotowania próbek zarówno do analiz całych preparatów (whole mount), jak i analiz w blokach parafinowych.
Zastosowane metody
- Staranne pozyskiwanie i obchodzenie się ze strukturami 3D w celu uniknięcia ich uszkodzenia.
- Immunoznakowanie całych preparatów: permeabilizacja, blokowanie, inkubacja z przeciwciałami pierwszorzędowymi i drugorzędowymi, barwienie jąder komórkowych oraz klarowanie optyczne.
- Zalewanie w parafinie: odwodnienie, barwienie eozyną, klarowanie w ksylenie, zalewanie w formach parafinowych i cięcie na skrawki do barwień histologicznych/immunohistochemicznych.
- Mikroskopia konfokalna do obrazowania 3D do głębokości 200 µm oraz zastosowanie algorytmów segmentacji do analizy ilościowej.
Główne wyniki
- Opisane protokoły umożliwiają wiarygodne barwienie i obrazowanie trójwymiarowych modeli kultur komórkowych o rozmiarach od 100 µm do kilku milimetrów.
- Barwienie całych preparatów w połączeniu z mikroskopią konfokalną zapewnia wysokorozdzielczą wizualizację składu komórkowego i układu przestrzennego do głębokości 200 µm.
- Zatapianie w parafinie i przygotowywanie skrawków pozwalają na szczegółową analizę komórek w strukturach o dowolnym rozmiarze.
- Metody te umożliwiają ilościowe oznaczenie liczby komórek oraz wykrywanie specyficznych markerów komórkowych w obrębie poszczególnych podtypów.
Wnioski
- Opisane protokoły stanowią niezawodne i komplementarne podejścia do charakterystyki komórkowej i subkomórkowej 3D modeli in vitro.
- Metody te mają szerokie zastosowanie w przypadku różnych organoidów i sferoidów, niezależnie od ich pochodzenia czy warunków hodowli.
- Wdrożenie tych protokołów może zwiększyć powtarzalność i głębię analiz w badaniach nad 3D hodowlami komórkowymi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Barwienie i obrazowanie o wysokiej rozdzielczości w trójwymiarowych (3D) modelach organoidów i sferoidów rozwiązuje krytyczny problem w badaniach nad wczesnym odkrywaniem leków i badaniach translacyjnych, umożliwiając charakterystykę komórkową i subkomórkową w złożonych systemach in vitro. Protokoły te zwiększają wiarygodność predykcyjną w modelowaniu chorób i procesach odkrywania leków, dostarczając solidnych i powtarzalnych danych na temat składu komórkowego oraz organizacji przestrzennej. Ich szeroka stosowalność w różnorodnych modelach 3D sprzyja standaryzacji całego portfolio i podejmowaniu decyzji w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szczegółową analizę architektury komórkowej i ekspresji markerów w modelach 3D istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez wizualizację relacji przestrzennych i podtypów komórek w organoidach i sferoidach.
- Ułatwia mechanistyczne ograniczanie ryzyka dzięki ilościowej segmentacji i wykrywaniu markerów w rozdzielczości subkomórkowej.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje walidowane biologiczne systemy 3D do późniejszego przesiewania związków i analizy fenotypowej.
- Standaryzuje procesy barwienia i obrazowania, aby zapewnić powtarzalność i porównywalność ilościową wyników między eksperymentami.
- Umożliwia uzyskanie wysokotreściowych obrazów odpowiednich do skalowalnego przesiewania i ponownego wykorzystania platformy.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia powiązanie wyników otrzymanych in vitro ze strategiami biomarkerów translacyjnych dzięki detekcji wielu markerów w kontekstach 3D.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej, wspierając rzetelną analizę komórkową i podkomórkową.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez zapewnienie charakterystyki systemów istotnych dla danej choroby przed rozpoczęciem badań in vivo.
Integracja potoku i przepływu pracy
Protokoły te integrują się z kontinuum badawczym – od wczesnych testów hipotez, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po walidację przedkliniczną, wspierając analizy całych preparatów oraz analizy na podstawie przekrojów w celu kompleksowej charakterystyki modelu.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez wizualizację składu komórkowego i organizacji przestrzennej.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowe do analizy, powtarzalne modele 3D z ilościowymi wynikami obrazowania do oceny związków chemicznych.
- Analityka: Zapewnia pomiary o wysokiej rozdzielczości oraz dane segmentacyjne do porównywania warunków doświadczalnych i wykrywania markerów komórkowych.
- Badania translacyjne: Wspiera dopasowanie biomarkerów i ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie analizy multipleksowej w systemach istotnych dla danej choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje ustandaryzowany, szeroko stosowalny schemat postępowania dla różnorodnych modeli organoidów i sferoidów w programach B+R.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w charakterystyce modeli 3D.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procesów barwienia oraz obrazowania.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową dzięki dostarczeniu rzetelnych danych komórkowych na wczesnym etapie procesu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację i rozwój kandydatów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o wysokotreściowe dane z modeli 3D.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek 3D oraz zaawansowanych technik obrazowania.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej i infrastruktury do analizy obrazu w celu uzyskania rozdzielczości subkomórkowej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów barwienia i obrazowania pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do dostosowania do szerokiego zakresu modeli organoidów i sferoidów o różnej morfologii i pochodzeniu.
- Staranna manipulacja oraz przestrzeganie protokołu są niezbędne do zachowania integralności struktury 3D.
