Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis i innych roślin
9 marca 2021
Przedstawiamy protokół budowy prostego systemu dystrybucji zarodników, składającego się z pudełka do zaszczepiania z siatką ~50 μm i przezroczystej komory z tworzywa sztucznego. Można to wykorzystać do równomiernego zaszczepienia roślin zarodnikami mączniaka prawdziwego, umożliwiając w ten sposób dokładną i odtwarzalną ocenę fenotypów chorobowych badanych roślin.
Mączniak prawdziwy jest ważną chorobą roślin. Dokładne określenie fenotypu choroby wymaga równomiernego zaszczepienia patogenu. Ponieważ istniejące metody są nieefektywne, opracowaliśmy ten protokół.
Nasza metoda inokulacji zarodników może z łatwością osiągnąć równomierną inokulację, a do tego jest prosta i skalowalna. Dlatego każde laboratorium pracujące z mączniakiem prawdziwym może z łatwością zastosować tę metodę. Naukowcy mogą również zamontować siatkę na kartonowym pudełku i użyć jej do zaszczepienia zarodników.
Jak usunąć zarodniki i przeczesać je przez siatkę, jest krytycznym krokiem. Tak więc pokazanie tego na wideo może być bardzo pomocne. W przypadku tego protokołu zdobądź rolkę nylonowej siatki membranowej o grubości 50 mikrometrów lub siatki ze stali nierdzewnej o długości 48 mikrometrów.
Pokrój sklejkę o dużych rozmiarach i średniej gęstości na kawałki o wymiarach 24,5 x 10 cali i 12 x 10 cali, aby zrobić pudełko do zaszczepiania. Aby wykonać zdejmowaną górną pokrywę z siatką, pokrój długi drewniany kwadratowy kołek na dwa zestawy 26 cali i 12,75 cala. Przyklej i przybij cztery elementy, aby zmieściły się wokół pudełka.
Weź arkusze akrylowe i złóż wszystkie arkusze akrylowe w pudełku za pomocą ośmiu zacisków narożnych. Wytnij otwierane okno o wymiarach 7X2 cale z przodu akrylowego arkusza pudełka. Aby przygotować świeże zarodniki mączniaka prawdziwego jako inokula, hoduj czyste, zmutowane rośliny z łazienką odpornościową Arabidopsis pad4-1 w komorze wzrostowej w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 65% przez sześć do ośmiu tygodni.
Uprawiaj rośliny, aby określić fenotypy infekcji w standardowych mieszkaniach. Zaszczep jedną lub połowę roślin pad4-1, aby zbudować wystarczającą ilość świeżych zarodników mączniaka prawdziwego. Gdy świeże zarodniki z zakażonych roślin są dostępne, przenieś mieszkanie roślin do pudełka do zaszczepiania wewnątrz komory do szczepienia w celu przeprowadzenia testu infekcji.
Odetnij od 15 do 20 silnie zainfekowanych liści rzodkiewnika i pozwól im wyschnąć, jeśli jest skondensowana woda. Trzymaj jeden lub dwa liście do góry nogami w jednej ręce za pomocą długich kleszczy. Następnie przełóż obie ręce przez otwór komory i delikatnie uderz nożyczkami w ramię kleszczy, powoli przesuwając liście nad siatką zamontowaną na pudełku do zaszczepiania.
Przeczesz zarodniki drobnymi szczotkami blendera wachlarzowego przez całą powierzchnię siatki w różnych kierunkach, aby zmaksymalizować równomierne rozprowadzenie zarodników na roślinach. Delikatnie poklep siatkę kilka razy szczotkami, aby strząsnąć zarodniki, które utknęły w siatce. Gdy zarodniki opadną, wynieś mieszkanie zawierające zaszczepione rośliny z pudełka do zaszczepiania.
Przykryj mieszkanie plastikową kopułą i umieść je w komorze wzrostowej o temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 65%. Fenotypowanie choroby można przeprowadzić po 5 lub 8 do 12 dniach od inokulacji. Zamień pudełka kartonowe w pudełko do zaszczepiania, usuwając górną i dolną stronę pudełka, przyklejając róg, aby go utwardzić, i montując siatkę o grubości 50 mikrometrów na górze za pomocą kleju.
Przenieś mieszkanie zawierające rośliny do komory do zaszczepiania i umieść mniejsze pudełko do zaszczepiania na wierzchu mieszkania, aby przykryć rośliny. Następnie usuń i wyszczotkuj zarodniki. Zrób mini pudełko do zaszczepiania nieco większe niż szalka Petriego.
Przechowuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce do czasu użycia. Wytnij jeden lub dwa w pełni rozwinięte liście z podstawy ogonka liściowego dla każdej badanej rośliny. Włóż ogonki oderwanych liści do podłoża agarowego pod kątem 30 stopni.
Zaszczepić liście w komorze do zaszczepiania i przenieść płytkę z pokrywką do komory wzrostu. W celu oceny fenotypów infekcji należy przenieść liście na świeżą, aseptyczną płytkę agarową MS po czterech lub pięciu dniach od inokulacji. Odetnij podstawę ogonka liściowego przed włożeniem liści do świeżego podłoża agarowego.
Oceń fenotypy choroby po ośmiu lub dziewięciu dniach od inokulacji. Analiza mikroskopowa wykazała równomierne rozmieszczenie zarodników na mikroskopijnych szkiełkach na dnie mieszkania. Obliczona gęstość zarodników, rozmieszczonych w sześciu różnych miejscach po lekkich inokulacjach, nie wykazała istotnych różnic.
Podobne wyniki osiągnięto po intensywnych szczepieniach zarodnikami. Równomierność inokulacji badano wśród różnych genotypów roślin po 12 dniach od ciężkiej inokulacji. Rośliny pad4-1 wykazywały zwiększoną podatność na choroby w porównaniu z Columbia 0, roślinami typu dzikiego.
Stosowanie odpowiednich świeżych zarodników, wytworzonych około 10 dni po inokulacji, na podatnych roślinach, jest ważne, ponieważ świeże zarodniki są łatwiejsze do usunięcia i bardziej prawdopodobne jest, że zadomowią się kolonizacja. Mączniak prawdziwy kolonizuje tylko komórki naskórka roślin. Izolacja komórek zakażonych mączniakiem prawdziwym poprzez złuszczanie naskórka lub laserową mikropreparację umożliwiłaby bardziej ukierunkowane badanie transkryptomiczne i proteomiczne odpowiedzi gospodarza.
Metoda ta pomoże naukowcom w skuteczniejszym określeniu fenotypów infekcji mączniakiem proszowym, a tym samym powinna ułatwić bardziej efektywne badania funkcjonalne nad interakcjami mączniaka prawdziwego roślin.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia bezpieczny, wydajny i powtarzalny system fenotypowania chorób roślin Arabidopsis zainfekowanych mączniakiem prawdziwym, biotroficznym patogenem grzybowym. Protokół odnosi się do problemów z uzyskaniem równomiernej inokulacji oraz dokładną oceną fenotypów chorobowych, dostarczając szczegółowych instrukcji konstrukcji i użytkowania specjalistycznego sprzętu do inokulacji w celu poprawy wyników badań nad interakcjami między rośliną a patogenem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fitopatologia
- Interakcje roślin z mikroorganizmami
- Eksperymentalna biologia roślin
Wstęp
- Mączniak prawdziwy jest istotną chorobą grzybową atakującą rośliny, w tym Arabidopsis.
- Dokładne fenotypowanie choroby jest niezbędne do zrozumienia odporności roślin oraz patogenezy grzybów.
- Istniejące metody inokulacji często prowadzą do nierównomiernego rozmieszczenia zarodników, co ogranicza powtarzalność.
- Patogeny biotrofične, takie jak mączniak prawdziwy, są trudne do hodowli, co komplikuje wysiłki w zakresie fenotypowania.
Cel badania
- Opracowanie prostego, skalowalnego i kosztowo efektywnego systemu do równomiernej inokulacji roślin Arabidopsis zarodnikami mączniaka prawdziwego.
- Poprawa dokładności i powtarzalności fenotypowania chorób w badaniach nad interakcjami między roślinami a grzybami.
- Przedstawienie szczegółowych protokołów i demonstracji budowy oraz użytkowania systemu inokulacji.
Zastosowane metody
- Konstrukcja drewnianej skrzynki do inokulacji z wyjmowaną siatkową pokrywą (siatka nylonowa 50 μm lub stal nierdzewna 48 μm).
- Zastosowanie przezroczystej akrylowej komory inokulacyjnej z małym otworem z przodu w celu zminimalizowania ucieczki zarodników.
- Przygotowanie świeżych zarodników mączniaka prawdziwego z zainfekowanych roślin Arabidopsis pad4-1.
- Równomierne rozmieszczenie zarodników poprzez omiatanie i wklepywanie zarodników przez siatkę na rośliny lub oddzielone liście.
- Ocena fenotypów infekcji w wielu punktach czasowych po inokulacji.
Główne wyniki
- Protokół ten umożliwia równomierne i powtarzalne rozmieszczenie zarodników mączniaka prawdziwego na tackach z roślinami oraz oddzielnych liściach.
- Analiza mikroskopowa potwierdziła jednorodną gęstość zarodników w wielu miejscach zarówno po lekkim, jak i silnym inokulowaniu.
- Rośliny mutanty pad4-1 wykazały zwiększoną podatność na chorobę w porównaniu z kontrolnymi roślinami typu dzikiego.
- Świeże zarodniki (wyprodukowane ok. 10 dni po inokulacji) były bardziej efektywne w kolonizacji i fenotypowaniu.
Wnioski
- System ten zapewnia niezawodną i przystępną metodę równomiernej inokulacji oraz dokładnego fenotypowania chorób w badaniach nad mączniakiem prawdziwym u Arabidopsis.
- Podejście to jest elastyczne, niskokosztowe i odpowiednie dla szerokiego grona laboratoriów.
- Udoskonalone fenotypowanie ułatwi badania funkcjonalne odporności roślin oraz interakcji z patogenami.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dokładne i powtarzalne fenotypowanie chorób stanowi krytyczne wąskie gardło w badaniach nad patogenami roślin, bezpośrednio wpływając na pewność prognostyczną walidacji celów oraz badań funkcjonalnych. Ten elastyczny system inokulacji umożliwia standaryzowane, równomierne dostarczanie zarodników w celu wywołania infekcji mączniakiem prawdziwym, wspierając rzetelne testowanie hipotez i ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach procesów odkrywania. Jego adaptacyjność i skalowalność sprawiają, że jest on narzędziem wielokrotnego użytku w translacyjnych badaniach nad odpornością roślin oraz w pracach B+R nad ochroną upraw.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia rygorystyczną analizę szlaków odporności roślin poprzez zapewnienie jednolitego wyzwania patogenem.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów genetycznych dzięki powtarzalnemu fenotypowaniu infekcji.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez minimalizację zmienności w odczytach choroby.
- Zwiększa pewność prognostyczną dla późniejszych decyzji dotyczących selekcji portfolio.
Przesiewy i opracowanie testów
- Przygotowuje zwalidowane układy roślinno-patogenne dla wysokowiarygodnych procesów przesiewowych.
- Standaryzuje warunki inokulacji w celu zwiększenia powtarzalności i porównywalności testów.
- Zapewnia ilościowe, przestrzennie jednorodne wyniki infekcji dla wiarygodnej oceny związków.
- Umożliwia skalowalne i kosztowo efektywne wdrażanie testów w zespołach badawczych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia dopasowanie wyników fenotypowania do modeli roślin istotnych dla danej choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera dostosowany do ryzyka postęp prac nad genami kandydackimi lub metodami leczenia w oparciu o wiarygodne dane dotyczące infekcji.
- Stanowi platformę dla ukierunkowanych badań transkrypomicznych i proteomicznych nad oddziaływaniami gospodarz-patogen.
- Zmniejsza biologiczne ryzyko na późnych etapach dzięki poprawie jakości danych na etapie wczesnym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda inokulacji jest w pełni zintegrowana z procesami badawczymi nad chorobami roślin – od wczesnego etapu odkrywania, poprzez identyfikację wiodących kandydatów, aż po walidację przedkliniczną.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez dotyczących mechanizmów odporności roślin i wirulencji patogenów.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe fenotypy infekcji w celu przygotowania analiz i przesiewania związków.
- Analityka: Zapewnia jednorodne odczyty umożliwiające rzetelne porównania statystyczne pomiędzy genotypami i wariantami traktowania.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość pomiędzy fenotypowaniem w fazie odkryć a walidacją przedkliniczną w systemach istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje niskokosztową, adaptowalną platformę do wielokrotnego zastosowania w różnorodnych badaniach nad interakcjami roślina-patogen.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad patogenami roślin.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów infekcji.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie lepszych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez poprawę jakości danych na wczesnym etapie.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój genetycznych lub chemicznych wiodących kandydatów.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu patologii roślin i analizy fenotypowej.
- Wymaga podstawowej infrastruktury laboratoryjnej do montażu skrzyń i komór oraz zapewnienia kontrolowanych warunków wzrostu.
- Wymaga standaryzacji protokołów inokulacji i fenotypowania pomiędzy zespołami.
- Można dostosować do różnych gatunków roślin i systemów patogenów poprzez modyfikację siatek i komór.
- Zależność od dostępności świeżych, żywotnych zarodników w celu uzyskania optymalnej powtarzalności infekcji.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Making a Standard Inoculation Box with a Removable Top Lid Mounted with a Mesh
1:17
Making an Inoculation Chamber and Inoculating Plants in Flats
3:13
Inoculate Plants with Smaller Inoculation Boxes
3:42
Inoculate Detached Leaves in Petri Dishes
4:37
Results: Assessment of Inoculation Evenness
5:19
Conclusion
