Name: Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis i innych roślin (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Poznaj prostą i skalowalną metodę inokulacji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis w celu dokładnej oceny fenotypów choroby. Protokół zapewnia równomierne rozprowadzenie zarodników i poprawia powtarzalność badań nad interakcjami roślino-patogen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca została wsparta przez National Science Foundation (IOS-1901566) dla S. Xiao. Autorzy pragną podziękować F. Cokerowi i C. Hooksowi za utrzymanie zakładu wzrostu roślin oraz Jorge Zamorze za pomoc techniczną związaną z produkcją pudełka i komory do szczepienia.

1. Wykonanie standardowego pudełka do szczepień ze zdejmowaną górną pokrywą zamontowaną za pomocą siatki
<ol>
	<li>Kup w sklepach rolkę nylonowej siatki membranowej 50 μm lub siatki ze stali nierdzewnej 48 μm (zalecane). Upewnij się, że zamówiłeś wystarczającą ilość do pocięcia na wiele kawałków o wymiarach 14 cali x 26 cali w celu wymiany zużytej siatki.</li>
	<li>Kup jedną płytę pilśniową lub sklejkę o średniej gęstości 1/4 cala x 2 stopy x 4 stopy i wytnij dwie 24-1/2 cala x 10 na kawałki i dwie 12 cali x 10 na kawałki do wykonania pudełka do zaszczepiania. Użyj 8 narożnych zacisków do podparcia czterech stron. 
	UWAGA: Jeśli jest zwrócony w stronę szerokiej strony obudowy, lewa strona 12 cali x 10 cali jest przymocowana na stałe, a prawa strona 12 cali x 10 cali to zdejmowane drzwi utrzymywane na miejscu przez cztery zaczepy magnetyczne (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Umieść cztery 2-calowe szelki narożne po dwa w każdym wewnętrznym rogu lewej strony, cal od góry i cal od dołu, zaznacz i wywierć otwór. Użyj, aby na stałe przymocować lewy krótki bok do dwóch długich boków (przodu i tyłu). Wewnętrzna odległość między dwoma dłuższymi bokami powinna wynosić 12 cali, a nie 11-1/2 cala.</li>
	<li>Gdy zaciski narożne są nadal na miejscu i są prawidłowo ustawione prawe drzwi, zaznacz i wywierć położenie 4 zaczepów magnetycznych, aby utrzymać prawe zdejmowane drzwi na miejscu. Zamontuj gałkę przycisku na drzwiach. Górna część drzwi zaczepia się pod górną pokrywą (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A,B).</li>
	<li>Aby wykonać zdejmowaną górną pokrywę z siatką, pokrój długi drewniany kwadratowy kołek na 2 zestawy po 26 cali i 12-3/4 cala. Przyklej i przybij cztery elementy w taki sposób, aby pasowały do pudełka - wewnętrzne wymiary ramy są nieco większe niż wymiary zewnętrzne pudełka, ponieważ siatka ekranu zostanie przymocowana do tej ramy.</li>
	<li>Przytnij siatkę ekranu do nieco mniej niż 14 cali x 26 cali. Nie pozwól, aby ekran wystawał poza ramę, aby zapobiec ostrym krawędziom. Poproś o pomoc w rozciągnięciu ekranu na ramce. Przytrzymaj siatkę z ramą za zaciski (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1C) i użyj zszywacza z odpowiednimi zszywkami, aby przymocować ekran do ramy.</li>
	<li>Wytnij dwa zestawy krótszych drewnianych kwadratowych kołków (21 cali i 9 cali) i użyj, aby ciasno ułożyć siatkę wzdłuż ramy za pomocą 4 krótszych kawałków drewnianego kwadratowego kołka (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1C, D).</li>
</ol>
2. Tworzenie komory do szczepienia
<ol>
	<li>Kupuj przezroczyste arkusze akrylowe i elementy sprzętowe w odpowiednich sklepach. Wytnij otwierane okno o wymiarach 7 cali x 20 cali na przedniej stronie akrylowego arkusza pudełka, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" > Rysunek 2C.</li>
	<li>Zmontuj lewą i prawą stronę, przednie (z oknem) i tylne arkusze akrylowe w pudełku za pomocą 8 narożnych zacisków, jak pokazano na <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A. Upewnij się, że wymiary wewnętrzne komory są równe wymiarom górnego arkusza. 
	UWAGA: Prawa strona służy do podparcia i nie będzie przymocowana do przednich ani tylnych arkuszy. Jest celowo o 1/2 cala krótszy niż inne arkusze. Ta prawa strona stanie się drzwiami "klapowymi w dół" utrzymywanymi w miejscu przez zawias pod kątem prostym na dole i dwa zaczepy magnetyczne na górze, jak pokazano na Rysunek 2C,D.</li>
	<li>Użyj stężeń narożnych, aby zabezpieczyć panele razem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B,C). Przytrzymaj szelki na miejscu, zaznacz markerem sharpie, wyśrodkuj dziurkacz, a następnie wywierć otwór. 
	UWAGA: Wiercenie w akrylu różni się od wiercenia czegokolwiek innego, nie należy używać siły, ponieważ bok otworu naprzeciwko wiertła może pęknąć. Użyj nitów lub. Nie dokręcaj zbyt mocno, ponieważ akryl może z czasem pęknąć.</li>
	<li>Obróć obudowę na tylną stronę i zdejmij 4 narożniki clamps i umieść górny arkusz na miejscu. Zaznacz i wywierć.</li>
	<li>Zamontuj zawias kątowy, wykonany z kątownika 3/4 cala. Użyj nylonowej nakrętki zabezpieczającej jako pręta zawiasu. Nie dokjaj, pozostaw szczelinę, aby drzwi obracały się na tym zawiasie.</li>
	<li>Oznacz, wyśrodkuj dziurkacz, wywierć i przymocuj dwa magnetyczne magnesy drzwiowe za pomocą z stożkowym stożkowym stożkowym #6-32x3/4". Następnie przymocuj płytki zaczepowe za pomocą z płaskim #6-32x3/8", patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2C,D.</li>
</ol>
3. Inokulacja roślin w mieszkaniach
<ol>
	<li>Przygotuj świeże zarodniki mączniaka prawdziwego jako inokulant (np. rzodkiewnik pospolity, mączniak prawdziwy, Golovinomyces cichoracearum, UCSC1). Wyhoduj czyste, zmutowane rośliny z obniżoną odpornością pardonu Arabidopsis 11 w komorze wzrostowej (22 °C, 65% wilgotności względnej przez 6-8 tygodni) i zaszczep jedną lub pół płaską roślinę pad4-1, aby wytworzyć wystarczającą ilość świeżych zarodników mączniaka prawdziwego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Uprawiaj rośliny w celu określenia fenotypów infekcji w standardzie: 11 cali x 21 cali x 2,5 w mieszkaniach. 
	UWAGA: Rośliny rzodkiewnika uprawiane w ciągu dnia krótkiego (8 godzin światła, 16 godzin ciemności; 22 °C) przez sześć do ośmiu tygodni są dobre do testów na infekcję mączniakiem prawdziwym.</li>
	<li>Gdy świeże zarodniki mączniaka prawdziwego z zakażonych roślin po 8-10 dniach od zaszczepienia (dpi) są dostępne, przenieś mieszkanie roślin do testu infekcji do pudełka do zaszczepiania wewnątrz komory zaszczepiania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B,2C).</li>
	<li>Odetnij 15-20 silnie porażonych liści Arabidopsis (lub 4-6 zainfekowanych rozet, w zależności od wielkości liścia/rozety i poziomu zaszczepienia), pozwól liściom wyschnąć, jeśli jest skondensowana woda.</li>
	<li>Chwyć jedną ręką 1-2 liście lub rozetę za pomocą długich kleszczy i skieruj liście do góry nogami. Następnie przełóż obie ręce przez otwór komory i delikatnie uderz nożyczkami w ramię kleszczy, powoli przesuwając liście/rozetę nad siatką zamontowaną na pudełku do zaszczepiania (<silna klasa="xfig">Ryc. 3B). Powtarzaj to, aż wszystkie liście lub rozety zostaną zużyte. 
	UWAGA: Dojrzałe zarodniki łatwo usuwają się z konidioforów zainfekowanych liści. Staraj się usunąć zarodniki z siatki tak równomiernie, jak to możliwe.</li>
	<li>Użyj jednej lub dwóch cienkich szczotek do blendera wachlarzowego, aby delikatnie przeczesać zarodniki przez siatkę (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3C). Upewnij się, że szczotkujesz całą powierzchnię siatki w różnych kierunkach cztery lub więcej razy, aby zmaksymalizować równomierne rozprowadzenie zarodników na roślinach na dnie pudełka do zaszczepiania (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Delikatnie poklep siatkę kilka razy szczotkami, aby strząsnąć zarodniki, które utknęły w siatce.</li>
	<li>Pozwól zarodnikom osiąść na pół minuty. Następnie wynieś mieszkanie zawierające zaszczepione rośliny z pudełka do zaszczepiania. Przykryj mieszkanie plastikową kopułą i umieść je w komorze wzrostowej (22 °C, 65% wilgotności względnej). Fenotypowanie choroby można przeprowadzić w rozdzielczości od 5 lub 8 do 12 dpi 12.</li>
</ol>
4. Zaszczepij rośliny mniejszymi skrzynkami do zaszczepiania
UWAGA: W przypadkach, gdy ma być zaszczepionych mniej roślin, nadal można użyć standardowego pola do szczepienia. Upewnij się, że umieściłeś rośliny na środku pudełka. Usuń i wyszczotkuj zarodniki w obszarze siatki, która pokrywa rośliny, aby upewnić się, że wszystkie rośliny są zaszczepione, oszczędzając inokulę. Alternatywnie, a najlepiej, można użyć mniejszych pojemników do zaszczepiania (jak opisano poniżej).
<ol>
	<li>Zamień kartony na pudełko do zaszczepiania. Po prostu zdejmij górną i dolną stronę pudełka, przyklej róg, aby go umocnić, jeśli to konieczne, i zamontuj na górze siatkę o odpowiedniej wielkości 50 μm, przyklejając lub zszywając (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A,B).</li>
	<li>Przenieś mieszkanie zawierające rośliny do komory do zaszczepiania, umieść mniejsze pudełko do zaszczepiania na wierzchu mieszkania, aby przykryć rośliny.</li>
	<li>Usuń i wyszczotkuj zarodniki, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Zaszczepij oderwane liście na szalkach Petriego
UWAGA: W przypadkach, gdy (i) świeże zarodniki mączniaka prawdziwego są bardzo ograniczone i/lub (ii) rośliny muszą być utrzymywane w czystości, podczas gdy fenotypy choroby i/lub lokalizacja subkomórkowa białek w zakażonych komórkach muszą być oceniane, oderwane liście mogą być używane do infekcji na płytkach MS-agar.
<ol>
	<li>Zrób mini pudełko do zaszczepiania, które jest tylko nieznacznie większe niż szalka Petriego.</li>
	<li>Przygotuj płytki z średnim agarem (1,5%) Murashige i Skoog (MS) o grubości 1/2%. W razie potrzeby dodać tiabendazol (40 mg/l) w celu zmniejszenia zanieczyszczenia pleśnią. Przechowuj talerze w temperaturze 4 °C w lodówce do czasu użycia.</li>
	<li>Wytnij jeden lub dwa w pełni rozwinięte liście od podstawy ogonka liściowego dla każdej badanej rośliny. Włóż ogonki oderwanych liści do podłoża agarowego pod kątem ~30°. 
	UWAGA: Każda płytka może zawierać 20-40 liści, w zależności od wielkości liści i użytej płytki (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C).</li>
	<li>Zaszczepić liście w komorze do zaszczepiania, jak opisano powyżej. Przenieś płytkę z pokrywką do komory wzrostowej.</li>
	<li>Wytnij mały fragment liścia i sprawdź subkomórkową lokalizację białek w określonych punktach czasowych.</li>
	<li>W celu oceny fenotypów infekcji należy przenieść liście na świeżą, aseptyczną płytkę z agarem MS w temperaturze 4 lub 5 dpi. Odetnij podstawę ogonka liściowego przed włożeniem liści do świeżego podłoża agarowego. Oceń fenotypy choroby przy 8 lub 9 dpi.</li>
</ol>

<ol><li>Huckelhoven, R., Panstruga, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+bi+ology+of+the+plant-powdery+mildew+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell bi ology of the plant-powdery mildew interaction.</a> Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 738-746 (2011).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).</li>
<li>Sakurai, H., Hirata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+observations+on+the+relation+between+the+penetration+hypha+and+haustorium+of+barley+powdery+mildew+and+host+cell.+V.+Influence+of+water+spray+on+the+pathogen+and+host+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Phytopathology+Society+of+Japan%22%5BJournal%5D)">Some observations on the relation between the penetration hypha and haustorium of barley powdery mildew and host cell. V. Influence of water spray on the pathogen and host tissue.</a> Annual Phytopathology Society of Japan. 24, 239-245 (1959).</li>
<li>Shomari, S. H., Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+Oidium+anacardii+on+cashew+%28Anacardium+occidentale%29+in+southern+Tanzania%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Survival of Oidium anacardii on cashew (Anacardium occidentale) in southern Tanzania.</a> Plant Pathology. 48 (4), 505-513 (1999).</li>
<li>Sitterly, W. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSitterly%2C+WR+%22Powdery+Mildews%22">Powdery Mildews</a>. Spencer, D. M. , Academic Press. 369(1978).</li>
<li>Reuveni, M., Agapov, V., Reuveni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+systemic+resistance+to+powdery+mildew+and+growth+increase+in+cucumber+by+phosphates%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Agriculture+%26+Horticulture%22%5BJournal%5D)">Induction of systemic resistance to powdery mildew and growth increase in cucumber by phosphates.</a> Biological Agriculture & Horticulture. 9 (4), 305-315 (1993).</li>
<li>Reifschneider, F. J. B., Boiteux, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vacuum-operated+settling+tower+for+inoculation+of+powdery+mildew+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A vacuum-operated settling tower for inoculation of powdery mildew fungi.</a> Phytopathology. 78 (11), 1463-1465 (1988).</li>
<li>Chowdhury, A., Bremer, G. B., Salt, D. W., Miller, P., Ford, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+of+delivering+Blumeria+graminis+f.+sp+hordei+spores+for+laboratory+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+Protection%22%5BJournal%5D)">A novel method of delivering Blumeria graminis f. sp hordei spores for laboratory experiments.</a> Crop Protection. 22 (7), 917-922 (2003).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad-spectrum+mildew+resistance+in+Arabidopsis+thaliana+mediated+by+RPW8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Broad-spectrum mildew resistance in Arabidopsis thaliana mediated by RPW8.</a> Science. 291 (5501), 118-120 (2001).</li>
<li>Xiao, S., Ellwood, S., Findlay, K., Oliver, R. P., Turner, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+three+loci+controlling+resistance+of+Arabidopsis+thaliana+accession+Ms-0+to+two+powdery+mildew+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterization of three loci controlling resistance of Arabidopsis thaliana accession Ms-0 to two powdery mildew diseases.</a> The Plant Journal. 12 (4), 757-768 (1997).</li>
<li>Reuber, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+defense+gene+induction+defects+with+powdery+mildew+susceptibility+in+Arabidopsis+enhanced+disease+susceptibility+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Correlation of defense gene induction defects with powdery mildew susceptibility in Arabidopsis enhanced disease susceptibility mutants.</a> The Plant Journal. 16 (4), 473-485 (1998).</li>
<li>Xiao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atypical+resistance+gene%2C+RPW8%2C+recruits+components+of+basal+defence+for+powdery+mildew+resistance+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The atypical resistance gene, RPW8, recruits components of basal defence for powdery mildew resistance in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 42 (1), 95-110 (2005).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nasza metoda inokulacji oparta na siatkowych pudełkach ma kilka zalet w porównaniu z innymi metodami inokulacji. Po pierwsze, może osiągnąć równomierne rozmieszczenie zarodników, jeśli jest prawidłowo obsługiwany, jak pokazano na rysunku 5. Po drugie, użycie siatki ~50 μm oraz usuwanie zarodników poprzez delikatne potrząsanie zainfekowanymi liśćmi może zmniejszyć infekcję roślin przez wciornastki lub inne owady infekujące rośliny, które są obecne w roślinach źródłowych. Po trzecie, użycie ró...

Mączniak prawdziwy jest jedną z najczęstszych i najważniejszych chorób wielu roślin spożywczych i ozdobnych1. Badania nad chorobami mączniaka prawdziwego cieszą się dużą popularnością, o czym świadczy ponad 10 500 publikacji jako wynik wyszukiwania z "mączniakiem prawdziwym" jako słowem kluczowym w Web of Science (stan na listopad 2020 r.). Rzeczywiście, mączniak prawdziwy (reprezentowany przez Blumeria graminis) jest uważany za jeden z 10 największych patogenów grzybowych przez journal of Molecular Plant Pathology2. Kwantyfikacja podatności na choroby jest niezbędnym krokiem w charakterystyce genów roślin przyczyniających się do odporności lub podatności na choroby lub funkcjonalnej identyfikacji kandydujących genów efektorowych w mączniaku prawdziwym. Jednak wiarygodne fenotypowanie choroby jest znacznie trudniejsze w przypadku mączniaka prawdziwego w porównaniu z większością innych patogenów grzybowych, częściowo dlatego, że w przeciwieństwie do zarodników tych ostatnich, zarodniki gatunków mączniaka prawdziwego (takie jak Golovinomyces cichoracearum UCSC1 na podstawie naszego doświadczenia laboratoryjnego) wykazują zmniejszoną żywotność po przejściu przez proces zawiesiny wodnej3,4. Nieodpowiednie i/lub nierównomierne inokulowanie badanych roślin określonym patogenem mączniaka prawdziwego może prowadzić do niedokładnych wyników fenotypowania.
Zgłoszono wiele metod inokulacji w badaniach nad mączniakiem prawdziwym. Obejmują one (i) szczotkowanie zarodników bezpośrednio z zainfekowanych liści w celu przetestowania roślin5, (ii) rozpylanie zawiesiny zarodników w celu przetestowania roślin6, (iii) wydmuchiwanie zarodników za pomocą próżniowej wieży osadniczej do roślin na dole wieży7, oraz (iv) dostarczanie zarodników przez kombinatoryczne użycie nylonowej membrany siatkowej i wibracji opartej na dźwięku8. Metoda szczotkowania zarodników (lub odkurzania) jest łatwa do wykonania, ale z natury nierówna, dlatego może nie być dokładna do oceny ilościowej. Opryskiwanie zarodników jest wygodne i równomierne, ale jak wspomniano powyżej, może skutkować słabym kiełkowaniem zarodników4. Dwie ostatnie (tj. iii-iv) są znacznie ulepszonymi metodami, zdolnymi do osiągnięcia równomiernego zaszczepienia; Jednak oba nie są elastyczne w dostosowywaniu swojej zdolności inokulacji pod względem liczby roślin, które mają być zaszczepione w jednym zdarzeniu, co sprawia, że każde z tych urządzeń nie jest trywialne, a ich działanie jest ograniczone do obszarów laboratoryjnych, w których występuje próżnia i/lub źródło energii elektrycznej.
Nasze laboratorium od ponad 20 lat zajmuje się interakcją między rośliną a mączniakiem prawdziwym9,10. W ciągu ostatniej dekady przetestowaliśmy wiele metod inokulacji, a ostatnio opracowaliśmy prostą, a jednocześnie skuteczną metodę inokulacji mączniaka prawdziwego. Ta metoda szczotkowania zarodników oparta na siatce może zapewnić równomierne zaszczepienie i jest prosta i skalowalna, dlatego powinna być łatwo przyjęta przez każde laboratorium pracujące z mączniakiem prawdziwym.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 48 &mikro; m siatka siatkowa ze stali nierdzewnej; Rozmiar: 24 "X 48"&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>NA</td><td>Do wykonania pokrywy pudełka do zaszczepiania</td></tr> <tr><td># 6-32 x &frac34; " maszynowe, podkładki płaskie i nakrętki&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>NA</td><td>Do wykonania komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>#6-32 ocynkowana nylonowa nakrętka blokująca (4-pak)</td><td>Home Depot</td><td>NA</td><td>Do wykonania komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>#6-32x3/8" maszynowe Phillips z płaskim, podkładki płaskie i nakrętki&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>NA</td><td>Do zabezpieczania&nbsp; magnetycznych płyt zaczepowych drzwi#</td></tr><tr><td>8-32x1/2" maszynowe, podkładki płaskie i nakrętki</td><td>Home Depot</td><td>NA</td><td>Do zabezpieczania stężeń narożnych i zawiasów drzwiowych</td></tr><tr><td>Przezroczysty wytłaczany arkusz maskowany folią akrylową o grubości 0,250; &nbsp; Rozmiar: 17 i frac12; " X 20"</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CEF</td><td>Do wykonania komory inokulacyjnej</td></tr> o <tr><td>grubości 0,250 przezroczystego wytłaczanego arkusza maskowanego folią akrylową; Rozmiar: 18 "X 20"&nbsp; &nbsp;</td><td>Profesjonalne tworzywa sztuczne</td><td>&nbsp; SACR.250CEF</td><td>Do wykonania komory inokulacyjnej</td></tr> z <tr><td>przezroczystego wytłaczanego arkusza maskowanego folią akrylową o grubości 0,250; Rozmiar: 18 "X 30"&nbsp;</td><td>Profesjonalne tworzywa sztuczne</td><td>SACR.250CEF</td><td>Do wykonania komory inokulacyjnej</td></tr> o <tr><td>grubości 0,250 przezroczystego wytłaczanego arkusza maskowanego folią akrylową; Rozmiar: 20 "X 29 i frac12; "</td><td>Professional Plastics</td><td>SACR.250CEF</td><td>Do wykonania komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>1-5/8" drzwi szafy zaczep magnetyczny biały</td><td>Home Depot</td><td>Model #P110-W</td><td>Do wykonania komory inokulacyjnej</td></tr><tr><td>2" stalowa ocynkowana klamra narożna (8-Pack)&nbsp;</td><td>Magazyn domowy</td><td>&nbsp; Modelka #13611&nbsp;</td><td>Do wykonania pudełka i komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>3-calowy zacisk narożny</td><td>Narzędzia do frachtu portowego</td><td>SKU 63653, 1852, 60589</td><td>Do wykonania komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>3/4"&nbsp; stalowa ocynkowana klamra narożna (4-pak)</td><td>Home Depot</td><td>Model #13542</td><td>Do wykonania pudełka i komory do zaszczepiania</td></tr><tr><td>4-7/8" ocynkowane lekkie uchwyty do drzwi</td><td>Home Depot</td><td>Model #15184</td><td>Do wykonania pudełka do zaszczepiania</td></tr><tr><td>Drobny blender wentylatorowy szczotki</td><td>Michaels Store</td><td>M10472846&nbsp;</td><td>Do zaszczepienia</td></tr><tr><td>Drewniany kołek kwadratowy Kelleher 3/4" x 3/4" x 36"&nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>NA</td><td>Do wykonania pokrywy pudełka na zaszczepiaczki</td></tr><tr><td>Płyta pilśniowa o średniej gęstości (1/4" x 2' x 4'); &nbsp;</td><td>Home Depot</td><td>Model# 1508104</td><td>Do wykonania pudełka do zaszczepiania</td></tr><tr><td>Okrągłe szklane szkiełka nakrywkowe z 500 &mikro; m grid</td><td>ibidi USA Inc.</td><td>10816</td><td>Do określania&nbsp; gęstości zarodników</td></tr></tbody></table>

Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym arabidopsis i innych roślin

An Easy and Flexible Inoculation Method for Accurately Assessing Powdery Mildew-Infection Phenotypes of Arabidopsis and Other Plants

Zmniejszenie strat plonów spowodowanych chorobami grzybowymi wymaga lepszego zrozumienia mechanizmów rządzących odpornością roślin i patogenezą grzybów, co z kolei wymaga dokładnego określenia fenotypów chorobowych roślin po zakażeniu określonym patogenem grzybowym. Jednak dokładne fenotypowanie choroby za pomocą niemożliwych do wyhodowania biotroficznych patogenów grzybowych, takich jak mączniak prawdziwy, nie jest łatwe do osiągnięcia i może być krokiem ograniczającym tempo projektu badawczego. W tym miejscu opracowaliśmy bezpieczny, wydajny i łatwy w obsłudze system fenotypowania chorób, wykorzystując jako przykład interakcję rzodkiewnika z mączniakiem prawdziwym. System ten składa się głównie z trzech elementów: (i) drewnianego pudełka do zaszczepiania wyposażonego w zdejmowaną pokrywę zamontowaną za pomocą siatki ze stali nierdzewnej lub nylonu o porach ~50 μm do zaszczepiania mieszkania roślin zarodnikami grzybów, (ii) przezroczystej plastikowej komory z małym przednim otworem w celu zminimalizowania ucieczki zarodników podczas przeprowadzania inokulacji wewnątrz, oraz (iii) metodę usuwania i dystrybucji zarodników w celu równomiernego i skutecznego zaszczepienia. Opisane tutaj protokoły obejmują kroki i parametry wytwarzania pudełka do szczepienia i plastikowej komory przy niskich kosztach oraz demonstrację wideo pokazującą, jak korzystać z systemu, aby umożliwić równomierne zaszczepienie zarodnikami mączniaka prawdziwego, poprawiając w ten sposób dokładność i odtwarzalność fenotypowania choroby.

W niniejszej pracy przedstawiamy nową metodę inokulacji zarodnikami mączniaka prawdziwego, która jest łatwa w przygotowaniu, obsłudze i dostosowaniu. Rysunek 1 przedstawia konstrukcję standardowej skrzynki do inokulacji, ze szczególnym uwzględnieniem budowy zdejmowanej pokrywy wyposażonej w membranę z siatki o oczkach 50 µm. Rysunek 2 pokazuje montaż komory do inokulacji. Rysunek 3 ilustruje kluczowe etapy procesu inokulacji z wykor...

Przedstawiamy protokół budowy prostego systemu dystrybucji zarodników, składającego się z pudełka do zaszczepiania z siatką ~50 μm i przezroczystej komory z tworzywa sztucznego. Można to wykorzystać do równomiernego zaszczepienia roślin zarodnikami mączniaka prawdziwego, umożliwiając w ten sposób dokładną i odtwarzalną ocenę fenotypów chorobowych badanych roślin.

Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis i innych roślin

Reducing crop losses due to fungal diseases requires improved understanding of the mechanisms governing plant immunity and fungal pathogenesis, which in ...

Mączniak prawdziwy jest ważną chorobą roślin. Dokładne określenie fenotypu choroby wymaga równomiernego zaszczepienia patogenu. Ponieważ istniejące metody są nieefektywne, opracowaliśmy ten protokół.Nasza metoda inokulacji zarodników może z łatwością osiągnąć równomierną inokulację, a do tego jest prosta i skalowalna. Dlatego każde laboratorium pracujące z mączniakiem prawdziwym może z łatwością zastosować tę metodę. Naukowcy mogą również zamontować siatkę na kartonowym pudełku i użyć jej do zaszczepienia zarodników.Jak usunąć zarodniki i przeczesać je przez siatkę, jest krytycznym krokiem. Tak więc pokazanie tego na wideo może być bardzo pomocne. W przypadku tego protokołu zdobądź rolkę nylonowej siatki membranowej o grubości 50 mikrometrów lub siatki ze stali nierdzewnej o długości 48 mikrometrów.Pokrój sklejkę o dużych rozmiarach i średniej gęstości na kawałki o wymiarach 24,5 x 10 cali i 12 x 10 cali, aby zrobić pudełko do zaszczepiania. Aby wykonać zdejmowaną górną pokrywę z siatką, pokrój długi drewniany kwadratowy kołek na dwa zestawy 26 cali i 12,75 cala. Przyklej i przybij cztery elementy, aby zmieściły się wokół pudełka.Weź arkusze akrylowe i złóż wszystkie arkusze akrylowe w pudełku za pomocą ośmiu zacisków narożnych. Wytnij otwierane okno o wymiarach 7X2 cale z przodu akrylowego arkusza pudełka. Aby przygotować świeże zarodniki mączniaka prawdziwego jako inokula, hoduj czyste, zmutowane rośliny z łazienką odpornościową Arabidopsis pad4-1 w komorze wzrostowej w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 65% przez sześć do ośmiu tygodni.Uprawiaj rośliny, aby określić fenotypy infekcji w standardowych mieszkaniach. Zaszczep jedną lub połowę roślin pad4-1, aby zbudować wystarczającą ilość świeżych zarodników mączniaka prawdziwego. Gdy świeże zarodniki z zakażonych roślin są dostępne, przenieś mieszkanie roślin do pudełka do zaszczepiania wewnątrz komory do szczepienia w celu przeprowadzenia testu infekcji.Odetnij od 15 do 20 silnie zainfekowanych liści rzodkiewnika i pozwól im wyschnąć, jeśli jest skondensowana woda. Trzymaj jeden lub dwa liście do góry nogami w jednej ręce za pomocą długich kleszczy. Następnie przełóż obie ręce przez otwór komory i delikatnie uderz nożyczkami w ramię kleszczy, powoli przesuwając liście nad siatką zamontowaną na pudełku do zaszczepiania.Przeczesz zarodniki drobnymi szczotkami blendera wachlarzowego przez całą powierzchnię siatki w różnych kierunkach, aby zmaksymalizować równomierne rozprowadzenie zarodników na roślinach. Delikatnie poklep siatkę kilka razy szczotkami, aby strząsnąć zarodniki, które utknęły w siatce. Gdy zarodniki opadną, wynieś mieszkanie zawierające zaszczepione rośliny z pudełka do zaszczepiania.Przykryj mieszkanie plastikową kopułą i umieść je w komorze wzrostowej o temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 65%. Fenotypowanie choroby można przeprowadzić po 5 lub 8 do 12 dniach od inokulacji. Zamień pudełka kartonowe w pudełko do zaszczepiania, usuwając górną i dolną stronę pudełka, przyklejając róg, aby go utwardzić, i montując siatkę o grubości 50 mikrometrów na górze za pomocą kleju.Przenieś mieszkanie zawierające rośliny do komory do zaszczepiania i umieść mniejsze pudełko do zaszczepiania na wierzchu mieszkania, aby przykryć rośliny. Następnie usuń i wyszczotkuj zarodniki. Zrób mini pudełko do zaszczepiania nieco większe niż szalka Petriego.Przechowuj talerze w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce do czasu użycia. Wytnij jeden lub dwa w pełni rozwinięte liście z podstawy ogonka liściowego dla każdej badanej rośliny. Włóż ogonki oderwanych liści do podłoża agarowego pod kątem 30 stopni.Zaszczepić liście w komorze do zaszczepiania i przenieść płytkę z pokrywką do komory wzrostu. W celu oceny fenotypów infekcji należy przenieść liście na świeżą, aseptyczną płytkę agarową MS po czterech lub pięciu dniach od inokulacji. Odetnij podstawę ogonka liściowego przed włożeniem liści do świeżego podłoża agarowego.Oceń fenotypy choroby po ośmiu lub dziewięciu dniach od inokulacji. Analiza mikroskopowa wykazała równomierne rozmieszczenie zarodników na mikroskopijnych szkiełkach na dnie mieszkania. Obliczona gęstość zarodników, rozmieszczonych w sześciu różnych miejscach po lekkich inokulacjach, nie wykazała istotnych różnic.Podobne wyniki osiągnięto po intensywnych szczepieniach zarodnikami. Równomierność inokulacji badano wśród różnych genotypów roślin po 12 dniach od ciężkiej inokulacji. Rośliny pad4-1 wykazywały zwiększoną podatność na choroby w porównaniu z Columbia 0, roślinami typu dzikiego.Stosowanie odpowiednich świeżych zarodników, wytworzonych około 10 dni po inokulacji, na podatnych roślinach, jest ważne, ponieważ świeże zarodniki są łatwiejsze do usunięcia i bardziej prawdopodobne jest, że zadomowią się kolonizacja. Mączniak prawdziwy kolonizuje tylko komórki naskórka roślin. Izolacja komórek zakażonych mączniakiem prawdziwym poprzez złuszczanie naskórka lub laserową mikropreparację umożliwiłaby bardziej ukierunkowane badanie transkryptomiczne i proteomiczne odpowiedzi gospodarza.Metoda ta pomoże naukowcom w skuteczniejszym określeniu fenotypów infekcji mączniakiem proszowym, a tym samym powinna ułatwić bardziej efektywne badania funkcjonalne nad interakcjami mączniaka prawdziwego roślin.

an-easy-flexible-inoculation-method-for-accurately-assessing-powdery

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Źródło: Lee, H. i wsp., Split Green Fluorescent Protein System do wizualizacji efektorów dostarczanych przez bakterie podczas infekcji. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia metodę monitorowania infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych za pomocą komplementacji dzielonego białka fluorescencyjnego (sfGFP) w połączeniu z mikroskopią konfokalną. Podejście to umożliwia precyzyjną wizualizację translokacji efektorowej do cytozolu komórki gospodarza.

Monitorowanie infekcji bakteryjnej i dostarczania białek efektorowych w komórkach roślinnych

Źródło: Rufián, J. S., et.al. Analiza ekspresji genów strzykawki pseudomonas w tkance roślinnej na poziomie pojedynczych komórek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film demonstruje metodę infiltracji próżniowej polegającą na wprowadzeniu patogenu bakteryjnego do liści rośliny Arabidopsis . Podejście to wykorzystuje przygotowaną zawiesinę bakteryjną oraz impulsy próżniowe, aby umożliwić równomierne przenikanie przez szparki szparkowe, co skutkuje kontrolowanym zakażeniem liści.

Szczepienie patogena bakteryjnego do liści Arabidopsis poprzez infiltrację próżniową

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Opisano użycie metody iniekcji igłą do inokulacji roślin kukurydzy i teosinte biotroficznym patogenem Ustilago maydis.  Metoda inokulacji igłowej ułatwia kontrolowane dostarczanie patogenu grzybowego między liście rośliny, gdzie patogen dostaje się do rośliny poprzez tworzenie appresorii. Metoda ta jest bardzo skuteczna, umożliwiając powtarzalne inokulacje U. maydis.

Szybka i skuteczna metoda oceny patogenności Ustilago maydis na liniach kukurydzy i teosinte

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Tutaj prezentujemy protokół do testowania zjadliwości roślin z patogenem roślinnym Magnaporthe grisea. Raport ten przyczyni się do zakrojonych na szeroką skalę badań przesiewowych patotypów izolatów grzybów i posłuży jako doskonały punkt wyjścia do zrozumienia mechanizmów oporności roślin podczas hodowli molekularnej.

Test infekcji roślin: inokulacja w sprayu i za pośrednictwem ran patogenem roślinnym Magnaporthe Grisea

Przedstawiamy prostą i wszechstronną metodę wykonywania fluorescencyjnego obrazowania na żywo liści Arabidopsis thaliana przez dłuższy okres czasu. Używamy transgenicznej rośliny Arabidopsis wykazującej ekspresję fluorescencyjnego genu reporterowego pod kontrolą promotora związanego z odpornością jako przykładu uzyskania czasoprzestrzennego zrozumienia odpowiedzi immunologicznych roślin.

Uniwersalna metoda montażu liści Arabidopsis do przyżyciowego obrazowania poklatkowego

Ten artykuł opisuje dwie metody ilościowego określania reakcji obronnych u Arabidopsis thaliana po ekspozycji na elicytory immunologiczne: przejściowy wybuch oksydacyjny i zahamowanie wzrostu siewki.

Testy wybuchu oksydacyjnego wywołanego wzorcem i zahamowania wzrostu siewek u Arabidopsis thaliana

Ten protokół przedstawia szczegółowe podsumowanie strategii inokulacji korzeni roślin mikrobami przenoszonymi przez glebę. Na przykładzie grzybów Verticillium longisporum i Verticillium dahliae opisano trzy różne systemy infekcji korzeni. Przedstawiono potencjalne zastosowania i możliwe dalsze analizy, a także omówiono zalety i wady każdego systemu.

Strategie inokulacji w celu infekowania korzeni roślin mikroorganizmami przenoszonymi przez glebę

Obecny protokół opisuje metodę, która pozwala na analizę ekspresji genów w pojedynczych komórkach w populacjach Pseudomonas syringae hodowanych w roślinnym apoplastie.

Jednokomórkowa analiza ekspresji genów Pseudomonas syringae w tkance roślinnej

Ulepszona metoda pomiaru profili nawodnienia pyłku u Arabidopsis thaliana jest opisana tutaj. Nowa metoda oferuje wyższą rozdzielczość, jest nieinwazyjna i wysoce odtwarzalna. Protokół stanowi nowe narzędzie do dokładniejszej analizy procesów regulujących wczesne etapy zapylania.

Jednoziarnisty test biologiczny uwodnienia pyłku in vivo o wysokiej rozdzielczości dla Arabidopsis thaliana

Poznaj prostą i skalowalną metodę inokulacji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis w celu dokładnej oceny fenotypów choroby. Protokół zapewnia równomierne rozprowadzenie zarodników i poprawia powtarzalność badań nad interakcjami roślino-patogen.

Łatwa i elastyczna metoda inokulacji do dokładnej oceny fenotypów infekcji mączniakiem prawdziwym Arabidopsis i innych roślin

Przeglądaj więcej filmów