Name: Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Poznaj metodę obrazowania wapnia w ostrych wycinkach trzustki myszy za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika zachowuje natywną architekturę tkanki i umożliwia badanie sygnałów wapniowych w komórkach endokrynnych oraz egzokrynnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca przedstawiona w tym badaniu była finansowana przez Słoweńską Agencję Badawczą (podstawowe finansowanie badań nr P3-0396 i I0-0029, a także projekty badawcze nr J3-9289, N3-0048 i N3-0133) oraz przez Austriacki Fundusz Naukowy / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (granty dwustronne I3562--B27 i I4319--B30). Dziękujemy Marušie Rošerowi, Mašie Čaterowi i Rudiemu Mlakarowi za doskonałą pomoc techniczną.

Autorzy oświadczają, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakiegokolwiek interesu komercyjnego lub finansowego.

Trzustka ssaków to duży gruczoł zewnątrzwydzielniczy i dokrewny. Część zewnątrzwydzielnicza stanowi 96-99% całkowitej objętości trzustki i składa się z acini i przewodów. Część hormonalna składa się z dużej liczby wysepek Langerhansa, które stanowią pozostałe 1-4% całkowitej objętości trzustki1. Część zewnątrzwydzielnicza wydziela główne enzymy trawienne, które rozkładają bogate w energię polimery w pożywieniu, a także płyn bogaty w wodorowęglany, który łączy się z innymi wydzielinami żołądkowo-jelitowymi, zapewniając środowisko odpowiednie do działania enzymów. Część hormonalna wydziela hormony, które regulują poposiłkową dystrybucję, magazynowanie i międzyposiłkowe uwalnianie składników odżywczych bogatych w energię. Chociaż tkanka zewnątrzwydzielnicza jest stosunkowo słabo rozwinięta, a endokrynna stosunkowo dobrze rozwinięta po urodzeniu, ta pierwsza szybko przerasta drugą po odsadzeniu2,3,4. Wczesne badania nad funkcją trzustki oznaczały narodziny nowoczesnej fizjologii, a główne postępy metodologiczne w tej dziedzinie pociągnęły za sobą wielkie przełomy naukowe5. Praca z trzustką jest technicznie trudna ze względu na skomplikowaną strukturę gruczołu, ale jest również dużą motywacją ze względu na choroby takie jak rak trzustki, zapalenie trzustki i cukrzyca, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego i dla których potrzebne są nowatorskie podejścia terapeutyczne.
Izolowane wysepki6, acini7,8, a fragmenty przewodów były opracowywane i używane przez dziesięciolecia jako złote metody ze względu na ich zalety w porównaniu z liniami komórkowymi i pierwotnymi rozproszonymi komórkami endokrynnymi, acinarnymi i przewodowymi9,10. Pomimo znacznie ulepszonej funkcji izolowanych zbiorowisk komórkowych, metody te nadal wiążą się ze znacznym obciążeniem mechanicznym i enzymatycznym, izolują komórki od otaczającej tkanki, a tym samym nie mają interakcji parakrynnych i wsparcia mechanicznego, a co najważniejsze, towarzyszą im znaczące zmiany w normalnej fizjologii11,12,13. Ostry wycinek tkanki trzustki myszy został opracowany w 2001 roku z powodu postrzeganej potrzeby opracowania eksperymentalnej platformy podobnej do wycinków mózgu, przysadki mózgowej i nadnerczy z zachowanymi kontaktami międzykomórkowymi, interakcjami parakrynnymi, mezenchymą i architekturą tkankową, a także bez niektórych z najważniejszych wad metody złotego standardu w badaniach wysp trzustkowych tamtych czasów - izolowanych wysepek<klasa sup="xref">12, 14. Wśród tych niedociągnięć znajdują się uszkodzenia najbardziej zewnętrznych warstw, brak dostępności obszarów wysepek rdzeniowych oraz potrzeba hodowli, która może mieć istotny wpływ na tożsamość i fizjologię komórek12,15. Co więcej, metoda warstw tkanek umożliwia badania na modelach zwierzęcych o znacznie zaburzonej architekturze wysepek, gdzie niemożliwe jest wyizolowanie wysepek lub gdy wydajność wysepek jest bardzo niska przy tradycyjnej izolacji16,17,18,19,20,21.
Dodatkowo, wycinek jest bardziej odpowiedni do badania zmian morfologicznych podczas rozwoju cukrzycy i zapalenia trzustki, na przykład, ponieważ umożliwia lepszy przegląd całej tkanki i jest również kompatybilny z badaniem różnic regionalnych. Co ważne, pomimo wczesnego skupienia się na części hormonalnej, metoda warstw tkanek z natury umożliwia badanie składników zewnątrzwydzielniczych9,22,23. W ciągu pierwszej dekady po wprowadzeniu metoda ta była stosowana do badań elektrofizjologicznych klasy beta<sup="xref">14,24,25,26,27,28,29 i alpha30,31 komórek, a także do badania morfologicznego i funkcjonalnego dojrzewania trzustki2,3. Dziesięć lat później, w 2013 roku, metoda została z powodzeniem zaadaptowana do obrazowania komórek wysp trzustkowych na żywych komórkach wapnia przy użyciu CLSM w celu scharakteryzowania ich reakcji na glukozę32, ich wzorców połączeń funkcjonalnych33 oraz związku między potencjałem błonowym a wewnątrzkomórkowym wapniem poprzez połączenie fluorescencyjnego barwnika wapniowego z barwnikiem potencjału błonowego34. Później w tym samym roku metoda ta została również wykorzystana do oceny dynamiki wapnia w komórkach groniastych22,35. W ciągu następnych lat wycinki tkanki trzustkowej były wykorzystywane w wielu różnych badaniach i z powodzeniem adaptowane do tkanek świńskich i ludzkich9,36,37,38,39,40,41. Jednak podsumowując, obrazowanie wapnia - ogólnie w wycinkach tkanki trzustki myszy, a w szczególności w wyspach trzustkowych - jest nadal wykonywane głównie przez tę grupę. Jedną z głównych przyczyn takiego stanu rzeczy może być połączenie trudnego technicznie przygotowania wycinków tkanki, potrzeby mikroskopu konfokalnego i dość złożonej analizy danych. Głównym celem niniejszego artykułu jest uczynienie tej potężnej metody bardziej dostępną dla innych potencjalnych użytkowników.
Istnieje już kilka doskonałych artykułów metodologicznych szczegółowo omawiających przygotowanie wycinków tkanek i wykorzystanie plastrów do badań strukturalnych i wydzielniczych, ale nie do konfokalnego obrazowania wapnia9,42,43. Dlatego w tym artykule skupiono się na kilku dodatkowych wskazówkach i sztuczkach podczas przygotowywania plastrów, na krokach krytycznych dla pomyślnego ładowania barwnika, akwizycji obrazu, a także na głównych krokach podstawowej analizy danych dotyczących wapnia. W związku z tym wkład ten powinien być postrzegany raczej jako uzupełnienie niż alternatywa dla wyżej wymienionej metody. Podobnie, obrazowanie wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy powinno być postrzegane jako podejście eksperymentalne, które należy zastosować w celu udzielenia odpowiedzi na konkretne pytania, a zatem jest raczej uzupełnieniem niż absolutną alternatywą dla innych podejść do obrazowania wapnia w fizjologii trzustki, takich jak izolowane przewody lub acini, izolowane wyspy trzustkowe, organoidy, wyspy trzustkowe przeszczepione do przedniej komory oka, i nagrania in vivo11,44,45,46,47,48. Potencjał obrazowania wapnia w wycinkach tkanki trzustki myszy jest prawdopodobnie najlepiej zilustrowany przez niedawne udane nagrania dynamiki wapnia w komórkach mezenchymalnych wysp trzustkowych, takich jak pericytes49 i makrofagi50, a także w komórkach przewodowych23.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waga analityczna KERN ALJ 120-4</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>ALJ 160-4A</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny Leica TCS SP5 II Ustawienie pionowe</td><td>Mikroskop</td><td></td> konfokalny Leica 5100001578 <td></td></tr><tr><td>Konfiguracja Leica TCS SP5 AOBS Tandem II Podkładka</td> korkowa <td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm x 15 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Okrągłe wiaderko na lód z pokrywką, 4 L</td><td>Fischer Scientific, Leicestershire, Wielka Brytania</td><td>432124</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka z podwójną krawędzią</td><td>Personna, Stany Zjednoczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Kleszcze precyzyjne</td><td>FST, Niemcy</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Eppendorf Safe-Lock 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Kolba Erlenmeyera 200 ml</td><td>IsoLab, Niemcy</td><td>027.01.100</td><td></td></tr><tr><td>Cienkie nożyczki - ToughCut</td><td>FST, Niemcy</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Płaska wytrząsarka orbitalna&nbsp; IKA KS 260 basic</td><td>IKA</td><td>Ident. Nr: 0002980200</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka laboratoryjna 1000 ml</td><td>IsoLab, Niemcy</td><td>091.01.901</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Hemostat, zakrzywiony</td><td>FST, Niemcy</td><td>13003-10</td><td></td></tr><tr><td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (obiektyw do zanurzenia w wodzie, 20x, NA 1.0)</td>Cylinder miarowy <td>Leica</td><td>15507701</td><td></td></tr><tr><td>25 mL</td><td>IsoLab, Niemcy</td><td>015.01.025</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynka kontrolna mikromanipulatora SM-7, Klawiatura SM-7</td><td>Luigs & Neumann</td><td>&nbsp; 200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td><td></td></tr><tr><td>Kuchenka mikrofalowa owen</td><td>Gorenje, Słowenia</td><td>MO20MW</td><td></td></tr><tr><td>Osmometr Gonotec 010</td><td>Gonotec, Berlin, Niemcy</td><td>OSMOMAT 010 Nr 01-02-20</td><td></td></tr><tr><td>Pędzel</td><td>Faber-Castell, nr 2</td><td></td><td>Dowolny cienki miękki okrągły pędzel nr 2, najlepiej</td></tr><tr><td>Ręczniki</td><td></td><td></td><td></td>papierowe</tr><tr><td>Pompy peryfuzyjne</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827</td><td>Reglo Analog MS -</td></tr><tr><td>szalka Petriego 4/8 100/20 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35/10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 x 10 mm Nunclon Delta</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>153066</td><td>NON-STICKY do bloków agarozy</td></tr><tr><td>pH-metr inoLab pH Level 1</td><td>WTW, Weilheim, Niemcy</td><td>E163694</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 1000 ml</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.120</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.066</td><td></td></tr><tr><td>Pinezki 23 mm</td><td>Deli, Ningbo, Chiny</td><td>E0021</td><td></td></tr><tr><td>Rurka z nakrętką, 15 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Semken</td><td>FST, Niemcy</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień stabilizujący do kolby Erlenmeyera</td><td>IsoLab, Niemcy</td><td>027.11.048</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Nikon SMZ 745</td><td>Nikon, Melville, NY USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka Injekt Solo 5 mL</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawkowa 0,30 x 12 mm (30 G x 1/2")</td><td>Braun, Melsungen, Niemcy</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>Regulator temperatury</td><td>Luigs & Neumann</td><td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td><td>Mini komora Slice, regulator temperatury TC 07</td></tr><tr><td>Rurki do systemu peryfuzyjnego</td><td>Ismatec</td><td>SC0310</td><td>Ismatec Pharmed 1,14 mm(ID) + rurka silikonowa 1,0 (ID) x 1,8 mm(OD)</td></tr><tr><td>Wanna ultradźwiękowa Studio GT-7810A</td><td>Wibrotom Globaltronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica VT 1000 S</td><td>Leica, Nussloch, Niemcy</td><td>14047235613</td><td></td></tr><tr><td>Wolumetryczny kolba 1000 ml</td><td>IsoLab, Niemcy</td><td>013.01.910</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik wirowy Neolab 7-2020</td><td>Neolab</td><td>&nbsp; 7-2020</td><td></td></tr><tr><td>Łaźnia wodna Pompa cyrkulacyjna otwarta Thermo Haake</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z527912</td><td></td></tr><tr><td>Materiał/Odczynnik</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny chlorek wapnia - CaCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D4540-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Kwas DL-mlekowy</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>L1250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina gazów zawierająca 95% O2 i 5% CO2 przy ciśnieniu</td><td></td><td></td><td></td>atmosferycznym</tr><tr><td>Klej Wekem sekundenkleber WK-110</td><td>Wekem GmbH, Bergkamen, Niemcy</td><td>WK 110-020</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>H3375-250G</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)- Kwas askorbinowy</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>A9,290-2</td><td></td></tr><tr><td>ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssaków</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, Stany Zjednoczone</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny - MgCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inozytol</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td><td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td><td>Przepuszczalny</td><td>dla komórek wskaźnik Ca2+ (wzbudzenie/emisja: 495/523 nm)</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>P3000MP</td><td>Polaxamer: niejonowy kopolimer triblokowy</td></tr><tr><td>Chlorek potasu - KCl</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque GTG agaroza</td><td>Lonza, Rockland, Stany Zjednoczone</td><td>50111</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu - NaHCO3</td><td>Honeywell, Niemcy</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu - NaCl</td><td>Honeywell, Niemcy</td><td>31434-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu - NaOH</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy- NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma Aldrich, Niemcy</td><td>15990-100G</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>FIJI to projekt open source</td></tr><tr><td>LASAF</td><td>Leica microsystems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python</td><td>Python Software Foundation</td><td></td><td>Python to projekt open source</td></tr></tbody></table>

konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Ostry wycinek tkanki trzustki myszy jest unikalnym preparatem in situ z zachowaną komunikacją międzykomórkową i architekturą tkankową, która pociąga za sobą znacznie mniej zmian wywołanych przygotowaniem niż izolowane wyspy trzustkowe, acini, przewody lub rozproszone komórki opisane w typowych badaniach in vitro. Łącząc ostry wycinek tkanki trzustki z obrazowaniem żywych komórek wapnia w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM), sygnały wapniowe mogą być badane jednocześnie w dużej liczbie komórek endokrynnych i zewnątrzwydzielniczych, z rozdzielczością jednokomórkową lub nawet subkomórkową. Czułość pozwala na wykrywanie zmian i umożliwia badanie fal międzykomórkowych i łączności funkcjonalnej, a także badanie zależności reakcji fizjologicznych komórek od ich lokalizacji w obrębie wyspy trzustkowej i relacji parakrynnej z innymi komórkami. Wreszcie, z punktu widzenia dobrostanu zwierząt, rejestrowanie sygnałów z dużej liczby komórek jednocześnie obniża liczbę zwierząt potrzebnych w eksperymentach, przyczyniając się do zasady wymiany, redukcji i udoskonalenia 3R.

Wstrzyknięcie roztworu agarozy do przewodu trzustkowego jest najważniejszym krokiem w przygotowaniu plastrów tkanki trzustki. Prawidłowe wstrzyknięcie można rozpoznać po wybieleniu tkanki trzustki, co widoczne jest po lewej stronie Rysunku 3A, natomiast niedostatecznie wypełniona część trzustki przedstawiona jest po prawej stronie Rysunku 3A. Wyspy Langerhansa można rozpoznać gołym okiem lub pod stereomikroskopem, co ułatwia wycinanie odpowiednich części trzustki do późniejszego zatopienia w blokach agarozowych (Rysunek 3B). W świeżo wyciętym plastrze tkanki trzustki myszy wyspy Langerhansa można łatwo odróżnić od otaczającej tkanki egzokrynnej i mezenchymy jako białe punkty pod stereomikroskopem (Rysunek 3C) lub jako brązowawe struktury pod mikroskopem świetlnym (Rysunek 3D). Plastry tkanki trzustki mogą być wykorzystywane do różnych typów eksperymentów przez co najmniej 12 h po wycięciu. Oprócz ogólnej oceny morfologicznej pod stereomikroskopem, mikroskopem świetlnym oraz analizy odpowiedzi funkcjonalnych komórek podczas obrazowania wapnia, można ocenić żywotność plastrów tkanki trzustki (Rysunek 4).
<img alt="Obraz mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający struktury komórkowe; barwienie czerwono-zielone podkreśla rozmieszczenie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Żywotność komórek w skrawku tkanki. Żywotność komórek określono za pomocą testu Live/Dead. Żywe komórki są barwione Calcein AM (kolor zielony), natomiast martwe komórki są barwione etydium homodimerem-1 (kolor czerwony). Żółte linie wyznaczają położenie przekroju X-Y stosu Z (Z-stack) wyświetlonego na dole i po prawej stronie. Pełna głębokość stosu Z wynosi 88 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
W eksperymentach z obrazowaniem wapnia fluorescencyjny wskaźnik wapnia musi przeniknąć przez kilka warstw komórek. Rysunek 5A przedstawia pomyślne wprowadzenie przenikalnego przez błony komórkowe barwnika wskaźnikowego Ca2+ do przekroju tkanki trzustki, w którym można rozpoznać poszczególne komórki wysepek oraz komórki acinarne. W przeciwieństwie do tego, przekroje na Rysunku 5B-D nie są optymalne ze względu na niepowodzenie w przenikaniu barwnika (Rysunek 5B), brak komórek wysepek (Rysunek 5C) oraz obecność dużej ilości tkanki martwiczej na powierzchni (Rysunek 5D). Takie przekroje można odrzucić, sprawdzić pod kątem obecności dodatkowych wysepek, które są lepiej przecięte lub zabarwione (patrz Tabela 1 w celu rozwiązywania problemów), lub wykorzystać do rejestracji odpowiedzi komórek egzokrynnych.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej; analiza tkanki komórkowej; rozkład intensywności emisji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Przykłady preparatów użytecznych i nieużytecznych. (A) Przykład prawidłowo przygotowanego przekroju tkanki trzustki z dobrze wybarwionymi komórkami w wysepkach Langerhansa, a także komórkami przewodowymi i otaczającą tkanką acynarną. (B) Przykład słabo wybarwionego przekroju tkanki. (C) Przykład wysepki Langerhansa z przerwami w strukturze. (D) Przykład wysepki Langerhansa zawierającej wiele martwych komórek i dużo debrisu. Tabela mapowania kolorów „glow-over, glow-under” po prawej stronie wyświetla intensywność 0 w kolorze zielonym, a nasycenie w kolorze niebieskim. Pasek skali = 100 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Reprezentatywne wyniki obrazowania wapnia z użyciem przenikającego przez błony komórkowe barwnika wskaźnikowego Ca2+ przedstawiono na Rysunku 6. Na Rysunku 6A zaprezentowano obraz o wysokiej rozdzielczości przekroju tkanki trzustki, zawierający wysepkę Langerhansa, tkankę acynarną oraz przewód trzustkowy. W celu lepszego rozróżnienia, części endokrynna, egzokrynna i przewodowa przekroju tkanki trzustki przedstawionego na Rysunku 6A zostały pokolorowane na Rysunku 6B. Zastosowanie odpowiednich bodźców pozwala na funkcjonalne rozróżnienie pomiędzy różnymi komórkami wysepek lub pomiędzy komórkami wysepek a komórkami pozawysepkowymi51. Komórki beta zazwyczaj reagują na stymulację glukozą w formie impulsu prostokątnego przejściowym wzrostem [Ca2+]IC, po którym następują szybkie oscylacje wapnia na stałym plateau (Rysunek 6C, panel górny).
Ponieważ wszystkie komórki beta są sprzężone w jedno duże, funkcjonalne syncytium, oscylacje te są również bardzo dobrze zsynchronizowane pomiędzy różnymi komórkami poprzez rozprzestrzenianie się fal [Ca2+]IC32,34,52,53,54 (Rysunek 7C). Wolniejsze oscylacje [Ca2+]IC o okresie od 5 do 15 minut mogą stanowić podstawę oscylacji szybkich lub nawet być dominującym typem odpowiedzi55,56. Ten sam prosty protokół może ujawnić inne typy odpowiedzi, szczególnie na obrzeżach wysepek (Rysunek 6C, dolny panel). Ponieważ komórki te nie są zsynchronizowane z komórkami beta i odpowiadają szybszymi oraz bardziej nieregularnymi oscylacjami, które występują już w warunkach niskiego stężenia glukozy lub objawiają się spadkiem aktywności, takie odpowiedzi silnie sugerują obecność komórek innych niż beta21,32,57,58. Jednak ich ostateczna charakterystyka funkcjonalna wymaga bardziej złożonych protokołów z dodatkowymi etapami stymulacji lub alternatywnych podejść, które zostaną omówione poniżej. Typowe odpowiedzi komórek acynarnych i przewodowych przedstawiono odpowiednio na Rysunku 6D i Rysunku 6E. Szczegółowe informacje na temat komórek acynarnych i przewodowych znajdują się w literaturze22,23,35.
<img alt="Schemat wysepki Langer한sa z komórkami beta, acynarnymi i przewodowymi oraz wykresami odpowiedzi na stymulację." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki dynamiki wapnia w poszczególnych typach komórek trzustki. (A) Obraz wysokiej rozdzielczości wysepki Langer한sa z otaczającą tkanką. Pasek skali = 100 µm. (B) Wyznaczenie poszczególnych części tkanki trzustki z tkanką acynarną zaznaczoną na żółto, wysepką Langer한sa na czerwono oraz fragmentem drzewa przewodowego na niebiesko. Pasek skali = 100 µm. (C) Typowe przebiegi dynamiki wapnia w komórkach beta oraz domniemanych komórkach nie-beta podczas stymulacji 12 mM glukozy; 3 mM glukozy zastosowano w warunkach niestymulujących. Protokoły, które mogą być wykorzystane do bardziej specyficznego rozróżnienia komórek nie-beta, opisano w sekcji dyskusji. (D) Typowy przebieg dynamiki wapnia komórek acynarnych stymulowanych 25 nM acetylocholiny. (E) Typowy przebieg dynamiki wapnia komórek przewodowych stymulowanych 1 mM kwasu chenodeoksycholowego. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Po pomyślnym obrazowaniu wapnia dane są najpierw eksportowane i korygowane pod kątem blaknięcia (bleachingu) poprzez kombinację dopasowania wykładniczego i liniowego, zgodnie z opisem w sekcji protokołu. Szeregi czasowe przed i po korekcie blaknięcia przedstawiono na Rysunku 7A. Następnie można przeanalizować kilka parametrów w fazie aktywacji i deaktywacji odpowiedzi, a także w fazie plateau. Opóźnienie początku wzrostu [Ca2+]IC po stymulacji można zmierzyć, co przedstawiono jako delayA na Rysunku 7B, a także heterogeniczność opóźnień między poszczególnymi komórkami (delayA1). Te same parametry (delayD i delayD1) mogą być użyte do opisu fazy deaktywacji. Po początkowym przejściowym wzroście [Ca2+]IC, fazę plateau w większości komórek beta trzustki w wysepce charakteryzują stosunkowo regularne, wysokoczęstotliwościowe oscylacje [Ca2+]IC. Fazę plateau można opisać, analizując klasyczne parametry funkcjonalne. Schematyczne przedstawienie czasu trwania, częstotliwości i procentowego czasu aktywności oscylacji [Ca2+]IC ukazano na Rysunku 7C. W obrazowaniu wapnia przy częstotliwościach akwizycji przekraczających 10 Hz można również wyraźnie rozpoznać fale wapniowe wielokrotnie rozprzestrzeniające się w obrębie wysepki (Rysunek 7C).
<img alt="Wykres elektrofizjologiczny; odpowiedź na stymulację nerwu; analiza opóźnienia czasowego; trend danych w czasie 200s." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7: Analiza danych szeregów czasowych. (A) Korekcja danych szeregów czasowych pod kątem fotoblaknięcia. (B) Analiza opóźnień aktywacji po stymulacji oraz dezaktywacji po zaprzestaniu stymulacji glukozą 12 mM. Czas trwania stymulacji zaznaczono na obrazie jasnoszarym, zacieniowanym paskiem. (C) Analiza kilku parametrów fazy plateau: I) Czas trwania oscylacji wyznaczony na połowie wysokości, II) częstotliwość oscylacji wyznaczona na podstawie odstępów międzyoscylacyjnych, III) czas aktywności jako iloczyn częstotliwości i czasu trwania oscylacji. I-IV) Opóźnienia między oscylacjami w dowolnej fali oscylacji rozprzestrzeniającej się przez wysepek Langerhansa, wyznaczone na podstawie opóźnień (Δt) w czasie, w którym pojedyncza komórka osiąga połowę wysokości oscylacji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Tabela 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>

Prezentujemy przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustkowej i ich zastosowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do jednoczesnego badania dynamiki wapnia w dużej liczbie żywych komórek, przez długie okresy czasu i z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

W połączeniu z obrazowaniem wapnia w żywych komórkach, technika ostrego wycinka tkanki trzustki umożliwia badanie fal międzykomórkowych i wielokomórkowych połączeń funkcjonalnych z wysoką rozdzielczością przez długi czas. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, zachowuje architekturę tkankową i zmniejsza ograniczone naprężenia enzymatyczne i mechaniczne przy zachowaniu wysokiej wydajności tkanki. Wykrywając zmiany funkcjonalne i morfologiczne podczas postępu choroby, technika ta pomaga nam zrozumieć choroby związane z trzustką, takie jak cukrzyca.Ta technika wycinania tkanek może być stosowana do tkanek mózgu, przysadki mózgowej i nadnerczy z naciskiem na zachowanie kontaktu międzykomórkowego, interakcji parakrynnych i architektury tkanki. Aby przygotować się do wstrzyknięcia agarozy do trzustki myszy, napełnij pięciomililitrową strzykawkę płynną agarozą o temperaturze 40 stopni Celsjusza i wyposaż strzykawkę w igłę o rozmiarze 30. Po dokładnym przykryciu igły nasadką, umieścić końcówkę igły strzykawki w dół, tak aby cała objętość agarozy znajdowała się poniżej powierzchni wody, w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza.Bąbelkować butelkę roztworu zewnątrzkomórkowego karbogenem, w sposób ciągły na lodzie, w ilości 1,5 mililitra na minutę przy ciśnieniu atmosferycznym i temperaturze pokojowej, aby zapewnić natlenienie i pH 7,4. Aby wykonać wstrzyknięcie agarozy, umieść uśpioną dorosłą mysz pod mikroskopem stereoskopowym i uzyskaj dostęp do brzucha myszy za pomocą laparotomii. Delikatnie przesuń jelito w lewą stronę, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy i użyj kleszczy, aby lekko unieść dwunastniczy koniec przewodu, aby zlokalizować brodawkę Vatera.Użyj hemostatu, aby zacisnąć przewód żółciowy na brodawce dwunastnicy, aby zapobiec wyciekowi agarozy z przewodu do dwunastnicy i użyj małych ostrych kleszczyków, aby dotrzeć pod wspólny przewód żółciowy, aby przerwać błonę mocującą przewód do tkanki trzustki. Po usunięciu jak największej ilości tłuszczu i tkanki łącznej z przewodu, umieść przewód prostopadle na końcówkach większej pary większych kleszczy i mocno naciskając tłok strzykawki, wstrzyknij lepką płynną agarozę do bliższego końca wspólnego przewodu żółciowego na 20 do 30 sekund. Gdy tkanka stanie się biaława i lekko rozdęta, wyjmij strzykawkę i powoli wlej 20 mililitrów bąbelkowego, lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego na trzustkę, aby schłodzić tkankę i stwardnieć agarozę.Aby uzyskać plastry tkanki trzustkowej, użyj kleszczy i cienkich, twardych nożyczek, aby delikatnie przenieść trzustkę z wstrzykniętą agarozą na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 40 mililitrów lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego. Zakręć naczyniem, aby wypłukać tkankę i przenieś trzustkę do drugiego naczynia z lodowatym roztworem zewnątrzkomórkowym. Za pomocą kleszczy i nożyczek pokrój białawy, dobrze wstrzyknięty fragment trzustki na maksymalnie sześć kawałków o objętości od 0,1 do 0,2 centymetra sześciennego i usuń pozostałą tkankę łączną i tłuszczową z tych kawałków.Umieść oczyszczone bloki na 35-milimetrowej, nielepkiej szalce Petriego zawierającej około pięciu mililitrów płynnej agarozy o temperaturze 40 stopni Celsjusza i natychmiast umieść szalkę Petriego na lodzie. Gdy agaroza stwardnieje, trzymaj szalkę Petriego do góry nogami nad pokrywką 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj połowy żyletki, aby ostrożnie przeciąć margines między boczną ścianką szalki Petriego a agarozą, aby usunąć agarozę z naczynia. Za pomocą żyletki wyciąć pojedyncze kostki, z których każda zawiera jeden blok tkanki agarozy, z uwolnionej agarozy i użyć kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować bloki do płytki próbki wibratomu.Napełnij komorę tnącą wibratomu 150 mililitrami lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego stale bulgoczącego karbogenem. Przykręć płytkę sample do wibratomu i zamontuj nową żyletkę. Otocz komorę lodem i dodaj dwie kostki lodu o objętości 10 mililitrów wykonane z roztworu zewnątrzkomórkowego uzupełnionego sześciomilimolową glukozą.Ustaw krajalnicę na 0,05 do 1 milimetra na sekundę i 70 herców, a następnie rozpocznij krojenie, aby uzyskać plastry agarozy o grubości 140 mikronów i powierzchni od 20 do 100 milimetrów kwadratowych. Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie przenieś każdy plasterek na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 40 milimetrami buforu HEPES uzupełnionego sześciomilimolową glukozą. Do przygotowania barwnika wapniowego rozpuść 50 mikrogramów przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego wapnia, 7,5 mikrolitra DMSO i 2,5 mikrolitra poloksamera oraz 6,667 mililitra HBS w 15-mililitrowej tubce z nakrętką.Użyj pipety, aby dokładnie wymieszać roztwór przez 20 sekund, a następnie zanurz probówkę w komorze kąpieli ultradźwiękowej i wiruj, każdy przez 30 sekund. Następnie podatkować 3,333 mililitra powstałego roztworu barwnika wskaźnika wapnia na jedną 5-mililitrową szalkę Petriego na 10 plasterków tkanki, która ma być oznaczona. Do ładowania barwnika użyj cienkiego miękkiego pędzla, aby przenieść do 10 plasterków tkanki do każdego naczynia z roztworem barwnika i umieść naczynia na wytrząsarce orbitalnej na 50 minut w temperaturze pokojowej i 40 obrotach na minutę, chroniąc przed światłem.Pod koniec inkubacji przenieś do 20 barwionych plastrów na pojedyncze 60-mililitrowe szalki Petriego wypełnione bezbarwnikowym HBS. W przypadku obrazowania wapnia za pomocą mikroskopii konfokalnej wybierz 20 lub 25-krotne powiększenie i ustaw tryb akwizycji na obrazowanie poklatkowe, otwór na 100 do 200 mikronów, a wzbudzenie i emisję dla fluoroforu użytego w eksperymencie. Zamontuj komorę zapisu i system perfuzyjny na stoliku mikroskopu o kontrolowanej temperaturze i umieść wlot i wylot na dalszych krawędziach komory zapisu.Ustaw szybkość dopływu i odpływu na jeden do dwóch mililitrów na minutę. Ustaw temperaturę systemu profuzji na 37 stopni Celsjusza i rozpocznij obfitowanie roztworem niestymulującym. Aby zarejestrować dynamikę wapnia w tkance, umieść pojedynczy plasterek tkanki w komorze rejestracyjnej i unieruchomij tkankę za pomocą platynowego ciężarka w kształcie litery U z napiętą nylonową siatką.Użyj opcji jasnego pola, aby zlokalizować interesującą nas strukturę i użyj obrazowania na żywo, aby ustawić badane struktury w polu widzenia. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu, dostosuj moc lasera, wzmocnienie detektora i grupowanie uśredniania linii, jednocześnie utrzymując moc lasera na minimalnym poziomie. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej do 15 mikronów poniżej powierzchni cięcia, aby uniknąć nagrywania z potencjalnie uszkodzonych komórek i uzyskać obrazy.Ustawienie częstotliwości próbkowania na jeden do dwóch herców, aby umożliwić wstępne wykrycie pojedynczych oscylacji i zarejestrowanie obrazu o wysokiej rozdzielczości. Jeśli to możliwe, skorzystaj z wykresu online, aby uzyskać natychmiastową informację zwrotną na temat reakcji preparatu, nadmiernego oświetlenia, fotowybielania i dryfu mechanicznego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zapisz dane do późniejszej analizy.Tutaj można zaobserwować przykład optymalnego wycinka tkanki, w którym przepuszczalny dla komórek barwnik wskaźnikowy wapnia został pomyślnie załadowany do wycinka tkanki trzustkowej. W przeciwieństwie do tego, te wycinki tkanki nie są optymalne do obrazowania ze względu na nieudaną penetrację barwnika, brak komórek wysp trzustkowych lub obfitość tkanki martwiczej na powierzchni próbek. Obrazy o wysokiej rozdzielczości wycinka tkanki trzustki można wykorzystać do wyznaczenia odrębnych obszarów tkanki trzustkowej, takich jak wyspy Langerhansa, tkanka zraziona lub przewód trzustkowy.Bodźce mogą być wykorzystywane do funkcjonalnego rozróżniania różnych komórek wysp trzustkowych lub komórek wysp trzustkowych i niewyspowych. Na przykład komórki beta zazwyczaj reagują na stymulację glukozą impulsem kwadratowym, wykazując przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, po którym następują szybkie oscylacje wapnia na utrzymującym się plateau . Natomiast komórki inne niż beta reagują szybszymi i bardziej nieregularnymi oscylacjami.Można również zmierzyć opóźnienie w wystąpieniu wewnątrzkomórkowego wzrostu wapnia po stymulacji, a także niejednorodność i opóźnienia między poszczególnymi komórkami. Te same parametry można wykorzystać do opisania fazy dezaktywacji. Tutaj można zaobserwować schematyczne przedstawienie czasu trwania, częstotliwości i procentu czasu aktywności oscylacji wapnia.Podczas obrazowania z szybkością akwizycji większą niż 10 Hz można wyraźnie rozpoznać fale wapniowe, które wielokrotnie rozprzestrzeniają się po wysepce. Zacisnąć wspólny przewód żółciowy jak najbliżej dwunastnicy, aby zapobiec przypadkowemu zasłanianiu gałęzi, która wchodzi do trzustki. Nie należy również przestawać wciskać tłoka podczas wstrzykiwania, ponieważ agaroza natychmiast stwardnieje w igle.Technika ostrego plastra tkanki trzustki myszy może być również stosowana z metodą patch clamp do badania prądów kanałów jonowych i cytozy dostępu, a także badań immunohistochemicznych i badań sekretarskich.

confocal-laser-scanning-microscopy-calcium-dynamics-acute-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje technikę obrazowania komórek wysp trzustkowych w czasie rzeczywistym, w celu zbadania zmian w stężeniu wapnia cytozolowego w mniejszych subpopulacjach komórek wysp trzustkowych. Mniejsze subpopulacje komórek można zidentyfikować za pomocą funkcjonalnych odpowiedzi na związki markerowe, takie jak adrenalina i grelina, które indukują zmiany w cytozolowym wapniu w określonych populacjach komórek wysp trzustkowych. Może to zapewnić wgląd w wzajemne oddziaływanie między poziomem...

Obrazowanie dynamiki wapnia w komórkach trzustki: technika badania zmian w czasie rzeczywistym stężenia wapnia cytozolowego w wyspach trzustkowych

W tym filmie opisujemy obrazowanie trzustki myszy w trybie przyżyciowym przez ustabilizowane okno do długoterminowej wizualizacji dynamiki komórkowej.

Obrazowanie przyżyciowe: metoda obserwacji trzustki myszy na poziomie komórkowym przez ustabilizowane okno obrazowania

Opisujemy powtarzalną metodę przygotowania komórek groniastych trzustki myszy od myszy w celu zbadania sygnałów wapniowych komórek groniastych i uszkodzeń komórkowych za pomocą fizjologicznie i patologicznie istotnych bodźców. Podano również metodę infekcji adenowirusowej tych komórek.

Przygotowanie komórek groniastych trzustki do celów obrazowania wapnia, pomiarów uszkodzeń komórek i infekcji adenowirusowej

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania i ilościowego oznaczania dynamiki wapnia w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak komórki wysp trzustkowych. Reportery fluorescencyjne są dostarczane do obwodowej warstwy komórek w obrębie wyspy trzustkowej, która jest następnie unieruchamiana i obrazowana, a także przeprowadzana jest analiza dynamiki intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek.

Obrazowanie dynamiki wapnia w subpopulacjach komórek wysp trzustkowych myszy

To badanie przedstawia zastosowanie żywych wycinków tkanki trzustki do badania fizjologii wysp trzustkowych i interakcji między komórkami odpornościowymi wysp trzustkowych.

Obserwacja funkcji wysp trzustkowych i interakcji między wyspami trzustkowymi a komórkami układu odpornościowego w żywych wycinkach tkanki trzustkowej

Obrazowanie in vivo trzustki w wysokiej rozdzielczości było ułatwione dzięki oknu obrazowania przyżyciowego trzustki.

Stabilizowana podłużna wizualizacja trzustki na poziomie komórkowym in vivo w modelu mysim z oknem obrazowania przyżyciowego trzustki

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Ten protokół opisuje, jak generować ludzkie wycinki trzustki od zmarłych dawców narządów w celu badania funkcji komórek w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. To innowacyjne podejście umożliwia badanie normalnych i strukturalnie uszkodzonych wysp trzustkowych oraz skomplikowanych interakcji między przedziałami endokrynnymi i zewnątrzwydzielniczymi.

Generowanie wycinków ludzkiej tkanki trzustki w celu badania fizjologii endokrynnej i zewnątrzwydzielniczej trzustki

Mikroskopia z przechwytywaniem laserowym, znana również jako laserowa mikrodysekcja (LMD), umożliwia użytkownikowi izolację niewielkiej liczby komórek lub tkanek z zamrożonych lub ...

Mikrorozcięcie laserowe z wychwytem (Laser Capture Microdissection) tkanek ssaków

Uzyskanie wysokiej jakości i odpowiedniej ilości ludzkich wysepek trzustkowych jest jednym z głównych warunków koniecznych do pomyślnego przeszczepienia wysepek. W niniejszym filmie opisujemy krok po kroku procedury izolacji ludzkich wysepek trzustkowych (część I: trawienie i pobieranie tkanki trzustki) z wykorzystaniem zmodyfikowanej metody zautomatyzowanej.

Izolacja wysepek trzustkowych człowieka: Część I: Trawienie i pobieranie tkanki trzustki

Poznaj metodę obrazowania wapnia w ostrych wycinkach trzustki myszy za pomocą konfokalnej mikroskopii laserowej. Technika zachowuje natywną architekturę tkanki i umożliwia badanie sygnałów wapniowych w komórkach endokrynnych oraz egzokrynnych.

Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy

Przeglądaj więcej filmów