Konfokalna laserowa mikroskopia skaningowa dynamiki wapnia w ostrych wycinkach tkanki trzustkowej myszy
13 kwietnia 2021
Prezentujemy przygotowanie ostrych wycinków tkanki trzustkowej i ich zastosowanie w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej do jednoczesnego badania dynamiki wapnia w dużej liczbie żywych komórek, przez długie okresy czasu i z wysoką rozdzielczością czasoprzestrzenną.
W połączeniu z obrazowaniem wapnia w żywych komórkach, technika ostrego wycinka tkanki trzustki umożliwia badanie fal międzykomórkowych i wielokomórkowych połączeń funkcjonalnych z wysoką rozdzielczością przez długi czas. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest szybka, zachowuje architekturę tkankową i zmniejsza ograniczone naprężenia enzymatyczne i mechaniczne przy zachowaniu wysokiej wydajności tkanki. Wykrywając zmiany funkcjonalne i morfologiczne podczas postępu choroby, technika ta pomaga nam zrozumieć choroby związane z trzustką, takie jak cukrzyca.
Ta technika wycinania tkanek może być stosowana do tkanek mózgu, przysadki mózgowej i nadnerczy z naciskiem na zachowanie kontaktu międzykomórkowego, interakcji parakrynnych i architektury tkanki. Aby przygotować się do wstrzyknięcia agarozy do trzustki myszy, napełnij pięciomililitrową strzykawkę płynną agarozą o temperaturze 40 stopni Celsjusza i wyposaż strzykawkę w igłę o rozmiarze 30. Po dokładnym przykryciu igły nasadką, umieścić końcówkę igły strzykawki w dół, tak aby cała objętość agarozy znajdowała się poniżej powierzchni wody, w łaźni wodnej o temperaturze 40 stopni Celsjusza.
Bąbelkować butelkę roztworu zewnątrzkomórkowego karbogenem, w sposób ciągły na lodzie, w ilości 1,5 mililitra na minutę przy ciśnieniu atmosferycznym i temperaturze pokojowej, aby zapewnić natlenienie i pH 7,4. Aby wykonać wstrzyknięcie agarozy, umieść uśpioną dorosłą mysz pod mikroskopem stereoskopowym i uzyskaj dostęp do brzucha myszy za pomocą laparotomii. Delikatnie przesuń jelito w lewą stronę, aby odsłonić wspólny przewód żółciowy i użyj kleszczy, aby lekko unieść dwunastniczy koniec przewodu, aby zlokalizować brodawkę Vatera.
Użyj hemostatu, aby zacisnąć przewód żółciowy na brodawce dwunastnicy, aby zapobiec wyciekowi agarozy z przewodu do dwunastnicy i użyj małych ostrych kleszczyków, aby dotrzeć pod wspólny przewód żółciowy, aby przerwać błonę mocującą przewód do tkanki trzustki. Po usunięciu jak największej ilości tłuszczu i tkanki łącznej z przewodu, umieść przewód prostopadle na końcówkach większej pary większych kleszczy i mocno naciskając tłok strzykawki, wstrzyknij lepką płynną agarozę do bliższego końca wspólnego przewodu żółciowego na 20 do 30 sekund. Gdy tkanka stanie się biaława i lekko rozdęta, wyjmij strzykawkę i powoli wlej 20 mililitrów bąbelkowego, lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego na trzustkę, aby schłodzić tkankę i stwardnieć agarozę.
Aby uzyskać plastry tkanki trzustkowej, użyj kleszczy i cienkich, twardych nożyczek, aby delikatnie przenieść trzustkę z wstrzykniętą agarozą na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 40 mililitrów lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego. Zakręć naczyniem, aby wypłukać tkankę i przenieś trzustkę do drugiego naczynia z lodowatym roztworem zewnątrzkomórkowym. Za pomocą kleszczy i nożyczek pokrój białawy, dobrze wstrzyknięty fragment trzustki na maksymalnie sześć kawałków o objętości od 0,1 do 0,2 centymetra sześciennego i usuń pozostałą tkankę łączną i tłuszczową z tych kawałków.
Umieść oczyszczone bloki na 35-milimetrowej, nielepkiej szalce Petriego zawierającej około pięciu mililitrów płynnej agarozy o temperaturze 40 stopni Celsjusza i natychmiast umieść szalkę Petriego na lodzie. Gdy agaroza stwardnieje, trzymaj szalkę Petriego do góry nogami nad pokrywką 100-milimetrowej szalki Petriego i użyj połowy żyletki, aby ostrożnie przeciąć margines między boczną ścianką szalki Petriego a agarozą, aby usunąć agarozę z naczynia. Za pomocą żyletki wyciąć pojedyncze kostki, z których każda zawiera jeden blok tkanki agarozy, z uwolnionej agarozy i użyć kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować bloki do płytki próbki wibratomu.
Napełnij komorę tnącą wibratomu 150 mililitrami lodowatego roztworu zewnątrzkomórkowego stale bulgoczącego karbogenem. Przykręć płytkę sample do wibratomu i zamontuj nową żyletkę. Otocz komorę lodem i dodaj dwie kostki lodu o objętości 10 mililitrów wykonane z roztworu zewnątrzkomórkowego uzupełnionego sześciomilimolową glukozą.
Ustaw krajalnicę na 0,05 do 1 milimetra na sekundę i 70 herców, a następnie rozpocznij krojenie, aby uzyskać plastry agarozy o grubości 140 mikronów i powierzchni od 20 do 100 milimetrów kwadratowych. Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie przenieś każdy plasterek na 100-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną 40 milimetrami buforu HEPES uzupełnionego sześciomilimolową glukozą. Do przygotowania barwnika wapniowego rozpuść 50 mikrogramów przepuszczalnego dla komórek barwnika wskaźnikowego wapnia, 7,5 mikrolitra DMSO i 2,5 mikrolitra poloksamera oraz 6,667 mililitra HBS w 15-mililitrowej tubce z nakrętką.
Użyj pipety, aby dokładnie wymieszać roztwór przez 20 sekund, a następnie zanurz probówkę w komorze kąpieli ultradźwiękowej i wiruj, każdy przez 30 sekund. Następnie podatkować 3,333 mililitra powstałego roztworu barwnika wskaźnika wapnia na jedną 5-mililitrową szalkę Petriego na 10 plasterków tkanki, która ma być oznaczona. Do ładowania barwnika użyj cienkiego miękkiego pędzla, aby przenieść do 10 plasterków tkanki do każdego naczynia z roztworem barwnika i umieść naczynia na wytrząsarce orbitalnej na 50 minut w temperaturze pokojowej i 40 obrotach na minutę, chroniąc przed światłem.
Pod koniec inkubacji przenieś do 20 barwionych plastrów na pojedyncze 60-mililitrowe szalki Petriego wypełnione bezbarwnikowym HBS. W przypadku obrazowania wapnia za pomocą mikroskopii konfokalnej wybierz 20 lub 25-krotne powiększenie i ustaw tryb akwizycji na obrazowanie poklatkowe, otwór na 100 do 200 mikronów, a wzbudzenie i emisję dla fluoroforu użytego w eksperymencie. Zamontuj komorę zapisu i system perfuzyjny na stoliku mikroskopu o kontrolowanej temperaturze i umieść wlot i wylot na dalszych krawędziach komory zapisu.
Ustaw szybkość dopływu i odpływu na jeden do dwóch mililitrów na minutę. Ustaw temperaturę systemu profuzji na 37 stopni Celsjusza i rozpocznij obfitowanie roztworem niestymulującym. Aby zarejestrować dynamikę wapnia w tkance, umieść pojedynczy plasterek tkanki w komorze rejestracyjnej i unieruchomij tkankę za pomocą platynowego ciężarka w kształcie litery U z napiętą nylonową siatką.
Użyj opcji jasnego pola, aby zlokalizować interesującą nas strukturę i użyj obrazowania na żywo, aby ustawić badane struktury w polu widzenia. Aby zoptymalizować stosunek sygnału do szumu, dostosuj moc lasera, wzmocnienie detektora i grupowanie uśredniania linii, jednocześnie utrzymując moc lasera na minimalnym poziomie. Dostosuj płaszczyznę ogniskowej do 15 mikronów poniżej powierzchni cięcia, aby uniknąć nagrywania z potencjalnie uszkodzonych komórek i uzyskać obrazy.
Ustawienie częstotliwości próbkowania na jeden do dwóch herców, aby umożliwić wstępne wykrycie pojedynczych oscylacji i zarejestrowanie obrazu o wysokiej rozdzielczości. Jeśli to możliwe, skorzystaj z wykresu online, aby uzyskać natychmiastową informację zwrotną na temat reakcji preparatu, nadmiernego oświetlenia, fotowybielania i dryfu mechanicznego. Po uzyskaniu wszystkich obrazów zapisz dane do późniejszej analizy.
Tutaj można zaobserwować przykład optymalnego wycinka tkanki, w którym przepuszczalny dla komórek barwnik wskaźnikowy wapnia został pomyślnie załadowany do wycinka tkanki trzustkowej. W przeciwieństwie do tego, te wycinki tkanki nie są optymalne do obrazowania ze względu na nieudaną penetrację barwnika, brak komórek wysp trzustkowych lub obfitość tkanki martwiczej na powierzchni próbek. Obrazy o wysokiej rozdzielczości wycinka tkanki trzustki można wykorzystać do wyznaczenia odrębnych obszarów tkanki trzustkowej, takich jak wyspy Langerhansa, tkanka zraziona lub przewód trzustkowy.
Bodźce mogą być wykorzystywane do funkcjonalnego rozróżniania różnych komórek wysp trzustkowych lub komórek wysp trzustkowych i niewyspowych. Na przykład komórki beta zazwyczaj reagują na stymulację glukozą impulsem kwadratowym, wykazując przejściowy wzrost wewnątrzkomórkowego wapnia, po którym następują szybkie oscylacje wapnia na utrzymującym się plateau . Natomiast komórki inne niż beta reagują szybszymi i bardziej nieregularnymi oscylacjami.
Można również zmierzyć opóźnienie w wystąpieniu wewnątrzkomórkowego wzrostu wapnia po stymulacji, a także niejednorodność i opóźnienia między poszczególnymi komórkami. Te same parametry można wykorzystać do opisania fazy dezaktywacji. Tutaj można zaobserwować schematyczne przedstawienie czasu trwania, częstotliwości i procentu czasu aktywności oscylacji wapnia.
Podczas obrazowania z szybkością akwizycji większą niż 10 Hz można wyraźnie rozpoznać fale wapniowe, które wielokrotnie rozprzestrzeniają się po wysepce. Zacisnąć wspólny przewód żółciowy jak najbliżej dwunastnicy, aby zapobiec przypadkowemu zasłanianiu gałęzi, która wchodzi do trzustki. Nie należy również przestawać wciskać tłoka podczas wstrzykiwania, ponieważ agaroza natychmiast stwardnieje w igle.
Technika ostrego plastra tkanki trzustki myszy może być również stosowana z metodą patch clamp do badania prądów kanałów jonowych i cytozy dostępu, a także badań immunohistochemicznych i badań sekretarskich.
Przegląd
Technika przygotowania świeżych skrawków tkanki trzustki myszy w połączeniu z obrazowaniem wapnia w żywych komórkach przy użyciu konfokalnego skanującego mikroskopu laserowego (CLSM) umożliwia wysokorozdzielcze badanie dynamiki wapnia zarówno w komórkach endokrynnych, jak i egzokrynnych trzustki. Metoda ta pozwala na zachowanie natywnej architektury tkanki oraz komunikacji międzykomórkowej, co umożliwia szczegółową analizę łączności funkcjonalnej i odpowiedzi fizjologicznych przy jednoczesnym zminimalizowaniu artefaktów wynikających z przygotowania preparatu. Podejście to wspiera również dobrostan zwierząt poprzez redukcję liczby zwierząt wymaganych do przeprowadzenia eksperymentów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Fizjologia trzustki
- Obrazowanie komórkowe
- Endokrynologia
- Biologia komórkowa egzokrynna i endokrynna
Wstęp
- Tradycyjne badania in vitro często wykorzystują izolowane wyspy, acini, przewody lub rozproszone komórki, co może prowadzić do zaburzenia architektury tkanki i komunikacji międzykomórkowej.
- Metoda preparowania świeżych przekrojów tkankowych zachowuje naturalną strukturę oraz interakcje parakrynne trzustki.
- Obrazowanie wapnia w żywych komórkach umożliwia monitorowanie aktywności komórkowej w czasie rzeczywistym z rozdzielczością pojedynczych komórek lub rozdzielczością subkomórkową.
- Technikę tę można zastosować do innych tkanek, takich jak mózg, przysadka i nadnercza, kładąc nacisk na zachowanie kontaktów międzykomórkowych.
Cel badania
- Przedstawienie protokołu przygotowania ostrych skrawków tkanki trzustki myszy, odpowiednich do obrazowania wapnia w żywych komórkach.
- Umożliwienie jednoczesnego badania sygnalizacji wapniowej w dużych populacjach komórek trzustki.
- Ułatwienie badania fal międzykomórkowych, łączności funkcjonalnej oraz odpowiedzi fizjologicznych in situ.
Zastosowane metody
- Wstrzyknięcie ciepłej agarozy do trzustki myszy poprzez wspólny przewód żółciowy w celu stabilizacji tkanki.
- Przygotowanie skrawków tkanki przy użyciu wibrotomu po zatopieniu w agarozie i schłodzeniu.
- Ładowanie skrawków tkanki barwnikiem wskaźnikowym wapnia przenikającym przez błony komórkowe.
- Obrazowanie wapnia w żywych komórkach przy użyciu konfokalnej mikroskopii skaningowej z akwizycją time-lapse i perfuzją z kontrolą temperatury.
Główne wyniki
- Wysokiej jakości przekroje tkanek umożliwiają wyraźną wizualizację wysepek, tkankiy akinarnej oraz przewodów.
- Obrazowanie wapnia ujawnia odmienne reakcje komórek beta i nie-beta na stymulację glukozą, w tym różnice w wzorcach oscylacji i opóźnieniach aktywacji.
- Międzykomórkowe fale wapnia oraz łączność funkcjonalna mogą być obserwowane z wysoką rozdzielczością czasową.
- Technika ta umożliwia dodatkowe zastosowania, takie jak elektrofizjologia metodą patch clamp, immunohistochemia oraz badania wydzielnicze.
Wnioski
- Metoda przygotowania ostrych przekrojów tkanki trzustki zachowuje integralność tkanki i umożliwia szczegółowe badania funkcjonalne komórek trzustki.
- Połączenie tego podejścia z obrazowaniem wapnia w żywych komórkach pozwala na uzyskanie wglądu w komunikację komórkową oraz mechanizmy chorób, takich jak cukrzyca.
- Metoda ta ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt i może zostać zaadaptowana do innych typów tkanek.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Konfokalna mikroskopia laserowa dynamiki wapnia w ostrych przekrojach tkanki trzustki myszy umożliwia wysokorozdzielczą, fizjologicznie istotną analizę sygnalizacji międzykomórkowej i łączności funkcjonalnej. Podejście to zachowuje natywną architekturę tkanki oraz oddziaływania parakrynowe, co zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie odkrywania i w procesie ograniczania ryzyka mechanistycznego dla celów terapeutycznych w chorobach metabolicznych. Skalowalność tej metody oraz ograniczenie liczby wykorzystywanych zwierząt są zgodne z priorytetami badawczo-rozwojowymi przedsiębiorstw w zakresie wydajności i ciągłości translacyjnej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią wizualizację sygnalizacji wapniowej i fal międzykomórkowych w nienaruszonych mikrośrodowiskach trzustki.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez rozróżnianie odpowiedzi komórek endokrynnych i egzokrynnych na bodźce fizjologiczne.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez zachowanie oddziaływań parakrynnych i wielokomórkowych istotnych dla modeli chorobowych.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celów w portfelach badawczych dotyczących metabolizmu i endokrynologii.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowane, powtarzalne systemy tkankowe do ilościowych analiz obrazowania żywych komórek.
- Umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe (high-content screening) odpowiedzi funkcjonalnych w dużych populacjach komórek w natywnym kontekście tkankowym.
- Wspiera standaryzację analiz oraz ponowne wykorzystanie platformy do oceny związków i badań mechanistycznych.
- Dostarcza ilościowe dane wyjściowe, takie jak częstotliwość oscylacji, opóźnienia aktywacji oraz wskaźniki łączności funkcjonalnej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób cukrzycy i zaburzeń trzustki dzięki zachowaniu architektury fizjologicznej.
- Umożliwia przejście od etapu odkrywania do walidacji przedklinicznej poprzez wsparcie analizy funkcjonalnych biomarkerów.
- Zmniejsza ryzyko biologiczne na późnych etapach dzięki dostarczaniu predykcyjnych danych in situ na temat odpowiedzi na poziomie komórkowym i tkankowym.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka dzięki solidnym, ilościowym odczytom.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum od etapu odkrywania do fazy przedklinicznej, łącząc wczesne badania mechanistyczne z badaniami translacyjnymi w zakresie chorób metabolicznych i funkcji endokrynnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez umożliwienie analizy dynamiki wapnia i sygnalizacji międzykomórkowej w czasie rzeczywistym.
- Przesiewanie: Dostarcza gotowych do analizy, powtarzalnych przekrojów tkankowych do obrazowania ilościowego i przesiewania funkcjonalnego.
- Analityka: Zapewnia wysokotreściowe, ilościowe pomiary oscylacji wapnia, kinetyki aktywacji oraz łączności wielokomórkowej.
- Badania translacyjne: Zachowuje kontekst tkankowy istotny dla danej choroby w celu dopasowania biomarkerów i walidacji modeli przedklinicznych.
- Zastosowania szerokoskalowe: Oferuje platformę wielokrotnego użytku, którą można dostosować do innych tkanek i która jest kompatybilna z dodatkowymi metodami, takimi jak patch clamp i immunohistochemia.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu terapeutycznego.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność funkcjonalnych testów tkankowych.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez ograniczenie wykorzystania zwierząt i artefaktów przygotowawczych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów badawczych nad chorobami metabolicznymi i endokrynologicznymi.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w przygotowaniu tkanek, obrazowaniu żywych komórek oraz ilościowej analizie danych.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej, wibratomu oraz systemów perfuzyjnych.
- Konieczna jest standaryzacja międzyzespołowa w celu zapewnienia powtarzalności protokołów obsługi tkanek i obrazowania.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do innych układów narządowych z zachowaną architekturą i komunikacją międzykomórkową.
- Wiarygodność wyników zależy od jakości tkanki, penetracji barwnika oraz optymalizacji parametrów obrazowania.
