Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Protokoły te można wykorzystać do opracowania wewnętrznych multipleksowych testów ddPCR do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Jest to przydatne dla osób, które chcą opracować własne zestawy do wykrywania SARS-CoV-2 i innych patogenów. W porównaniu ze złotym standardem RT-QPCR, RT-DDPCR może być stosowany do ilościowego oznaczania wielu genów SARS-CoV-2 bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej.

Ponieważ ddPCR jest nową techniką, demonstracja wizualna jest ważna, aby pomóc obecnym i przyszłym użytkownikom zrozumieć i łatwo opracować testy multipleksowe do wykrywania SARS-CoV-2 i innych patogenów. W celu syntezy cDNA dodaj dwa mikrolitry 5-krotnej mieszanki głównej z odwrotną transkrypcją, pięć mikrolitrów interesującej próbki RNA i trzy mikrolitry podwójnie destylowanej wody bez RNaz do 100 lub 200 mikrolitrowej probówki PCR do końcowej objętości 10 mikrolitrów jako roztwór i umieść probówkę na lodzie. Po dodaniu odczynników załaduj próbkę do termocyklera i ustaw przyrząd tak, aby uruchamiał odwrotną transkrypcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, inaktywację termiczną odwrotnej transkrypcji przez 5 sekund w temperaturze 85 stopni Celsjusza i końcowe nieskończone zatrzymanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przed wykonaniem kropelkowego cyfrowego PCR dodaj 19,8 mikrolitra świeżo przygotowanej mieszanki wzorcowej do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki cyfrowej PCR bez nukleaz. Dodać 2,2 mikrolitra cDNA do każdej studzienki mieszanki głównej do końcowej objętości 22 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na studzienkę i uszczelnić płytkę jednorazowym uszczelniaczem do płytek PCR. Następnie wiruj płytkę przez 15 do 30 sekund w wirówce przez 10 do 15 sekund, aby zebrać zawartość dołka na dnie płytki.

Aby automatycznie generować kropelki, na ekranie dotykowym automatycznego generatora kropel kliknij konfiguruj płytkę próbki i wybierz kolumny, w których znajdują się próbki na płytce próbki. Kliknij OK i otwórz drzwiczki automatycznego generatora kropel. Załaduj płytki do generowania próbki i kropel oraz inne materiały niezbędne do eksperymentu w odpowiednie miejsca w przyrządzie i zamknij drzwiczki.

Gdy ekran dotykowy zmieni kolor na zielony, wskazując, że wszystkie materiały zostały załadowane we właściwe pozycje, wybierz olej do sond i rozpocznij generowanie kropel. Poczekaj, aż generowanie kropli zostanie zakończone zgodnie z czasem wskazanym na ekranie. Gdy na ekranie pojawi się informacja, że kropelki są gotowe, otwórz drzwiczki, aby wyjąć płytkę zawierającą kropelki i użyj zgrzewarki do płytek przez pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza, aby uszczelnić płytkę za pomocą przebijalnej uszczelki foliowej.

W ciągu 30 minut od wytworzenia się kropli umieść szczelną płytkę kropli w termocyklerze o głębokości 96. Ustaw objętość próbki na 40 mikrolitrów, a temperaturę pokrywki na 105 stopni Celsjusza. Następnie PCR amplifikuje kropelki.

W celu odczytu kropelk, po amplifikacji, przenieś 96-dołkową płytkę z cyklami termicznymi do czytnika kropel i otwórz dołączone oprogramowanie na komputerze podłączonym do czytnika kropel. W trybie instalacji wybierz Nowy i kliknij dwukrotnie dowolny dołek, aby otworzyć okno dialogowe edytora studni. Wybierz dołki do odczytania i ustaw eksperyment na bezwzględną kwantyfikację, supermix na kropelkowy cyfrowy supermiks PCR dla sond.

Kieruj jeden typ na nieznany kanał 1 i cel dwa typu na nieznany kanał 2. Przypisz nazwy próbek na podstawie układu blachy, a następnie kliknij przycisk Zastosuj i OK. Po zapisaniu szablonu kliknij przycisk Uruchom.

Po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie wybierz kolor FAM/HEX. Po zakończeniu zbierania danych wyjmij płytkę z czytnika. Przed analizą danych sprawdź dane ze wszystkich studzienek, aby uzyskać całkowitą liczbę kropel.

I ustaw granicę, aby zaakceptować minimalną liczbę kropel, które mają być liczone jako wyniki dodatnie lub negatywne. W przypadku analizy jednostronnej i dwustronnej kliknij dwukrotnie plik QLP, który ma zostać przeanalizowany, i wybierz opcję Analizuj. Użyj narzędzi do amplitudy 1D i progu amplitudy 2D, aby rozróżnić dodatnie i ujemne krople dla każdej studzienki we właściwym kanale, używając jako przewodnika kontroli szablonu węzła i próbek kontroli dodatniej.

Następnie wyeksportuj wyniki jako plik CSV w celu dodatkowej analizy. W przypadku testu mieszania z sondą triplex otwórz plik QLP i wybierz dołki do analizy w zakładce edytora płyt. Ustaw typ eksperymentu na bezpośrednią kwantyfikację i test na sondę mieszania potrójnego, a następnie wprowadź nazwę docelową.

Następnie kliknij przycisk Zastosuj. Użyj narzędzi wykresu, aby przypisać określone kolory do różnych klastrów docelowych zgodnie z sugestiami wyskakującymi okien okna wybierz w celu przypisania. Po przypisaniu wszystkich kolorów docelowych dane kwantyfikacji zostaną wyświetlone w oknie danych odwiertu.

Wyeksportuj dane jako plik CSV do dalszej analizy. W przypadku testu kwadrupleksowego ustaw typ eksperymentu na bezpośrednią kwantyfikację, a test na multipleks amplitudy. Wprowadź nazwę obiektu docelowego i kliknij przycisk Zastosuj.

Użyj narzędzi wykresu, aby przypisać określone kolory do różnych klastrów docelowych zgodnie z sugestiami wyskakującymi okien okna wybierz w celu przypisania. Po przypisaniu wszystkich kolorów docelowych dane kwantyfikacji zostaną wyświetlone w oknie danych odwiertu. Wyeksportuj dane jako plik CSV w celu dodatkowej analizy.

Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie gradientu temperatury, wyższe temperatury klęczenia nie były w stanie wyraźnie odróżnić kropel dodatnich od ujemnych, gdy przeprowadzono test dupleksowy. Jednak wraz ze spadkiem temperatury klęczącej osiągnięto optymalną separację między kroplami dodatnimi i ujemnymi. Za pomocą dwukolorowego cyfrowego systemu detekcji PCR RT z kroplami możliwe jest wykrycie jednego, dwóch, trzech i czterech celów SARS-CoV-2 w jednej próbce.

Próbka kontrolna bez matrycy może być użyta do zlokalizowania ujemnych kropel, aby pomóc w ustaleniu ujemnego progu w testach sympleksowych. W testach dupleksowych analiza może być wykonywana w pojedynczych kanałach lub w amplitudzie 2D. Chociaż analiza danych testów multipleksowych wyższego rzędu nie jest prosta, testy te są przydatne, ponieważ umożliwiają ocenę do ośmiu klastrów kropel w testach mieszanych z sondą triplex i do 16 klastrów kropel w testach opartych na amplitudzie poczwórnej.

W zależności od testu, który ma zostać opracowany, upewnij się, że do mieszanki głównej dodano prawidłowe docelowe stężenia startera i sondy. Korzystając z tej procedury, można zmieniać cele, aby opracować nowatorskie testy RT-ddPCR. Testy te mogą być wykorzystywane do różnych celów badawczych lub do diagnozowania pojawiających się chorób zakaźnych.

Od czasu jej opracowania technika ta jest stosowana do dokładnego oznaczania kopii wirusowych kwasów nukleinowych w różnych standardach, ludzkim ciele i próbkach środowiskowych.