Name: Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj protokoły dwuetapowej cyfrowej PCR z kroplami do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2. Metoda umożliwia jednoczesną detekcję do czterech genów wirusa bez krzywych kalibracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane przez Megaproject of Infectious Disease Control z Ministerstwa Zdrowia Chin, numer grantu 2017ZX10302301-005 oraz Sino-Africa Joint Research Center, grant numer SAJC201605.

<ol><li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world%5BTitle%5D)+AND+%22Tuberculosis%22%5BJournal%5D)">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li>
<li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+hits+its+stride%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+a+technology+review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors%22%5BJournal%5D)">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), Basel, Switzerland. 1271(2018).</li>
<li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236(1999).</li>
<li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621(2017).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer%2Fprobe+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li>
<li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ddPCR%3A+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+%26+Infections%22%5BJournal%5D)">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li>
<li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+The+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370(2020).</li>
<li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li>
<li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis%5BTitle%5D)+AND+%22Life%22%5BJournal%5D)">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302(2020).</li>
<li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Preprints%22%5BJournal%5D)">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li>
<li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li>
<li>Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451(2016).</li>
<li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701(2020).</li>
<li>VDC Institute. Specific primers and probes for detection 2019 novel coronavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html">http://www.chinaivdc.cn/kyjz/202001/t20200121_211337.html</a> (2020).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis%2C+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge%5BTitle%5D)+AND+%22medRxiv%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li>
<li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów do ujawnienia.

Dostępnych jest niewiele zasobów na temat opracowywania testów RT-ddPCR do wykrywania SARS-CoV-2. Chociaż nie są one używane w tym artykule, standardowe próbki ze znanymi kopiami mogą być wykorzystywane do opracowywania i optymalizacji testów. Jednak w tej pracy próbki SARS-CoV-2 wyhodowane w komórkach Vero-E6 zostały wzbogacone w tło ludzkiego genomowego RNA i wykorzystane jako próbki standardowe do opracowania testów. Właściwe sekwencje starterów i sond są niezbędne podczas opracowywania testów. Ponieważ większość wstę...

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), dobrze znana technika, przeszła kilka transformacji od czasu jej pojawienia się, stając się potężną techniką zdolną do dostarczania odpowiedzi na badania nad kwasami nukleinowymi. Przemiany te były ciągłym ulepszaniem starej techniki. Transformacje te można podsumować w trzech generacjach1. Pierwsza generacja to konwencjonalny PCR, który opiera się na elektroforezie żelowej w celu ilościowego określenia i wykrycia amplifikowanych celów. Druga generacja to ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR), który może wykrywać próbki w czasie rzeczywistym i opierać się na krzywej standardowej w celu bezpośredniego ilościowego określenia celów w próbce. Trzecia generacja, cyfrowy PCR (dPCR), może wykonywać zarówno wykrywanie, jak i bezwzględną kwantyfikację celów kwasów nukleinowych bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej. dPCR został również ulepszony dzięki temu, że komory reakcyjne są rozdzielane przez studzienki ściany na emulsje oleju, wody i stabilizujących chemikaliów w tej samej studzience, jak to widać w cyfrowym PCR2. W cyfrowym PCR kropelkowym (ddPCR) próbka jest dzielona na tysiące kropelek o rozmiarach nanolitrów zawierających indywidualne cele, które później zostaną określone ilościowo za pomocą statystyk Poissona2,3,4. Technika ta daje ddPCR przewagę w ilościowym określaniu celów o niskiej liczebności w porównaniu z innymi generacjami PCR.
Ostatnio, wiele aplikacji podkreśliło wyższość ddPCR nad powszechnie używanym qPCR przy wykrywaniu i ilościowym określaniu celów o niskiej liczebności1,5,6. SARS-CoV-2 nie jest wyjątkiem od tych zastosowań7,8,9,10,11,12. Od wybuchu epidemii SARS-CoV-2 naukowcy pracują na wszystkich frontach, aby znaleźć rozwiązania w zakresie diagnozowania wirusa i skutecznego jego wykrywania. Obecnym standardem złota nadal pozostaje qPCR13. Wykazano jednak, że RT-ddPCR jest dokładniejszy w wykrywaniu celów SARS-CoV-2 o niskiej liczebności zarówno w próbkach środowiskowych, jak i klinicznych w porównaniu z RT-qPCR7,8,9,10,11,12. Większość opublikowanych prac ddPCR SARS-CoV-2 opiera się na testach sympleksowych, przy czym testy multipleksowe zależą od testów komercyjnych. W związku z tym należy zrobić więcej, aby wyjaśnić, jak opracowywać multipleksowe testy RT-dPCR do wykrywania SARS-CoV-2.
W prawidłowym projekcie testu, multipleksowanie może być użyte do zaoszczędzenia kosztów, zwiększenia przepustowości próbki i maksymalizacji liczby celów, które mogą być wykryte z czułością w małej próbce. Podczas multipleksowania za pomocą ddPCR należy wziąć pod uwagę, ile fluoroforów można wykryć w danym systemie. Niektóre platformy ddPCR mogą obsługiwać do trzech kanałów, podczas gdy inne obsługują tylko dwa kanały. W związku z tym, gdy multipleksujesz z dwoma kanałami, należy użyć różnych podejść, w tym multipleksowania wyższego rzędu, aby wykryć więcej niż dwa cele14,15,16. W tej pracy wykorzystano dwukolorowy system wykrywania ddPCR, aby pokazać kroki, jak opracować różne testy SARS-CoV-2 RT-ddPCR, które można dostosować do różnych zastosowań badawczych.

<table><tbody><tr><td>32-kanałowy, w pełni automatyczny ekstraktor kwasów nukleinowych Oczyszczacz 32</td><td>Genfine Biotech</td><td>FHT101-32</td><td>Automatyczny ekstraktor do RNA</td></tr><tr><td>AutoDG Olej do sond</td><td>BioRad</td><td>12003017</td><td>QX200 AutoDG Materiały eksploatacyjne</td></tr><tr><td>ddPCR 96-dołkowe BioRad</td><td></td><td>12003185</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix do sond (bez dUTP)</td><td>BioRad</td><td>1863024</td><td>Wytwarzanie mastermixu do testów ddPCR</td></tr><tr><td>Wkłady DG32 AutoDG BioRad</td><td></td><td>1864108</td><td>QX200 Materiały eksploatacyjne AutoDG</td></tr><tr><td>Elektroniczny termostatyczny garnek do kąpieli wodnej</td><td>Pekin Changfeng Instrument and Meter Company</td><td>XMTD-8000</td><td>Inaktywacja termiczna próbek</td></tr><tr><td>FineMag Rapid Bead Virus Zestaw do ekstrakcji DNA/RNA</td><td>Genfine Biotech</td><td>FMY502T5</td><td>Magnetyczna ekstrakcja kulkowa inaktywowanych próbek RNA</td></tr><tr><td>Zgrzewy termiczne z folii przebijalnej</td><td>Końcówki</td> do pipet BioRad <td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>do AutoDG</td> Materiały eksploatacyjne <td>BioRad</td><td>1864120</td><td>QX200 AutoDG</td></tr><tr><td>Pojemniki na odpady do AutoDG</td> Materiały eksploatacyjne <td>BioRad</td><td></td><td>1864125 QX200 AutoDG</td></tr><tr><td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td><td>TaKaRa</td><td>RR036A</td><td>Zgrzewarka do płytek PCR generacji</td></tr><tr><td>PX1</td><td>BioRad</td><td>1814000</td><td>Uszczelnij płytkę kropelkową od AutoDG</td></tr><tr><td>QuantaSoft 1.7 Oprogramowanie</td><td>BioRad</td><td>10026368</td><td>Akwizycja i analiza danych</td></tr><tr><td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td><td>BioRad</td><td>N/A Analiza</td><td>danych</td></tr><tr><td>QX200 Automatyczny gererator kropelkowy QX200 (AutoDG)</td><td>BioRad</td><td>1864101</td><td>QX200 Materiał eksploatacyjny AutoDG</td></tr><tr><td>Czytnik kropel</td><td>BioRad</td><td>1864003</td><td>Odczyt kropel i akwizycja danych</td></tr><tr><td>T100 Termocykler</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Amplifikacja docelowa kropelki (PCR) i generowanie cDNA</td></tr></tbody></table>

dwuetapowe cyfrowe protokoły pcr z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji sars-cov-2

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diagnoza trwającej pandemii SARS-CoV-2 jest priorytetem dla wszystkich krajów na całym świecie. Obecnie ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją (RT-qPCR) jest złotym standardem w diagnostyce SARS-CoV-2, ponieważ nie jest dostępne żadne trwałe rozwiązanie. Niezależnie od tego, jak skuteczna może być ta technika, pojawiły się badania pokazujące jej ograniczenia w wykrywaniu i diagnozowaniu, zwłaszcza jeśli chodzi o cele o niskiej liczebności. Wykazano natomiast, że kropelkowy cyfrowy PCR (ddPCR), niedawno pojawiająca się technologia o większej przewadze nad qPCR, pokonuje wyzwania związane z RT-qPCR w diagnostyce SARS-CoV-2 z mało obfitych próbek docelowych. Perspektywicznie, w tym artykule, możliwości RT-ddPCR są dalej rozszerzane, pokazując kroki, jak opracowywać testy simplex, duplex, triplex probe mix i quadruplex przy użyciu dwukolorowego systemu detekcji. Wykazano, że przy użyciu starterów i sond ukierunkowanych na określone miejsca genomu SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 i RBD2) możliwe jest opracowanie tych testów. Dodatkowo krok po kroku dostarczane są szczegółowe protokoły, notatki i sugestie, jak usprawnić przepływ pracy testów i analizować dane. Dostosowanie tego przepływu pracy w przyszłych pracach zapewni, że maksymalna liczba obiektów będzie mogła być wykrywana z czułością w małej próbce, co znacznie poprawi koszty i przepustowość próbki.

W badaniu koncepcyjnym skuteczność analityczna testów wieloparametrowych została przebadana na próbkach klinicznych i badawczych19. Wydajność testów wieloparametrowych była lepsza niż testu RT-PCR19. Ponieważ niska liczba kropelek może wskazywać na problem podczas generowania kropelek, w niniejszym artykule ustalono próg wynoszący 10 000 kropelek na dołek, na podstawie danych empirycznych.
Dobra separacja kropelek dodatnich i ujemnych przy minima...

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Protokoły te można wykorzystać do opracowania wewnętrznych multipleksowych testów ddPCR do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Jest to przydatne dla osób, które chcą opracować własne zestawy do wykrywania SARS-CoV-2 i innych patogenów. W porównaniu ze złotym standardem RT-QPCR, RT-DDPCR może być stosowany do ilościowego oznaczania wielu genów SARS-CoV-2 bez konieczności stosowania krzywej wzorcowej.Ponieważ ddPCR jest nową techniką, demonstracja wizualna jest ważna, aby pomóc obecnym i przyszłym użytkownikom zrozumieć i łatwo opracować testy multipleksowe do wykrywania SARS-CoV-2 i innych patogenów. W celu syntezy cDNA dodaj dwa mikrolitry 5-krotnej mieszanki głównej z odwrotną transkrypcją, pięć mikrolitrów interesującej próbki RNA i trzy mikrolitry podwójnie destylowanej wody bez RNaz do 100 lub 200 mikrolitrowej probówki PCR do końcowej objętości 10 mikrolitrów jako roztwór i umieść probówkę na lodzie. Po dodaniu odczynników załaduj próbkę do termocyklera i ustaw przyrząd tak, aby uruchamiał odwrotną transkrypcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut, inaktywację termiczną odwrotnej transkrypcji przez 5 sekund w temperaturze 85 stopni Celsjusza i końcowe nieskończone zatrzymanie w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przed wykonaniem kropelkowego cyfrowego PCR dodaj 19,8 mikrolitra świeżo przygotowanej mieszanki wzorcowej do odpowiedniej liczby dołków 96-dołkowej płytki cyfrowej PCR bez nukleaz. Dodać 2,2 mikrolitra cDNA do każdej studzienki mieszanki głównej do końcowej objętości 22 mikrolitrów mieszaniny reakcyjnej na studzienkę i uszczelnić płytkę jednorazowym uszczelniaczem do płytek PCR. Następnie wiruj płytkę przez 15 do 30 sekund w wirówce przez 10 do 15 sekund, aby zebrać zawartość dołka na dnie płytki.Aby automatycznie generować kropelki, na ekranie dotykowym automatycznego generatora kropel kliknij konfiguruj płytkę próbki i wybierz kolumny, w których znajdują się próbki na płytce próbki. Kliknij OK i otwórz drzwiczki automatycznego generatora kropel. Załaduj płytki do generowania próbki i kropel oraz inne materiały niezbędne do eksperymentu w odpowiednie miejsca w przyrządzie i zamknij drzwiczki.Gdy ekran dotykowy zmieni kolor na zielony, wskazując, że wszystkie materiały zostały załadowane we właściwe pozycje, wybierz olej do sond i rozpocznij generowanie kropel. Poczekaj, aż generowanie kropli zostanie zakończone zgodnie z czasem wskazanym na ekranie. Gdy na ekranie pojawi się informacja, że kropelki są gotowe, otwórz drzwiczki, aby wyjąć płytkę zawierającą kropelki i użyj zgrzewarki do płytek przez pięć sekund w temperaturze 180 stopni Celsjusza, aby uszczelnić płytkę za pomocą przebijalnej uszczelki foliowej.W ciągu 30 minut od wytworzenia się kropli umieść szczelną płytkę kropli w termocyklerze o głębokości 96. Ustaw objętość próbki na 40 mikrolitrów, a temperaturę pokrywki na 105 stopni Celsjusza. Następnie PCR amplifikuje kropelki.W celu odczytu kropelk, po amplifikacji, przenieś 96-dołkową płytkę z cyklami termicznymi do czytnika kropel i otwórz dołączone oprogramowanie na komputerze podłączonym do czytnika kropel. W trybie instalacji wybierz Nowy i kliknij dwukrotnie dowolny dołek, aby otworzyć okno dialogowe edytora studni. Wybierz dołki do odczytania i ustaw eksperyment na bezwzględną kwantyfikację, supermix na kropelkowy cyfrowy supermiks PCR dla sond.Kieruj jeden typ na nieznany kanał 1 i cel dwa typu na nieznany kanał 2. Przypisz nazwy próbek na podstawie układu blachy, a następnie kliknij przycisk Zastosuj i OK. Po zapisaniu szablonu kliknij przycisk Uruchom.Po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie wybierz kolor FAM/HEX. Po zakończeniu zbierania danych wyjmij płytkę z czytnika. Przed analizą danych sprawdź dane ze wszystkich studzienek, aby uzyskać całkowitą liczbę kropel.I ustaw granicę, aby zaakceptować minimalną liczbę kropel, które mają być liczone jako wyniki dodatnie lub negatywne. W przypadku analizy jednostronnej i dwustronnej kliknij dwukrotnie plik QLP, który ma zostać przeanalizowany, i wybierz opcję Analizuj. Użyj narzędzi do amplitudy 1D i progu amplitudy 2D, aby rozróżnić dodatnie i ujemne krople dla każdej studzienki we właściwym kanale, używając jako przewodnika kontroli szablonu węzła i próbek kontroli dodatniej.Następnie wyeksportuj wyniki jako plik CSV w celu dodatkowej analizy. W przypadku testu mieszania z sondą triplex otwórz plik QLP i wybierz dołki do analizy w zakładce edytora płyt. Ustaw typ eksperymentu na bezpośrednią kwantyfikację i test na sondę mieszania potrójnego, a następnie wprowadź nazwę docelową.Następnie kliknij przycisk Zastosuj. Użyj narzędzi wykresu, aby przypisać określone kolory do różnych klastrów docelowych zgodnie z sugestiami wyskakującymi okien okna wybierz w celu przypisania. Po przypisaniu wszystkich kolorów docelowych dane kwantyfikacji zostaną wyświetlone w oknie danych odwiertu.Wyeksportuj dane jako plik CSV do dalszej analizy. W przypadku testu kwadrupleksowego ustaw typ eksperymentu na bezpośrednią kwantyfikację, a test na multipleks amplitudy. Wprowadź nazwę obiektu docelowego i kliknij przycisk Zastosuj.Użyj narzędzi wykresu, aby przypisać określone kolory do różnych klastrów docelowych zgodnie z sugestiami wyskakującymi okien okna wybierz w celu przypisania. Po przypisaniu wszystkich kolorów docelowych dane kwantyfikacji zostaną wyświetlone w oknie danych odwiertu. Wyeksportuj dane jako plik CSV w celu dodatkowej analizy.Jak zaobserwowano w tej reprezentatywnej analizie gradientu temperatury, wyższe temperatury klęczenia nie były w stanie wyraźnie odróżnić kropel dodatnich od ujemnych, gdy przeprowadzono test dupleksowy. Jednak wraz ze spadkiem temperatury klęczącej osiągnięto optymalną separację między kroplami dodatnimi i ujemnymi. Za pomocą dwukolorowego cyfrowego systemu detekcji PCR RT z kroplami możliwe jest wykrycie jednego, dwóch, trzech i czterech celów SARS-CoV-2 w jednej próbce.Próbka kontrolna bez matrycy może być użyta do zlokalizowania ujemnych kropel, aby pomóc w ustaleniu ujemnego progu w testach sympleksowych. W testach dupleksowych analiza może być wykonywana w pojedynczych kanałach lub w amplitudzie 2D. Chociaż analiza danych testów multipleksowych wyższego rzędu nie jest prosta, testy te są przydatne, ponieważ umożliwiają ocenę do ośmiu klastrów kropel w testach mieszanych z sondą triplex i do 16 klastrów kropel w testach opartych na amplitudzie poczwórnej.W zależności od testu, który ma zostać opracowany, upewnij się, że do mieszanki głównej dodano prawidłowe docelowe stężenia startera i sondy. Korzystając z tej procedury, można zmieniać cele, aby opracować nowatorskie testy RT-ddPCR. Testy te mogą być wykorzystywane do różnych celów badawczych lub do diagnozowania pojawiających się chorób zakaźnych.Od czasu jej opracowania technika ta jest stosowana do dokładnego oznaczania kopii wirusowych kwasów nukleinowych w różnych standardach, ludzkim ciele i próbkach środowiskowych.

two-step-reverse-transcription-droplet-digital-pcr-protocols-for-sars

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film demonstruje ilościową metodę wykrywania infekcji wirusowej za pomocą PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Krok odwrotnej transkrypcji przekształca RNA w cDNA, które jest następnie amplifikowane w cyklach PCR. Obecność wirusowego RNA w próbce potwierdza się analizując krzywe amplifikacji i dysocjacji DNA uzyskane z PCR.

Ilościowy PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym do diagnozowania infekcji wirusowych

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Ten protokół opisuje szczegółową metodę cyfrowego kropelkowego PCR (dd-PCR) do precyzyjnej kwantyfikacji kolistych poziomów RNA (circRNA) w komórkach przy użyciu rozbieżnych starterów.

Kwantyfikacja kolistych RNA za pomocą cyfrowego PCR kropelkowego

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

Precyzyjna kwantyfikacja kopii genomu wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) jest kluczowa, ale standardowy protokół nie został jeszcze ustalony. Protokół ten opisuje zwalidowaną metodę przygotowania oczyszczonych próbek AAV i przeprowadzenia cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej (dd_PCR) w celu wiarygodnego ilościowego określenia miana genomu wirusa.

Kwantyfikacja genomów wirusów związanych z adenowirusami w oczyszczonych próbkach wektorów za pomocą cyfrowej reakcji łańcuchowej polimerazy kropelkowej

Opisano niedrogą, wysokoprzepustową metodę jednoczesnego wykrywania do 43 celów molekularnych. Zastosowania mPCR/RLB obejmują typowanie mikrobiologiczne oraz wykrywanie wielu patogenów w próbkach klinicznych.

Wielokrotna reakcja łańcuchowa polimerazy i analiza hybrydyzacji w układzie reverse line blot (mPCR/RLB)

Zestaw do wykrywania Mycoplasma metodą PCR LookOut wykorzystuje reakcję polimerazy łańcuchowej (PCR), która jest uznawana za metodę z wyboru zapewniającą najwyższą czułość w wykrywaniu zanieczyszczeń Mycoplasma, Acholeplasma i Ureaplasma w hodowlach komórkowych oraz innych produktach biologicznych pochodzenia komórkowego.

Zoptymalizowana detekcja Mycoplasma metodą PCR

Poznaj protokoły dwuetapowej cyfrowej PCR z kroplami do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2. Metoda umożliwia jednoczesną detekcję do czterech genów wirusa bez krzywych kalibracyjnych.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Przeglądaj więcej filmów