Ukierunkowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych
21 kwietnia 2021
Korzystając z metody samoorganizacji, opracowujemy protokół z dodatkiem COCO, który może znacznie zwiększyć generowanie fotoreceptorów.
Jest to model choroby siatkówki i naśladuje siatkówkę in vivo. Do pewnego stopnia może zastąpić eksperymenty na zwierzętach. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem jakości i ilości prekursorów fotoreceptorów w organoidach siatkówki, a fotoreceptor jest kluczem do kilku nieodwracalnych stanów ślepoty.
Zacznij od hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub hESC w warunkach wolnych od karmienia. W tym celu należy pokryć jedną studzienkę płytki sześciodołkowej jednym mililitrem 100 mikrogramów na mililitr odczynnika A i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej pół godziny. Rozmrozić porcję miliona komórek macierzystych i odwirować ją przy 200 xg przez pięć minut.
Po usunięciu supernatantu należy zasiać komórki na wcześniej pokrytej płytce wraz z dwoma mililitrami odczynnika B.Przejdź komórki po osiągnięciu około 80% zbiegu po około czterech dniach. Po osiągnięciu zbiegu umyj komórki wstępnie podgrzanym DPBS i przenieś je do 500 mikrolitrów świeżo przygotowanego odczynnika. Następnie inkubuj komórki przez 3,5 minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla.
Odłącz komórki, przesuwając bok i spód płytki przez kilka sekund, a następnie dodaj 500 mikrolitrów przygotowanej płytki. Zbierz odłączone komórki do nowej probówki o pojemności 1,5 mililitra i pipetuj zawiesinę komórek w górę iw dół. Do liczenia komórek dodaj 100 mikrolitrów zawiesiny komórek do 900 mikrolitrów DPBS.
Rozcieńczyć 900 mikrolitrów pozostałej zawiesiny komórek pożywką na szalce Petriego, aby uzyskać dziewięć razy od 10 do czwartej komórki mocy na mililitr. Dodaj 100 mikrolitrów rozcieńczonej zawiesiny komórkowej do każdego dołka nieprzylegającej, 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery V. Lekko odwiruj płytkę na wytrząsarce wolnoobrotowej przez pięć minut i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do drugiego dnia.
Drugiego dnia dodaj 20 mikrolitrów 1% odczynnika A do każdej studzienki 96-dołkowej płytki i pipetuj dwa razy w środku, aby rozproszyć martwe komórki. Oczyść spód płytki przed inkubacją w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do szóstego dnia. Szóstego dnia zastąp 58 mikrolitrów pożywki 60 mikrolitrami świeżej pożywki i kontynuuj inkubację.
W dniu 12 zbierz granulki komórkowe z 96-dołkowej płytki w stożkowej probówce o pojemności 15 mililitrów i pozwól granulkom naturalnie osiąść przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Gdy osady opadną, usuń supernatant bez naruszania organoidów i przenieś agregaty komórkowe do 10-centymetrowego naczynia zawiesinowego zawierającego 18 mililitrów pożywki dwa z odczynnikiem A. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla do 18 dnia. W dniu 18 potwierdź wytworzenie się półprzezroczystego pęcherzyka wzrokowego w naczyniu i przetnij wygenerowane organoidy za pomocą noża mikrochirurgicznego.
Zbierz wszystkie pokrojone granulki do środka naczynia. Następnie zbierz komórki do 15-mililitrowej stożkowej rurki Falcon. Gdy komórki opadną, delikatnie usuń supernatant i ponownie zawieś granulki na dwóch 10-centymetrowych szalkach Petriego z 18 mililitrami pożywki, po trzy na szalkę.
Delikatnie przenieś szalki do inkubatora, aby uniknąć agregacji komórek. Kontynuuj hodowlę komórek, zmieniając pożywkę co tydzień. Przeanalizuj wyrażenie CRX po 45 dniu do 120 dnia.
W tej reprezentatywnej analizie przedstawiono różne etapy powstawania siatkówki u człowieka. Szóstego dnia organoidy pojawiły się jako skupisko gęstych połączeń wewnątrz jasnej obręczy o średnicy około 600 mikrometrów. W 12 dniu miało miejsce początkowe wytworzenie struktur przypominających pęcherzyki wzrokowe.
Organoidy bez odpowiedniej struktury pęcherzykowej zostały odrzucone przed wyhodowaniem na szalce Petriego w 18 dniu. Do 30 dnia hodowli architektura przypominająca pęcherzyki była bardziej oczywista, a gorsze RO można było łatwo odróżnić i usunąć. Począwszy od 45 dnia, organoidy wyrażały różne markery prekursorów fotoreceptorów, takich jak CRX, RCVRN i OTX2.
Poprzez rozszczepienie nadrzędnych organoidów siatkówki znacznie poprawia się wydajność różnicowania i można pobrać ponad 100 doskonałych organoidów z 96 płytek.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół generowania trójwymiarowych ludzkich organoidów siatkówki (RO) z pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSCs). Metoda ta zwiększa wydajność różnicowania prekursorów fotoreceptorów, zapewniając niezawodną platformę do modelowania chorób siatkówki, przesiewu leków oraz potencjalnych terapii przeszczepowych komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórek macierzystych
- Modelowanie chorób siatkówki
- Transplantacja komórek
Wprowadzenie
- Przeszczepianie komórek siatkówki daje nadzieję na przywrócenie wzroku w przypadku zdegenerowanych siatkówek.
- Obecne wyzwania obejmują pozyskiwanie wysokiej jakości, standaryzowanych ludzkich siatkówek do celów badawczych i terapeutycznych.
- Modele zwierzęce mają ograniczenia w odtwarzaniu architektury ludzkiej siatkówki oraz przebiegu chorób.
- W celu rozwoju badań i zastosowań terapeutycznych niezbędne są wydajne protokoły generowania organoidów siatkówki z PSC.
Cel badania
- Opracowanie stabilnego i wydajnego protokołu produkcji ludzkich organoidów siatkówki z PSCs.
- Optymalizacja wydajności i jakości prekursorów fotoreceptorów w obrębie tych organoidów.
- Zapewnienie skalowalnego systemu odpowiedniego do modelowania chorób, przesiewania leków oraz transplantacji.
Zastosowane metody
- Hodowla ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez użycia komórek karmicieli, z wykorzystaniem odczynnika A do powlekania i odczynnika B do pożywki.
- Wysiewanie i agregowanie komórek w nieprzylegających płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery V w celu promowania tworzenia organoidów.
- Sekwencyjne zmiany pożywki i ręczne wycinanie organoidów w celu selekcji struktur o najlepszej budowie pęcherzykowej.
- Długoterminowa hodowla z cotygodniową wymianą pożywki oraz analiza ekspresji markerów fotoreceptorów (np. CRX, RCVRN, OTX2) od 45. do 120. dnia.
- Zastosowanie cząsteczek egzogennych, w tym COCO, w celu zwiększenia wydajności różnicowania fotoreceptorów.
Główne wyniki
- Efektywne generowanie organoidów siatkówki wykazujących kluczowe etapy rozwoju siatkówki, w tym struktury przypominające pęcherzyk optyczny.
- Najlepszej jakości organoidy wykazują ekspresję specyficznych markerów prekursorów fotoreceptorów od 45. dnia.
- Ręczna selekcja i wycinanie poprawiają jakość oraz wydajność uzyskiwania organoidów bogatych w fotoreceptory.
- Z płytek 96-dołkowych można pozyskać ponad 100 wysokiej jakości organoidów.
Wnioski
- Zoptymalizowany protokół pozwala na niezawodną hodowlę ludzkich organoidów siatkówki o wysokiej zawartości prekursorów fotoreceptorów.
- System ten stanowi skalowalną, biorelewantną platformę do badań nad chorobami siatkówki oraz rozwoju terapii.
- Organoidy siatkówki pochodzące z PSC mogą potencjalnie ograniczyć zależność od modeli zwierzęcych oraz rozwiązać problemy z pozyskiwaniem pierwotnej ludzkiej tkanki siatkówki.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kierowana indukcja organoidów siatkówki z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych odpowiada na krytyczną potrzebę stworzenia standaryzowanych, skalowalnych i biorelewantnych modeli tkanki siatkówki w modelowaniu chorób oraz we wczesnych etapach odkrywania leków. Platforma ta umożliwia predykcyjną ocenę biologii siatkówki, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka i walidację celów dla terapii skierowanych przeciwko degeneracji fotoreceptorów. Powtarzalność i skalowalność protokołu sprawiają, że stanowi on strategiczny zasób dla badań translacyjnych oraz rozwoju etapu przedklinicznego.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów chorób siatkówki w systemie istotnym dla człowieka.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów specyficznych dla fotoreceptorów z wykorzystaniem odczytów z organoidów.
- Ułatwia mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez modelowanie istotnych dla choroby szlaków in vitro.
- Zapewnia odnawialne źródło standaryzowanej tkanki siatkówki do badań opartych na hipotezach.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Dostarcza zwalidowane systemy organoidowe do ilościowej oceny wpływu związków na różnicowanie fotoreceptorów.
- Umożliwia powtarzalne i skalowalne przygotowanie organoidów siatkówki dla przepływów pracy w ramach wysokoprzepustowych badań przesiewowych (high-content screening).
- Wspiera standaryzację testów poprzez selekcję najlepszych organoidów na podstawie markerów.
- Zwiększa niezawodność badań przesiewowych poprzez minimalizację zmienności związanej z pozyskiwaniem tkanek pierwotnych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zgadza się z fenotypami istotnymi dla danej choroby w celu odkrywania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od wczesnej fazy odkryć do walidacji przedklinicznej w modelach degeneracji siatkówki.
- Zmniejsza zależność od modeli zwierzęcych, oferując specyficzną dla człowieka platformę do badań nad skutecznością i toksycznością.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne dane pochodzące z organoidów.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Niniejszy protokół wpisuje się w kontinuum procesu badawczego, od wczesnego modelowania chorób i walidacji celów terapeutycznych, poprzez opracowywanie testów, aż po badania przedkliniczne, wspierając identyfikację związków wiodących oraz ciągłość translacyjną.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych w kontekście chorób siatkówki.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, zwalidowane markerami organoidy do ilościowej oceny związków.
- Analityka: Umożliwia pomiar ekspresji markerów fotoreceptorów (np. CRX, RCVRN, OTX2) do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Stanowi pomost między fazą odkryć a walidacją przedkliniczną dzięki zastosowaniu ludzkich modeli tkankowych istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną, odnawialną platformę, którą można dostosować do wielu programów badawczych nad siatkówką.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych siatkówki.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje produkcję tkanek siatkówki na potrzeby wykorzystania w wielu programach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i redukuje ryzyko biologiczne na późnych etapach w portfelach projektów dotyczących siatkówki.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację dostosowaną do ryzyka oraz rozwój kandydatów na terapie siatkówki.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pluripotencjalnych komórek macierzystych i różnicowaniu organoidów.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej infrastruktury hodowli komórkowych oraz narzędzi analitycznych do walidacji markerów.
- Wymaga standaryzacji kryteriów selekcji najlepszych organoidów pomiędzy zespołami.
- Może wymagać adaptacji dla konkretnych modeli chorób lub klas związków.
- Zależne od spójnego pozyskiwania i kontroli jakości odczynników oraz linii komórkowych.
