Zastosowanie odcisków palców DNA przy użyciu locus D1S80 w klasach laboratoryjnych

Odciski palców DNA są powszechnym narzędziem w naukach biologicznych i znajdują zastosowanie w testach na ojcostwo, a także w badaniach kryminalistycznych czy filogenetycznych. Protokół ten ma na celu zapewnienie studentom studiów licencjackich podstawowych zasad pobierania odcisków palców DNA na zajęciach laboratoryjnych. Opiera się na ludzkim locus D1S80, zmiennym regionie powtórzeń tandemowych, którego allele mogą różnić się długością u poszczególnych osób.

Ekstrakcja DNA, PCR, elektroforeza żelowa i późniejsza analiza mogą być trudne do wykonania, zwłaszcza jeśli są wykonywane po raz pierwszy. Wizualna demonstracja wszystkich kroków pozwala widzom obserwować ogólną praktykę, szczegóły i środki ostrożności, które należy podjąć podczas wykonywania tego bardzo solidnego protokołu. Aby wyodrębnić DNA z komórek nabłonka błony śluzowej policzka, zacznij od pobrania komórek za pomocą sterylnego wacika z jamy ustnej.

Użyj wacika, aby energicznie wcierać w wewnętrzną stronę policzka przez 30 do 40 sekund. Umieść końcówkę wacika do pobierania w oznaczonej sterylnej probówce do mikrowirówki i oderwij kawałek plastiku, który wystaje poza krawędź, a następnie zamknij probówkę. Podgrzej blok grzewczy do 65 stopni Celsjusza i przygotuj wszystkie wymagane i roztwory.

Dodaj 500 mikrolitrów roztworu lizy do wacika, upewniając się, że próbka jest całkowicie zanurzona w roztworze lizy i wirować próbkę przez co najmniej pięć sekund. Inkubować próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza i od czasu do czasu wirować. Po inkubacji wyjmij wacik, dociskając go do ścianki probówki, aby uzyskać maksymalną objętość próbki.

Dodaj 100 mikrolitrów buforu denaturacyjnego do lizy komórek i dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę, aż pojawi się biały osad. Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie odwirowywać próbkę przez pięć minut w temperaturze 17 950 G. Przenieść 450 mikrolitrów supernatantu do czystej, 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej. Następnie dodaj 450 mikrolitrów iso 2-propanolu i dokładnie wymieszaj, odwracając probówkę, aby wytrącić DNA.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wirować przez pięć minut. Wyrzuć supernatant i odwróć probówkę na czystym ręczniku papierowym i wysusz granulkę. Przemyć DNA 500 mikrolitrami 70% etanolu, odwirować przez chwilę przez minutę i wyrzucić supernatant.

Aby całkowicie wysuszyć osad, należy inkubować próbkę przez pięć minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza w bloku grzewczym. Na koniec dodaj 30 mikrolitrów buforu elucyjnego i inkubuj przez 10 minut w temperaturze 65 stopni Celsjusza, aby dezaktywować system DNA. Przygotuj mieszankę główną, dodając zielony bufor PCR, DNTP, startery, wodę i polimerazę do probówki mikrowirówkowej.

Oznaczyć probówki do PCR numerami próbek i podać 45 mikrolitrów głównej mieszanki PCR do każdej probówki PCR. Następnie dodaj pięć mikrolitrów DNA lub, w celu kontroli bez szablonu, dodaj wodę. Zamknij probówki do PCR i krótko je odwiruj.

Umieść probówki w termocyklerze i uruchom program PCR. Po zakończeniu programu przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszej obróbki. Przygotuj 1,5% żel agarozowy, ważąc 1 1/2 grama proszku agarozy i mieszając go ze 100 mililitrami roztworu buforowego TAE w butelce.

Ostrożnie podgrzej mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej i mieszaj mieszaninę pomiędzy nimi, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Należy pamiętać, że mogą wystąpić opóźnienia w gotowaniu. Po krótkim schłodzeniu mieszanki agarozy dodaj dwa mikrolitry zieleni Pec.

Wlej żel i użyj grzebienia z wystarczającą ilością dołków na próbki. Po całkowitej polimeryzacji żelu agarozowego należy załadować studzienki 10 mikrolitrami każdej z próbek PCR i dodać wzorzec masy cząsteczkowej do dołków bocznych. Uruchom żel pod napięciem 150 V przez około 40 minut.

Aby zobrazować produkty PCR, zobrazuj żel za pomocą światła ultrafioletowego. W celu analizy amplifikowanych alleli D1S80 umieść linijkę obok wzorca masy cząsteczkowej, zaczynając od dołków na zdjęciu żelu fotograficznego. Zmierz odległość dla każdego pasma wzorca masy i zapisz długości w programie do obliczania tabeli.

Następnie określ logarytm każdego rozmiaru fragmentu wzorca masy. Wstaw wykres rozrzutu, używając przekształconych logarytmicznie, standardowych rozmiarów fragmentów i zmierzonych odległości od żelu. Dopasuj linię trendu i wyświetl równanie regresji oraz wartość R-kwadrat.

W nowej tabeli wstaw odległości miar od amplikonów PCR do dołków. Aby określić rozmiar tych amplikonów, użyj równania regresji z regresji liniowej i oblicz antylogarytm, aby uzyskać rozmiary fragmentów w parach zasad z amplikonów. Na koniec przypisz powtarzające się jednostki 16 par zasad do każdego mierzonego amplikonu.

Ekstrakcja DNA i amplifikacja locus D1S80 zakończyła się sukcesem u wszystkich badanych osób, a kontrola bez matrycy na torze 10 nie wykazała żadnych amplikonów. Na podstawie analizy długości fragmentów osobniki zostały sklasyfikowane jako homozygotyczne lub heterozygotyczne z dwoma allelami. Liczba powtórzeń powtórzeń w tandemie była wyraźnie relatywna i może teraz służyć do dalszej analizy.

Tutaj opisujemy prostą i opłacalną metodę wdrażania molekularnego odcisku palca na zajęciach praktycznych na studiach licencjackich. Cała procedura może zostać zakończona w ciągu jednego dnia roboczego i składa się z czterech różnych kroków. W pierwszym kroku przygotowywana jest matryca DNA.

Komórki nabłonka policzków pobiera się przez pobranie wymazu. Wymazy z jamy ustnej są niezawodnym narzędziem zapewniającym wystarczającą ilość i jakość komórek do ekstrakcji DNA. Ponadto w protokole ekstrakcji DNA nie stosuje się rozpuszczalników organicznych, co jest korzystne na studiach laboratoryjnych na poziomie licencjackim.

Krok pierwszy można wykonać w 90 minut lub krócej. W drugim etapie locus D1S80 jest amplifikowany metodą PCR. Przedstawione tu warunki PCR są odporne nawet w przypadku złej jakości matrycy DNA.

Ten krok można wykonać w ciągu 2 1/2 godziny. Produkty PCR są następnie analizowane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Elektroforeza w żelu agarozowym ma wiele zalet w porównaniu z innymi technikami, takimi jak unikanie niebezpiecznych składników i prosta technika przygotowania.

Analizę tę można wykonać w ciągu 90 minut. Po elektroforezie wyniki długości fragmentu można przeanalizować w ciągu 90 minut za pomocą analizy regresji liniowej, wykonanej za pomocą programu do obliczeń tabelarycznych lub za pomocą prostego kalkulatora. Podsumowując, przedstawiona metoda odcisków palców może być wykorzystana w praktyce do nauki stosowania markerów molekularnych i ich zastosowania w naukach biologicznych.