Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Standardowe przygotowanie próbki utrudnia uzyskanie dobrego stosunku sygnału do szumu podczas eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej mikrokryształów. Protokół ten ma na celu ograniczenie źródeł tła powstających kryształów w kontrolowany sposób. Zastosowanie robotyki do zamrażania stempla i siatek cryoTEM zapewnia solidną platformę do wielokrotnego manipulowania mikrokryształami, zmniejszania objętości otaczającej cieczy i zapewnienia szybkiej witryfikacji próbki.

Zręczność potrzebna do obchodzenia się z kratkami jest podobna do tej potrzebnej do tradycyjnego zbierania kryształów. Kolejnym ważnym czynnikiem jest określenie początkowych parametrów blottingu za pomocą roztworu krystalizacyjnego, co jest kluczem do zmniejszenia zużycia próbki. Aby rozpocząć, ustaw i schłodź automatyczną zamrażarkę wgłębną zgodnie z instrukcjami producenta.

Tuż przed użyciem należy rozładować siatki krioTEM jarzeniowo przez 25 sekund prądem o natężeniu 15 miliamperów i ciśnieniem 0,39 milibara, a następnie utrzymać siatki rozładowania jarzeniowego na przykrytej szalce Petriego. Ustaw wilgotność względną w komorze próbki na 90%, a czas blottingu na pięć sekund. Upewnij się, że zamrażarka wgłębna jest ustawiona na automatyczne zanurzanie próbki po zakończeniu osuszania.

Otwórz uszczelkę studni krystalizacyjnej i zbiornika. Szybko dodaj od dwóch do pięciu mikrolitrów roztworu zbiornika w kropli kryształu, aby utrzymać objętość kropli. Przenieś 10 mikrolitrów roztworu zbiornika do probówki o pojemności 0,5 mililitra do późniejszego użycia i ponownie zamknij studzienkę, aby zapobiec wyschnięciu kropli krystalizacji.

Użyj kleszczyków do zamrażania wgłębnego, aby wybrać pojedynczą świecącą siatkę wyładowczą i załadować siatkę do instrumentu stroną z włókna węglowego skierowaną od ramienia bibuły. Obróć kleszcze przytrzymujące siatkę tak, aby strona z włókna węglowego była skierowana w stronę ramienia bibuły. Użyj pipety o pojemności 2,5 mikrolitra, aby nanieść dwa mikrolitry roztworu zbiornika na niepodpartą stronę siatki cryoTEM.

Obróć siatkę stroną z włókna węglowego skierowaną w stronę przeciwną do ramienia bibuły i ostrożnie nałóż płyn ze zbiornika na stronę nośną siatki z folii węglowej. Zainicjuj proces blottingu i obserwuj ciecz pobieraną z powierzchni węgla, aż fala przebijająca się przez powierzchnię siatki będzie widoczna. Jeśli fala trzaskania nie jest widoczna, wydłuż czas osuszania o jedną do dwóch sekund, zanim ramię bibułki wycofa się z siatki.

Umieść płytkę krystalizacyjną pod mikroskopem świetlnym i dobrze ustaw cel w polu view. Umieść świeżą jarzeniową kratkę wyładowczą w zamrażarce wgłębnej i nanieś płyn ze zbiornika na nienośną stronę kratki, jak pokazano wcześniej. Obróć siatkę tak, aby wspornik z folii węglowej był skierowany w stronę portu próbki zamrażarki wgłębnej.

Zdejmij tymczasowe uszczelnienie z płytki krystalizacyjnej i użyj pipety ustawionej na dwa mikrolitry, aby kilkakrotnie delikatnie zassać kroplę krystalizacji. Przenieść dwa mikrolitry zasysanej zawiesiny mikrokrystalicznej do zamrażarki wgłębnej i nanieść całą próbkę na węglową stronę siatki cryoTEM. Zainicjuj blotting i obserwuj falę trzaskania, a następnie natychmiast zainicjuj zamrażanie zanurzeniowe.

Szybko przenieś siatkę z ciekłego etanu do skrzynki siatkowej zanurzonej w ciekłym azocie. Po osuszeniu i zamrożeniu rusztu wgłębnego, wycofaj zanurzoną siatkę z ciekłego etanu, resetując zamrażarkę wgłębną. Wyjmij kleszcze przytrzymujące siatkę z zamrażarki wgłębnej i umieść siatkę pod mikroskopem świetlnym.

Dostosuj precyzyjną ostrość i oceń gęstość kryształów na siatce. Po załadowaniu siatki cryoTEM do SEM wyrównaj próbkę i włącz wiązkę elektronów. Początkowo oceń całą siatkę w 45-krotnym powiększeniu i zapisz obraz, a następnie zwiększ powiększenie, aby dokładniej przyjrzeć się poszczególnym kwadratom siatki, aż poszczególne kryształy będą wyraźnie obserwowane.

Poruszaj się po siatce i rób nieruchome obrazy, upewniając się, że siatki są płaskie, a folia nośna z włókna węglowego jest w dużej mierze nienaruszona. Upewnij się, że wokół kryształu znajduje się wiele monokryształów z wąską aureolą zeszklonej cieczy, a otwory są widoczne w węglowej folii nośnej. Obserwując i rejestrując obrazy siatki, upewnij się, że duże obszary zeszklonej cieczy są nieobecne, sześciokątny lód lub lód powierzchniowy nie jest rozrzucony po siatce oraz że kryształy nie nakładają się na siebie i są równomiernie rozmieszczone na folii nośnej.

W dużym piankowym dewarze schłodzić wymaganą liczbę uchwytów na próbki VMXm załadowanych do wkładu z próbką. Dodać ciekły azot powyżej pozycji próbki w ładowarce próbek. Szybko przenieś skrzynkę siatkową zawierającą siatki mikrokrystaliczne do wgłębienia skrzynki siatkowej w ładowarce próbek i lekko odkręć pokrywę, aby pokrywa była luźna i obracała się.

Podnieś siatkę z pudełka na siatkę i obróć siatkę, aby położyć siatkę płasko na uchwycie próbki. Szybko umieść wstępnie schłodzone narzędzie do pierścieni osadczych nad rusztem w otworze kratki i naciśnij przycisk, aby zainstalować pierścień osadczy. Dodać ciekły azot około 1,5 centymetra powyżej uchwytu próbki.

Użyj kleszczyków do próbek VMXm, aby ostrożnie podnieść załadowany uchwyt na próbkę i umieścić go z powrotem w kartridżu z próbką. Załóż pokrywę wkładu, upewniając się, że kołek na górze wkładu zazębia się z otworem w pokrywie. Skaningowe mikrofotografie elektronowe mikrokryształów przygotowanych na siatkach cryoTEM wykazały minimalne rozproszenie tła.

Siatka była wolna od nadmiaru cieczy i zaobserwowano wąską aureolę cieczy otaczającą kryształy. Wielościenne kryształy obserwowano pojedynczo, jak również w kępach. Nieco większe kryształy insuliny również wykazywały pewne zlepianie się wraz z izolowanymi kryształami.

Bardzo duże mikrokryształy udało się również z powodzeniem zamontować na siatkach cryoTEM. Otwory w węglowej folii nośnej były wyraźnie widoczne, co wskazywało na silne plamy. Wiele próbek wymagało dalszej optymalizacji ze względu na różnice w czasie krzepnięcia i stężeniu mikrokryształów.

Siatki przeładowane kryształami zmniejszają wydajność blottingu, a na jednym obrazie dyfrakcyjnym zarejestrowano wiele sieci. Krótki czas osuszania roztworów krystalizacyjnych o dużej lepkości może skutkować nadmiernie mokrą próbką. W przypadku roztworu krystalizacyjnego o niższej lepkości, krótki czas osuszania powoduje kradzież mikrokryształów po jednej stronie siatek.

Optymalne przygotowanie próbki umożliwia wykorzystanie pełnych możliwości VMXm do zbierania wysokiej jakości danych dyfrakcji rentgenowskiej w najwyższej możliwej rozdzielczości z wysokim stosunkiem sygnału do szumu. Określenie początkowego blottingu roztworu krystalizacyjnego jest kluczem do użycia minimalnej próbki. Jeśli próbka jest bardzo ograniczona, pomiń ocenę gęstości.

Ostatecznie lepiej jest mieć rozcieńczoną próbkę. Próbki te są teraz gotowe do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej na linii badawczej VMXm, dyfrakcji elektronów mikrokrystalicznych lub mielenia skupionej wiązki jonów przed mikro ED.