Name: Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Poznaj uproszczony protokół szybkiego przesiewania synergicznych kombinacji leków skierowanych przeciwko komórkom macierzystym glejaka. Metoda wykorzystuje lucyferazę i bioluminescencję do identyfikacji terapii skojarzonej w glioblastomie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Chińskiej Narodowej Fundacji Nauk Przyrodniczych (81672962), Fundacji Programu Zespołu Innowacji Prowincji Jiangsu oraz Fundacji Wspólnego Projektu Kluczowego Uniwersytetu Południowo-Wschodniego i Uniwersytetu Medycznego w Nankinie za ich wsparcie.

Próbka GBM została pobrana od pacjenta podczas rutynowej operacji po uzyskaniu w pełni świadomej zgody komisji etycznej ds. badań na ludziach Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego Uniwersytetu Medycznego w Nankinie.
1. Izolacja i hodowla GSC pochodzących od pacjentów
<ol>
	<li>Umieść świeżą, chirurgicznie wyciętą tkankę glejaka w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml wypełnionej sterylnym PBS i przechowuj tkankę na lodzie do czasu dalszej operacji.</li>
	<li>Zmiel tkankę GBM na kawałki o średnicy około 0,5 do 1 mm za pomocą nożyczek preparacyjnych i umyj próbki tkanek neuronalnym podłożem podstawnym, aby usunąć resztki komórkowe w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Trawić fragmenty tkanek za pomocą 1 mg/ml kolagenazy A w temperaturze 37 °C przez 30 minut i odwirowywać przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad na ślepym neuronalnym podłożu podstawowym i mechanicznie rozdzielić osad poprzez powtarzalne pipetowanie na lodzie.</li>
	<li>Hodować mieszaninę na 6-dołkowych płytkach hodowlanych o bardzo niskim przyłączu, wypełnionych pożywką hodowlaną GSC (patrz tabela 1 dla receptury) w sterylnym inkubatorze komórkowym z 5% CO2 i wilgotnością 90% w temperaturze 37 °C, aż do powstania neurosfery.</li>
	<li>Po utworzeniu się wystarczającej neurosfery zbierz je za pomocą pipety w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i odwiruj przy 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zawiesić osad i podzielić go na kilka kolb wypełnionych powyższą pożywką hodowlaną w celu utrzymania pierwotnych GSC. 
	UWAGA: GSC pochodzące od pacjenta użyte w przykładzie pochodziły z biopsji chirurgicznej 34-letniego pacjenta płci męskiej z nawracającym GBM IV stopnia wg WHO. Na potrzeby przyszłych eksperymentów GSC zostały nazwane XG387. Testy na obecność mykoplazmy oparte na PCR zostały przeprowadzone dla powyższych GSC, aby potwierdzić, że nie ma zanieczyszczenia mykoplazmą. Wszystkie eksperymenty z udziałem GSC użyte w tym protokole zostały przeprowadzone <15 fragmentów.</li>
</ol>
2. Przygotowanie GSC oznaczonych lucyferazą
<ol>
	<li>Zebrać GSC z pożywki i odwirować je przy 70 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant, trawić komórki za pomocą akutazy przez 4 minuty w temperaturze 37 °C. Kilkakrotnie użyć końcówki o pojemności 200 μl i pipety, aby oddzielić i ponownie zawiesić osad komórkowy.</li>
	<li>Rozcieńczyć komórki do 2 x 105 komórek na studzienkę na 12-dołkowej płytce hodowlanej i hodować komórki przez noc.</li>
	<li>Dodać 30 μl supernatantu wirusa lucyferazy-EGFP (miano >10,8 j./ml) do każdego dołka na płytce, a następnie odwirować komórki w temperaturze 1 000 x g przez 2 godziny w temperaturze 25 °C. Hodować komórki przez noc.</li>
	<li>Odśwież pożywkę następnego dnia i hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.</li>
	<li>Obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby potwierdzić pojawienie się komórek GFP dodatnich.</li>
	<li>Użyj sortera komórek przepływowych, aby posortować i wybrać GSC o wysokiej fluorescencji GFP w celu dalszej hodowli komórek.</li>
</ol>
3. Pomiar żywotności komórek oparty na bioluminescencji
<ol>
	<li>Powlekanie płytek mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) (np. Matrigel): Dodać 40 μl mieszaniny ECM o stężeniu 0,15 mg/ml do każdego dołka i inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Usunąć nadmiar mieszaniny ECM i delikatnie spłukać raz PBS.</li>
	<li>Dodać 100 μl pożywki hodowlanej zawierającej 15 000, 10 000, 8 000, 6 000, 4 000, 2 000, 1 000 i 500 komórek XG387-Luc wraz ze 100 μl pożywki ślepej jako kontrolę do każdej studzienki dla 6 powtórzeń na 96-dołkowej optycznej płytce dolnej i hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant, dodać 50 μl pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania (ROI) i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.</li>
</ol>
4. Leczenie temozolomidem i skojarzone badania przesiewowe
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć cztery 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Umieść komórki XG387-Luc o gęstości 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hoduj komórki przez noc.</li>
	<li>Należy wcześniej przygotować temozolomid i docelowe środki z roztworu podstawowego. Przygotować serię stężeń składającą się z 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM i 50 μM temozolomidu w pożywce do leczenia pojedynczym środkiem. Rozcieńczyć temozolomid i środki docelowe w roztworze podstawowym w pożywce, odpowiednio, w celu uzyskania końcowych stężeń 200 μM i 2 μM do badań przesiewowych leków złożonych (Tabela 2).</li>
	<li>Usunąć pożywkę hodowlaną, gdy większość GSC przylega do dna płytek; dodać wyżej przygotowaną pożywkę zawierającą temozolomid do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.</li>
	<li>W celu poddania działaniu temozolomidu i przeprowadzenia badań przesiewowych kombinacji leków, należy usunąć pożywkę ślepą i dodać powyżej przygotowaną pożywkę zawierającą 200 μM temozolomidu lub 2 μM czynnika docelowego, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg.</li>
	<li>Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 3 dni.</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą lek, dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdej studzienki i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widma IVIS. Użyj wbudowanego oprogramowania, aby utworzyć wiele cyklicznych zwrotów z inwestycji i określić ilościowo bioluminescencję komórkową.</li>
</ol>
5. Leczenie skojarzone temozolomidu i UMI-77 w liniach komórkowych XG387-Luc i XG328-Luc
<ol>
	<li>Przed zabiegiem należy wstępnie pokryć trzy 96-dołkowe płytki, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Zasiać komórki XG387-Luc i XG328-Luc o gęstości odpowiednio 1,000 komórek w 100 μl pożywki hodowlanej do każdej studzienki 96-dołkowej optycznej płytki dolnej i hodować komórki przez noc.</li>
	<li>Przygotować serię stężeń składającą się z 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM, 50 μM i 0 μM temozolomidu oraz serię stężeń składającą się z 6 μM, 4 μM, 3 μM, 2 μM, 1 μM, 0,5 μM i 0 μM UMI-77 w pożywce do leczenia matrycą miareczkowania sześć na sześć.</li>
	<li>Usunąć ślepą pożywkę, gdy większość SGC przylega do dna płytki; dodać wyżej przygotowaną pożywkę do każdej studzienki w celu uzyskania trzech powtórzeń technicznych na zabieg.</li>
	<li>Inkubować te płytki przez 3 dni w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Usunąć pożywkę zawierającą lek; dodać 50 μl ślepej pożywki zawierającej 150 ng/μl D-lucyferyny do każdego dołka i inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu pomiaru bioluminescencji.</li>
</ol>
6. Analiza danych
<ol>
	<li>Oblicz wynik wskaźnika czułości (SI) temozolomidu i środka docelowego zgodnie ze wzorem w <silna klasa="xfig">Rysunek 2A. 
	UWAGA: Wynik SI służy do ilościowego określenia wpływu dodania innego leku. Wahał się od -1 do +1, przy czym wartości dodatnie wskazywały na synergiczne działanie temozolomidu.</li>
	<li>Oblicz wartości indeksu kombinacji (CI) między temozolomidem a UMI-77 za pomocą oprogramowania CompuSyn w celu analizy ich połączonych interakcji. Wartość CI <1 wskazuje na synergię; Wartość CI >1 wskazuje na antagonizm.</li>
	<li>Oblicz wysokie wartości pojedynczego czynnika (HSA) między temozolomidem a UMI-77 za pomocą oprogramowania Combenefit. Wartość HSA wskazuje na połączone działanie hamujące. Wartość HSA >0 oznacza synergię, a wartość HSA <0 wskazuje na antagonizm.</li>
</ol>

<ol><li>Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in glioblastoma.</a> Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).</li>
<li>Binello, E., Germano, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+glioma+stem+cells%3A+a+novel+framework+for+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Science%22%5BJournal%5D)">Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors.</a> Cancer Science. 102 (11), 1958-1966 (2011).</li>
<li>Mathews Griner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+screening+identifies+drugs+that+cooperate+with+ibrutinib+to+kill+activated+B-cell-like+diffuse+large+B-cell+lymphoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial screening identifies drugs that cooperate with ibrutinib to kill activated B-cell-like diffuse large B-cell lymphoma cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (6), 2349-2354 (2014).</li>
<li>Di Veroli, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combenefit%3A+an+interactive+platform+for+the+analysis+and+visualization+of+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Combenefit: an interactive platform for the analysis and visualization of drug combinations.</a> Bioinformatics. 32 (18), 2866-2868 (2016).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ibrutinib+inactivates+BMX-STAT3+in+glioma+stem+cells+to+impair+malignant+growth+and+radioresistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Ibrutinib inactivates BMX-STAT3 in glioma stem cells to impair malignant growth and radioresistance.</a> Science Translational Medicine. 10 (443), 1-13 (2018).</li>
<li>Tan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+synergistic+drug+pairs+targeting+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of synergistic drug pairs targeting HIV.</a> Nature Biotechnology. 30 (11), 1125-1130 (2012).</li>
<li>Jansen, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinome-wide+RNA+interference+screen+reveals+a+role+for+PDK1+in+acquired+resistance+to+CDK4%2F6+inhibition+in+ER-positive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Kinome-wide RNA interference screen reveals a role for PDK1 in acquired resistance to CDK4/6 inhibition in ER-positive breast cancer.</a> Cancer Research. 77 (9), 2488-2499 (2017).</li>
<li>Malyutina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+combination+sensitivity+scoring+facilitates+the+discovery+of+synergistic+and+efficacious+drug+combinations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Drug combination sensitivity scoring facilitates the discovery of synergistic and efficacious drug combinations in cancer.</a> PLoS Computational Biology. 15 (5), 1006752(2019).</li>
<li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+High-throughput+drug+combination+screening+and+synergy+scoring%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Methods for High-throughput drug combination screening and synergy scoring.</a> Cancer Systems Biology. 1711, 351-398 (2018).</li>
<li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+synthetic+vulnerability+of+PTEN-deficient+glioblastoma+cells+with+MCL1+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Targeting the synthetic vulnerability of PTEN-deficient glioblastoma cells with MCL1 inhibitors.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 19 (10), 2001-2011 (2020).</li>
</ol>

Autorzy deklarują, że nie ujawniają żadnych konfliktów.

W niniejszym badaniu opisano protokół, który można zastosować do identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu GSC pochodzących od pacjenta. W przeciwieństwie do standardowego modelu metrycznego synergii/addytywności, takiego jak metody Loewe, BLISS lub HSA, zastosowano prosty i szybki przepływ pracy, który nie wymaga łączenia pary leków w wielu stężeniach w sposób w pełni silniowy, jak to ma miejsce w przypadku metod tradycyjnych. W tym przepływie pracy wprowadzono SI (wskaźnik wrażliwości), który pocho...

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszym i najbardziej agresywnym typem pierwotnego guza mózgu. Obecnie całkowite przeżycie pacjentów z GBM, którzy otrzymali maksymalne leczenie (połączenie operacji, chemioterapii i radioterapii) jest nadal krótsze niż 15 miesięcy; dlatego pilnie potrzebne są nowatorskie i skuteczne terapie GBM.
Obecność komórek macierzystych glejaka (GSC) w GBM stanowi poważne wyzwanie dla konwencjonalnego leczenia, ponieważ te komórki macierzyste odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu mikrośrodowiska guza, oporności na leki i nawrotu nowotworu1. W związku z tym celowanie w GSC może być obiecującą strategią leczenia GBM2. Niemniej jednak główną wadą skuteczności leku w GBM jest jego heterogenetyczny charakter, w tym między innymi różnica w mutacjach genetycznych, mieszanych podtypach, regulacji epigenetycznej i mikrośrodowisku guza, co czyni je bardzo opornymi na leczenie. Po wielu nieudanych próbach klinicznych naukowcy i badacze kliniczni zdali sobie sprawę, że terapia celowana jednolekowa prawdopodobnie nie jest w stanie w pełni kontrolować progresji wysoce niejednorodnych nowotworów, takich jak GBM. Natomiast starannie dobrane kombinacje leków zostały zatwierdzone ze względu na ich skuteczność poprzez synergistyczne wzmacnianie wzajemnego działania, zapewniając w ten sposób obiecujące rozwiązanie w leczeniu GBM.
Chociaż istnieje wiele sposobów oceny interakcji lek-lek w kombinacji leków, takich jak CI (Indeks Kombinacji), HSA (Najwyższy Pojedynczy Agent), wartości Bliss, itd.3,4, te metody obliczeniowe są zwykle oparte na wielu kombinacjach stężeń. Rzeczywiście, metody te mogą zapewnić pozytywną ocenę interakcji między lekami, ale mogą być bardzo pracochłonne, jeśli są stosowane w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych. Aby uprościć ten proces, opracowano proces badań przesiewowych w celu szybkiej identyfikacji potencjalnych kombinacji leków, które hamują wzrost GSC pochodzących z biopsji chirurgicznej pacjenta GBM. Wskaźnik wrażliwości (SI), który odzwierciedla różnicę między oczekiwanym łącznym efektem a obserwowanym połączonym efektem, został wprowadzony do tej metody w celu ilościowego określenia efektu synergicznego każdego leku, dzięki czemu potencjalni kandydaci mogą być łatwo zidentyfikowani przez ranking SI. Tymczasem protokół ten przedstawia przykładowy ekran przesiewowy w celu zidentyfikowania potencjalnego kandydata (kandydatów), który może synergizować efekt przeciwglejakowy z temozolomidem, chemioterapią pierwszego rzutu w leczeniu GBM, spośród 20 inhibitorów małocząsteczkowych.

<table><tbody><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50X</td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>FGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0263</td><td>20 ng/ml</td></tr><tr><td>Gluta Max</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>100X</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>1X</td></tr><tr><td>Hyklon penicyliny-streptomycyny</td><td></td><td>SV30010</td><td>P: 10 000 jednostek/ml&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; S:&nbsp; 10 000 ug/ml</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>2088876</td><td>100 mM</td></tr><tr><td>Tabela 1. Ten&nbsp; Formulacja&nbsp; Sekretariatu Generalnego&nbsp; Kompletna pożywka hodowlana.&nbsp; &nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ABT-737</td><td>MCE</td><td></td><td>Selektywny i mimetyczny BH3&nbsp; Bcl-2,&nbsp; Bcl-xL&nbsp; oraz&nbsp; Bcl-w&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Adavosertib (MK-1775)</td><td>MCE</td><td></td><td>Wee1&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Aksytynib</td><td>MCE</td><td></td><td>Wielokierunkowy inhibitor kinazy tyrozynowej</td></tr><tr><td>AZD5991</td><td>MCE</td><td></td><td>Mcl-1&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>A 83-01</td><td>MCE</td><td></td><td>Silny inhibitor receptora TGF-&beta typu I&nbsp; Kinaza ALK5</td></tr><tr><td>CGP57380</td><td>Selleck</td><td></td><td>Potent&nbsp; MNK1&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Dactolisib (BEZ235)</td><td>Selleck</td><td></td><td>Dual ATP-konkurencyjny&nbsp; PI3K&nbsp; oraz&nbsp; mTOR&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Dazatynib</td><td>MCE</td><td></td><td>Dual&nbsp; Kinaza tyrozynowa rodziny Bcr-Abl i Src&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Erlotinib</td><td>MCE</td><td></td><td>EGFR&nbsp; inhibitor kinazy tyrozynowej</td></tr><tr><td>Gefitynib</td><td>MCE</td><td></td><td>EGFR kinaza tyrozynowa&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>Linifanib</td><td>MCE</td><td></td><td>Multi-target inhibitor&nbsp; VEGFR&nbsp; oraz&nbsp; PDGFR&nbsp; rodzina</td></tr><tr><td>Masytynib</td><td>MCE</td><td></td><td>Inhibitor&nbsp; c-Kit</td></tr><tr><td>ML141</td><td>Selleck</td><td></td><td>Niekonkurencyjny inhibitor&nbsp; Cdc42 GTPaza&nbsp;</td></tr><tr><td>OSI-930</td><td>MCE</td><td></td><td>Multi-target inhibitor Kit, KDR i CSF-1R&nbsp;</td></tr><tr><td>Palbociclib</td><td>MCE</td><td></td><td>selektywny&nbsp; CDK4&nbsp; oraz&nbsp; CDK6&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>SB 202190</td><td>MCE</td><td></td><td>Selektywny&nbsp; Kinaza p38 MAP&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>bromku sepantronium (YM-155)</td><td>MCE</td><td></td><td>Survivin&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>TCS 359</td><td>Selleck</td><td></td><td>Silny inhibitor FLT3</td></tr><tr><td>UMI-77</td><td>MCE</td><td></td><td>Selektywny&nbsp; Mcl-1&nbsp; inhibitor</td></tr><tr><td>4-hydroksytamoksyfenu(afimoksyfen)</td><td>Selleck</td><td></td><td>Selektywny&nbsp; receptor estrogenowy (ER)&nbsp; modulator</td></tr><tr><td>Tabela 2. Informacje o 20 docelowych agentach używanych na ekranie testowym. Wszystkie te inhibitory są selektywnymi inhibitorami małocząsteczkowymi. Dostawca, nazwa i cele zostały podane w tabeli.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej gbm przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

A Rapid Screening Workflow to Identify Potential Combination Therapy for GBM using Patient-Derived Glioma Stem Cells

Komórki macierzyste glejaka (GSC) to niewielka część komórek nowotworowych, które odgrywają kluczową rolę w inicjacji nowotworu, angiogenezie i oporności na leki w glejaku (GBM), najbardziej rozpowszechnionym i wyniszczającym pierwotnym guzie mózgu. Obecność GSC sprawia, że GBM jest bardzo oporny na większość pojedynczych leków docelowych, dlatego potrzebne są wysokoprzepustowe metody badań przesiewowych w celu zidentyfikowania potencjalnie skutecznych terapii skojarzonych. Protokół opisuje prosty przebieg pracy, aby umożliwić szybkie badania przesiewowe pod kątem potencjalnej terapii skojarzonej z synergiczną interakcją. Ogólne etapy tego przepływu pracy polegają na ustaleniu GSC znakowanych lucyferazy, przygotowaniu płytek pokrytych matryżelem, skojarzonym badaniu przesiewowym leków, analizie i walidacji wyników.

Komórki XG387 tworzyły neurosfery w pożywce hodowlanej opisanej w Tabeli 1 w płytce hodowlanej 6-dołkowej o ultra-niskiej adhezji lub w płytce niepowlekanej5 (Rysunek 1A). W pierwszej kolejności przeprowadzono test w celu sprawdzenia, czy intensywność bioluminescencji komórek XG387-Luc była proporcjonalna do liczby komórek. Jak pokazano na Rysunku 1B, intensywność bioluminescencji wzrastała proporcjonalnie do gęstości kom...

Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

The glioma stem cells (GSCs) are a small fraction of cancer cells which play essential roles in tumor initiation, angiogenesis, and drug resistance in ...

Komórki macierzyste glejaka to subpopulacja komórek glejaka, które są zwykle oporne na chemioterapię i radioterapię. W tym artykule opisaliśmy metodę szybkiej identyfikacji terapii skojarzonych, ukierunkowanych na komórki macierzyste glejaka, a nie na zróżnicowane komórki glejaka. W porównaniu z innymi metodami, które mogą być pracochłonne i skomplikowane.Protokół ten jest stosunkowo prosty i szybki, aby zidentyfikować potencjalne użyteczne kombinacje leków. Rozpocznij od pobrania komórek macierzystych glejaka lub GSC z pożywki hodowlanej i odwirowania ich w temperaturze 70 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu trawić komórki za pomocą akutazy przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Za pomocą końcówki o pojemności 200 mikrolitrów kilkakrotnie pipetuj komórki, aby doszło do dysocjacji i ponownie zawiesić osad komórek. Dodaj GSC o gęstości 200 000 komórek w jednym mililitrze pożywki hodowlanej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj je przez noc. Och następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów supernatantu wirusa lucyferazy-eGFP do każdego dołka płytki.Odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez dwie godziny, w temperaturze 25 stopni Celsjusza i inkubuj je przez noc. Następnego dnia należy wymienić pożywkę w studzienkach, zbierając GSC, odwirowując je, usuwając supernatant, ponownie umieszczając je w świeżej pożywce i ponownie platerując. Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.Obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i potwierdź pojawienie się komórek GFP-dodatnich. Sortować i zbierać GSC o wysokiej fluorescencji za pomocą sortera przepływowego i dalej je hodować. Pokryj 96-dołkowe optyczne płytki dolne mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej, taką jak matrigel, i inkubuj je przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Usuń nadmiar mieszaniny i delikatnie przepłucz płytki raz PBS, a następnie wysiew komórki XG387-Luc o gęstości 1000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i do każdej studzienki pokrytych płytek i hoduj je przez noc. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich przyczepienie do płytki. Następnie przygotować 200-mikromolowy roztwór temozolomidu i dwa mikromolowe roztwory docelowych środków w pożywce hodowlanej.W przypadku skojarzonych badań przesiewowych leków należy usunąć ślepą próbę i dodać pożywkę zawierającą 200 mikromolowy temozolomid lub dwa mikromolowe środki celowane, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widmowego IVIS.Korzystając z wbudowanego oprogramowania, utwórz wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania i określ ilościowo bioluminescencję komórkową. Aby zidentyfikować potencjalnych kandydatów, którzy mogliby wzmocnić działanie przeciwglejakowe temozolomidu, przeanalizowano 20 docelowych selektywnych inhibitorów małocząsteczkowych za pomocą badań przesiewowych w skojarzeniu leków. Wartości indeksu wrażliwości 13 docelowych agentów były powyżej zera, a pięć z nich powyżej 0,1.Wskaźnik wrażliwości dwóch głównych kandydatów na leki, UMI-77 i A 83-01, był wyższy niż 0,25, co sugeruje ich potencjał do synergii z temozolomidem. Skojarzone leczenie temozolomidem i UMI-77 oceniano za pomocą testu antyproliferacyjnego w matrycy miareczkowania sześć na sześć. Wartości indeksu kombinacji były mniejsze niż jeden.Wysokie wartości pojedynczego czynnika były większe od zera dla większości kombinacji temozolomidu i UMI-77 w różnych stężeniach. Sugeruje to ogólną synergiczną interakcję temozolomidu i UMI-77 w GSC XG387 i XG328. Protokół ten może być również stosowany do znajdowania kombinacji leków przy użyciu przylegających komórek rakowych, po prostu usuwając etap powlekania płytki.

a-rapid-screening-workflow-to-identify-potential-combination-therapy

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Niniejszy protokół wideo demonstruje izolację i ekspansję komórek macierzystych z chirurgicznie wyciętej tkanki guza glejaka wielopostaciowego (GBM) u człowieka przy użyciu metody hodowli neurosfer.

Izolacja i ekspansja komórek nowotworowych glejaka wielopostaciowego człowieka z wykorzystaniem testu neurosferycznego

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Ten film pokazuje tworzenie komórek macierzystych glejaka znakowanych lucyferazą poprzez dostarczanie genów za pośrednictwem lentiwirusa. Lucyferazy działa jako gen reporterowy i ułatwia szybkie eksperymenty przesiewowe leków.

Model komórek macierzystych glejaka znakowany lucyferazą: metoda przygotowania komórek macierzystych glejaka znakowanych lucyferazą do badań terapeutycznych in vitro za pośrednictwem lentiferazy

Ten film demonstruje technikę generowania linii reporterowej komórek macierzystych glejaka w celu identyfikacji różnicowania komórek macierzystych glejaka (GSC) w astroglej. Przedstawiono w nim etapy związane z wysiewaniem GSC, transdukcją ich za pomocą lentiwirusa kodującego GFP i określaniem ekspresji reporterowej GFP za pomocą cytometrii przepływowej.

Lentiwirusowy transkrypcyjny system reporterowy do generowania linii reporterowej różnicowania komórek macierzystych glejaka

Przedstawiono skuteczny protokół badań przesiewowych do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie astrogleju w komórkach macierzystych glejaka (GSC). Test opiera się na reporterze różnicowania komórek macierzystych, w którym ekspresja wzmocnionego GFP (eGFP) jest napędzana przez ludzki promotor GFAP.

System badań przesiewowych leków oparty na cytometrii przepływowej do identyfikacji małych cząsteczek, które promują różnicowanie komórkowe komórek macierzystych glejaka

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

Tutaj przedstawiamy kompleksowy protokół generowania i wykorzystywania laboratoryjnie zaprojektowanych organoidów glejaka (LEGO) do badania zależności genotyp-fenotyp i badania potencjalnych leków do leczenia glejaka.

Laboratoryjnie zmodyfikowana hodowla organoidów glejaka wielopostaciowego i badania przesiewowe leków

Ten protokół opisuje metodę szybkiego przetwarzania pośmiertnego rozlanego wewnętrznego glejaka mostu w celu stworzenia modeli hodowli komórkowych pochodzących od pacjenta lub bezpośredniej charakterystyki komórek nowotworowych i mikrośrodowiskowych.

Protokół szybkiej pośmiertnej hodowli komórkowej rozlanego wewnętrznego glejaka mostu (DIPG)

Poznaj uproszczony protokół szybkiego przesiewania synergicznych kombinacji leków skierowanych przeciwko komórkom macierzystym glejaka. Metoda wykorzystuje lucyferazę i bioluminescencję do identyfikacji terapii skojarzonej w glioblastomie.

Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta (Wideo) | JoVE Journal

Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

Przeglądaj więcej filmów