Szybki przebieg badań przesiewowych w celu identyfikacji potencjalnej terapii skojarzonej GBM przy użyciu komórek macierzystych glejaka pochodzącego od pacjenta

Komórki macierzyste glejaka to subpopulacja komórek glejaka, które są zwykle oporne na chemioterapię i radioterapię. W tym artykule opisaliśmy metodę szybkiej identyfikacji terapii skojarzonych, ukierunkowanych na komórki macierzyste glejaka, a nie na zróżnicowane komórki glejaka. W porównaniu z innymi metodami, które mogą być pracochłonne i skomplikowane.

Protokół ten jest stosunkowo prosty i szybki, aby zidentyfikować potencjalne użyteczne kombinacje leków. Rozpocznij od pobrania komórek macierzystych glejaka lub GSC z pożywki hodowlanej i odwirowania ich w temperaturze 70 razy G przez trzy minuty w temperaturze pokojowej. Po usunięciu supernatantu trawić komórki za pomocą akutazy przez cztery minuty w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Za pomocą końcówki o pojemności 200 mikrolitrów kilkakrotnie pipetuj komórki, aby doszło do dysocjacji i ponownie zawiesić osad komórek. Dodaj GSC o gęstości 200 000 komórek w jednym mililitrze pożywki hodowlanej do każdej studzienki 12-dołkowej płytki hodowlanej i inkubuj je przez noc. Och następnego dnia dodaj 30 mikrolitrów supernatantu wirusa lucyferazy-eGFP do każdego dołka płytki.

Odwiruj komórki w temperaturze 1000 razy G przez dwie godziny, w temperaturze 25 stopni Celsjusza i inkubuj je przez noc. Następnego dnia należy wymienić pożywkę w studzienkach, zbierając GSC, odwirowując je, usuwając supernatant, ponownie umieszczając je w świeżej pożywce i ponownie platerując. Hoduj komórki przez kolejne 48 godzin.

Obserwuj płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i potwierdź pojawienie się komórek GFP-dodatnich. Sortować i zbierać GSC o wysokiej fluorescencji za pomocą sortera przepływowego i dalej je hodować. Pokryj 96-dołkowe optyczne płytki dolne mieszaniną macierzy zewnątrzkomórkowej, taką jak matrigel, i inkubuj je przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Usuń nadmiar mieszaniny i delikatnie przepłucz płytki raz PBS, a następnie wysiew komórki XG387-Luc o gęstości 1000 komórek w 100 mikrolitrach pożywki hodowlanej i do każdej studzienki pokrytych płytek i hoduj je przez noc. Następnego dnia obserwuj komórki pod mikroskopem, aby potwierdzić ich przyczepienie do płytki. Następnie przygotować 200-mikromolowy roztwór temozolomidu i dwa mikromolowe roztwory docelowych środków w pożywce hodowlanej.

W przypadku skojarzonych badań przesiewowych leków należy usunąć ślepą próbę i dodać pożywkę zawierającą 200 mikromolowy temozolomid lub dwa mikromolowe środki celowane, lub kombinację obu, do każdej studzienki w celu uzyskania trzech kontrprób technicznych na zabieg. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy dni. Wykonaj zdjęcia bioluminescencji komórkowej w płytce za pomocą systemu obrazowania widmowego IVIS.

Korzystając z wbudowanego oprogramowania, utwórz wiele okrągłych obszarów obszaru zainteresowania i określ ilościowo bioluminescencję komórkową. Aby zidentyfikować potencjalnych kandydatów, którzy mogliby wzmocnić działanie przeciwglejakowe temozolomidu, przeanalizowano 20 docelowych selektywnych inhibitorów małocząsteczkowych za pomocą badań przesiewowych w skojarzeniu leków. Wartości indeksu wrażliwości 13 docelowych agentów były powyżej zera, a pięć z nich powyżej 0,1.

Wskaźnik wrażliwości dwóch głównych kandydatów na leki, UMI-77 i A 83-01, był wyższy niż 0,25, co sugeruje ich potencjał do synergii z temozolomidem. Skojarzone leczenie temozolomidem i UMI-77 oceniano za pomocą testu antyproliferacyjnego w matrycy miareczkowania sześć na sześć. Wartości indeksu kombinacji były mniejsze niż jeden.

Wysokie wartości pojedynczego czynnika były większe od zera dla większości kombinacji temozolomidu i UMI-77 w różnych stężeniach. Sugeruje to ogólną synergiczną interakcję temozolomidu i UMI-77 w GSC XG387 i XG328. Protokół ten może być również stosowany do znajdowania kombinacji leków przy użyciu przylegających komórek rakowych, po prostu usuwając etap powlekania płytki.