Name: Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Poznaj metodę oceny wpływu agrochemikaliów na matki pszczele w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Protokół QMC umożliwia badanie produktywności składania jaj i zdrowia kolonii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękuję dr Amy Cash-Ahmed, Nathanaelowi J. Beachowi i Alison L. Sankey za pomoc w realizacji tej pracy. Wzmianki o nazwach handlowych lub produktach komercyjnych w tej publikacji służą wyłącznie dostarczeniu konkretnych informacji i nie oznaczają rekomendacji ani poparcia ze strony Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych. USDA jest dostawcą równych szans i pracodawcą. Badania te były wspierane przez grant z Agencji Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obszarze Obronności # HR0011-16-2-0019 dla Gene'a E. Robinsona i Huimina Zhao, projekt USDA 2030-21000-001-00-D oraz doświadczenie badawcze w zakresie plastyczności fenotypowej dla studentów szkół wyższych na Uniwersytecie Illinois w Urbana Champaign.

1. Montaż QMC
<ol>
	<li>Zmontuj klatki QMC z elementów (Rycina 1A), wkładając jedną płytkę do składania jaj (ELP) zgodnie z Rycyną 1B. Nie dodawaj rurek karmnych, dopóki robotnice nie zostaną wprowadzone do klatki. Tymczasowo zaklej 4 otwory karmne taśmą laboratoryjną.</li>
	<li>Wsuń przegrodę przeciwkrólową oraz drzwiczki komory karmienia nad komorę karmienia, aby uniemożliwić królowej wejście do niej i kontakt z traktowaną dietą. Szczegóły montażu opisano w pracy Fine et al.32.</li>
	<li>Pobierz ramki z woskowym plastrem zawierające zasklepiony czerw robotnic z kolonii pszczół miodnych na 24 h przed wygryzieniem się dorosłych osobników i umieść je w inkubatorze (34,5 °C) wewnątrz larwnika. Po 24 h zmieć wygryzione pszczoły z ramek do otwartego pojemnika wyłożonego farbą barierową dla owadów (np. Fluon), aby zapobiec ucieczce pszczół.</li>
	<li>Wprowadź do komory składania jaj każdej klatki QMC co najmniej 50 pszczół wagowo (5 g ≈ 50 pszczół44,45). Aby zapewnić reprezentatywną i zróżnicowaną pulę genetyczną robotnic w eksperymencie, pobierz w przybliżeniu taką samą liczbę pszczół robotnic z co najmniej trzech kolonii i wymieszaj je przed umieszczeniem w klatkach QMC. 
	UWAGA: Nowo wygryzione pszczoły robotnice w wieku poniżej 1 dnia nie potrafią latać ani żądlić ze względu na niedorozwinięte mięśnie lotne i nieutwardzony kutykula. Jeśli są wprowadzane w tym wieku, nie ma potrzeby ich znieczulania przed manipulacją. Można je ważyć, delikatnie nabierając pszczoły z pojemnika małą miarką o pojemności ¼ szklanki i przenosząc je do drugiego pojemnika (wyłożonego farbą barierową, np. Fluon), który został wytarowany na wadze. Powierzchnia ramek pokryta zasklepionym czerwiem powinna być w przybliżeniu taka sama, aby zapewnić równą reprezentację kolonii źródłowych w populacjach robotnic w QMC. Homogenizację pszczół robotnic można osiągnąć poprzez zmiecenie nowo wygryzionych pszczół z ramek pobranych ze wszystkich kolonii do jednego pojemnika i pozostawienie ich do wymieszania przez 5 min przed wprowadzeniem do klatek QMC.</li>
	<li>Dodaj karmniki zawierające roztwór sacharozy, wodę i suplement pyłkowy (patrz sekcja 2).</li>
	<li>Naraź poszczególne zapłodnione królowe na gaz CO2, aby pobudzić je do składania jaj46 oraz ułatwić przeniesienie do QMC.
	<ol>
		<li>Użyj królowych zakupionych od komercyjnego hodowcy w ciągu 48 godzin od otrzymania. Gdy królowa znajduje się jeszcze w klatce transportowej, włóż ją do przezroczystej plastikowej torby. Włóż jeden koniec plastikowej rurki podłączonej do butli z gazem CO2 do wnętrza torby i delikatnie otwórz zawór butli, aby dopuścić przepływ gazu CO2.</li>
		<li>Po napompowaniu torby gazem jednocześnie zamknij zawór butli i szczelnie zamknij torbę, aby uwięzić gaz w środku. Trzymaj torbę zamkniętą przez 30 s lub do momentu, aż królowa przestanie się poruszać. Wyjmij królową i otwórz klatkę transportową, gdy stwierdzisz, że straciła przytomność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uchyl drzwi do komory składania jaj, delikatnie umieść w niej nieprzytomną królową i zamknij pokrywę, uważając, aby nie zmiażdżyć królowej ani robotnic wewnątrz. Dodaj drugą płytkę do składania jaj do każdej klatki QMC, jak pokazano na Rycynie 1C. Przyklej kawałek taśmy laboratoryjnej w poprzek górnej części obu płytek ELP, aby zapobiec ich oddzieleniu od ramy QMC i uniemożliwić robotnicom opuszczenie klatki.</li>
	<li>Umieść klatki w ciemnym inkubatorze ze stabilnymi warunkami środowiskowymi: 34 ± 0,5 °C oraz wilgotnością względną 60% ± 10%, co odpowiada warunkom panującym w normalnej kolonii.</li>
</ol>
<img alt="Układ symulacji kolonii pszczół, schematy przedstawiające komorę karmienia, przegrodę królową i komorę składania jaj." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62316/62316fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A: Rozmontowany QMC. B: Częściowo zmontowany QMC z włożoną jedną płytką ELP. C: W pełni zmontowany QMC z dwiema płytkami ELP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62316/62316fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Przygotowanie i podawanie diet z dodatkiem agrochemikaliów
<ol>
	<li>Aby przygotować 1000 g 50% (g/g) roztworu sacharozy, umieść mieszadło magnetyczne na dnie czystej szklanej butelki na odczynniki o pojemności 1 L. Dodaj 500 g sacharozy i 500 mL wody dejonizowanej. Odkręć korek butelki i użyj grzewczego mieszadła magnetycznego ustawionego na niską temperaturę, aby mieszać roztwór do czasu całkowitego rozpuszczenia sacharozy. Pozostaw roztwór do ochłodzenia do temperatury pokojowej przed dodaniem roztworów zapasowych agrochemikaliów.</li>
	<li>Przygotuj roztwory zapasowe agrochemikaliów w odpowiednim rozpuszczalniku, np. w acetonie, w stężeniu, które po dodaniu do diety pozwoli uzyskać pożądane stężenie końcowe interesującego agrochemikaliu. 
	UWAGA: Przy stosowaniu acetonu jako rozpuszczalnika nośnika wytyczne Organizacji Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) określają, że stężenie końcowe acetonu w diecie musi wynosić ≤ 5% w przypadku testów przewlekłej toksyczności doustnej u dorosłych pszczół miodnych47. Jednak niektóre rozpuszczalniki, takie jak n-metylo-2-pirolidon5,31 oraz dimetylosulfotlenek25, mogą wywoływać efekty toksyczne poniżej tego stężenia, dlatego zaleca się utrzymywanie stężeń rozpuszczalników w diecie traktowanej na możliwie niskim poziomie. W zależności od objętości i rodzaju zastosowanego rozpuszczalnika może być konieczne uwzględnienie zarówno grupy kontrolnej rozpuszczalnika, jak i grupy kontrolnej negatywnej, aby zapewnić wykrycie potencjalnych efektów wynikających z toksyczności rozpuszczalnika. W przypadku stosowania produktów sformułowanych ilość użytego produktu musi zostać dostosowana do stężenia obecnego w formulacji. W zależności od stabilności interesującego agrochemikaliu w rozpuszczalniku, roztwory zapasowe można przechowywać do 2 tygodni w temperaturze -20 °C.</li>
	<li>Wybierz dawki subletalne na podstawie wyników Testu OECD nr 245: Pszczoła miodna (Apis mellifera L.), Test przewlekłej toksyczności doustnej (karmienie przez 10 dni)47 i zidentyfikuj odpowiednią literaturę poprzez przeszukanie bazy wiedzy Ecotox48.</li>
	<li>Podaj preparaty agrochemiczne w roztworze sacharozy, komercyjnym suplemencie pyłkowym (jeśli jest dostępny w formie proszku) lub w obu. Przygotuj dietę eksperymentalną do użycia w tym samym dniu, dodając odpowiednią ilość roztworu zapasowego do schłodzonego lub w temperaturze pokojowej 50% roztworu sacharozy (w/w). Wymieszaj dokładnie za pomocą vortexu lub mieszadła magnetycznego ustawionego na średnią prędkość. W przypadku suplementów pyłkowych dodaj roztwór sacharozy z agrochemikaliem do proszkowego suplementu zamiast syropu, zgodnie z protokołami producenta, pamiętając o dostosowaniu objętości użytego roztworu zapasowego do końcowej masy diety pyłkowej. Przykładowe obliczenia znajdują się w Tabeli 1.</li>
	<li>Przygotuj rurki do karmienia z probówek do mikrocentryfugi o pojemności 2 mL.
	<ol>
		<li>W przypadku karmideł z dietą płynną, podgrzej końcówkę igły 20G na płycie grzejnej/kuchence i przebij dno probówki dwukrotnie. Zamknij korek probówki i pipetuj około 1,5 mL roztworu sacharozy lub wody przez jeden z otworów. Postaw probówkę stroną przebitą do góry, aż zostanie dodana do QMC.</li>
		<li>W przypadku karmideł z suplementem pyłkowym, użyj żyletki, aby odciąć dno probówki. Zamknij korek i wciśnij kulkę suplementu pyłkowego o masie 1-2 g do probówki, aż dotknie korka.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zapisz masę karmideł przed umieszczeniem ich w QMC. Nie przechowuj niewykorzystanej diety w temperaturze 4 °C dłużej niż przez 48 godzin.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Pożądane stężenie</td>
			<td>Pożądane stężenie rozpuszczalnika nośnika</td>
			<td>Pożądana objętość/masa końcowa roztworu sacharozy</td>
			<td>Objętość roztworu zapasu </td>
			<td>Imidaklopryd w roztworze stokowym</td>
			<td>Sugerowany przepis na roztwór zapasowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór sacharozy</td>
			<td>10 ppb (m/m)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>81,45 ml/100 g*</td>
			<td>40.7 µL</td>
			<td>0,001 mg/40.7 µL</td>
			<td>0,02 mg/814 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement z pyłkiem kwiatowym</td>
			<td>10 ppb (m/m)</td>
			<td></td>
			<td>10 g</td>
			<td>4.07 µL</td>
			<td>0,0001 mg/4.07 µL</td>
			<td>0,02 mg/814 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór sacharozy</td>
			<td>50 ppb (m/m)</td>
			<td>0,05% (v/v)</td>
			<td>78,5 ml/100 g*</td>
			<td>40.7 µL</td>
			<td>0,005 mg/40.7 µL</td>
			<td>0,1 mg/814 µL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suplement z pyłkiem kwiatowym</td>
			<td>50 ppb (m/m)</td>
			<td></td>
			<td>10 g</td>
			<td>4.07 µL</td>
			<td>0,0005 mg/4.07 µL</td>
			<td>0,1 mg/814 µL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Przykładowe receptury na przetworzony roztwór sacharozy, suplement pyłkowy i roztwór zapasowy. *Objętość oparta na gęstości 50% (w/w) roztworu sacharozy (1,228 g/mL). **Gęstość suplementu pyłkowego będzie się różnić w zależności od zastosowanego produktu, ale przy użyciu tej objętości rozpuszczalnika końcowe stężenie rozpuszczalnika w suplemencie pyłkowym zmieści się w pożądanym zakresie ≤ 5% objętościowo.
3. Monitorowanie - stopa produkcji jaj
<ol>
	<li>Kwantyfikuj znoszenie jaj 1–2 razy dziennie, rano i/lub wieczorem. Rozpocznij od wyjęcia QMC z inkubatora w celu sprawdzenia obecności jaj. 
	UWAGA: W przypadku pomyślnego przebiegu eksperymentu, produkcja jaj w większości kontrolnych QMC rozpocznie się w ciągu 3 dni od początkowego montażu klatek. Wyjmuj z inkubatora jednorazowo tylko tyle QMC, ile można sprawdzić i nakarmić w ciągu 10 min. Dłuższe przebywanie poza inkubatorem może zaburzyć produkcję jaj.</li>
	<li>Obejrzyj tył przezroczystych ELP pod kątem obecności jaj. Jeśli jaja są obecne, zdejmij panel drzwi przed interesującą Cię płytką. Usuń taśmę z ELP i ostrożnie wsuń panel drzwi pomiędzy ELP a pszczoły wewnątrz QMC, dbając o to, aby nie zmiażdżyć pszczół, które mogą czyścić komórki w ELP.</li>
	<li>Przy zamontowanym panelu drzwi wyjmij ELP, a następnie policz i zapisz liczbę jaj w komórkach ELP. Usuń jaja, opukując krawędzią ELP (otwartą stroną komórek skierowaną w dół) o twardą powierzchnię (np. krawędź pojemnika na odpady). Po wypadnięciu jaj umieść pusty ELP z powrotem w QMC. Delikatnie zdejmij i ponownie zamontuj panel drzwi za ELP na zewnątrz QMC. Powtórz czynności w razie potrzeby z drugim ELP i po zakończeniu ponownie zaklej QMC taśmą. 
	UWAGA: Produkcja jaj zazwyczaj spada, a śmiertelność wzrasta w QMC po 2 tygodniach32,33, dlatego zaleca się zakończenie eksperymentów po 14 dniach.</li>
</ol>
4. Monitorowanie - spożycie pokarmu
<ol>
	<li>Co dwa dni wymieniaj całą pozostałą w karmnikach QMC pożywkę na świeżo przygotowaną dietę. Przygotuj nowe rurki do karmników (łącznie z wodą) i zważ je przed wyjęciem QMC z inkubatora w celu monitorowania. Zamień wszystkie stare rurki na nowe i zważ stare rurki przed utylizacją niezużytej diety. Porównaj końcową masę rurki do karmnika wraz z niezużytą dietą z masą tej samej rurki przed umieszczeniem jej w QMC, aby oszacować spożycie diety.</li>
	<li>W dniach pomiędzy zaplanowanymi wymianami karmników sprawdzaj spożycie diety raz dziennie (w tym samym czasie, gdy monitoruje się produkcję jaj w QMC), aby upewnić się, że karmniki nigdy nie są puste. Jeśli rurka do karmnika jest pusta lub prawie pusta, wyjmij ją, napełnij ponownie, zanotuj masę rurki przed i po napełnieniu, a różnicę dodaj do całkowitej sumy spożycia diety z 2 dni dla danego QMC.</li>
</ol>
5. Monitorowanie - żywotność zarodków
<ol>
	<li>W wybranym momencie eksperymentu QMC wyjmij ELP zawierające świeżo zniesione jaja z QMC zgodnie z krokiem 3, ale nie oddzielaj jaj od ELP.</li>
	<li>Przykryj ELP uniwersalną pokrywką do mikropłytek i umieść ją w eksyكاتهrze z nasyconym roztworem K2SO4 (150 g K2SO4 w 1 L wody, umieszczonym w płytkim naczyniu). 
	UWAGA: Po osiągnięciu przez mieszaninę temperatury w inkubatorze na dnie naczynia powinna być widoczna niewielka ilość soli.</li>
	<li>Przechowuj eksykator w inkubatorze ustawionym na 34,5 °C, co zapewni wilgotność względną 95% wewnątrz eksykatora, podobnie do warunków stosowanych przez Collinsa49. 
	UWAGA: Prawie wszystkie jaja wyklują się w ciągu 72 ± 6 godzin od momentu ich zniesienia49, zatem wskaźniki wykluwalności można ocenić już 78 godzin po usunięciu ELP z QMC. Larwa w kształcie litery „C” na dnie komórki świadczy o pomyślnym wykluciu. Możliwe są pewne odchylenia w tym czasie, jeśli na przykład jaja są trutniami, a nie robotnicami50.</li>
</ol>
6. Pobieranie próbek robotnic
<ol>
	<li>Jeśli QMC zostały zasiedlone nadmiarową liczbą robotnic, pobierz próbki pszczół robotnic w wybranym punkcie czasowym podczas eksperymentu w celu oceny zmian w ich fizjologii wywołanych traktowaniem. Przeprowadzaj zbiory równocześnie z codziennym karmieniem i liczeniem jaj, aby zminimalizować czas przebywania QMC poza inkubatorem.</li>
	<li>Przed pobraniem próbek umieść panel drzwiowy pomiędzy ELP a wnętrzem QMC, a następnie usuń ELP. Ostrożnie unieś panel drzwiowy na około 0,5 cm od podstawy klatki i usuń pszczelą robotnicę z wnętrza QMC, używając pęsety precyzyjnej. Aby zapobiec ucieczce pszczół, w razie potrzeby zakryj fragmenty otworu o szerokości 0,5 cm palcem w rękawiczce lub kawałkiem waty.</li>
	<li>Zakonserwuj pobraną pszczołę do dalszych analiz i powtarzaj ten proces, aż zostanie zebrana pożądana liczba próbek. W przypadku analizy ekspresji genów zdecydowanie zaleca się szybkie zamrożenie pszczół w ciekłym azocie i natychmiastowe przechowywanie w temperaturze -80 °C51.</li>
</ol>
7. Śmiertelność robotnic
<ol>
	<li>Oceń śmiertelność robotnic w trakcie eksperymentu, licząc liczbę martwych pszczół na dnie komory karmienia oraz komory składania jaj. Przeprowadzaj tę ocenę równocześnie z codziennym ilościowym oznaczaniem składania jaj.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie usuwaj martwe pszczoły przez otwory karmnika, zasłaniając otwór palcem w rękawiczce lub kawałkiem waty w czasie, gdy pęseta nie jest w nim umieszczona.</li>
	<li>Usuń martwe pszczoły z komory składania jaj, ostrożnie unosząc panel drzwiowy na wysokość około 0,5 cm od podstawy klatki i wkładając pęsetę. Aby zapobiec ucieczce pszczół, w razie potrzeby zasłaniaj części otworu o szerokości 0,5 cm palcem w rękawiczce lub kawałkiem waty.</li>
	<li>Oceń śmiertelność robotnic po zakończeniu eksperymentu, usuwając i licząc wszystkie martwe pszczoły z QMC przy użyciu wcześniej opisanych metod przed eutanazją pozostałych pszczół. 
	UWAGA: W przypadku braku pszczół robotnic królowe nie będą składać jaj i zagłodują w ciągu 24 godzin. Dlatego, jeśli zaobserwuje się śmierć wszystkich robotnic w QMC, należy usunąć to QMC z eksperymentu. Podobnie, jeśli królowa padnie w trakcie eksperymentu, należy usunąć QMC, a dane powinny zostać odpowiednio ocenzurowane.</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Na płodność samic samotnych owadów, a także królowych w koloniach owadów eusocjalnych mogą wpływać abiotyczne czynniki stresogenne, takie jak agrochemikalia 25,28,29,30,33. U pszczół miodnych wpływ agrochemikaliów na królowe może być pośredni, ponieważ może wystąpić w wyniku zmian w pielęgnacji i żywieniu pszczół robotnic. Nasze reprezentatywne wyniki, które s...

Ze względu na zwiększony globalny popyt na produkty rolne, nowoczesne praktyki rolnicze często wymagają użycia agrochemikaliów do zwalczania licznych szkodników, o których wiadomo, że zmniejszają lub szkodzą plonom1. Jednocześnie hodowcy wielu upraw owoców, warzyw i orzechów polegają na usługach zapylania świadczonych przez komercyjne kolonie pszczół miodnych, aby zapewnić obfite plony2. Praktyki te mogą spowodować, że zapylacze, w tym pszczoły miodne (Apis mellifera), będą narażone na szkodliwe poziomy pozostałości pestycydów3. Jednocześnie powszechna obecność pasożytniczych roztoczy Varroa destructor w koloniach pszczół miodnych często wymaga od pszczelarzy traktowania uli środkami roztoczobójczymi, które mogą również wywierać negatywny wpływ na zdrowie i długowieczność kolonii4,5,6. Aby ograniczyć i złagodzić szkodliwe działanie produktów agrochemicznych, konieczna jest pełna ocena ich bezpieczeństwa dla pszczół miodnych przed ich wdrożeniem, aby można było sformułować zalecenia dotyczące ich stosowania w celu ochrony pożytecznych owadów.
Obecnie, Agencja Ochrony Środowiska (EPA) opiera się na wielopoziomowej strategii oceny ryzyka narażenia pszczół miodnych na pestycydy, która obejmuje badania laboratoryjne na dorosłych pszczołach, a czasem na larwach pszczół miodnych7. Jeżeli badania laboratoryjne niższego poziomu nie rozwieją obaw związanych z toksycznością, mogą być zalecane badania terenowe i półterenowe wyższego poziomu. Chociaż te testy laboratoryjne dostarczają cennych informacji na temat potencjalnego wpływu agrochemikaliów na długowieczność pracowników, niekoniecznie przewidują ich wpływ na królowe, które znacznie różnią się od robotnic pod względem biologicznym8 i behawioralnie9. Co więcej, istnieje wiele potencjalnych skutków agrochemikaliów na owady wykraczających poza śmiertelność, co może mieć poważne konsekwencje dla owadów społecznych, które polegają na skoordynowanych zachowaniach, aby funkcjonować jako jednostka kolonijna10,11.
Chociaż śmiertelność jest najczęściej rozważanym skutkiem agrochemicznych pestycydów12, produkty te mogą mieć szeroki zakres wpływu zarówno na docelowe, jak i niedocelowe stawonogi, w tym zmienione zachowanie13,14,15,16, odstraszanie lub przyciąganie17,18,19, zmiany we wzorcach żywienia20,21,22, oraz zwiększył lub zmniejszył płodność20,21,22,23,24,25. W przypadku owadów społecznych efekty te mogą systemowo zakłócać interakcje i funkcje kolonii11. Spośród tych funkcji rozmnażanie, które jest w dużym stopniu uzależnione od pojedynczej królowej składającej jaja wspieranej przez resztę jednostki kolonijnej9, może być szczególnie podatne na zakłócenia spowodowane ekspozycją na pestycydy.
Badania przeprowadzone na niedojrzałych królowych wykazały, że rozwojowe narażenie na roztoczobójcze może wpływać na zachowanie dorosłej królowej, fizjologię, przeżywalność26,27. Podobnie, badania z użyciem kolonii o pełnych lub zmniejszonych rozmiarach wykazały, że agrochemikalia mogą wpływać na dorosłe matki pszczół miodnych poprzez zmniejszanie sukcesu krycia28, zmniejszanie składania jaj29 i zmniejszanie żywotności wyprodukowanych jaj25,30,31. Zjawiska te były wcześniej trudne do zaobserwowania bez użycia całych kolonii, głównie ze względu na brak dostępnych metod laboratoryjnych. Jednak metoda badania składania jaj królowej w ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych przy użyciu klatek do monitorowania królowej (QMC)32 została niedawno dostosowana do zbadania wpływu agrochemikaliów na płodność królowej33. W tym miejscu techniki te są szczegółowo opisane wraz z dodatkowymi metodami pomiaru i śledzenia spożycia diety pracowników w QMC.
Te metody są bardziej korzystne niż eksperymenty wymagające pełnowymiarowych kolonii, ponieważ pozwalają na podawanie precyzyjnych dawek agrochemikaliów znacznie zmniejszonej liczbie robotnic w stosunku do dziesiątek tysięcy zazwyczaj obecnych wewnątrz kolonii34, które następnie dostarczają królową. Ta technika ekspozycji odzwierciedla narażenie z drugiej ręki, którego królowe doświadczałyby w rzeczywistych scenariuszach, ponieważ w kolonii królowe nie żywią się same i polegają na robotnicach, które dostarczają im dietę9. Podobnie, królowe na ogół nie opuszczają ula, z wyjątkiem okresu rozmnażania kolonii (roju) w celu lotów godowych35. Kryte królowe pszczół miodnych można kupić od komercyjnych hodowców matek i wysłać z dnia na dzień. Zazwyczaj hodowcy matek sprzedają królowe bezpośrednio po potwierdzeniu, że zaczęły składać jaja, co jest uważane za wskaźnik udanego krycia. Jeśli potrzebne są dokładniejsze informacje na temat wieku matki lub pokrewieństwa, badacze mogą skonsultować się z hodowcą królowej przed złożeniem zamówienia.
QMCs pozwalają na precyzyjną obserwację i kwantyfikację składania jaj przez królową pszczoły miodnej oraz wskaźników wylęgu jaj32,33, dostarczając cennych danych związanych z wpływem ekspozycji agrochemicznej na płodność królowej. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki opisują eksperyment określający ilościowo składanie jaj, spożycie diety i żywotność zarodków w QMC pod wpływem przewlekłego narażenia na istotne dla pola stężenia ogólnoustrojowego neurotoksycznego pestycydu neonikotynoidowego imidakloprydu36. Po zastosowaniu imidaklopryd przemieszcza się do tkanek roślinnych37, a pozostałości zostały wykryte w pyłku i nektarze wielu roślin zapylanych przez pszczoły38,39,40. Narażenie na imidaklopryd może mieć szeroki zakres szkodliwych skutków dla pszczół miodnych, w tym upośledzenie wydajności żerowania16, upośledzenie funkcji immunologicznych41 oraz zmniejszenie szybkości ekspansji i przeżywalności kolonii42,43. W tym przypadku imidaklopryd został wybrany do użycia jako substancja badana, ponieważ eksperymenty terenowe wykazały, że może on wpływać na składanie jaj królowej pszczół miodnych29

<table><tbody><tr><td>Fluon</td><td>BioQuip, Rancho Dominguez, CA</td><td>2871A</td><td></td></tr><tr><td>Królowe pszczół miodnych</td><td>Olivarez Honey Bees, Orland, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imidaklopryd</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>37894</td><td></td></tr><tr><td>MegaBee w proszku</td><td>MegaBee, San Dieago, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 2 ml</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>02-682-004</td><td></td></tr><tr><td>Igły o grubości 20</td><td>W. W. Grainger, Lake Forest, IL</td><td>5FVK4</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan potasu</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Klatki monitorujące królową</td><td>University of Illinois Urbana-Champaign</td><td></td><td>Numer zgłoszenia patentowego: 20190350175</td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldritch, St. Louis, MO</td><td>S8501</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalne pokrywki do mikropłytek</td><td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA</td><td>5500</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Assessing Agrochemical Risk to Mated Honey Bee Queens

Obecne strategie oceny ryzyka dla pszczół miodnych opierają się głównie na testach laboratoryjnych przeprowadzanych na dorosłych lub niedojrzałych pszczołach robotnicach, ale te metody mogą nie uchwycić dokładnie wpływu ekspozycji agrochemicznej na królowe pszczół miodnych. Jako jedyny producent zapłodnionych jaj w kolonii pszczół miodnych, królowa jest prawdopodobnie najważniejszym pojedynczym członkiem funkcjonującej jednostki kolonijnej. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób agrochemikalia wpływają na zdrowie i produktywność królowych, powinno być uważane za kluczowy aspekt oceny ryzyka związanego z pestycydami. W tym miejscu przedstawiono dostosowaną metodę wystawiania królowych pszczół miodnych i matek robotnic na agrochemiczne czynniki stresogenne podawane w diecie robotnic, a następnie śledzenie produkcji jaj w laboratorium i ocenę pierwszego stadium rozwojowego za pomocą specjalistycznej klatki, zwanej klatką do monitorowania królowej. Aby zilustrować zamierzone zastosowanie metody, opisano wyniki eksperymentu, w którym robotnice karmiono dietą zawierającą subletalne dawki imidakloprydu i monitorowano wpływ na królowe.

Produkcję jaj monitorowano w QMC zmontowanych i utrzymywanych zgodnie z powyższym opisem, przeprowadzając obserwacje produkcji jaj raz dziennie w 15 klatkach na grupę badawczą. Nowo zapłodnione matki, pochodzące głównie z linii Carniola, zostały zakupione i dostarczone w przesyłce nocnej od hodowcy matek, a robotnice pszczół miodnych pozyskano z 3 kolonii utrzymywanych zgodnie ze standardowymi metodami komercyjnymi w The Bee Research Facility na University of Illinois Urbana-Champaign. Zastosowano 4 grupy dietetyczne: 1)...

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Current risk assessment strategies for honey bees rely heavily upon laboratory tests performed on adult or immature worker bees, but these methods may not ...

Narażenie na działanie agrochemikaliów może mieć duży wpływ na wszystkich członków rodziny pszczół miodnych, w tym na najważniejszego członka, królowe. Jednak do niedawna dostępnych było niewiele narzędzi do badania tych efektów. Technika ta pozwala naukowcom wystawić królowe na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych warunkach, które symulują warunki, jakich mogą doświadczyć na polu.Dość łatwo jest zakłócić zachowania królowej pszczół miodnych podczas składania jaj, dlatego ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z robotnicami i królowymi przed i w trakcie eksperymentu. Amy Floyd i Eliza Litsey, technicy laboratoryjni z Jednostki Badawczej ds. Gatunków Inwazyjnych i Zdrowia Zapylaczy, Laboratorium Badawczego Pszczół Miodnych, zademonstrują te procedury. Na początek zmontuj klatki do monitorowania królowej lub QMC, wkładając panele drzwi, a następnie włóż odstraszacz królowej w drzwiach komory karmienia nad komorą karmienia, aby zapobiec przedostawaniu się królowej i kontaktowaniu się z podawaną dietą.Wstaw pojedynczy ELP. Nie dodawaj rurek podajnika, dopóki robotnice nie zostaną dodane do klatki i tymczasowo przykryj cztery otwory podajnika taśmą laboratoryjną. Po zebraniu i wysiadowaniu woskowych ramek plastrów zawierających zakryty czerw robotnic z kolonii pszczół miodnych, zetrzyj zamknięte pszczoły do otwartego pojemnika wyłożonego farbą barierową dla owadów, aby zapobiec wypełzaniu pszczół.Dodać wagowo co najmniej 50 pszczół do komory składania jaj każdego QMC. Aby zapewnić wprowadzenie zróżnicowanej puli genetycznej, należy pozyskać podobną liczbę pszczół robotnic z co najmniej trzech rodzin i pozwolić im wymieszać się przed dodaniem pszczół do QMC. Dodać karmniki zawierające roztwór sacharozy, wodę i suplement pyłkowy.Używaj matek zakupionych od hodowcy komercyjnego w ciągu 48 godzin od otrzymania. Gdy królowa jest jeszcze w klatce transportowej, umieść ją w przezroczystej plastikowej torbie. Następnie umieść jeden koniec plastikowej rurki podłączonej do kanistra z dwutlenkiem węgla wewnątrz torby i delikatnie otwórz zawór kanistra, aby umożliwić przepływ dwutlenku węgla.Gdy worek zostanie napompowany gazem, jednocześnie zamknij zawór kanistra i przytrzymaj worek zamknięty, aby zatrzymać gaz w środku. Trzymaj torbę zamkniętą przez 30 sekund lub do momentu, gdy królowa przestanie się poruszać. Usuń królową, otwierając klatkę transportową, gdy zaobserwujesz, że królowa jest nieprzytomna.Częściowo otwórz drzwi do komory składania jaj, delikatnie umieść nieprzytomną królową w środku i zamknij pokrywę. Dodaj drugi ELP do każdego QMC. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej w poprzek górnej części dwóch ELP, aby zapobiec ich oddzieleniu się od ramy QMC i uniemożliwić pracownikom wyjście z klatki.Umieść klatki w ciemnym inkubatorze o stabilnych warunkach środowiskowych od 34 do 35 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 50-70%. Aby podawać dietę z dodatkiem agrochemikaliów, należy przygotować roztwory podstawowe agrochemikaliów w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak aceton, w stężeniu, które można dodać do diety, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenie agrochemikaliów będących przedmiotem zainteresowania. Zabiegi agrochemiczne należy podawać w roztworze sacharozy, komercyjnym suplemencie pyłkowym lub w obu.Przygotuj eksperymentalną dietę do użycia tego samego dnia, dodając odpowiednią ilość roztworu podstawowego do schłodzonego lub o temperaturze pokojowej, 50% roztworu sacharozy. Dokładnie wymieszaj, wirując ze średnią prędkością. W przypadku suplementów pyłkowych dodaj obliczoną ilość roztworu podstawowego agrochemikaliów do roztworu sacharozy i dokładnie wymieszaj przed dodaniem go do sproszkowanego suplementu.Dodaj dietę do probówek podajnika i zapisz wagę podajnika przed umieszczeniem ich w QMC. Aby określić ilościowo składanie jaj, zacznij od usunięcia QMC z inkubatora. Sprawdź grzbiety przezroczystych ELP, jeśli są obecne jaja, zdejmij panel drzwi przed tabliczką będącą przedmiotem zainteresowania.Usuń taśmę z poprzek ELP i wsuń panel drzwi między ELP a pszczoły wewnątrz QMC. Po założeniu panelu drzwi wyjmij ELP i policz oraz zapisz liczbę jaj w komórkach ELP. Usuń jaja, stukając krawędzią ELP otwartą stroną do dołu, o twardą powierzchnię.Gdy jaja wypadną, wymień pusty ELP w QMC. Delikatnie zdejmij i załóż panel drzwi za ELP na zewnątrz QMC. W razie potrzeby powtórz tę czynność z drugim ELP i po zakończeniu załóż taśmę w poprzek QMC.Aby monitorować spożycie żywności, co dwa dni zastępuj ją świeżo przygotowaną dietą. Przygotuj nowe rurki do karmienia i zważ je przed rozpoczęciem działań związanych z monitorowaniem produkcji jaj. Zamień stare probówki na nowe i zważ stare probówki przed ich wyrzuceniem.Porównaj końcową wagę rurki zasilającej i nieskonsumowanej diety z wagą tej samej tubki, aby oszacować spożycie diety. Sprawdzaj raz dziennie, aby upewnić się, że karmniki nigdy nie są puste. Jeśli rurka zasilająca jest pusta lub prawie pusta, wyjmij ją, napełnij ponownie, zapisz wagę rurki przed i po, a następnie dodaj różnicę do dwudniowej sumy spożycia diety dla QMC.W wybranym momencie podczas eksperymentu QMC należy usunąć ELP zawierające świeżo złożone jaja z QMC, jak opisano wcześniej, ale nie usuwać jaj z ELP. Przykryj ELP najpierw uszczelką płytki PCR, a następnie uniwersalną pokrywką mikropłytki i umieść ją w eksykatorze z nasyconym roztworem siarczanu potasu. Ocenić tempo wylęgu około 78 godzin po usunięciu ELP z QMC.Larwa w kształcie litery C na dnie komórki wskazuje na udane wylęganie. Jeśli QMC zostały zasiedlone nadmiarem robotnic, należy pobrać próbki pszczół robotnic w wybranym punkcie czasowym podczas eksperymentu, aby ocenić zmiany w ich fizjologii wywołane leczeniem. Przed pobraniem próbek należy umieścić panel drzwiowy między ELP a wnętrzem QMC i usunąć ELP.Ostrożnie podnieś panel drzwi około 0.5 centymetra od podstawy klatki i usuń pszczołę robotnicę z wnętrza QMC za pomocą pęsety o dużej wadze piórkowej. W celu analizy ekspresji genów należy zamrozić pszczoły w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Zachowaj zebraną pszczołę do dalszej analizy i powtarzaj ten proces, aż do pobrania żądanej liczby próbek.Zmiany w dziennej liczbie jaj związane z leczeniem imidakloprydem oceniano poprzez wdrożenie liniowego uogólnionego równania estymacji logarytmu Poissona z macierzą korelacji autoregresywnej. Dzienna produkcja jaj była znacznie niższa w QMC, którym podawano suplement pyłku i sacharozę zawierającą 50 części na miliard imidachloprydu. Zaobserwowano zależny od dawki wpływ na całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych w każdym QMC w przypadku leczenia imidakloprydem podawanego zarówno w suplemencie sacharozy, jak i pyłku.Największą redukcję zaobserwowano u QMC karmionych imidachloprydem w dawce 50 części na miliard, a następnie 10 części na miliard w suplemencie pyłkowym i sacharozy. Nie zaobserwowano różnicy w całkowitej liczbie wyprodukowanych jaj między grupą kontrolną a QMC karmionymi 10 częściami na miliard imidachloprydu i suplementem pyłkowym. Suplementację pyłku, spożycie wody i sacharozy rejestrowano co 48 godzin przez 10 lub 12 dni.Dzienne wskaźniki spożycia sacharozy znacznie wzrosły wraz z postępem eksperymentu, ale wskaźniki spożycia suplementów pyłkowych spadły. Wyższe wskaźniki spożycia pyłku zaobserwowano, gdy 10 części na miliard imidachloprydu podawano w samym suplemencie pyłkowym. Wskaźnik ten zmniejszył się, gdy 10 lub 50 części na miliard podawano razem w suplemencie pyłkowym i roztworze sacharozy.Wykorzystanie jednodniowych pszczół ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia akceptacji królowej i zmniejszenia nadmiernej reaktywacji robotnic. Bardzo ważne jest również ostrożne obchodzenie się z królową i utrzymywanie klatek w stabilnym środowisku.

assessing-agrochemical-risk-to-mated-honey-bee-queens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Tutaj opisujemy nasz szczegółowy protokół przygotowania jednokohortowych kolonii pszczół miodnych - użyteczne narzędzie do analizy fizjologii pracowników związanych z rolą. Opisujemy również szczegółowe protokoły leczenia pracowników hormonem juwenilnym i ekdyzonem, aby ocenić udział tych hormonów w regulacji zachowania i/lub fizjologii pracowników.

Przygotowanie kolonii jednokohortowych i leczenie hormonalne robotnic pszczół miodnych w celu analizy fizjologii związanej z rolą i/lub układem hormonalnym

Konsorcja mikrobiologiczne w ulach trzmieli wzbogacają i zachowują pyłek dla larw pszczół. Wykorzystując sekwencjonowanie nowej generacji, wraz z eksperymentami laboratoryjnymi i terenowymi, manuskrypt ten opisuje protokoły stosowane do testowania hipotezy, że pozostałości fungicydów zmieniają mikrobiom pyłku i demografię kolonii, ostatecznie prowadząc do utraty kolonii.

Techniki empiryczne, metagenomiczne i obliczeniowe rzucają światło na mechanizmy, za pomocą których fungicydy zagrażają zdrowiu pszczół

Niniejszym przedstawiamy metodę karmienia skażoną pestycydami żywnością zarówno pojedynczej pszczoły miodnej, jak i kolonii ula. Procedura ocenia wpływ pestycydów na poszczególne pszczoły miodne poprzez dokarmianie in vivo podstawową dietą larw, a także na naturalny stan rodziny pszczelej.

Ocena wpływu chemikaliów środowiskowych na rozwój pszczół miodnych od poziomu osobnika do poziomu kolonii

Utrata kolonii pszczół miodnych stanowi wyzwanie dla służb zajmujących się zapylaniem upraw. Obecne praktyki ochrony owadów zapylających uzasadniają alternatywne podejście do minimalizacji kontaktu pszczół miodnych ze szkodliwymi pestycydami przy użyciu odstraszających środków chemicznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowe metody protokołu śledzenia wizualnego w celu odstraszania pszczół.

Protokół śledzenia wideo w celu przesiewania środków chemicznych odstraszających pszczoły miodne

Subletalne dawki pestycydów mogą wpływać na kolonie w sposób, który jest trudny do wykrycia przy użyciu tylko metod okresowych lub wizualnych. Podano metody pomiaru całkowitej masy dorosłych pszczół, czerwiu i zasobów pokarmowych poprzez ważenie uli i części ula, fotografowanie ramek i instalowanie czujników. Poruszana jest również kwestia analizy danych.

Monitorowanie wpływu narażenia na subletalne pestycydy na pszczoły miodne na poziomie kolonii

Spraye fungicydowe na kwitnące rośliny mogą narażać samotne pszczoły na wysokie stężenia pozostałości fungicydów przenoszonych przez pyłki. Wykorzystując eksperymenty laboratoryjne z udziałem larw pszczół hodowanych in vitro, badanie to bada interaktywne efekty spożywania pyłku poddanego działaniu fungicydów pochodzącego z roślin żywicielskich i niebędących żywicielami.

In vitro Hodowla pszczół samotnic: narzędzie do oceny czynników ryzyka larw

Obecny protokół wyjaśnia metodę karmienia larwami samotnicy, pszczoły samotnicy, Osmia excavata, skażonymi pestycydami. W ramach procedury bada się ekotoksyczność pestycydu dla larw pszczół samotnic.

Ocena wpływu pestycydów na larwy pszczół samotnic

Pszczoły można poddać warunkowaniu w paradygmacie apetytywnego uczenia się węchowego (warunkowanie PER). Wykorzystując zapachy jako bodźce, opracowaliśmy metodę, w której rejestrowane jest zachowanie, przy jednoczesnym zastosowaniu obrazowania wapniowego w celu pomiaru aktywności wywołanej zapachem w neuronach ciała grzybowatego in vivo.

In vivo obrazowanie Ca2+ neuronów ciał grzybowych podczas uczenia się zapachów u pszczoły miodnej

Przedstawiamy nieinwazyjne podejście do pobierania próbek, umożliwiające efektywne gromadzenie próbek sierści od płochliwych małych ssaków, co zaprezentowano na przykładzie piki amerykańskiej. Wykazujemy użyteczność tej metody poprzez ekstrakcję DNA z pobranej sierści oraz amplifikację kilku typów markerów molekularnych powszechnie stosowanych w badaniach nad ekologią i ochroną dzikiej przyrody.

Nieinwazyjna technika pobierania próbek sierści w celu pozyskania wysokiej jakości DNA od trudnych do uchwycenia małych ssaków

Opisano przejrzystą, zestandaryzowaną metodę sekcji i izolacji serca danio pręgowanego na wielu etapach rozwoju. Omówiono również techniki adnotacji i kwantyfikacji.

Sekcja serca w larwalnym, młodzieżowym i dorosłym zebrafish, Danio rerio

Poznaj metodę oceny wpływu agrochemikaliów na matki pszczele w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Protokół QMC umożliwia badanie produktywności składania jaj i zdrowia kolonii.

Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Przeglądaj więcej filmów