Ocena ryzyka agrochemicznego dla krytych matek pszczół miodnych

Ten protokół został opracowany w celu lepszego zrozumienia, jak agrochemikalia wpływają na reprodukcję pszczół miodnych (Apis mellifera), poprzez ustanowienie metod wystawiania królowych pszczół miodnych i ich opiekunów na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych, laboratoryjnych warunkach i uważne monitorowanie ich odpowiednich reakcji.

Narażenie na działanie agrochemikaliów może mieć duży wpływ na wszystkich członków rodziny pszczół miodnych, w tym na najważniejszego członka, królowe. Jednak do niedawna dostępnych było niewiele narzędzi do badania tych efektów. Technika ta pozwala naukowcom wystawić królowe na działanie agrochemikaliów w kontrolowanych warunkach, które symulują warunki, jakich mogą doświadczyć na polu.

Dość łatwo jest zakłócić zachowania królowej pszczół miodnych podczas składania jaj, dlatego ważne jest, aby zachować ostrożność podczas obchodzenia się z robotnicami i królowymi przed i w trakcie eksperymentu. Amy Floyd i Eliza Litsey, technicy laboratoryjni z Jednostki Badawczej ds. Gatunków Inwazyjnych i Zdrowia Zapylaczy, Laboratorium Badawczego Pszczół Miodnych, zademonstrują te procedury. Na początek zmontuj klatki do monitorowania królowej lub QMC, wkładając panele drzwi, a następnie włóż odstraszacz królowej w drzwiach komory karmienia nad komorą karmienia, aby zapobiec przedostawaniu się królowej i kontaktowaniu się z podawaną dietą.

Wstaw pojedynczy ELP. Nie dodawaj rurek podajnika, dopóki robotnice nie zostaną dodane do klatki i tymczasowo przykryj cztery otwory podajnika taśmą laboratoryjną. Po zebraniu i wysiadowaniu woskowych ramek plastrów zawierających zakryty czerw robotnic z kolonii pszczół miodnych, zetrzyj zamknięte pszczoły do otwartego pojemnika wyłożonego farbą barierową dla owadów, aby zapobiec wypełzaniu pszczół.

Dodać wagowo co najmniej 50 pszczół do komory składania jaj każdego QMC. Aby zapewnić wprowadzenie zróżnicowanej puli genetycznej, należy pozyskać podobną liczbę pszczół robotnic z co najmniej trzech rodzin i pozwolić im wymieszać się przed dodaniem pszczół do QMC. Dodać karmniki zawierające roztwór sacharozy, wodę i suplement pyłkowy.

Używaj matek zakupionych od hodowcy komercyjnego w ciągu 48 godzin od otrzymania. Gdy królowa jest jeszcze w klatce transportowej, umieść ją w przezroczystej plastikowej torbie. Następnie umieść jeden koniec plastikowej rurki podłączonej do kanistra z dwutlenkiem węgla wewnątrz torby i delikatnie otwórz zawór kanistra, aby umożliwić przepływ dwutlenku węgla.

Gdy worek zostanie napompowany gazem, jednocześnie zamknij zawór kanistra i przytrzymaj worek zamknięty, aby zatrzymać gaz w środku. Trzymaj torbę zamkniętą przez 30 sekund lub do momentu, gdy królowa przestanie się poruszać. Usuń królową, otwierając klatkę transportową, gdy zaobserwujesz, że królowa jest nieprzytomna.

Częściowo otwórz drzwi do komory składania jaj, delikatnie umieść nieprzytomną królową w środku i zamknij pokrywę. Dodaj drugi ELP do każdego QMC. Umieść kawałek taśmy laboratoryjnej w poprzek górnej części dwóch ELP, aby zapobiec ich oddzieleniu się od ramy QMC i uniemożliwić pracownikom wyjście z klatki.

Umieść klatki w ciemnym inkubatorze o stabilnych warunkach środowiskowych od 34 do 35 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 50-70%. Aby podawać dietę z dodatkiem agrochemikaliów, należy przygotować roztwory podstawowe agrochemikaliów w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak aceton, w stężeniu, które można dodać do diety, aby osiągnąć pożądane końcowe stężenie agrochemikaliów będących przedmiotem zainteresowania. Zabiegi agrochemiczne należy podawać w roztworze sacharozy, komercyjnym suplemencie pyłkowym lub w obu.

Przygotuj eksperymentalną dietę do użycia tego samego dnia, dodając odpowiednią ilość roztworu podstawowego do schłodzonego lub o temperaturze pokojowej, 50% roztworu sacharozy. Dokładnie wymieszaj, wirując ze średnią prędkością. W przypadku suplementów pyłkowych dodaj obliczoną ilość roztworu podstawowego agrochemikaliów do roztworu sacharozy i dokładnie wymieszaj przed dodaniem go do sproszkowanego suplementu.

Dodaj dietę do probówek podajnika i zapisz wagę podajnika przed umieszczeniem ich w QMC. Aby określić ilościowo składanie jaj, zacznij od usunięcia QMC z inkubatora. Sprawdź grzbiety przezroczystych ELP, jeśli są obecne jaja, zdejmij panel drzwi przed tabliczką będącą przedmiotem zainteresowania.

Usuń taśmę z poprzek ELP i wsuń panel drzwi między ELP a pszczoły wewnątrz QMC. Po założeniu panelu drzwi wyjmij ELP i policz oraz zapisz liczbę jaj w komórkach ELP. Usuń jaja, stukając krawędzią ELP otwartą stroną do dołu, o twardą powierzchnię.

Gdy jaja wypadną, wymień pusty ELP w QMC. Delikatnie zdejmij i załóż panel drzwi za ELP na zewnątrz QMC. W razie potrzeby powtórz tę czynność z drugim ELP i po zakończeniu załóż taśmę w poprzek QMC.

Aby monitorować spożycie żywności, co dwa dni zastępuj ją świeżo przygotowaną dietą. Przygotuj nowe rurki do karmienia i zważ je przed rozpoczęciem działań związanych z monitorowaniem produkcji jaj. Zamień stare probówki na nowe i zważ stare probówki przed ich wyrzuceniem.

Porównaj końcową wagę rurki zasilającej i nieskonsumowanej diety z wagą tej samej tubki, aby oszacować spożycie diety. Sprawdzaj raz dziennie, aby upewnić się, że karmniki nigdy nie są puste. Jeśli rurka zasilająca jest pusta lub prawie pusta, wyjmij ją, napełnij ponownie, zapisz wagę rurki przed i po, a następnie dodaj różnicę do dwudniowej sumy spożycia diety dla QMC.

W wybranym momencie podczas eksperymentu QMC należy usunąć ELP zawierające świeżo złożone jaja z QMC, jak opisano wcześniej, ale nie usuwać jaj z ELP. Przykryj ELP najpierw uszczelką płytki PCR, a następnie uniwersalną pokrywką mikropłytki i umieść ją w eksykatorze z nasyconym roztworem siarczanu potasu. Ocenić tempo wylęgu około 78 godzin po usunięciu ELP z QMC.

Larwa w kształcie litery C na dnie komórki wskazuje na udane wylęganie. Jeśli QMC zostały zasiedlone nadmiarem robotnic, należy pobrać próbki pszczół robotnic w wybranym punkcie czasowym podczas eksperymentu, aby ocenić zmiany w ich fizjologii wywołane leczeniem. Przed pobraniem próbek należy umieścić panel drzwiowy między ELP a wnętrzem QMC i usunąć ELP.

Ostrożnie podnieś panel drzwi około 0.5 centymetra od podstawy klatki i usuń pszczołę robotnicę z wnętrza QMC za pomocą pęsety o dużej wadze piórkowej. W celu analizy ekspresji genów należy zamrozić pszczoły w ciekłym azocie i przechowywać je w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Zachowaj zebraną pszczołę do dalszej analizy i powtarzaj ten proces, aż do pobrania żądanej liczby próbek.

Zmiany w dziennej liczbie jaj związane z leczeniem imidakloprydem oceniano poprzez wdrożenie liniowego uogólnionego równania estymacji logarytmu Poissona z macierzą korelacji autoregresywnej. Dzienna produkcja jaj była znacznie niższa w QMC, którym podawano suplement pyłku i sacharozę zawierającą 50 części na miliard imidachloprydu. Zaobserwowano zależny od dawki wpływ na całkowitą liczbę jaj wyprodukowanych w każdym QMC w przypadku leczenia imidakloprydem podawanego zarówno w suplemencie sacharozy, jak i pyłku.

Największą redukcję zaobserwowano u QMC karmionych imidachloprydem w dawce 50 części na miliard, a następnie 10 części na miliard w suplemencie pyłkowym i sacharozy. Nie zaobserwowano różnicy w całkowitej liczbie wyprodukowanych jaj między grupą kontrolną a QMC karmionymi 10 częściami na miliard imidachloprydu i suplementem pyłkowym. Suplementację pyłku, spożycie wody i sacharozy rejestrowano co 48 godzin przez 10 lub 12 dni.

Dzienne wskaźniki spożycia sacharozy znacznie wzrosły wraz z postępem eksperymentu, ale wskaźniki spożycia suplementów pyłkowych spadły. Wyższe wskaźniki spożycia pyłku zaobserwowano, gdy 10 części na miliard imidachloprydu podawano w samym suplemencie pyłkowym. Wskaźnik ten zmniejszył się, gdy 10 lub 50 części na miliard podawano razem w suplemencie pyłkowym i roztworze sacharozy.

Wykorzystanie jednodniowych pszczół ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia akceptacji królowej i zmniejszenia nadmiernej reaktywacji robotnic. Bardzo ważne jest również ostrożne obchodzenie się z królową i utrzymywanie klatek w stabilnym środowisku.