Name: Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 13 min
Description: Poznaj metody donosowej immunizacji i pobierania mleka u królików nowozelandzkich w badaniach transferu przeciwciał matczynych. Protokoły umożliwiają ocenę odporności błonowej i translacyjne badania immunologiczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Wydziałowi Zasobów Zwierząt Laboratoryjnych na Uniwersytecie Duke'a i ich zespołowi hodowlanemu za pomoc i wspaniałą opiekę nad zwierzętami. Ponadto autorzy chcieliby podziękować zespołowi PhotoPath z Zakładu Patologii za pomoc w przygotowaniu części audio i wideo manuskryptu. Prace te były wspierane przez uznaniowe fundusze badawcze z laboratorium Staats.

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z polityką IACUC Uniwersytetu Duke'a.
UWAGA: Potrzebne materiały są podane w Tabeli Materiałów.
1. Uspokojenie i znieczulenie królika
<ol>
	<li>Uspokoić samicę królika (dojrzałą płciowo; w wieku około 5-30 miesięcy), podając acepromazynę domięśniowo (IM) w dawce 1 mg/kg. W zależności od wielkości zwierzęcia należy użyć strzykawki o pojemności 1 lub 3 ml z igłą o masie 25 g. Mięśnie osiowe są preferowanym miejscem wstrzyknięcia domięśniowego. 
	UWAGA: Acepromazyna może być również podawana podskórnie, ale IM jest preferowany przez laboratorium, ponieważ działa szybciej i zmniejsza częstość występowania zmian skórnych.</li>
	<li>Odczekaj 10-15 minut, aby acepromazyna zaczęła działać.</li>
	<li>Znieczulij królika izofluranem, umieszczając połączony stożek nosowy na nosie zwierzęcia. Dostosuj waporyzator do 4% izofluranu w połączeniu z tlenem do 4 litrów/minutę. Króliki mają dużą awersję do izofluranu, dlatego podczas maskowania zwierzęcia konieczna jest odpowiednia powściągliwość.</li>
	<li>Po całkowitym znieczuleniu, zgodnie z oceną za pomocą małżowiny usznej, pedału i/lub odruchu powiekowego, nałóż lubrykant okulistyczny na każde oko, aby zapobiec wysuszeniu oczu i późniejszemu owrzodzeniu rogówki.</li>
	<li>Stale monitoruj odruchy i oddech podczas znieczulenia i zmniejsz dawkę izofluranu do 1-2% po osiągnięciu odpowiedniej płaszczyzny znieczulenia.</li>
</ol>
2. Szczepienia donosowe
<ol>
	<li>Przygotować roztwór uodparniający przed przystąpieniem do kontaktu ze zwierzętami.</li>
	<li>Uspokój królika, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Gdy pracownik laboratorium jest gotowy do podania szczepionki, a królik znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia, wyłącz izofluran i tlen oraz usuń stożek nosowy.</li>
	<li>Umieść królika w pozycji leżącej grzbietowej i podeprzyj szyję i głowę pod kątem około 45°, który umożliwia łatwy dostęp i wizualizację obu nozdrzy przez członka laboratorium podającego szczepionkę.</li>
	<li>Załadować do pipety nie więcej niż 100 μl roztworu szczepionki i szybko podać roztwór do każdego nozdrza. Pipetę należy trzymać pod kątem około 45°, pod kątem w kierunku przyśrodkowej części przewodu nosowego. 
	UWAGA: Celem immunizacji jest kontakt roztworu z błoną śluzową nozdrzy, dlatego końcówki nie należy umieszczać w nozdrzach, ponieważ może to spowodować otarcie lub podrażnienie tkanek błony śluzowej i potencjalnie wpłynąć na immunogenność szczepionki podawanej donosowo. Szczepionkę należy podać szybko i w ten sam sposób w drugi środek.</li>
	<li>Po podaniu w oba kanały nosowe należy utrzymywać królika w pozycji leżącej grzbietowej przez 30 sekund, aby zminimalizować wyciek roztworu szczepionki. 
	UWAGA: Laboratorium zazwyczaj podaje jednorazowo nie więcej niż 100 μl na nozdrze. Jeżeli ma być podana większa objętość, maksymalnie 500 μl, szczepionka może być podawana w podwielokrotnościach 100 μl z 30-sekundowym okresem odpoczynku między szczepieniami i powtarzaniem dodatkowych podań szczepionki, z 30-sekundowym odpoczynkiem między każdym podaniem, aż do podania całkowitej objętości szczepionki.</li>
	<li>Po szczepieniu umieść królika na brzuszku w celu wyzdrowienia i ściśle monitoruj zwierzę, aż będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka.</li>
</ol>
3. Odbiór mleka
<ol>
	<li>Uspokój królika w okresie laktacji, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Oczyść skórę nad żyłą brzeżną ucha wacikiem/chusteczką nasączoną alkoholem.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 25 g podać dożylnie około 1-2 j.m. oksytocyny przez żyłę ucha brzeżnego w celu wywołania upływu mleka. 
	UWAGA: Ze względu na rozluźnienie mięśni gładkich często królik oddaje mocz lub kał po podaniu oksytocyny.</li>
	<li>Po podaniu oksytocyny należy uciskać miejsce wstrzyknięcia kawałkiem gazy.</li>
	<li>Trzymając maskę anestezjologiczną na nosie królika, podeprzyj królika na jego tylnych kończynach. 
	UWAGA: Pobieranie mleka można również przeprowadzić ze zwierzęciem w pozycji bocznej, ale laboratorium stwierdza, że pobieranie mleka jest łatwiejsze, gdy królik jest podparty na zadzie z asystentem trzymającym królika w pozycji pionowej za pomocą maski anestezjologicznej.</li>
	<li>Otwórz sterylną rurkę, aby przygotować się do pobrania mleka i zlokalizuj tkankę sutkową i związane z nią smoczki. Strzyki są zazwyczaj otoczone mokrym futrem po niedawnym karmieniu, a tkanka sutka jest łatwo wyczuwalna, gdy jest pełna mleka.</li>
	<li>Chwyć tkankę sutkową związaną ze smoczkiem między kciukiem a palcem wskazującym i delikatnie uciskaj tkankę gruczołową w kierunku smoczka. Umieścić probówkę zbiorczą nad smoczkiem, aby zebrać odciągnięte mleko. 
	UWAGA: Czasami może minąć kilka minut, zanim oksytocyna zacznie działać, a produkcja mleka wydaje się różnić w zależności od gruczołów sutkowych. Jeśli odciąganie pokarmu nie powiedzie się, odczekaj kilka minut lub obróć do dodatkowych gruczołów mlecznych. Mleko ze wszystkich strzyków można zebrać do tej samej fiolki. Zazwyczaj kilka mililitrów mleka można łatwo zebrać od karmiącej łani.</li>
	<li>Po pobraniu mleka należy wyłączyć izofluran i tlen i pozwolić królikowi dojść do siebie, będąc pod ścisłym nadzorem, dopóki zwierzę nie będzie w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż nie zostało to opisane w powyższym protokole, udana hodowla królików jest niezbędna dla tego modelu matczynego i umożliwienia odbioru mleka. Króliki są łatwo hodowane przez żywe osłony w warunkach badawczych. Zaleca się, aby kozły były przenoszone do klatki w celu rozmnażania, ponieważ mogą być terytorialne i agresywne, jeśli są trzymane we własnej klatce z kozłem. Jeśli samice nie są otwarte po 15 minutach (na co wskazuje ucieczka, gryzienie lub wokalizowanie), łania powinna zostać umieszczona z powrotem w jej w...

Badania nad szczepieniami matek i transferem przeciwciał są nieocenione z wielu powodów, ponieważ jest to początkowa droga transferu odporności i późniejszej ochrony przed patogenami i chorobami u noworodków i niemowląt. Szczepienia matek mogą potencjalnie pozytywnie wpłynąć zarówno na zdrowie matki, jak i niemowlęcia/dziecka na poziomie globalnym, zmniejszając zachorowalność i śmiertelność związaną z niektórymi patogenami w tym wrażliwym okresie1. Głównym celem tej strategii jest zwiększenie poziomu swoistych przeciwciał matczynych przez cały okres ciąży. Przeciwciała te mogą być następnie przenoszone do noworodka i niemowlęcia na poziomie wystarczającym do ochrony przed infekcjami, dopóki ich układ odpornościowy nie dojrzeje do odpowiedniego reagowania na wyzwania1,2,3. Wcześniejsze prace wykazały, że wyższe miana przeciwciał po urodzeniu są związane albo z pełną ochroną, albo opóźnionym początkiem i zmniejszonym nasileniem wielu różnych chorób zakaźnych u noworodków, w tym tężca, krztuśca, syncytialnego wirusa oddechowego (RSV), grypy i zakażeń paciorkowcowych grupy B1,2,3.
U ludzi przeciwciała matki są przenoszone pasywnie przez łożysko, a także są przenoszone przez mleko matki poprzez karmienie. Wcześniejsze prace wykazały, że poziomy IgA swoiste dla HIV w mleku matki zakażonej wirusem były związane ze zmniejszoną transmisją wirusa po urodzeniu, co sugeruje ochronną rolę mleka matki anty-HIV IgA4. Badania na naczelnych wykazały, że immunizacja przeciwko HIV może wywołać znaczącą odpowiedź przeciwciał w mleku matki i chociaż podobne odpowiedzi IgG w surowicy zostały wywołane po uodparnieniu ogólnoustrojowym w porównaniu z szczepieniem błony śluzowej, immunizacja błony śluzowej wywołała znacznie wyższą odpowiedź IgA w klasie milk5,6.
Identyfikacja odpowiedniego translacyjnie modelu zwierzęcego do tych badań powinna uwzględniać typ łożyska i mechanizmy pasywnego transferu przeciwciał, a także transfer przeciwciał przez mleko matki. Istnieją trzy główne typy łożyska u ssaków w zależności od typów tkanek i warstw na granicy matczyno-płodowej, w tym hemochorial (naczelne, gryzonie i króliki), śródbłonek (mięsożercy) i nabłonek (konie, świnie i przeżuwacze). Łożysko krwiokosmiczne jest najbardziej inwazyjnym typem, umożliwiającym bezpośrednią komunikację między dopływem krwi matki a kosmówką, czyli najbardziej zewnętrzną błoną płodu. W oparciu o liczbę warstw trofoblastu, istnieje kilka odmian łożyska hemochorialnego, w tym łożysko hemomonochoralne występujące u naczelnych, łożysko hemodichorialne u królików oraz łożysko hemotrichorialne obserwowane u szczurów i myszy7. Ten bezpośredni kontakt między dopływem krwi matki a kosmówką pozwala na bierne przenoszenie przeciwciał przez łożysko podczas ciąży. IgG jest jedyną klasą przeciwciał, która znacząco przekracza ludzką klasę łożyska<sup="xref">8, podczas gdy IgA jest dominującą klasą Ig występującą w mleku matki 9. Spośród naukowo istotnych modeli tylko naczelne (w tym ludzie), króliki i świnki morskie przenoszą IgG w macicy i IgA w klasie milk<sup="xref">10,11. Dlatego model królika obejmuje czynniki porównywalne z tymi u ludzi, które kontrolują przezłożyskowy transfer IgG i laktacyjny transfer IgA.
Oprócz tego, że służy jako wyjątkowy model dla odporności matki i opracowania szczepionki, podobieństwa między jamami nosowymi królika i człowieka czynią je odpowiednim modelem dla immunizacji donosowej. Objętość jamy nosowej królika jest bardziej zbliżona do ludzkiej niż do modeli gryzoni opartych na względnej masie ciała12. Dodatkowo, Casteleyn i in. 12 wykazali, że tkanka limfatyczna związana z nosem (NALT) jest bardziej obszerna u królików w porównaniu z gryzoniami. NALT znajduje się głównie w brzusznym i brzuszno-przyśrodkowym aspekcie brzusznego przewodu nosowego oraz w bocznym i grzbietowo-bocznym aspekcie ujścia nosowo-gardłowego u królików, podczas gdy u gryzoni tkanka limfatyczna jest obecna tylko wzdłuż brzusznego aspektu ujścia nosowo-gardłowego12. U królików struktura i lokalizacja limfocytów śródnabłonkowych i blaszki właściwej, a także izolowanych pęcherzyków limfoidalnych, są podobne do ludzkich12.
Dodatkowe zalety wykorzystania królika jako modelu odporności matczynej i śluzówkowej obejmują jego wysoką płodność i stosunkowo krótki okres ciąży. Duże naczynia krwionośne małżowiny usznej pozwalają na stosunkowo łatwy dostęp do dużych ilości krwi do seryjnych pobrań. Można pobrać różne próbki błony śluzowej do testów odpowiedzi przeciwciał swoistych dla antygenu, w tym mleko matki13 (podczas laktacji), wydzieliny śluzówkowe lub płukanie (np. oral14,15,16, płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe13,17,18,19, pochwy20,21,22) i feces20,23,24,25. Próbki mleka można łatwo pobrać w okresie laktacji, aby ocenić obecność odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu. Chociaż nie jest ich tak dużo, jak u ludzi i myszy, dostępna jest szeroka gama odczynników eksperymentalnych do badań i testów specyficznych dla królików. W tym artykule opiszemy i zademonstrujemy immunizację donosową i pobieranie mleka u królików nowozelandzkich białych (Oryctolagus cuniculus).

<table><tbody><tr><td>Immunizacja donosowa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia Machine/Vaporizer</td><td>Vet Equip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>Igła podskórna (25 g)</td><td>Terumo</td><td>07-806-7584</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (butelka 250 ml)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>2-4%</td></tr><tr><td>Strzykawka Luer Lock (1 mL)</td><td>Air-Tite</td><td>07-892-7410</td><td></td></tr><tr><td>Szczepionka błony śluzowej</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Eksperymentalna szczepionka</td></tr><tr><td>stożek nosowy</td><td>McCulloch Medical</td><td>07891-1097</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>VWR</td><td>53503-290</td><td></td></tr><tr><td>Piper</td><td>VWR</td><td>89079-962</td><td></td></tr><tr><td>PromAce (maleinian acepromazyny)</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>07-893-5734</td><td>1mg/kg IM</td></tr><tr><td>Puralube Sterylny Maść okulistyczna</td><td>Dechra</td><td>07-888-2572</td><td></td></tr><tr><td>Milk Collection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol Prep 2-warstwowy</td><td>Covidien</td><td>07-839-8871</td><td></td></tr><tr><td>Maszyna anestezjologiczna/parownik</td><td>Vet Equip</td><td>901807</td><td></td></tr><tr><td>Igły podskórne (25 g)</td><td>Terumo</td><td>07-806-7584</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran (butelka 250 ml)</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>2-4%</td></tr> <tr><td>Strzykawka Luer Lock (1 ml)</td> <td>Air-Tite</td><td>07-892-7410</td><td></td></tr><tr><td>Gąbka włókninowa (4x4)</td> <td>Covidien</td><td>07-891-5815</td><td></td></tr><tr><td>Stożek nosowy</td><td>McCulloch Medical</td><td>07891-1097</td><td></td></tr><tr><td>PromAce (maleinian acepromazyny)</td> <td>Boehringer Ingelheim</td><td>07-893-5734</td><td>1 mg / kg IM</td></tr><tr><td>Puralube Sterylny Maść oftalmiczna</td><td>Dechra</td><td>07-888-2572</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna fiolka stożkowa (15 ml)</td><td>Falcon</td><td>14-959-49B</td><td></td></tr></tbody></table>

immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (oryctolagus cuniculus)

Intranasal Immunization and Milk Collection in Studies of Maternal Immunization in New Zealand White Rabbits (Oryctolagus cuniculus)

Ze względu na podobieństwa w łożyskowaniu i przenoszeniu przeciwciał u ludzi, króliki są doskonałym modelem immunizacji matek. Dodatkowymi zaletami tego modelu badawczego są łatwość hodowli i pobierania próbek, stosunkowo krótki okres ciąży oraz duże rozmiary miotów. Powszechnie oceniane drogi szczepień obejmują szczepienie podskórne, domięśniowe, donosowe i śródskórne. Nieterminalne pobieranie próbek w celu chronologicznego wykrycia odpowiedzi immunologicznej na te szczepienia obejmuje pobieranie krwi, zarówno od matek, jak i kociąt, oraz mleka od karmiących samic. W tym artykule przedstawimy techniki wykorzystane przez nasze laboratorium w badaniach nad szczepieniami matek u królików białych z Nowej Zelandii (Oryctolagus cuniculus), w tym immunizacją donosową i zbieraniem mleka.

Przegląd typowego projektu badania nadylowej immunizacji samic przedstawiono na Rysunku 1, obejmując immunizacje, kojenie, mioty, laktację oraz transfer przeciwciał. Choć nie został on zilustrowany, krew należy pobrać przed pierwszą immunizacją w celu dokonania pomiarów bazowych oraz w regularnych odstępach czasu przez resztę badania. Krew można łatwo pobrać z centralnej tętnicy ucha przy zastosowaniu łagodnej sedacji i miejscowego środka przeciwbólowego (np. kremu z lidokainą 2,5% i pryloka...

Ten artykuł opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych oraz pobieranie mleka od królików w okresie laktacji (Oryctolagus cuniculus) jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnie odpowiednim modelu immunizacji matki.

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

Due to similarities in placentation and antibody transfer with humans, rabbits are an excellent model of maternal immunization. Additional advantages of ...

Badania nad immunizacją matki i transferem przeciwciał są nieocenione z wielu powodów, ponieważ jest to początkowa droga transferu odporności i późniejszej ochrony przed patogenami i chorobami u noworodków i niemowląt. Ze względu na podobieństwa w łożyskowaniu i przenoszeniu przeciwciał z ludźmi, króliki są doskonałym modelem immunizacji matek. W tym artykule wideo pokazujemy techniki wykorzystane przez nasze laboratorium w badaniach nad szczepieniami matek u białych królików nowozelandzkich, w tym immunizacją donosową i zbieraniem mleka.Najpierw opiszemy przykładową oś czasu i serię wydarzeń dla badania szczepień błony śluzowej matki u białych królików w Nowej Zelandii. Samice królików są immunizowane drogą donosową, jak pokazano w tym filmie. W zależności od badania, szczepionka może wymagać dawki przypominającej lub może być konieczne podanie jej dodatkową drogą, taką jak szczepienie domięśniowe.Chociaż nie zostało to przedstawione, krew powinna być pobierana przed początkowym szczepieniem w celu pomiarów wyjściowych i przez pozostałą część badania w regularnych odstępach czasu. Krew jest łatwo pobierana przez centralną tętnicę ucha z łagodną sedacją i miejscowym środkiem przeciwbólowym. W próbkach tych można zmierzyć obecność poziomów IgG specyficznych dla antygenu.Następnie hodowane są króliki. Preferujemy kupowanie sprawdzonych hodowców od dostawców, aby zapewnić wyższy wskaźnik ciąż w tych badaniach. W zależności od harmonogramu szczepień, króliki mogą otrzymywać dodatkowe szczepienia przez cały okres ciąży.Swoista dla antygenu IgG jest przenoszona przezłożyskowo do zestawów. Około 30 do 32 dni po rozrodze ciężarne samice zapalą się. Zalecamy ograniczenie obchodzenia się z zestawami przez pierwsze kilka dni, aby zminimalizować odrzucenie przez łanie.Próbki krwi można pobrać z zestawów w celu oceny poziomów IgG specyficznych dla antygenu, które zostały przeniesione przezłożyskowo. Krew można pobrać z niewielkiej liczby kociąt w momencie narodzin lub w pobliżu tego momentu w celu oceny wczesnego poziomu przeciwciał specyficznych dla antygenu. Oprócz szerokiej gamy składników odżywczych, zestawy otrzymują swoistą antygenowo IgA od karmiącej łań podczas karmienia.Kocięta są zwykle odsadzane od piersi w wieku od czterech do ośmiu tygodni. Przed odsadzeniem mleko można łatwo pobrać od łań w okresie laktacji, jak pokazano na tym filmie. Pobrane próbki mleka są następnie przetwarzane w celu wykrycia IgA swoistej dla antygenu.W zależności od badania, do zestawów można podać szczepionki i dawkę przypominającą, a seryjne próbki krwi można pobrać z zestawów w bardzo młodym wieku przy użyciu bocznej żyły odpiszczelowej. Zademonstrujemy teraz immunizację donosową i pobieranie mleka u nowozelandzkich białych królików.Protokół. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z zasadami Duke University Institutional Animal Care And Use Committee.Immunizacja donosowa. Potrzebne materiały: acepromazyna, strzykawka i igła, lubrykant okulistyczny, izofluran, stożek nosowy, pipeta i końcówki pipet, szczepionka śluzówkowa. Przygotować roztwór uodparniający przed przystąpieniem do kontaktu ze zwierzętami.Króliki są uspokajane acepromazyną w ilości jednego miligrama na kilogram domięśniowo i znieczulane izofluranem za pomocą stożka nosowego. Po całkowitym znieczuleniu, zgodnie z oceną odruchu powiekowego, do każdego oka dodaje się lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu i późniejszemu owrzodzeniu rogówki. Gdy pracownik laboratorium jest gotowy do podania szczepionki, a królik znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia, wyłącz izofluran i tlen oraz usuń stożek nosowy.Umieść królika w pozycji leżącej grzbietowej i podeprzyj szyję i głowę pod kątem około 45 stopni, który umożliwia łatwy dostęp i wizualizację obu alarów przez członka laboratorium podającego szczepionkę. Załadować do pipety nie więcej niż 100 mikrolitrów roztworu szczepionki i szybko podać roztwór do jednego nozdrza i powtórzyć procedurę dla drugiego nozdrza. Pipetę należy trzymać pod kątem około 45 stopni.Kąt w kierunku przyśrodkowej części przewodu nosowego. Celem immunizacji jest, aby roztwór stykał się z błonami śluzowymi nozdrzy. Dlatego końcówka nie powinna być umieszczana w nozdrzach, ponieważ może to spowodować otarcie lub podrażnienie tkanek błony śluzowej i potencjalnie wpłynąć na immunogenność szczepionki podawanej donosowo.Szczepionkę należy podać szybko i w ten sam sposób do drugiego nozdrza. Po podaniu w oba kanały nosowe, królik jest utrzymywany w pozycji leżącej grzbietowej przez 30 sekund, aby zminimalizować wyciek roztworu szczepionki. Laboratorium zazwyczaj podaje jednorazowo nie więcej niż 100 mikrolitrów na nozdrze.Jeśli ma być podana większa objętość przy maksymalnej całkowitej objętości 500 mikrolitrów, szczepionka może być podawana w podwielokrotnościach 100 mikrolitrów z 30-sekundowym okresem odpoczynku między szczepieniami. Oraz dodatkowe podania szczepionki powtarzane z 30-sekundowym odpoczynkiem między każdym podaniem, aż do podania całkowitej objętości szczepionki. Po szczepieniu umieść królika na brzuszku w celu wyzdrowienia i ściśle monitoruj zwierzę, aż będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka.W niektórych przypadkach preparat szczepionki może nie zostać całkowicie dostarczony do jamy nosowej, a część preparatu szczepionki może pozostać na zewnętrznej części nozdrzy. W takim przypadku, ponieważ nie jest jasne, jaka jest dokładna objętość szczepionki, która została prawidłowo dostarczona do jamy nosowej, nie należy zalecać ponownego stosowania dodatkowego materiału szczepionkowego, ponieważ dodałoby to nieokreśloną zmienną do eksperymentu. Ważne jest, aby stosować technikę podawania szczepionki, która zapewnia pełne i spójne dostarczanie preparatu szczepionki do nozdrzy.Odbiór mleka. Potrzebne materiały: acepromazyna, strzykawki i igły, wacik nasączony alkoholem, gaza, lubrykant okulistyczny, izofluran, stożek nosowy, oksytocyna i fiolka do pobrania. Króliki są uspokajane acepromazyną w ilości jednego miligrama na kilogram domięśniowo i znieczulane izofluranem za pomocą stożka nosowego.Po całkowitym znieczuleniu, zgodnie z oceną odruchu powiekowego, na każde oko nakłada się lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu i późniejszemu owrzodzeniu rogówki. Oczyść skórę nad żyłą brzeżną ucha wacikiem nasączonym alkoholem. Za pomocą strzykawki o średnicy 1 milimetra i igły o rozmiarze 25 należy podać dożylnie około jednej do dwóch jednostek międzynarodowych oksytocyny przez żyłę ucha brzeżnego w celu wywołania wypływu mleka.Ze względu na rozluźnienie mięśni gładkich często królik oddaje mocz lub kał po podaniu oksytocyny. Po podaniu oksytocyny należy uciskać miejsce wstrzyknięcia kawałkiem gazy, aby zapewnić hemostazę. Utrzymując maskę anestezjologiczną lub stożek nosowy nad nosem królika, podeprzyj królika na jego tylnych kończynach.Na marginesie, pobieranie mleka może być również wykonywane ze zwierzęciem w pozycji bocznej, ale laboratorium stwierdza, że pobieranie jest łatwiejsze, gdy królik jest oparty na zadzie z asystentem trzymającym królika pionowo za pomocą maski anestezjologicznej. Otwórz sterylną rurkę, aby przygotować się do pobrania mleka i zlokalizuj tkankę sutkową i związane z nią smoczki. Króliki zazwyczaj mają od czterech do pięciu par gruczołów sutkowych.Strzyki są zazwyczaj otoczone mokrym futrem po niedawnym karmieniu, a tkanka sutka jest łatwo wyczuwalna, gdy jest pełna mleka. Chwyć tkankę sutkową związaną ze smoczkiem między kciukiem a palcem wskazującym i delikatnie masuj tkankę gruczołową w kierunku smoczka. Umieścić probówkę zbiorczą nad smoczkiem, aby zebrać odciągnięte mleko.Czasami może minąć kilka minut, zanim oksytocyna zacznie działać, a produkcja mleka wydaje się różnić w zależności od gruczołów sutkowych. Jeśli odciąganie pokarmu nie powiedzie się, odczekaj kilka minut lub obróć do dodatkowego gruczołu sutkowego. Mleko ze wszystkich strzyków można zbierać w tym samym podłym.Zazwyczaj kilka mililitrów mleka można łatwo zebrać od karmiącej łani. Po zebraniu żądanej objętości mleka należy wyłączyć izofluran i tlen oraz usunąć stożek nosowy z królika i pozwolić królikowi dojść do siebie, będąc pod ścisłym nadzorem do czasu, gdy zwierzę będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka. Reprezentatywne wyniki.Rysunek pierwszy. W przypadku badań na matkach ustalenie ciąży tak wcześnie, jak to możliwe, jest pomocne w potwierdzeniu, że łania nie musi być ponownie rozmnażana. Opcje wykrywania ciąży obejmują badanie palpacyjne, ultrasonografie, zdjęcia rentgenowskie, przyrost masy ciała i techniki molekularne, takie jak pomiary czynników wzrostu insuliny i progesteronu.Odpowiedni poziom progesteronu jest niezbędny do utrzymania ciąży u królików. W związku z tym w kilku badaniach oceniano również poziom progesteronu u ciężarnych królików i wykazano podwyższony poziom w porównaniu z królikami niebędącymi w ciąży, szczególnie podczas organogenezy około połowy ciąży. Jak pokazano na rycinie pierwszej, podwyższony poziom progesteronu można wykryć u ciężarnych królików w porównaniu z królikami niebędącymi w ciąży, nawet po potwierdzeniu krycia przez kozła dla wszystkich łań.Poziom progesteronu w surowicy mierzono za pomocą automatycznego testu chemiluminescencyjnego. Rysunek drugi. Swoiste dla antygenu IgG, które zostały przeniesione przezłożyskowo podczas ciąży, można zmierzyć w surowicy kociąt za pomocą testu Elisa.Krew można pobrać z niewielkiej liczby kociąt w momencie narodzin lub w pobliżu tego momentu w celu oceny wczesnego poziomu przeciwciał specyficznych dla antygenu. Seryjne pobieranie krwi jest technicznie znacznie łatwiejsze, ponieważ zestawy starzeją się i zwiększają swój rozmiar. Jak pokazano na rycinie drugiej, poziomy IgG specyficznych dla antygenu w surowicy w zestawach można zmierzyć i porównać z poziomami matczynymi.Poziomy IgG przenoszonych przez matkę są wyższe po urodzeniu i zmniejszają się z czasem. Rysunek trzeci. Mleko królicze można zebrać, jak pokazano na tym filmie, i przetworzyć w celu zmierzenia całkowitego i specyficznego dla antygenu poziomu przeciwciał za pomocą testu Elisa.Jak pokazano na tym rysunku, IgA stanowi znaczną część wszystkich przeciwciał w mleku matki, które są dostępne do biernego transferu do zestawów. Zarówno poziomy IgA, jak i IgG są znacznie wyższe niż IgM.Streszczenie. Ten artykuł wideo opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych i pobieranie mleka od królików w okresie laktacji jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnym modelu immunizacji matki.Na zdjęciu przedstawiono obraz podsumowujący typowy projekt badania immunizacji donosowej matki, obejmujący szczepienia, hodowlę, rozpalanie, laktację i transfer przeciwciał.

intranasal-immunization-milk-collection-studies-maternal-immunization

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie opisujemy technikę podawania interesującego roztworu do przewodu sutkowego królika i potwierdzamy dostarczenie za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe królika: miejscowe dostarczanie roztworu będącego przedmiotem zainteresowania do gruczołu sutkowego królika

W tym filmie pokazujemy inokulację konkanawaliny A, mitogenu limfocytów, do dolnego gruczołu łzowego oka królika w celu wywołania choroby suchego oka. Obrazy ultrasonograficzne lub ultrasonograficzne są wykorzystywane do precyzyjnego określenia miejsca wstrzyknięcia, a także do potwierdzenia powodzenia inokulacji.

Wstrzyknięcie konkanawaliny A pod kontrolą USG do dolnego gruczołu łzowego: technika inokulacji dolnego gruczołu łzowego konkanawaliną A w celu wywołania zespołu suchego oka w modelu królika

Ten film demonstruje donosową immunizację BCG u myszy, aktywując zarówno wrodzoną, jak i adaptacyjną odpowiedź immunologiczną, prowadząc do rozwoju rezydujących w płucach limfocytów T pamięci i efektorowych limfocytów B, zwiększając w ten sposób ochronę przed infekcjami Mycobacterium.

Immunizacja donosowa BCG w modelu mysim

Niedawny rozwój narzędzi do celowania w geny umożliwia produkcję królików nokautujących (KO). W niniejszej pracy wygenerowaliśmy pięć królików Apolipoproteiny (Apo) C-III KO przy użyciu nukleaz palca cynkowego (ZFN). Prace te wykazały, że ZFN jest wysoce wydajną metodą produkcji królików KO.

Produkcja królików z nokautem apolipoproteiny C-III przy użyciu nukleaz palca cynkowego

Pobieranie mleka z modeli zwierzęcych ułatwia różne ścieżki badań: zrozumienie odporności biernej, identyfikację patogenów odpowiedzialnych za transgeniczne przenoszenie i, dzięki wykorzystaniu transgenicznych myszy, nawet komercyjną produkcję białek znajdujących się w ludzkim mleku matki. Tutaj ilustrujemy prostą metodę zbierania mleka u myszy i jeleni muntjac Reevesa.

Metody zbierania mleka dla myszy i jelenia Muntjac Reevesa

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Chociaż europejskie króliki są gatunkiem społecznym, utrzymanie ich w bezpiecznym miejscu może być wyzwaniem. Dlatego konieczne jest dokładne zrozumienie zachowań i struktur społecznych królików laboratoryjnych trzymanych w parach. W tym miejscu przedstawiamy protokół identyfikacji metod łączenia w pary, typowych dla gatunku zachowań ustanawiających hierarchię oraz zachowań, które uzasadniają odpowiednią interwencję.

Metody łączenia w pary i utrzymywania par białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus) za pomocą etogramu behawioralnego, monitorowania i interwencji

Opisano metodę produkcji przeciwciał jednodomenowych od alpak, w tym immunizację, pobieranie krwi, izolację komórek B i selekcję.

Immunizacja alpak (Lama pacos) antygenami białkowymi i wytwarzanie przeciwciał jednodomenowych specyficznych dla antygenu

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Ten protokół opisuje technikę zarządzania ciążą i żywieniem dla królików przeniesionych na zarodki i genetycznie zmodyfikowanych, mającą na celu zmniejszenie śmiertelności nowonarodzonych królików i zwiększenie efektywności przygotowania królików z edytowanymi genami.

Postępowanie w sprawie ciąży i karmienia królikami przeniesionymi na zarodki i zmodyfikowanymi genetycznie

Poznaj metody donosowej immunizacji i pobierania mleka u królików nowozelandzkich w badaniach transferu przeciwciał matczynych. Protokoły umożliwiają ocenę odporności błonowej i translacyjne badania immunologiczne.

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus) (Wideo) | JoVE Journal

Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

Przeglądaj więcej filmów