Immunizacja donosowa i pobieranie mleka w badaniach immunizacji matek u białych królików nowozelandzkich (Oryctolagus cuniculus)

Badania nad immunizacją matki i transferem przeciwciał są nieocenione z wielu powodów, ponieważ jest to początkowa droga transferu odporności i późniejszej ochrony przed patogenami i chorobami u noworodków i niemowląt. Ze względu na podobieństwa w łożyskowaniu i przenoszeniu przeciwciał z ludźmi, króliki są doskonałym modelem immunizacji matek. W tym artykule wideo pokazujemy techniki wykorzystane przez nasze laboratorium w badaniach nad szczepieniami matek u białych królików nowozelandzkich, w tym immunizacją donosową i zbieraniem mleka.

Najpierw opiszemy przykładową oś czasu i serię wydarzeń dla badania szczepień błony śluzowej matki u białych królików w Nowej Zelandii. Samice królików są immunizowane drogą donosową, jak pokazano w tym filmie. W zależności od badania, szczepionka może wymagać dawki przypominającej lub może być konieczne podanie jej dodatkową drogą, taką jak szczepienie domięśniowe.

Chociaż nie zostało to przedstawione, krew powinna być pobierana przed początkowym szczepieniem w celu pomiarów wyjściowych i przez pozostałą część badania w regularnych odstępach czasu. Krew jest łatwo pobierana przez centralną tętnicę ucha z łagodną sedacją i miejscowym środkiem przeciwbólowym. W próbkach tych można zmierzyć obecność poziomów IgG specyficznych dla antygenu.

Następnie hodowane są króliki. Preferujemy kupowanie sprawdzonych hodowców od dostawców, aby zapewnić wyższy wskaźnik ciąż w tych badaniach. W zależności od harmonogramu szczepień, króliki mogą otrzymywać dodatkowe szczepienia przez cały okres ciąży.

Swoista dla antygenu IgG jest przenoszona przezłożyskowo do zestawów. Około 30 do 32 dni po rozrodze ciężarne samice zapalą się. Zalecamy ograniczenie obchodzenia się z zestawami przez pierwsze kilka dni, aby zminimalizować odrzucenie przez łanie.

Próbki krwi można pobrać z zestawów w celu oceny poziomów IgG specyficznych dla antygenu, które zostały przeniesione przezłożyskowo. Krew można pobrać z niewielkiej liczby kociąt w momencie narodzin lub w pobliżu tego momentu w celu oceny wczesnego poziomu przeciwciał specyficznych dla antygenu. Oprócz szerokiej gamy składników odżywczych, zestawy otrzymują swoistą antygenowo IgA od karmiącej łań podczas karmienia.

Kocięta są zwykle odsadzane od piersi w wieku od czterech do ośmiu tygodni. Przed odsadzeniem mleko można łatwo pobrać od łań w okresie laktacji, jak pokazano na tym filmie. Pobrane próbki mleka są następnie przetwarzane w celu wykrycia IgA swoistej dla antygenu.

W zależności od badania, do zestawów można podać szczepionki i dawkę przypominającą, a seryjne próbki krwi można pobrać z zestawów w bardzo młodym wieku przy użyciu bocznej żyły odpiszczelowej. Zademonstrujemy teraz immunizację donosową i pobieranie mleka u nowozelandzkich białych królików.Protokół. Wszystkie procedury zostały zatwierdzone i wykonane zgodnie z zasadami Duke University Institutional Animal Care And Use Committee.

Immunizacja donosowa. Potrzebne materiały: acepromazyna, strzykawka i igła, lubrykant okulistyczny, izofluran, stożek nosowy, pipeta i końcówki pipet, szczepionka śluzówkowa. Przygotować roztwór uodparniający przed przystąpieniem do kontaktu ze zwierzętami.

Króliki są uspokajane acepromazyną w ilości jednego miligrama na kilogram domięśniowo i znieczulane izofluranem za pomocą stożka nosowego. Po całkowitym znieczuleniu, zgodnie z oceną odruchu powiekowego, do każdego oka dodaje się lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu i późniejszemu owrzodzeniu rogówki. Gdy pracownik laboratorium jest gotowy do podania szczepionki, a królik znajduje się w odpowiedniej płaszczyźnie znieczulenia, wyłącz izofluran i tlen oraz usuń stożek nosowy.

Umieść królika w pozycji leżącej grzbietowej i podeprzyj szyję i głowę pod kątem około 45 stopni, który umożliwia łatwy dostęp i wizualizację obu alarów przez członka laboratorium podającego szczepionkę. Załadować do pipety nie więcej niż 100 mikrolitrów roztworu szczepionki i szybko podać roztwór do jednego nozdrza i powtórzyć procedurę dla drugiego nozdrza. Pipetę należy trzymać pod kątem około 45 stopni.

Kąt w kierunku przyśrodkowej części przewodu nosowego. Celem immunizacji jest, aby roztwór stykał się z błonami śluzowymi nozdrzy. Dlatego końcówka nie powinna być umieszczana w nozdrzach, ponieważ może to spowodować otarcie lub podrażnienie tkanek błony śluzowej i potencjalnie wpłynąć na immunogenność szczepionki podawanej donosowo.

Szczepionkę należy podać szybko i w ten sam sposób do drugiego nozdrza. Po podaniu w oba kanały nosowe, królik jest utrzymywany w pozycji leżącej grzbietowej przez 30 sekund, aby zminimalizować wyciek roztworu szczepionki. Laboratorium zazwyczaj podaje jednorazowo nie więcej niż 100 mikrolitrów na nozdrze.

Jeśli ma być podana większa objętość przy maksymalnej całkowitej objętości 500 mikrolitrów, szczepionka może być podawana w podwielokrotnościach 100 mikrolitrów z 30-sekundowym okresem odpoczynku między szczepieniami. Oraz dodatkowe podania szczepionki powtarzane z 30-sekundowym odpoczynkiem między każdym podaniem, aż do podania całkowitej objętości szczepionki. Po szczepieniu umieść królika na brzuszku w celu wyzdrowienia i ściśle monitoruj zwierzę, aż będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka.

W niektórych przypadkach preparat szczepionki może nie zostać całkowicie dostarczony do jamy nosowej, a część preparatu szczepionki może pozostać na zewnętrznej części nozdrzy. W takim przypadku, ponieważ nie jest jasne, jaka jest dokładna objętość szczepionki, która została prawidłowo dostarczona do jamy nosowej, nie należy zalecać ponownego stosowania dodatkowego materiału szczepionkowego, ponieważ dodałoby to nieokreśloną zmienną do eksperymentu. Ważne jest, aby stosować technikę podawania szczepionki, która zapewnia pełne i spójne dostarczanie preparatu szczepionki do nozdrzy

Odbiór mleka. Potrzebne materiały: acepromazyna, strzykawki i igły, wacik nasączony alkoholem, gaza, lubrykant okulistyczny, izofluran, stożek nosowy, oksytocyna i fiolka do pobrania. Króliki są uspokajane acepromazyną w ilości jednego miligrama na kilogram domięśniowo i znieczulane izofluranem za pomocą stożka nosowego.

Po całkowitym znieczuleniu, zgodnie z oceną odruchu powiekowego, na każde oko nakłada się lubrykant okulistyczny, aby zapobiec wysuszeniu oczu i późniejszemu owrzodzeniu rogówki. Oczyść skórę nad żyłą brzeżną ucha wacikiem nasączonym alkoholem. Za pomocą strzykawki o średnicy 1 milimetra i igły o rozmiarze 25 należy podać dożylnie około jednej do dwóch jednostek międzynarodowych oksytocyny przez żyłę ucha brzeżnego w celu wywołania wypływu mleka.

Ze względu na rozluźnienie mięśni gładkich często królik oddaje mocz lub kał po podaniu oksytocyny. Po podaniu oksytocyny należy uciskać miejsce wstrzyknięcia kawałkiem gazy, aby zapewnić hemostazę. Utrzymując maskę anestezjologiczną lub stożek nosowy nad nosem królika, podeprzyj królika na jego tylnych kończynach.

Na marginesie, pobieranie mleka może być również wykonywane ze zwierzęciem w pozycji bocznej, ale laboratorium stwierdza, że pobieranie jest łatwiejsze, gdy królik jest oparty na zadzie z asystentem trzymającym królika pionowo za pomocą maski anestezjologicznej. Otwórz sterylną rurkę, aby przygotować się do pobrania mleka i zlokalizuj tkankę sutkową i związane z nią smoczki. Króliki zazwyczaj mają od czterech do pięciu par gruczołów sutkowych.

Strzyki są zazwyczaj otoczone mokrym futrem po niedawnym karmieniu, a tkanka sutka jest łatwo wyczuwalna, gdy jest pełna mleka. Chwyć tkankę sutkową związaną ze smoczkiem między kciukiem a palcem wskazującym i delikatnie masuj tkankę gruczołową w kierunku smoczka. Umieścić probówkę zbiorczą nad smoczkiem, aby zebrać odciągnięte mleko.

Czasami może minąć kilka minut, zanim oksytocyna zacznie działać, a produkcja mleka wydaje się różnić w zależności od gruczołów sutkowych. Jeśli odciąganie pokarmu nie powiedzie się, odczekaj kilka minut lub obróć do dodatkowego gruczołu sutkowego. Mleko ze wszystkich strzyków można zbierać w tym samym podłym.

Zazwyczaj kilka mililitrów mleka można łatwo zebrać od karmiącej łani. Po zebraniu żądanej objętości mleka należy wyłączyć izofluran i tlen oraz usunąć stożek nosowy z królika i pozwolić królikowi dojść do siebie, będąc pod ścisłym nadzorem do czasu, gdy zwierzę będzie w stanie utrzymać pozycję leżącą mostka. Reprezentatywne wyniki.

Rysunek pierwszy. W przypadku badań na matkach ustalenie ciąży tak wcześnie, jak to możliwe, jest pomocne w potwierdzeniu, że łania nie musi być ponownie rozmnażana. Opcje wykrywania ciąży obejmują badanie palpacyjne, ultrasonografie, zdjęcia rentgenowskie, przyrost masy ciała i techniki molekularne, takie jak pomiary czynników wzrostu insuliny i progesteronu.

Odpowiedni poziom progesteronu jest niezbędny do utrzymania ciąży u królików. W związku z tym w kilku badaniach oceniano również poziom progesteronu u ciężarnych królików i wykazano podwyższony poziom w porównaniu z królikami niebędącymi w ciąży, szczególnie podczas organogenezy około połowy ciąży. Jak pokazano na rycinie pierwszej, podwyższony poziom progesteronu można wykryć u ciężarnych królików w porównaniu z królikami niebędącymi w ciąży, nawet po potwierdzeniu krycia przez kozła dla wszystkich łań.

Poziom progesteronu w surowicy mierzono za pomocą automatycznego testu chemiluminescencyjnego. Rysunek drugi. Swoiste dla antygenu IgG, które zostały przeniesione przezłożyskowo podczas ciąży, można zmierzyć w surowicy kociąt za pomocą testu Elisa.

Krew można pobrać z niewielkiej liczby kociąt w momencie narodzin lub w pobliżu tego momentu w celu oceny wczesnego poziomu przeciwciał specyficznych dla antygenu. Seryjne pobieranie krwi jest technicznie znacznie łatwiejsze, ponieważ zestawy starzeją się i zwiększają swój rozmiar. Jak pokazano na rycinie drugiej, poziomy IgG specyficznych dla antygenu w surowicy w zestawach można zmierzyć i porównać z poziomami matczynymi.

Poziomy IgG przenoszonych przez matkę są wyższe po urodzeniu i zmniejszają się z czasem. Rysunek trzeci. Mleko królicze można zebrać, jak pokazano na tym filmie, i przetworzyć w celu zmierzenia całkowitego i specyficznego dla antygenu poziomu przeciwciał za pomocą testu Elisa.

Jak pokazano na tym rysunku, IgA stanowi znaczną część wszystkich przeciwciał w mleku matki, które są dostępne do biernego transferu do zestawów. Zarówno poziomy IgA, jak i IgG są znacznie wyższe niż IgM.Streszczenie. Ten artykuł wideo opisuje i demonstruje podawanie szczepionek donosowych i pobieranie mleka od królików w okresie laktacji jako sposób oceny odporności błony śluzowej w translacyjnym modelu immunizacji matki.

Na zdjęciu przedstawiono obraz podsumowujący typowy projekt badania immunizacji donosowej matki, obejmujący szczepienia, hodowlę, rozpalanie, laktację i transfer przeciwciał.