Name: Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Poznaj mikrofluidyczną metodę modulacji oscylacji sygnalizacyjnych w mysich zarodkach. Technika umożliwia precyzyjną synchronizację endogennych oscylacji Notch i badanie ich roli w somitogenezie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Jesteśmy wdzięczni Yang Li i Jos Malda z UMC Utrecht za pomoc w drukowaniu 3D form, Karen van den Anker z grupy Sonnen za bardzo przydatne informacje zwrotne na temat protokołu, oraz Tjeerd Faase z warsztatu mechanicznego w Instytucie Hubrechta za uchwyt do mikroprzepływowych układów scalonych w mikroskopie. Serdecznie dziękujemy całej grupie Sonnen za krytyczną lekturę manuskryptu, a recenzentom za konstruktywną opinię. Prace te otrzymały dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych w ramach umowy o grant ERBN nr 850554 dla K.F.S.

<ol><li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+live+imaging+links+HES5+dynamics+with+cell-state+and+fate+in+murine+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jag1+modulates+an+oscillatory+Dll1-Notch-Hes1+Signaling+module+to+coordinate+growth+and+fate+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors.</a> Developmental Cell. , 1-17 (2020).</li>
<li>Hubaud, A., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+plays+a+major+role+in+the+segmentation+clock+controlling+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
<li>Sonnen, K. F., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signal+encoding+-+From+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic signal encoding - From cells to organisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).</li>
<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+pipeline+for+systematic+modulation+and+analysis+of+3D+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.</a> Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineers+are+from+PDMS-land%2C+biologists+are+from+polystyrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li>
<li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).</li>
<li>Lo, J. F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+control+of+oxygen+microenvironment+at+the+single+islet+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).</li>
<li>Keil, W., Kutscher, L. M., Shaham, S., Siggia, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+of+developing+C.+elegans+larvae+with+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging of developing C. elegans larvae with microfluidics.</a> Developmental Cell. 40 (2), 202-214 (2017).</li>
<li>Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Drosophila+embryonic+patterning+network+perturbed+in+space+and+time+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics.</a> Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. , (2020).</li>
<li>Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D%C2%B5F+-+Interactive+design+environment+for+continuous+flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
<li>Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography+for+micro-+and+nanoscale+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Soft lithography for micro- and nanoscale patterning.</a> Nature Protocols. 5 (3), 491-502 (2010).</li>
<li>Yoshioka-kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+delay+controls+synchronized+oscillation+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock.</a> Nature. 16, (2019).</li>
<li>Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+frequency+analysis+for+biological+data+-+pyBOAT%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+Interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Dettinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+system+for+dynamic+stimulation+and+tracking+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).</li>
<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 965, 960-965 (2019).</li>
<li>Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for%3A+Caenorhabditis+elegans+culture+and+oxygen+consumption+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements.</a> Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

To, w jaki sposób dynamika sygnalizacji kontroluje systemy wielokomórkowe, jest od dawna pytaniem w tej dziedzinie. Badania funkcjonalne stanowią kluczowe wyzwanie, ponieważ dynamika ta musi być subtelnie modulowana, aby to umożliwić. Taką czasową kontrolę nad perturbacjami szlaku można w zasadzie osiągnąć za pomocą optogenetyki, która umożliwia również wysoką kontrolę przestrzenną34. Jednak optogenetyka wymaga ustanowienia wyrafinowanych narzędzi genetycznych do analizy każdego szlaku sygnałowego, o którym mowa. Opisany tutaj obecny protokół zapewnia bardzo wszechstronne narzędzie do perturbacji dowolnej ścieżki sygnałowej. Eksperyment mikrofluidyczny pozwala na zastosowanie czasowo sterowanych impulsów leków w celu funkcjonalnego zbadania dynamiki szlaków sygnałowych w kulturach tkankowych. W tym przypadku nacisk kładziony jest na badanie somitogenezy w kulturach ex vivo , ale protokół można dostosować do dowolnych innych systemów modelowych.
Niektóre kroki w protokole mają kluczowe znaczenie dla przeprowadzenia udanego eksperymentu mikrofluidycznego (podsumowane w Tabeli 1). Kluczowe punkty omówiono w następujący sposób. Ze względu na przepływ medium w trakcie eksperymentu, kultura tkankowa doświadcza naprężeń ścinających. Wystawienie systemu modelowego na ciągły przepływ może powodować stres komórkowy, a w skrajnych przypadkach śmierć komórki z powodu efektu ścinania. W przypadku hodowli tkankowych ex vivo mysich pąków ogonowych i obecnej konstrukcji chipa stwierdzono, że natężenie przepływu wynoszące 60 μl/h (maksymalnie 100 μl/h) działa dobrze przy minimalnym efekcie ścinania. Gdy wiele pomp jest włączanych jednocześnie dla tego samego chipa, natężenie przepływu poszczególnych pomp musi być odpowiednio dostosowane, aby nie powodować wzrostu całkowitego natężenia przepływu. Gdy obecny protokół zostanie dostosowany do innych systemów modelowych i projektów chipów, natężenie przepływu powinno zostać zoptymalizowane. Alternatywnie możliwe jest nie spłukiwanie medium w sposób ciągły, ale okresowa wymiana medium na chipie35. Taki układ można również zastosować do kontrolowania oscylacji sygnalizacyjnych w somitogenezie myszy (niepublikowane, dane nie pokazane). Co więcej, można również wyobrazić sobie konfigurację, w której hodowle tkankowe nie są narażone na bezpośredni przepływ płynów, ale leki docierają do tkanki poprzez dyfuzję z sąsiedniego kanału. Systemy te zostały z powodzeniem wykorzystane do zastosowania gradientów czynników wzrostu do modeli różnicowania ESC in vitro 14,36.
Jednym z głównych problemów związanych z eksperymentami mikroprzepływowymi jest występowanie pęcherzyków powietrza na chipie podczas eksperymentu. Pęcherzyki powietrza w chipie lub rurki mogą zakłócać równomierny przepływ cieczy na chipie i mogą prowadzić do usunięcia kultury zarodka z jego lokalizacji. Aby zapobiec obecności pęcherzyków powietrza, niezbędne są różne etapy protokołu. Po pierwsze, pożywka hodowlana w strzykawkach i sam chip mikroprzepływowy muszą zostać odgazowane za pomocą eksykatora (krok 3.1.3). Po drugie, podczas ładowania próbek do wlotów załadowczych należy uważać, aby nie wlać powietrza do chipa razem z próbką (krok 3.2.3). Po trzecie, podczas napełniania rurki medium, wszystkie pęcherzyki powietrza muszą zostać wypompowane przed zamocowaniem chipa (krok 3.3.2). W przeciwnym razie bąbelki te zostaną wepchnięte do głównego chipa podczas eksperymentu. Wreszcie, podczas eksperymentu, podłoże jest równoważone w komorze obrazowania lub inkubatorze dzięki półprzepuszczalnym rurkom. Przepuszczalność rurki pozwala również na odparowanie medium, dlatego należy upewnić się, że wilgotność jest regulowana podczas eksperymentu, aby zapobiec tworzeniu się nowych pęcherzyków w wężyku.
Ogólnie rzecz biorąc, mikrofluidyka jest bardzo wszechstronnym narzędziem, które można dostosować do konkretnego pytania badacza. Obecne podejście projektowe pozwala na obrazowanie do 12 kultur ex vivo równolegle na chip. Liczba ta jest ograniczona głównie liczbą zarodków w eksperymencie i czasem potrzebnym do zobrazowania każdej kultury zarodka z wystarczającą rozdzielczością. Jeśli w jednym eksperymencie trzeba porównać wiele warunków, wiele chipów można zamontować na jednym szklanym szkiełku. Zapewniona jest konstrukcja chipa, która jest idealna do równoległego obrazowania wielu eksplantatów tkanek, ale spersonalizowane projekty mogą przezwyciężyć ograniczenia w liczbie próbek, aby umożliwić analizę o wysokiej przepustowości i zwiększyć kombinację większej liczby warunków w jednym eksperymencie16,17. Mikrofluidyka jest ograniczona do modeli, które mogą być hodowane na chipie, a kultura na chipie będzie musiała być zoptymalizowana dla każdego systemu modelowegoindywidualnie 27,37,38.
W ciągu ostatnich 5-10 lat mikrofluidyka została zastosowana do rozwiązywania różnych problemów biologicznych ze względu na jej potencjał w zakresie podejść o wysokiej przepustowości i subtelnych modulacji dynamiki sygnalizacji i gradientów. W dzisiejszych czasach mikrofluidyka stała się łatwym w zastosowaniu, tanim i wszechstronnym narzędziem, które laboratoria mogą z łatwością opracować. W tym przypadku obecny protokół jest zoptymalizowany pod kątem konkretnego zastosowania, a mianowicie badania dynamiki sygnalizacji rządzącej somitogenezą. Łatwo jest dostosować ten protokół i projekt do indywidualnych pytań badawczych w biologii tkankowej.

Rozwój jest kontrolowany przez komunikację międzykomórkową za pośrednictwem szlaków sygnałowych. Istnieje tylko ograniczona liczba szlaków sygnałowych, które koordynują złożone tworzenie tkanek i prawidłowe różnicowanie komórek w przestrzeni i czasie. Aby regulować tę mnogość procesów, informacje mogą być zakodowane w dynamice ścieżki sygnałowej, zmianie ścieżki w czasie, takiej jak częstotliwość lub czas trwania sygnału1,2.
Podczas somitogenezy, tkanka somityczna jest okresowo oddzielana od mezodermy presomitycznej (PSM)3. PSM jest przestrzennie zorganizowany przez gradienty Wnt, czynnika wzrostu fibroblastów (FGF) i sygnalizacji kwasu retinowego. W przednim PSM na froncie oznaczania, gdzie sygnały Wnt i FGF są niskie, komórki są przygotowywane do różnicowania w somitach. Różnicowanie następuje, gdy fala aktywacji transkrypcyjnej dociera do tego frontu determinacji. W obrębie PSM oscylują sygnalizacje Wnt, FGF i Notch. Sąsiednie komórki oscylują nieznacznie w fazie, co powoduje fale oscylacyjnej aktywacji transkrypcji za szlakami Wnt, FGF i Notch przemieszczającymi się od tylnego do przedniego PSM. W zarodkach myszy fala transkrypcyjna dociera do frontu oznaczania mniej więcej co 2 godziny i inicjuje tworzenie somitów. Badanie somitogenezy poprzez zakłócanie lub aktywowanie szlaków sygnałowych może zilustrować znaczenie tych szlaków4,5,6,7,8,9. Jednak, aby móc zbadać funkcję dynamiki sygnalizacji w kontroli zachowania komórkowego, konieczne jest subtelne modulowanie szlaków sygnałowych zamiast ich trwałej aktywacji lub hamowania.
Aby czasowo modulować aktywność szlaku sygnałowego w segmentowanym zarodku myszy, Sonnen i in. opracowali system mikroprzepływowy10. System ten pozwala na ścisłą kontrolę przepływu płynów w mikrokanałach chipa, który zawiera próbkę biologiczną11. Aby zbadać znaczenie dynamiki sygnalizacji dla prawidłowej segmentacji PSM, ta konfiguracja mikrofluidyczna jest wykorzystywana do modulowania dynamiki sygnalizacji mysiego zegara segmentacyjnego ex vivo. Poprzez sekwencyjne pulsowanie aktywatorów lub inhibitorów szlaku do komory hodowlanej, uzyskuje się zewnętrzną kontrolę dynamiki sygnalizacji Wnt, FGF i Notch10. Na przykład, możliwa jest modyfikacja okresu poszczególnych szlaków i relacji fazowej między wieloma oscylacyjnymi szlakami sygnałowymi. Korzystając z jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym dynamicznych reporterów sygnalizacyjnych, można przeanalizować wpływ porywania na same szlaki, różnicowanie i tworzenie somitów. Korzystając z tego poziomu kontroli nad dynamiką sygnalizacji, podkreślono znaczenie zależności fazowej między szlakami sygnałowymi Wnt i Notch podczas somitogenezy10.
Spersonalizowane projekty chipów pozwalają na mnóstwo opcji perturbacji czasoprzestrzennych w środowisku lokalnym, np. stabilne tworzenie gradientu12,13,14,15, aktywacja/hamowanie pulsacji10,16,17,18 lub zlokalizowane perturbacje19,20. Mikrofluidyka może również umożliwić bardziej powtarzalny odczyt i wyższą przepustowość dzięki automatyzacji obsługi eksperymentalnej21,22,23. Obecny protokół ma na celu wprowadzenie mikrofluidyki i porywania endogennych oscylacji sygnalizacyjnych w tkankach do każdego standardowego laboratorium nauk przyrodniczych. Nawet przy braku zaawansowanego sprzętu do generowania chipów, takiego jak pomieszczenia czyste i sprzęt do miękkiej litografii, chipy mikroprzepływowe mogą być produkowane i wykorzystywane do rozwiązywania problemów biologicznych. Formy można projektować za pomocą ogólnodostępnego oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Formę do generowania chipów mikroprzepływowych, zwykle składającą się z polidimetylosiloksanu (PDMS), można wydrukować za pomocą drukarki 3D lub zamówić w firmach poligraficznych. W ten sposób chipy mikroprzepływowe mogą być produkowane w ciągu jednego dnia bez konieczności stosowania drogiego sprzętu24. W tym miejscu dostarczony jest projekt chipa, za pomocą którego za pomocą drukarki 3D można wydrukować formę do porywania zegara segmentacji myszy w dwuwymiarowych (2D) kulturach ex vivo25.
Hodowle na chipie i precyzyjne zakłócenia, możliwe dzięki mikrofluidyce, mają wyjątkowy potencjał w odkrywaniu molekularnych mechanizmów kontroli zachowań wielokomórkowych szlaków sygnałowych. Dynamika sygnalizacji i gradienty morfogenu są wymagane dla wielu procesów w rozwoju. Wcześniej laboratoria hodowały komórki, tkanki i całe organizmy w chipach mikroprzepływowych, a protokoły do czasoprzestrzennych zakłóceń głównie hodowli komórkowych 2D są dostępne gdzie indziej12,26,27,28,29. Zastosowanie mikrofluidyki do modulacji lokalnych środowisk w układach wielokomórkowych otwiera nowe perspektywy dla wysokoprzepustowych i precyzyjnych perturbacji czasoprzestrzennych. Dziedzina mikrofluidyki osiągnęła obecnie punkt, w którym stała się niespecjalistycznym, niedrogim i łatwym do zastosowania narzędziem dla biologów rozwojowych.
Tutaj dostępny jest protokół do załadowania zegara segmentacji myszy do impulsów inhibitora sygnalizacji Notch. Taki eksperyment składa się z następujących etapów: (1) wytworzenia chipa mikroprzepływowego, (2) przygotowania rurki i pokrycia chipa, oraz (3) samego eksperymentu mikroprzepływowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Badania obejmujące systemy modelowe kręgowców wymagają uprzedniej zgody etycznej właściwej komisji.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka 10 ml</td><td>Becton, Dickinson and company</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 Utwardzacz z elastomeru silikonowego</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 Elastomer silikonowy PDMS</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>strzykawki 3 ml</td><td>Becton, Dickinson i spółka</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Taśma</td><td></td><td></td> klejąca <td>Scotch Magic lub podobna</td></tr><tr><td>Kleszczyki z końcówką Bochem 18/10 Stal nierdzewna</td><td>Fisher Scientific</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej Liofilizowane pH ~ 7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>System sprężonego powietrza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Naczynie krystalizujące</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>Sterylizowany</td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza 45%</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>Eksykator</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>Kubki jednorazowe</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>Widelce jednorazowe</td><td>Zszywki</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt do</td><td></td><td></td><td></td>preparacji</tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Technologie hodowli komórkowych</td><td>niestandardowe</td><td>DMEM/F-12, bez czerwieni fenolowej, bez L-glutaminy, bez glukozy</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Kaptur przepływowy BioVanguard Greenline</td><td>CleanAir firmy Baker</td><td>511514</td><td>Do źródła światła UV</td></tr><tr><td>Szkiełko szklane nr 1,5H wysoka precyzja, 70x70 mm</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Bufor</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Leica SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>Igły 22G</td><td>Becton, dickinson i Firma</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Piekarnik</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Piec plazmowy Femto</td><td>Diener elektroniczny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dziurkacz & Oslash; 1mm</td><td>Uni-Core</td><td>WB100073</td> Skala Sartorius <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>Entris</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Rurka i Oslash; 1mm</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

Okresowa segmentacja mezokremy presomitycznej rozwijającego się zarodka myszy jest kontrolowana przez sieć szlaków sygnałowych. Uważa się, że oscylacje i gradienty sygnalizacyjne kontrolują odpowiednio czas i odstępy tworzenia segmentów. Chociaż zaangażowane szlaki sygnałowe były intensywnie badane w ciągu ostatnich dziesięcioleci, brakowało bezpośrednich dowodów na funkcję oscylacji sygnałowych w kontrolowaniu somitogenezy. Aby umożliwić funkcjonalne badanie dynamiki sygnalizacji, mikrofluidyka jest wcześniej uznanym narzędziem do subtelnej modulacji tej dynamiki. Dzięki temu podejściu opartemu na porywaniu mikrofluidyki, endogenne oscylacje sygnalizacyjne są synchronizowane przez impulsy modulatorów szlaku. Umożliwia to modulację np. okresu oscylacji lub zależności fazowej między dwiema ścieżkami oscylacji. Ponadto można ustalić gradienty przestrzenne modulatorów szlaku wzdłuż tkanki, aby zbadać, w jaki sposób określone zmiany w gradientach sygnałowych wpływają na somitogenezę.
Obecny protokół ma na celu pomóc w ustanowieniu metod mikroprzepływowych dla początkujących użytkowników mikrofluidyki. Opisano podstawowe zasady i sprzęt potrzebny do skonfigurowania systemu mikroprzepływowego, a także dostarczono projekt chipa, za pomocą którego można wygodnie przygotować formę do generowania chipów za pomocą drukarki 3D. Na koniec omówiono sposób hodowli pierwotnej tkanki myszy na chipie mikroprzepływowym i jak porywać oscylacje sygnałowe do zewnętrznych impulsów modulatorów szlaku.
Ten system mikroprzepływowy może być również przystosowany do przechowywania innych systemów modelowych in vivo i in vitro, takich jak gastruloidy i organoidy, do funkcjonalnego badania dynamiki sygnalizacji i gradientów morfogenów w innych kontekstach.

W niniejszym protokole przedstawiono metodę zewnętrznego synchronizowania oscylacji sygnałowych zegara segmentacyjnego myszy z wykorzystaniem mikroprzepływów. Poprzez stosowanie pulsów inhibitora szlaku Notch, oscylacje sygnałowe w niezależnych kulturach embrionów zostają zsynchronizowane między sobą10. Warunkiem wstępnym zastosowania tego systemu do badania funkcjonalności zegara segmentacyjnego jest utrzymanie dynamiki sygnałowej oraz procesu segmentacji na chipie. Wykazano wcześniej, że dynamika sygnałowa zarówno szlaku Wnt, jak i Notch jest zachowana pomimo stałego przepływu medium, a tworzenie granic fizycznych utrzymuje się w obwodowych kulturach 2D reprezentujących przednią część PSM10.
Aby potwierdzić synchronizację oscylacji sygnalizacyjnych z zewnętrznymi impulsami leku, podczas eksperymentu mikroprzepływowego wykonuje się obrazowanie w czasie rzeczywistym, na przykład reportera sygnalizacji Notch LuVeLu5, który wykazuje ekspresję żółtego białka fluorescencyjnego Venus. Ponieważ orientacja kultur 2D na chipie jest trudna do kontrolowania, analizowane są oscylacje sygnalizacyjne w tkance przedniej. Peryferia kultury 2D mogą być wykrywane w sposób powtarzalny. Orientacja przekrojów tkankowych na chipie nie może być kontrolowana dowolnie, a cała wewnętrzna powierzchnia chipa zostaje pokryta fibronektyną. W związku z tym zdarza się, że kultury przywierają do ścianek bocznych lub górnej ścianki chipa. W przypadku, gdy próbki przesuną się poza pole widzenia (w kierunku x, y i z) lub przywierną końcem tylnym ogona skierowanym w dół, próbki te są zazwyczaj wykluczane.
W celu dalszej analizy łączy się wiele takich eksperymentów synchronizacji. Niezależne eksperymenty można dopasować do siebie, wykorzystując czas podawania impulsów leku, wizualizowany za pomocą barwnika Cascade Blue przy długości fali około 400 nm. Aby przeanalizować i zwizualizować synchronizację, ilościowo określone oscylacje można poddać detrendowaniu (Rycyna 2B,D), a następnie przedstawić jako średnią i odchylenie standardowe lub obliczyć fazy oscylacji. Pozwala to na analizę relacji fazowej między oscylacjami niezależnych kultur tylnych części embrionów a sobą nawzajem oraz względem zewnętrznych impulsów leku (Rycyna 2C,E). Program pyBOAT oparty na języku python33 jest prostym i przyjaznym dla użytkownika narzędziem do wyznaczania okresu, fazy i amplitudy takich oscylacji sygnalizacyjnych. Aby potwierdzić synchronizację, można na przykład wyznaczyć okres endogennych oscylacji sygnalizacyjnych. Przy stosowaniu impulsów o okresie 130 min, oscylacje sygnalizacji Notch wykazują również okres 130 min (Rycyna 2F)10. Ponadto, dzięki zastosowaniu impulsów Cascade Blue, niezależne eksperymenty z różnymi reporterami sygnalizacji można dopasować do siebie. W ten sposób można pośrednio wyznaczyć relację fazową między oscylacjami wielu reporterów sygnalizacji10.
W związku z powyższym, przedstawiony system mikroprzepływowy umożliwia kontrolę oscylacji sygnałowych w kulturach ex vivo rozwijającego się zarodka myszy. W połączeniu z obrazowaniem markerów formowania i różnicowania segmentów, system ten może być teraz wykorzystany do analizy interakcji między szlakami sygnałowymi zegara segmentacyjnego oraz sposobu, w jaki kontrolują one powstawanie somytów.
<img alt="Schemat układu mikrofluidycznego: wytwarzanie chipa, przygotowanie PDMS, analiza tkanek w badaniach embrionalnych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Schematyczny przegląd protokołu mikrofluidycznego. (A) Formy do chipów można projektować przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD). Przedstawiono projekt chipa do wymuszania oscylacji sygnałowych w modelach ex vivo somitogenezy myszy. Formy można na przykład wytworzyć za pomocą druku 3D lub zamówić. Chipy mikrofluidyczne są produkowane poprzez odlewanie PDMS. Utwardzony chip z PDMS jest wycinany i kowalencyjnie wiązany z szkiełkiem przedmiotowym za pomocą pieca plazmowego. Powierzchnia szkła wewnątrz chipa jest powlekana fibronektyną, aby umożliwić przyleganie wypreparowanej tkanki. Tkanka embrionalna jest wprowadzana do chipa przez wloty załadowcze, które są następnie zamykane. Do wlotów chipa podłącza się pompy z różnymi warunkami pożywek i inicjuje program przepływu. Podczas eksperymentu tkankę można obrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego. (Kymografy zaadaptowane z Sonnen et al., 201810. Przedrukowane i zmodyfikowane z Cell zgodnie z licencją Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Schematyczna konstrukcja formy do hodowli tkanek tylnej części embrionu myszy na chipie. Wysokość kanałów mikrofluidycznych wynosi 500 µm, co jest wystarczające dla hodowli tylnych części ogonów embrionów myszy. Plik do wydrukowania tej formy znajduje się w Pliku uzupełniającym 1, a alternatywa podana jest w Pliku uzupełniającym 2. (C) Obraz w świetle przechodzącym przekroju ogona myszy E10.5 zamkniętego przez filary PDMS na chipie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat oscylacji endogennych; detekcja LuVeLu; wpływ DAPT; wykresy analizy fazowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki eksperymentu mikrofluidycznego. (A) Schematyczna reprezentacja eksperymentu synchronizacji z użyciem pomp do medium i leku. Impulsy modulatora szlaku sygnalizacyjnego są aplikowane do kultur ex vivo embrionów myszy, a oscylacje sygnalizacji można wizualizować poprzez obrazowanie w czasie rzeczywistym dynamicznych reporterów sygnalizacji (na przykład reportera sygnalizacji Notch LuVeLu5 oraz reportera sygnalizacji Wnt Axin2T2A10). Linie przerywane wskazują obszar wykorzystywany do analiz w czasie. (B-F) Oscylacje reportera LuVeLu są synchronizowane przez okresowe impulsy inhibitora sygnalizacji Notch DAPT. (B,D) Ilościowe oznaczenia oscylacji sygnalizacji Notch w przedniej części PSM po synchronizacji z użyciem DAPT lub kontroli DMSO. (C,E) Wykresy relacji faza-faza między fazą oscylacji sygnalizacji Notch a czasem zewnętrznych impulsów DAPT/DMSO. W przypadku synchronizacji ustanawiana jest stabilna relacja fazowa. (F) Ilościowe oznaczenie średniego okresu i SEM oscylacji reportera z porównaniem próbek synchronizowanych impulsami DMSO i DAPT. (Rysunek zaadaptowany z Sonnenet al., 201810. Przedrukowano i zmodyfikowano z Cell zgodnie z licencją Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Problem</td>
			<td>Sugerowane rozwiązanie(ia)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">PDMS nie wiąże się ze szkłem.</td>
			<td>- Upewnij się, że zarówno PDMS, jak i szkło są czyste.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Upewnij się, że wokół komory znajduje się wystarczająca ilość PDMS w celu zapewnienia wiązania.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Zoptymalizować ustawienia pieca plazmowego.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Na moim chipie znajdują się pęcherzyki powietrza.</td>
			<td>- Sprawdzić, czy pompa została włączona.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>– Odgazuj chip przed wprowadzeniem tkanki na chip.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Odgazuj podłoże przed rozpoczęciem eksperymentu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Należy upewnić się, że wilgotność w komorze inkubacyjnej jest wystarczająco wysoka.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Tkanka obumiera na początku eksperymentu.</td>
			<td>- Dodaj HEPES do pożywki podczas napełniania i montażu chipa.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Podczas ładowania nie należy zbyt często przepłukiwać tkanki w przód i w tył.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Sprawdzić, czy szybkość przepływu nie jest zbyt wysoka.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Tkanka obumiera podczas obrazowania.</td>
			<td>- Należy upewnić się, że obrazowanie nie wywołuje fototoksyczności</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Należy upewnić się, że nie doszło do kontaminacji.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Szybkość przepływu nie powinna być zbyt wysoka.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Podczas obrazowania dochodzi do zmiany ostrości.</td>
			<td>- Podczas obrazowania należy używać funkcji autofokusu, aby skorygować dryf preparatu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Pozostawić chip w mikroskopie przez co najmniej 30 minut w celu wyrównania temperatury.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odłączenie wylotów/wlotów.</td>
			<td>- Dociśnij wszystkie rurki całkowicie do końca.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Szkło chipa pęka.</td>
			<td>- Proszę zachować większą ostrożność, szkło jest bardzo kruche.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Cienkie szkło jest wymagane wyłącznie do obrazowania. Jeśli obrazowanie nie jest wykonywane, można zastosować standardowy, grubszy szkiełko przedmiotowe.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Jeśli pęknięcie znajduje się poza chipem, może ono nie stanowić problemu. Jeśli jednak uszczelnienie szklane chipa zostanie naruszone, ciecz będzie wyciekać, a do wnętrza dostanie się powietrze.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">Na moim chipie występuje zanieczyszczenie.</td>
			<td>- Dodać antybiotyki do pożywki hodowlanej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Sterylizować cały sprzęt i przewody.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>- Pracuj szybko i zachowaj czystość.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Rozwiązywanie problemów
Plik uzupełniający 1: Plik STL do drukowania formy za pomocą drukarki 3D. Formy tej używa się do wytwarzania chipa mikrofluidycznego do hodowli tylnej części tkanki embrionalnej na chipie (projekt przedstawiony na Rysunku 1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 2: Plik STL do wydrukowania formy za pomocą drukarki 3D w celu wytworzenia chipa mikroprzepływowego do hodowli tkanek embrionalnych części tylnej na chipie. W przeciwieństwie do Plik uzupełniający 1 a konstrukcja przedstawiona w Rycina 1W tej konstrukcji we wszystkich wlotach zastosowano pułapki pęcherzykowe, aby zapobiec przedostawaniu się niewielkich ilości powietrza do głównej komory mikrofluidycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>
Plik uzupełniający 3: Plik projektowy do wytworzenia uchwytu umożliwiającego umieszczenie chipa w mikroskopie. Uchwyt ten posiada wymiary płytki 96-dołkowej i powinien pasować do standardowych uchwytów w większości mikroskopów. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.</a>

Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

Szlaki sygnałowe kontrolujące systemy wielokomórkowe są dynamiczne. Aby zrozumieć funkcję tej dynamiki, niezbędna jest możliwość subtelnego modulowania tej dynamiki bez wpływu na ogólną aktywność sygnalizacyjną. Protokół ten wykorzystuje system mikroprzepływowy, który pozwala na funkcjonalną analizę oscylacji sygnałowych w rozwijających się zarodkach myszy.Dynamikę sygnalizacji stwierdzono w wielu tkankach, w tym w tkankach dorosłych. Mikrofluidyka to wszechstronne narzędzie, które można dostosować do wielu systemów modelowych, w tym kultur komórkowych, tkanek i organoidów. Na początek przygotuj wymaganą ilość PDMS, mieszając monomer z katalizatorem w stosunku dziewięć do jednego, aby wywołać polimeryzację.Używaj jednorazowych narzędzi i upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe. Umieść mieszaninę PDMS w eksykatorze i stosuj próżnię przez około 30 minut w celu usunięcia powietrza. Wlej warstwę PDMS o grubości około trzech do pięciu milimetrów do formy na wióry i umieść z powrotem w eksykatorze na około 30 minut.Utwardź formę, umieszczając ją na noc w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza lub niższej, w zależności od materiału formy. Wytnij wiór z formy za pomocą skalpela. Przebić otwory wlotowe i wylotowe jednomilimetrowym stemplem biopsyjnym, zaczynając od wewnętrznej strony komory mikroprzepływowej.Wyczyść szklane szkiełko sprężonym powietrzem. Aby przymocować chip do szkiełka podstawowego, umieść chip i szkiełko w piecu plazmowym bokami, które mają być połączone, skierowanymi do góry. Wygeneruj plazmę przy użyciu protokołu specyficznego dla używanej maszyny, a następnie przymocuj chip do szkła, umieszczając aktywowane powierzchnie na sobie i równomiernie wywierając nacisk.Aby przygotować rurkę i wiór do eksperymentu, przetnij rurkę pod kątem 45 stopni i przymocuj jedną igłę do każdej z rurek. Umieść rurkę z igłami, chipem i zatyczkami w naczyniu i wysterylizuj je, wystawiając na działanie światła ultrafioletowego przez około 15 minut. Aby pokryć chip fibronektyną, umieść chip w zlewce zawierającej PBS plus 1% penicyliny lub streptomycyny w temperaturze pokojowej.Przepłucz chip za pomocą PBS, aby usunąć powietrze za pomocą pipety P200. Załaduj trzymililitrową strzykawkę do każdej komory chipa. Przymocować igłę do strzykawki zawierającej fibronektynę i podłączyć strzykawkę do pompy strzykawkowej.Ręcznie przepłucz rurkę, aby usunąć powietrze. Podłącz rurkę wylotową do wylotu chipa. Upewnij się, że rurka jest dociśnięta do samego dołu i ustaw niskie natężenie przepływu, aby pokryć wiór.Pozwól pompie strzykawkowej pracować przez co najmniej dwie godziny lub przez całą noc. Po zakończeniu zatrzymaj pompę i odetnij rurkę zaraz za igłą. Przygotuj strzykawki wypełnione pożywką do eksperymentu i odgazuj zarówno pożywkę hodowlaną, jak i chip w PBS.Spróbuj wypłukać lub zassać większość pęcherzyków powietrza z chipa, a następnie zainstaluj strzykawki w pompach i podłącz rurki wlotowe do strzykawek. Aby załadować tkankę na chip, wypreparuj najbardziej tylny koniec ogona. Przepłukać chip pożywką hodowlaną z 25 mikromolowymi HEPES, aby usunąć PBS.Załaduj tkankę do chipa za pomocą pipety P200. Po każdym etapie ładowania tkanki zamknij odpowiedni wlot ładowania tkanki za pomocą kawałka rurki wypełnionej PDMS. Aby zmontować zestaw mikroprzepływowy, przymocuj rurkę do chipa mikroprzepływowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do środka.Aby to zrobić, upewnij się, że na końcu rurki znajduje się kropla pożywki. Gdy wszystkie rurki zostaną przymocowane do chipa, wyjmij go ze zlewki i umieść w naczyniu zawierającym mokrą chusteczkę. Umieść naczynie i około 1,5 metra rurki wlotowej w inkubatorze w celu przeprowadzenia nocnej hodowli.Zapewnij wysoką wilgotność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas hodowli. Alternatywnie, wysusz zewnętrzną część chipa i umieść go w uchwycie mikroskopu, a następnie umieść uchwyt i około 1,5 metra rurki wlotowej w komorze inkubacyjnej odwróconego mikroskopu w celu przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem na żywo. Po co najmniej 20 minutach stałego przepływu rozpocznij planowane pompowanie do eksperymentu.Aby poprowadzić sygnalizację karbową w segmentowanym zarodku myszy, należy użyć programu pompowania składającego się ze 100 minut pożywki i 30 minut impulsów lekowych powtarzanych do końca eksperymentu, zwykle przez 24 godziny. W przypadku obrazowania w czasie rzeczywistym należy rozpocząć obrazowanie po co najmniej 30 minutach. Aby potwierdzić porywanie oscylacji sygnałowych, wiele eksperymentów jest dopasowywanych przy użyciu czasu impulsów leku i wizualizowanych za pomocą barwnika Cascade Blue.Oscylacje ilościowe można zdetrendować i wyświetlić jako średnią, a odchylenie standardowe lub fazy oscylacji można obliczyć. Można przeanalizować zależność fazową między oscylacjami niezależnych kultur zarodków w tylnych częściach ciała względem siebie nawzajem i zewnętrznych impulsów leku. Aby potwierdzić porwanie, można na przykład określić okres endogennych oscylacji sygnalizacyjnych za pomocą programu pyBOAT opartego na Pythonie.Przy stosowaniu impulsów o okresie 130 minut, oscylacje sygnalizacji karbu również pokazują okres 130 minut. Bardzo ważne jest, aby zapobiec parowaniu cieczy podczas eksperymentu mikroprzepływowego. W przeciwnym razie w chipie utworzą się pęcherzyki powietrza, które zakłócają przepływ medium.Aby temu zapobiec, należy odgazować podłoże i chip oraz upewnić się, że wilgotność w inkubatorze jest wystarczająco wysoka. Za pomocą tej metody można modulować dynamikę sygnalizacji, a jej efekty można analizować za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym reporterów fluorescencyjnych, barwienia immunologicznego lub hybrydyzacji in situ. Co więcej, tkanka może być również pobrana z chipa w celu dalszej analizy.Metodę tę można wykorzystać do badania funkcji oscylacji sygnalizacyjnych w rozwoju embrionalnym. Zastosowano go, aby zademonstrować znaczenie przesunięcia fazowego między dwoma oscylującymi szlakami sygnałowymi dla segmentacji zarodka myszy. Mówiąc bardziej ogólnie, można go teraz wykorzystać do analizy mechanizmu dynamicznego kodowania sygnalizacji w systemach wielokomórkowych.

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Przedstawiamy prostą metodę wytwarzania urządzeń mikrofluidycznych zdolnych do stosowania podobnych warunków dynamicznych w odniesieniu do wielu odrębnych szczepów, bez konieczności korzystania z pomieszczeń typu clean room lub litografii miękkiej.

Urządzenie mikroprzepływowe do badania wielu odrębnych szczepów

Somitogeneza to rytmiczny proces rozwojowy, który przestrzennie kształtuje oś ciała zarodków kręgowców. Wcześniej opracowaliśmy transgeniczne linie ryb danio pręgowanego, które wykorzystują fluorescencyjne reportery do obserwacji cyklicznych genów napędzających ten proces. Tutaj hodujemy rozproszone komórki z tych linii i obrazujemy ich oscylacje w czasie in vitro.

Generowanie rozproszonych kultur komórek mezodermy presomitycznej do obrazowania zegara segmentacji danio pręgowanego w pojedynczych komórkach

Parametryczne wzbudzenia optomechaniczne zostały ostatnio eksperymentalnie zademonstrowane w mikroprzepływowych rezonatorach optomechanicznych za pomocą ciśnienia promieniowania optycznego i stymulowanego rozpraszania Brillouina. W artykule opisano wytwarzanie tych rezonatorów mikroprzepływowych wraz z metodologiami generowania i weryfikacji oscylacji optomechanicznych.

Produkcja i testowanie mikroprzepływowych oscylatorów optomechanicznych

Ten artykuł wideo szczegółowo opisuje prostą metodologię in vivo, która może być używana do systematycznego i efektywnego charakteryzowania składników złożonych szlaków sygnałowych i sieci regulacyjnych w wielu zarodkach bezkręgowców.

Siła prostoty: zarodki jeżowców jako modele rozwojowe in vivo do badania złożonych interakcji sieci sygnalizacyjnych między komórkami

Zegar segmentacyjny napędza oscylacyjną ekspresję genów w mezodermie presomitycznej (PSM). Dynamiczna aktywność Notch jest kluczem do tego procesu. Wykorzystujemy obrazowanie i analizy obliczeniowe, aby wyodrębnić dynamikę czasową z danych wyrażeń przestrzennych, aby wykazać, że ekspresja liganda Delta i receptora Notch oscyluje w PSM kręgowców.

Porządkowanie czasowe danych wyrażeń dynamicznych na podstawie szczegółowych map wyrażeń przestrzennych

Brak narzędzi do pomiaru właściwości materiału i parametrów rozciągania in vivo uniemożliwia walidację ich ról podczas rozwoju. Zastosowaliśmy mikroskopię sił atomowych (AFM) i śledzenie nanocząstek, aby określić ilościowo cechy mechaniczne nienaruszonej komórki żółtka zarodka danio pręgowanego podczas epibolii. Metody te są niezawodne i mają szerokie zastosowanie, unikając inwazyjnych interwencji.

AFM i mikroreologia w komórkach żółtka zarodka danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Szczegółowe protokoły krok po kroku są opisane tutaj do badania sygnałów mechanicznych in vitro przy użyciu multipotencjalnych komórek grzebienia nerwowego O9-1 i hydrożeli poliakrylamidowych o różnej sztywności.

Zoptymalizowany system O9-1/Hydrogel do badania sygnałów mechanicznych w komórkach grzebienia nerwowego

Protokół demonstruje wygodną metodę wytwarzania harmonicznego przepływu oscylacyjnego od 10 do 1000 Hz w mikrokanałach. Odbywa się to poprzez połączenie sterowanej komputerowo membrany głośnika z mikrokanałem w sposób modułowy.

Montaż i charakterystyka zewnętrznego sterownika do generowania subkilohercowego przepływu oscylacyjnego w mikrokanałach

Obecny protokół opisuje projekt, produkcję i charakterystykę systemu mikroprzepływowego zdolnego do wyrównania, unieruchomienia i precyzyjnego ucisku setek zarodków Drosophila melanogaster przy minimalnym zaangażowaniu użytkownika. System ten umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i odzyskiwanie próbek do analizy po stymulacji i może być skalowany w celu uwzględnienia innych wielokomórkowych systemów biologicznych.

Mechanostymulacja organizmów wielokomórkowych za pomocą wysokoprzepustowego systemu kompresji mikroprzepływowej

Przedstawiamy tutaj protokół do wytworzenia i obsługi układu mikrofluidalnego, który naraża komórki śródbłonka na zsynchronizowany oscylatorny hiperglikemię i pulsujące naprężenia ścinające. Takie podejście zapewnia fizjologicznie istotny in vitro model do badania cukrzycowej dysfunkcji śródbłonka. Ten protokół umożliwia ilościowe pomiary stresu oksydacyjnego i reakcji komórek śródbłonka.

System mikrofluidyczny do modelowania dysfunkcji endotelialnych w warunkach połączonego fizjologicznego pulsującego stresu ścinającego i oscylacyjnej hiperglikemii

Poznaj mikrofluidyczną metodę modulacji oscylacji sygnalizacyjnych w mysich zarodkach. Technika umożliwia precyzyjną synchronizację endogennych oscylacji Notch i badanie ich roli w somitogenezie.

Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą

Przeglądaj więcej filmów