Podejście mikrofluidyczne do funkcjonalnego badania oscylacji sygnalizacyjnych rządzących somitogenezą
19 marca 2021
Protokół hodowli i manipulacji tkanką embrionalną myszy na chipie mikroprzepływowym jest dostarczony. Stosując impulsy modulatorów szlaku, system ten może być wykorzystany do zewnętrznego sterowania oscylacjami sygnałowymi w celu funkcjonalnego badania somitogenezy myszy.
Szlaki sygnałowe kontrolujące systemy wielokomórkowe są dynamiczne. Aby zrozumieć funkcję tej dynamiki, niezbędna jest możliwość subtelnego modulowania tej dynamiki bez wpływu na ogólną aktywność sygnalizacyjną. Protokół ten wykorzystuje system mikroprzepływowy, który pozwala na funkcjonalną analizę oscylacji sygnałowych w rozwijających się zarodkach myszy.
Dynamikę sygnalizacji stwierdzono w wielu tkankach, w tym w tkankach dorosłych. Mikrofluidyka to wszechstronne narzędzie, które można dostosować do wielu systemów modelowych, w tym kultur komórkowych, tkanek i organoidów. Na początek przygotuj wymaganą ilość PDMS, mieszając monomer z katalizatorem w stosunku dziewięć do jednego, aby wywołać polimeryzację.
Używaj jednorazowych narzędzi i upewnij się, że mieszanie jest prawidłowe. Umieść mieszaninę PDMS w eksykatorze i stosuj próżnię przez około 30 minut w celu usunięcia powietrza. Wlej warstwę PDMS o grubości około trzech do pięciu milimetrów do formy na wióry i umieść z powrotem w eksykatorze na około 30 minut.
Utwardź formę, umieszczając ją na noc w piekarniku w temperaturze 65 stopni Celsjusza lub niższej, w zależności od materiału formy. Wytnij wiór z formy za pomocą skalpela. Przebić otwory wlotowe i wylotowe jednomilimetrowym stemplem biopsyjnym, zaczynając od wewnętrznej strony komory mikroprzepływowej.
Wyczyść szklane szkiełko sprężonym powietrzem. Aby przymocować chip do szkiełka podstawowego, umieść chip i szkiełko w piecu plazmowym bokami, które mają być połączone, skierowanymi do góry. Wygeneruj plazmę przy użyciu protokołu specyficznego dla używanej maszyny, a następnie przymocuj chip do szkła, umieszczając aktywowane powierzchnie na sobie i równomiernie wywierając nacisk.
Aby przygotować rurkę i wiór do eksperymentu, przetnij rurkę pod kątem 45 stopni i przymocuj jedną igłę do każdej z rurek. Umieść rurkę z igłami, chipem i zatyczkami w naczyniu i wysterylizuj je, wystawiając na działanie światła ultrafioletowego przez około 15 minut. Aby pokryć chip fibronektyną, umieść chip w zlewce zawierającej PBS plus 1% penicyliny lub streptomycyny w temperaturze pokojowej.
Przepłucz chip za pomocą PBS, aby usunąć powietrze za pomocą pipety P200. Załaduj trzymililitrową strzykawkę do każdej komory chipa. Przymocować igłę do strzykawki zawierającej fibronektynę i podłączyć strzykawkę do pompy strzykawkowej.
Ręcznie przepłucz rurkę, aby usunąć powietrze. Podłącz rurkę wylotową do wylotu chipa. Upewnij się, że rurka jest dociśnięta do samego dołu i ustaw niskie natężenie przepływu, aby pokryć wiór.
Pozwól pompie strzykawkowej pracować przez co najmniej dwie godziny lub przez całą noc. Po zakończeniu zatrzymaj pompę i odetnij rurkę zaraz za igłą. Przygotuj strzykawki wypełnione pożywką do eksperymentu i odgazuj zarówno pożywkę hodowlaną, jak i chip w PBS.
Spróbuj wypłukać lub zassać większość pęcherzyków powietrza z chipa, a następnie zainstaluj strzykawki w pompach i podłącz rurki wlotowe do strzykawek. Aby załadować tkankę na chip, wypreparuj najbardziej tylny koniec ogona. Przepłukać chip pożywką hodowlaną z 25 mikromolowymi HEPES, aby usunąć PBS.
Załaduj tkankę do chipa za pomocą pipety P200. Po każdym etapie ładowania tkanki zamknij odpowiedni wlot ładowania tkanki za pomocą kawałka rurki wypełnionej PDMS. Aby zmontować zestaw mikroprzepływowy, przymocuj rurkę do chipa mikroprzepływowego bez wprowadzania pęcherzyków powietrza do środka.
Aby to zrobić, upewnij się, że na końcu rurki znajduje się kropla pożywki. Gdy wszystkie rurki zostaną przymocowane do chipa, wyjmij go ze zlewki i umieść w naczyniu zawierającym mokrą chusteczkę. Umieść naczynie i około 1,5 metra rurki wlotowej w inkubatorze w celu przeprowadzenia nocnej hodowli.
Zapewnij wysoką wilgotność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza podczas hodowli. Alternatywnie, wysusz zewnętrzną część chipa i umieść go w uchwycie mikroskopu, a następnie umieść uchwyt i około 1,5 metra rurki wlotowej w komorze inkubacyjnej odwróconego mikroskopu w celu przeprowadzenia eksperymentu z obrazowaniem na żywo. Po co najmniej 20 minutach stałego przepływu rozpocznij planowane pompowanie do eksperymentu.
Aby poprowadzić sygnalizację karbową w segmentowanym zarodku myszy, należy użyć programu pompowania składającego się ze 100 minut pożywki i 30 minut impulsów lekowych powtarzanych do końca eksperymentu, zwykle przez 24 godziny. W przypadku obrazowania w czasie rzeczywistym należy rozpocząć obrazowanie po co najmniej 30 minutach. Aby potwierdzić porywanie oscylacji sygnałowych, wiele eksperymentów jest dopasowywanych przy użyciu czasu impulsów leku i wizualizowanych za pomocą barwnika Cascade Blue.
Oscylacje ilościowe można zdetrendować i wyświetlić jako średnią, a odchylenie standardowe lub fazy oscylacji można obliczyć. Można przeanalizować zależność fazową między oscylacjami niezależnych kultur zarodków w tylnych częściach ciała względem siebie nawzajem i zewnętrznych impulsów leku. Aby potwierdzić porwanie, można na przykład określić okres endogennych oscylacji sygnalizacyjnych za pomocą programu pyBOAT opartego na Pythonie.
Przy stosowaniu impulsów o okresie 130 minut, oscylacje sygnalizacji karbu również pokazują okres 130 minut. Bardzo ważne jest, aby zapobiec parowaniu cieczy podczas eksperymentu mikroprzepływowego. W przeciwnym razie w chipie utworzą się pęcherzyki powietrza, które zakłócają przepływ medium.
Aby temu zapobiec, należy odgazować podłoże i chip oraz upewnić się, że wilgotność w inkubatorze jest wystarczająco wysoka. Za pomocą tej metody można modulować dynamikę sygnalizacji, a jej efekty można analizować za pomocą obrazowania w czasie rzeczywistym reporterów fluorescencyjnych, barwienia immunologicznego lub hybrydyzacji in situ. Co więcej, tkanka może być również pobrana z chipa w celu dalszej analizy.
Metodę tę można wykorzystać do badania funkcji oscylacji sygnalizacyjnych w rozwoju embrionalnym. Zastosowano go, aby zademonstrować znaczenie przesunięcia fazowego między dwoma oscylującymi szlakami sygnałowymi dla segmentacji zarodka myszy. Mówiąc bardziej ogólnie, można go teraz wykorzystać do analizy mechanizmu dynamicznego kodowania sygnalizacji w systemach wielokomórkowych.
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje mikrofluidyczny system do funkcjonalnej analizy oscylacji sygnałowych w rozwijających się zarodkach myszy, ze szczególnym uwzględnieniem segmentacji mezo-dermy presomitycznej. Podejście to umożliwia precyzyjną modulację i synchronizację endogennej dynamiki sygnałowej za pomocą zewnętrznych impulsów modulatorów szlaków. Metoda ta jest dostosowalna do różnych systemów modelowych i stanowi platformę do obrazowania oraz analizy dynamiki sygnałowania w czasie rzeczywistym podczas rozwoju embrionalnego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozwojowa
- Mikrofluidyka
- Embriologia
Wstęp
- Okresowa segmentacja w mezo-dermie presomitycznej jest regulowana przez dynamiczne szlaki sygnalizacyjne.
- Oscylacje i gradienty sygnałów kontrolują czas i rozmieszczenie powstawania somytów.
- Bezpośrednie dowody funkcjonalne na rolę oscylacji sygnalizacyjnych w somitogenezie były ograniczone.
- Mikroprzepływy umożliwiają modulowanie dynamiki sygnalizacji z wysoką precyzją.
Cel badania
- Ustalenie protokołu mikroprzepływowego do modulowania i synchronizowania oscylacji sygnałowych w tkance embrionalnej myszy.
- Przedstawienie szczegółowego przewodnika dla początkujących użytkowników w zakresie konfiguracji i wykorzystania systemów mikroprzepływowych w badaniach nad biologią rozwoju.
- Umożliwienie funkcjonalnej analizy dynamiki sygnałowej oraz jej wpływu na segmentację embrionalną.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mikrofluidycznych chipów na bazie PDMS z wykorzystaniem form wydrukowanych w technologii 3D.
- Łączenie chipów z szkiełkami przedmiotowymi za pomocą obróbki plazmą.
- Powlekanie chipów fibronektyną oraz sterylizacja komponentów.
- Ładowanie i hodowla pierwotnej tkanki embrionalnej myszy w urządzeniu mikrofluidycznym.
- Wprowadzanie oscylacji sygnałowych za pomocą zaprogramowanych impulsów modulatorów szlaków.
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym i analiza ilościowa dynamiki sygnalizacji.
Główne wyniki
- Mikrofluidyczne wymuszanie pomyślnie zsynchronizowało endogenne oscylacje sygnałowe w tkance embrionalnej myszy.
- Okresy oscylacji można było modulować tak, aby odpowiadały okresowi zewnętrznych impulsów leku (np. 130 minut).
- Ilościowo przeanalizowano zależności fazowe między oscylującymi szlakami a bodźcami zewnętrznymi.
- Metoda ta wykazała znaczenie przesunięć fazowych między szlakami sygnałowymi dla prawidłowej segmentacji.
Wnioski
- System mikroprzepływowy umożliwia precyzyjną analizę funkcjonalną dynamicznego sygnalizowania w układach wielokomórkowych.
- Stanowi on niezawodną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw segmentacji zarodkowej i kodu sygnalizacyjnego.
- Podejście to można zaadaptować do innych modeli in vivo i in vitro, takich jak organoidy i gastruloidy.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Dynamiczne oscylacje sygnalizacyjne odgrywają kluczową rolę w procesach rozwojowych oraz modelowaniu chorób, jednak ich funkcje często pozostają niejednoznaczne ze względu na ograniczenia techniczne w precyzyjnej modulacji. To podejście oparte na mikrofluidyce umożliwia kontrolowane dostrojenie oraz ilościową analizę dynamiki sygnalizacji w układach wielokomórkowych, co bezpośrednio wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i zwiększa wiarygodność predykcyjną we wczesnych etapach odkrywania leków. Adaptacyjność platformy do różnorodnych systemów modelowych sprawia, że stanowi ona wielokrotnego użytku narzędzie do walidacji celów terapeutycznych i w ramach rurociągów badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia funkcjonalną analizę dynamiki szlaków sygnałowych w modelach tkanek i organoidów.
- Wspiera mechanistyczną redukcję ryzyka poprzez wyjaśnienie przyczynowej roli oscylacyjnego sygnałowania w segmentacji rozwojowej.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu poprzez umożliwienie precyzyjnej modulacji czasowej i analizy fazowej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane, dynamiczne układy biologiczne do dalszych etapów procesów screeningu związków.
- Standaryzuje warunki testu poprzez programowalne synchronizowanie oraz ilościowe odczyty.
- Umożliwia powtarzalną i skalowalną analizę wpływu modulacji szlaków na wzorcowanie tkanek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje modele in vitro i ex vivo do dynamiki sygnalizacji istotnej dla rozwoju choroby w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Wspiera odkrywanie biomarkerów poprzez umożliwienie obrazowania w czasie rzeczywistym oraz ilościowej analizy relacji fazowych.
- Zapewnia platformę do podejmowania decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka i badanie funkcjonalnych szlaków sygnałowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten mikrofluidyczny system wciągania łączy wczesną fazę odkryć z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając sterowaną hipotezami modulację oscylacji i gradientów sygnalizacyjnych w złożonych modelach tkankowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez kontrolowaną synchronizację i analizę fazową.
- Przesiewy: Dostarcza dynamiczne systemy tkankowe gotowe do analiz, zapewniające ustandaryzowane, ilościowe wyniki.
- Analityka: Umożliwia ilościowy pomiar okresów oscylacji, relacji fazowych oraz odpowiedzi na modulatory.
- Badania translacyjne: Ułatwia przejście od etapu odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie dynamiki sygnałowej istotnej dla przebiegu chorób.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Możliwość adaptacji do różnych systemów modelowych, co wspiera szerokie zastosowania portfolio w analizie funkcjonalnej sygnalizacji.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w segmentacji i wzorcowaniu zależnym od szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dynamiczne hodowle tkankowe i modulację sygnałową w celu uzyskania powtarzalnych i skalowalnych procesów roboczych.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji o kontynuacji lub przerwaniu prac oraz efektywne pod kątem kapitałowym ustalanie priorytetów dla celów i modeli.
- Wpływ na portfolio: Wspiera dostosowane do ryzyka postępy i transfer wiedzy między programami dzięki wielokrotnego użytku platformom mikroprzepływowym.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikrofluidyki, hodowli tkankowych oraz ilościowej analizy obrazowania.
- Wymaga dostępu do druku 3D, wiązania plazmowego oraz infrastruktury obrazowania w czasie rzeczywistym.
- Wymaga rygorystycznej standaryzacji przygotowania chipów i protokołów eksperymentalnych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest możliwa do adaptacji w modelach tkankowych, organoidach i modelach embrionalnych po optymalizacji protokołu.
- Kluczowe dla zachowania rzetelności eksperymentu jest uważne zarządzanie wilgotnością oraz pęcherzykami powietrza.
