Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek
9 marca 2021
Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.
Spektroskopia NMR w komórce oferuje unikalne podejście do badania struktury i funkcji białek bezpośrednio w żywych komórkach oraz do monitorowania biologicznie istotnych procesów, takich jak interakcje białko-ligand. Ten bioreaktor NMR może utrzymać dużą liczbę komórek ludzkich przy życiu i metabolicznie aktywnych przez kilka dni w spektrometrze, umożliwiając aplikacje NMR w czasie rzeczywistym. Metodę tę można zastosować do dowolnego rozpuszczalnego, swobodnie rozpadającego się białka wewnątrzkomórkowego ulegającego zmianom konformacyjnym lub chemicznym.
Znakowanie izotopowe dodatkowo rozszerza możliwości zastosowania tej metody. Aby rozpocząć, zmontuj jednostkę przepływu za pomocą drugiej rurki NMR jednostki przepływu, która później zostanie zastąpiona tą zawierającą komórki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi jednostki przepływowej, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego montażu.
Ustaw łaźnię wodną podłączoną do regulatora temperatury jednostki przepływowej na 37 stopni Celsjusza i umieść butelkę ze zbiornikiem w łaźni wodnej. Podłącz rurkę FEP butelki zbiornika do pompy. Przekręć zawór bioreaktora, aby obejść i wstępnie napełnić pompę medium.
Następnie przekręć zawór bioreaktora na przepływ i wstępnie napełnij bioreaktor medium z prędkością 0,1 mililitra na minutę. Pobrać kolbę T75 z transfekowanymi limfocytami T HEK 293 z inkubatora dwutlenku węgla i usunąć zużytą pożywkę. Dodaj dwa mililitry trypsyny EDTA do komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odłączyć komórki.
Dezaktywuj trypsynę za pomocą 20 mililitrów kompletnego DMEM i dokładnie ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół. Następnie przenieś je do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 800X G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.
Przenieś osad komórkowy do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Aby osadzić komórki w nitkach agarozy, rozpuść jedną porcję zestalonej agarozy w temperaturze 85 stopni Celsjusza w podgrzewaczu blokowym, a następnie trzymaj ją w roztworze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzewaczu blokowym. Za pomocą pipety Pasteura napełnij dno rurki NMR jednostki przepływowej 60 do 70 mikrolitrami 1,5% żelu agarozowego i umieść go na lodzie, aby utworzyć korek dolny o wysokości pięciu milimetrów.
Podgrzej granulkę komórkową przez 15 do 20 sekund w podgrzewaczu blokowym i ostrożnie ponownie zawieś komórki w 450 mikrolitrach roztworu agarozy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Odessać zawiesinę komórka/agaroza do 30-centymetrowej rurki chromatograficznej PEEK o średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra połączonej ze strzykawką o pojemności jednego mililitra. Pozwól rurkom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.
Wstępnie napełnij rurkę NMR jednostki przepływowej 100 mikrolitrami PBS w temperaturze pokojowej. Odlać nici komórek osadzonych w agarozie do rurki NMR jednostki przepływowej, delikatnie popychając strzykawkę. Wyjmij pustą rurkę NMR z jednostki przepływowej i zwiększ natężenie przepływu do dwóch mililitrów na minutę przez kilka minut, aby usunąć resztki pęcherzyków gazu z rurki dolotowej.
Ustaw natężenie przepływu na 0,2 mililitra na minutę i włóż rurkę NMR zawierającą komórki, popychając ją powoli, ale stabilnie do góry. Zasilaj medium bioreaktora z natężeniem przepływu 0,1 mililitra na minutę. Ustaw temperaturę w spektrometrze NMR na 310 kelwinów i włóż jednostkę przepływu do spektrometru.
Po włożeniu bioreaktora do spektrometru NMR odczekaj kilka minut, aby umożliwić wymianę medium. Dostosuj dopasowanie i dostrojenie kanału protonowego, podkładkę magnesu i oblicz długość twardego impulsu protonu o 90 stopni. Dostosuj poziomy mocy protonów w każdej sekwencji impulsów zgodnie z twardym impulsem protonu.
Zarejestruj pierwsze widmo NMR protonów zgesgp, aby zarejestrować zawartość próbki w jednorodności pola. Skopiuj eksperymenty zgesgp i p3919gp lub SOFAST-HMQC na żądaną liczbę i umieść je w kolejce w buforze akwizycji. Wstrzyknąć stężony roztwór cząsteczki zewnętrznej do butelki ze zbiornikiem pożywki, przekłuwając silikonową rurkę sterylną strzykawką z długą igłą.
Pod koniec eksperymentu NMR zastąp probówkę zawierającą komórki pustą probówką i przepłucz jednostkę przepływową wodą. W przypadku komórek wykazujących ekspresję nieznakowanej anhydrazy węglanowej należy przetworzyć widma p3919gp, stosując funkcję zerowego wypełnienia i wykładniczego poszerzania linii. W przypadku komórek wykazujących ekspresję dysmutazy ponadtlenkowej znakowanej azotem-15 należy przetworzyć widma SOFAST-HMQC, stosując funkcję wypełnienia zerowego i okna dzwonka ze znakiem kwadratowym w obu wymiarach.
W programie MATLAB zaimportuj regiony spektralne za pomocą niestandardowego skryptu Load_ascii_spectra. Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 1D. Otwórz graficzny interfejs użytkownika MCR-ALS 2.0, uruchamiając skrypt mcr_main, a następnie w zakładce Wybór danych załaduj macierz widm.
Sprawdź dane, wykreślając je. Oceń liczbę składników, albo przez dekompozycję wartości osobliwych, albo ręcznie, i wybierz metodę wstępnego oszacowania czystych widm. Można zastosować zarówno detekcję najczystszych zmiennych, jak i analizę czynników ewoluujących.
W oknie Wybór zestawu danych wybierz pozycję Kontynuuj. Ustaw ograniczenia dla stężeń w oknie Ograniczenia:tryb wiersza. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierając fnnls jako implementację i two jako liczbę gatunków.
Następnie zastosuj jedno ograniczenie zamknięcia, ustaw ograniczenie na jeden, warunek ograniczenia zamknięcia jako równy i zastosuj do wszystkich gatunków. Ustaw ograniczenia dla widm w oknie Ograniczenia:tryb kolumny. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierając fnnl jako implementację i dwa jako liczbę gatunków.
W ostatnim oknie ustaw 50 iteracji i kryterium konwergencji 0,01. Określ nazwy wyjściowe dla stężeń, widm i odchylenia standardowego. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić łącznik MCR-ALS.
Komórki w bioreaktorze mogą być utrzymywane przy życiu do 72 godzin, co potwierdza test błękitu trypanowego. Bioreaktor wykorzystano do monitorowania w czasie rzeczywistym wiązania dwóch inhibitorów, acetazolamidu i metazolamidu, z nadekspresją anhydrazy węglanowej w cytozolu limfocytów T HEK 293. Obecność sygnałów z nadekspresji białka i jednorodność pola oceniano za pomocą pierwszego widma protonów rzeźbiących wzbudzenie.
W przypadku anhydrazy węglanowej wewnątrzkomórkowe wiązanie dwóch inhibitorów monitorowano, obserwując sygnały protonowe w zakresie od 11 do 16 części na milion widma WATERGATE, powstające z histydyn koordynujących i innych reszt aromatycznych. Pomyślne wiązanie zostało potwierdzone pojawieniem się dodatkowych sygnałów. MCR-ALS wykorzystano do oddzielenia sygnałów NMR pochodzących z wolnej i związanej anhydrazy węglanowej oraz do przedstawienia względnych profili stężeń obu gatunków.
Bioreaktor zastosowano do monitorowania powstawania wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego dysmutazy ponadtlenkowej związanego z promowanego przez ebselen, naśladowcę peroksydazy glutationowej. Analiza MCR-ALS na wybranych obszarach widma 2D rozdzieliła sygnały pochodzące od dwóch gatunków i dostarczyła ich względnych profili stężeń. Ważne jest, aby powoli i równomiernie wkładać i wyjmować rurkę NMR jednostki przepływu, aby uniknąć skoków ciśnienia, które mogą powodować tworzenie się pęcherzyków.
Opracowanie bioreaktorów NMR utorowało drogę do badania procesów zależnych od czasu związanych z rozdzielczością atomową, takich jak kreślenie regulacji redux i interakcji lek/cel w żywych komórkach.
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje wykorzystanie spektroskopii NMR wewnątrzkomórkowej w połączeniu ze specjalistycznym bioreaktorem NMR do monitorowania oddziaływań białko-ligand oraz chemicznych modyfikacji białek w żywych ludzkich komórkach. Opisany schemat pracy umożliwia obserwację procesów wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym z rozdzielczością atomową, przełamując tradycyjne ograniczenia dotyczące żywotności komórek wewnątrz spektrometru NMR. Protokół obejmuje przygotowanie próbek, konfigurację bioreaktora, akwizycję danych NMR oraz analizę ilościową z wykorzystaniem wielowymiarowej rozdzielczości krzywych (MCR-ALS).
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia strukturalna
- Biochemia komórkowa
- Spektroskopia NMR
Wstęp
- NMR wewnątrzkomórkowy umożliwia bezpośrednią obserwację struktury i dynamiki białek w żywych komórkach.
- Tradycyjny NMR wewnątrzkomórkowy jest ograniczony krótkim czasem przeżywalności komórek w spektrometrze.
- Bioreaktory NMR mogą wydłużyć żywotność komórek, umożliwiając prowadzenie dłuższych eksperymentów oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym.
- Ilościowa analiza danych NMR w żywych komórkach jest trudna ze względu na złożone nakładanie się sygnałów i zmiany dynamiczne.
Cel badania
- Przedstawienie szczegółowego protokołu wykorzystania bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności ludzkich komórek przez dłuższy czas podczas eksperymentów NMR.
- Zaprezentowanie monitorowania w czasie rzeczywistym oddziaływań białko-ligand oraz modyfikacji białek w żywych komórkach.
- Wprowadzenie schematu postępowania dla ilościowej analizy danych in-cell NMR w czasie rzeczywistym przy użyciu metody MCR-ALS.
Zastosowane metody
- Przygotowanie transfekowanych komórek HEK 293T i ich osadzenie w niciach agarozy.
- Montaż i obsługa bioreaktora NMR z kontrolą temperatury i ciągłym przepływem pożywki.
- Akwizycja danych NMR wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym, obejmująca eksperymenty 1D i 2D (np. SOFAST-HMQC).
- Ilościowa analiza widm NMR z wykorzystaniem metody rozdzielania krzywych wielowymiarowych z naprzemiennymi najmniejszymi kwadratami (MCR-ALS) w środowisku MATLAB.
Główne wyniki
- Bioreaktor zapewnił wysoką żywotność komórek i aktywność metaboliczną przez okres do 72 godzin.
- Osiągnięto monitorowanie w czasie rzeczywistym wiązania inhibitorów (acetazolamidu, metazolamidu) z anhydrazą węglanową w żywych komórkach.
- Metoda MCR-ALS umożliwiła rozdzielenie i ilościowe oznaczenie wolnych oraz związanych form białek w czasie.
- System wykorzystano również do monitorowania chemicznych modyfikacji białek, takich jak tworzenie mostków dwusiarczkowych w dysmutazie ponadtlenkowej indukowane przez ebselen.
Wnioski
- Układ bioreaktora NMR umożliwia prowadzenie długotrwałych badań NMR wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym w celu analizy oddziaływań i modyfikacji białko-ligand.
- Metoda MCR-ALS zapewnia solidne podejście do ilościowej analizy złożonych, rozdzielonych w czasie danych NMR w żywych komórkach.
- Podejście to rozwija badania nad dynamicznymi procesami biologicznymi oraz oddziaływaniami lek-cel z rozdzielczością atomową w kontekście komórkowym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowe NMR wewnątrzkomórkowe w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem bioreaktora o wysokiej gęstości umożliwia bezpośrednie monitorowanie oddziaływań białko-ligand oraz modyfikacji chemicznych w żywych ludzkich komórkach z rozdzielczością atomową. Możliwość ta wypełnia krytyczną lukę we wczesnej fazie poszukiwania leków, dostarczając dynamicznych, ilościowych informacji na temat wiązania z celem wewnątrzkomórkowym oraz procesów mechanistycznych. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną na etapach walidacji celu i optymalizacji wiodących związków, wspierając decyzje dotyczące portfela projektów w oparciu o analizę ryzyka.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią obserwację wiązania białko-ligand oraz zmian konformacyjnych w natywnym kontekście komórkowym.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez ilościowe określanie zaangażowania celu wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym.
- Zapewnia profile kinetyczne i stężeń niezbędne do funkcjonalnej walidacji celu.
- Ułatwia selekcję celów w oparciu o dynamiczne, ilościowe odczyty.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Dostarcza zwalidowane, powtarzalne systemy biologiczne do późniejszych etapów procesów przesiewowych.
- Umożliwia uzyskanie ilościowych, rozdzielczych w czasie wyników analiz w celu oceny związków.
- Wspiera standaryzację testów i skalowalność platformy dzięki stabilnej pracy bioreaktora.
- Poprawia gotowość do badań przesiewowych poprzez utrzymanie wysokiej żywotności komórek i aktywności metabolicznej.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane dotyczące wewnątrzkomórkowego wiązania celu z modelami komórkowymi istotnymi dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną poprzez śledzenie modyfikacji i oddziaływań białek w czasie rzeczywistym.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka i ilościowe dowody na poziomie komórkowym.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie zdarzeń molekularnych z efektami funkcjonalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedkliniczne – zapewniając wielokrotnego użytku platformę do ilościowej analizy oddziaływań białko-ligand w żywych komórkach w czasie rzeczywistym.
- Biologia odkryć: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez monitorowanie dynamicznych procesów wewnątrzkomórkowych.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki testów do oceny i optymalizacji związków.
- Analityka: Dostarcza profile stężeń i parametry kinetyczne za pomocą analizy rozdzielczości krzywych wielowymiarowych (MCR-ALS).
- Badania translacyjne: Łączy etapy odkryć i badań przedklinicznych, umożliwiając monitorowanie w czasie rzeczywistym w modelach ludzkich komórek istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia zstandaryzowany, skalowalny schemat pracy do powtarzalnych zastosowań w różnych celach i programach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność procedur in-cell NMR.
- Wartość strategiczna: Usprawnia decyzje typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczenie ilościowych danych w czasie rzeczywistym.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów odkrywania leków.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie spektroskopii NMR, hodowli komórkowych oraz ilościowej analizy danych.
- Wymaga specjalistycznej aparatury, w tym bioreaktora NMR z kontrolą temperatury oraz systemu ciągłego przepływu pożywki.
- Wymaga standaryzacji protokołów przygotowania próbek, akwizycji danych i analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda jest adaptowalna do różnych rozpuszczalnych, swobodnie rotujących białek wewnątrzkomórkowych z możliwością znakowania izotopowego.
- Należy starannie utrzymywać żywotność komórek i ich aktywność metaboliczną, aby zapewnić jakość oraz powtarzalność danych.
