Name: Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Poznaj metodę ilościowego NMR w komórkach żywych z wykorzystaniem bioreaktora do monitorowania interakcji białko-ligand w komórkach HEK 293T. Technika ta umożliwia analizę zmian konformacyjnych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez iNEXT-Discovery, grant numer 871037, finansowany przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej, przez Instruct-ULTRA, grant numer 731005, projekt UE H2020 mający na celu dalszy rozwój usług Instruct-ERIC, oraz przez Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN grant 20177XJCHX. Autorzy dziękują za wsparcie Instruct-ERIC, przełomowego projektu ESFRI, poprzez przyznanie nagrody JRA Award nr 815 oraz wykorzystanie zasobów włoskiego Centrum CERM/CIRMMP. Dziękujemy Matteo Pennestri (Bruker, Wielka Brytania) za wsparcie w zakresie działania jednostki przepływowej InsightMR.

1. Konfiguracja odczynnika i roztworu
<ol>
	<li>Aby przygotować kompletny DMEM, dodaj 5 ml L-glutaminy 200 mM, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS, końcowe stężenie 10% obj.) do 440 ml DMEM. 
	UWAGA: Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.</li>
	<li>Przygotować roztwór agarozy, rozpuszczając 150 mg agarozy o niskiej żelowości w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze 85 °C w celu uzyskania 1,5% (w/v) roztworu. Sterylizuj przez filtrację za pomocą filtra 0,22 μm. Przygotować 1 ml podwielokrotności roztworu agarozy w 1,5 ml zakorkowanych probówek i przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę bioreaktora.
	<ol>
		<li>Rozpuścić 13,4 g proszku DMEM w 1 l ultraczystego H2O. 
		UWAGA: W zależności od zastosowania wymagana objętość końcowa może się różnić (np. dla pożywki o pojemności 500 ml rozpuścić 6,7 g proszku w 500 ml H2O).</li>
		<li>Dodać 2% FBS, 10 mM NaHCO3, 1x penicylina-streptomycyna (100x) i 2% D2O (np. na 500 ml pożywki dodać 10 ml FBS, 0,4 g NaHCO3, 5 ml penicyliny-streptomycyny 100x i 10 ml D2O).</li>
		<li>Zmierzyć pH za pomocą pH-metru i w razie potrzeby dostosować do 7,4, dodając HCl. 
		UWAGA: Zazwyczaj początkowe pH jest bardzo zbliżone do 7,4.</li>
		<li>Przefiltruj pożywkę bioreaktora za pomocą sterylnego filtra próżniowego w sterylnej szklanej butelce o pojemności 250 ml lub 500 ml.</li>
		<li>W kapturze z przepływem laminarnym uszczelnij butelkę sterylną stalową głowicą z dwiema dyszami węża i podłącz je do rurki FEP (o.d. = 1/8", ID = 1.6 mm), która zostanie podłączona do pompy i do filtra strzykawkowego PTFE 0.22 μm do wlotu powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Konfiguracja bioreaktora
<ol>
	<li>Zmontuj jednostkę przepływu za pomocą drugiej rurki NMR jednostki przepływu, która zostanie później zastąpiona tą zawierającą komórki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi jednostki przepływowej, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego montażu. 
	UWAGA: W tym momencie jednostka przepływu powinna być już wyczyszczona (jeśli nie, wykonaj krok 4.2).</li>
	<li>Ustawić łaźnię wodną podłączoną do regulatora temperatury jednostki przepływowej na 37 °C. Umieścić butelkę z biustem w łaźni wodnej.</li>
	<li>Podłącz rurkę FEP butelki ze zbiornikiem do pompy.</li>
	<li>Przekręć zawór bioreaktora w położenie "obejście" i wstępnie napełnij pompę medium.</li>
	<li>Przekręć zawór bioreaktora na "przepływ" i wstępnie napełnij bioreaktor medium z prędkością 0,1 ml/min.</li>
</ol>
3. Przygotowanie próbki komórki
<ol>
	<li>Pobrać komórki z inkubatora emisjiCO2.
	<ol>
		<li>Pobrać kolbę T75 z transfekowanymi komórkami HEK293T z inkubatora CO2 i usunąć zużytą pożywkę.</li>
		<li>Umyj komórki dwukrotnie 7 ml (każda) PBS w temperaturze pokojowej (~20 °C).</li>
		<li>Użyj 2 ml trypsyny/EDTA, aby odłączyć komórki. Po dodaniu roztworu inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej w celu odłączenia komórek. 
		UWAGA: Odklejenie się transfekowanych komórek może zająć nieco więcej czasu. W razie potrzeby inkubować komórki w temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Dezaktywować trypsynę za pomocą 20 ml kompletnego DMEM; dokładnie zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół, a następnie przenieść je do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml.</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Umyj komórki 10 ml PBS w temperaturze pokojowej, aby usunąć pozostałą pożywkę.</li>
		<li>Odwirować komórki o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.</li>
		<li>Przenieś osad komórkowy do zaślepionej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadź komórki w niciach agarozy.
	<ol>
		<li>Stopić jedną podwielokrotność zestalonej agarozy w temperaturze 85 °C w łaźni wodnej, a następnie przechowywać ją w roztworze w temperaturze 37 °C w bloku grzewczym.</li>
		<li>Za pomocą pipety Pasteura napełnij dno rurki NMR jednostki przepływowej 60-70 μl 1,5% żelu agarozowego i umieść ją w lodzie. Spowoduje to utworzenie dolnego korka o wysokości ~5 mm, który umożliwia umieszczenie próbki komórki w aktywnej objętości cewki 1H NMR.</li>
		<li>Podgrzać osad komórek otrzymany w kroku 3.1.8 w temperaturze 37 °C przez 15−20 s w termobloku.</li>
		<li>Zawieś komórki w 450 μl roztworu agarozy. Uważaj, aby nie tworzyć się pęcherzyków.</li>
		<li>Odessać zawiesinę komórkowo-agarozową do rurki chromatograficznej PEEK o długości ~30 cm (średnica wewnętrzna = 0,75 mm) podłączonej do strzykawki o pojemności 1 ml. 
		UWAGA: Przed aspiracją rurkę i martwą objętość strzykawki należy wstępnie napełnić PBS w temperaturze pokojowej, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Długość rurki nie jest krytyczna.</li>
		<li>Pozwól rurki ostygnąć w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.</li>
		<li>Napełnij rurkę NMR jednostki przepływowej 100 μl PBS w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Odlewać nici komórek osadzonych w agarozie do rurki NMR jednostki przepływowej, delikatnie popychając strzykawkę. 
		UWAGA: Aby równomiernie napełnić rurkę NMR, zacznij od umieszczenia końca rurki PEEK na dole rurki NMR i idź w kierunku góry, powoli obracając się w lewo i w prawo.</li>
		<li>Powtarzać kroki 3.2.5, 3.2.6 i 3.2.8, aż cała zawiesina agarozy komórkowej zostanie odlana.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wprowadzić komórki do bioreaktora.
	<ol>
		<li>Wyjmij pustą rurkę NMR z jednostki przepływowej i zwiększ natężenie przepływu do 2 ml/min na kilka minut, aby usunąć resztki pęcherzyków gazu z rurki doprowadzającej.</li>
		<li>Ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min i włóż rurkę NMR zawierającą komórki, popychając ją powoli, ale stabilnie do góry. 
		UWAGA: Aktywny przepływ medium pozwala uniknąć cofania się zawartości rurki przez wlot, co w przeciwnym razie miałoby miejsce podczas wkładania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Eksploatacja i czyszczenie bioreaktora
<ol>
	<li>Praca bioreaktora podczas eksperymentu NMR.
	<ol>
		<li>Ustaw temperaturę w spektrometrze NMR na 310 K.</li>
		<li>Włożyć jednostkę przepływu do spektrometru.</li>
		<li>Zasilaj pożywkę bioreaktora z natężeniem przepływu 0,1 ml/min przez cały czas trwania eksperymentów NMR w komórce.</li>
		<li>W pożądanym czasie podczas eksperymentu wstrzyknąć stężony roztwór cząsteczki zewnętrznej do butelki ze zbiornikiem pożywki, przekłuwając silikonową rurkę sterylną strzykawką z długą igłą. 
		UWAGA: Końcowe stężenie cząsteczki w pożywce powinno być wybrane na podstawie wcześniejszej wiedzy na temat toksyczności komórkowej oraz, jeśli jest to możliwe, na przewidywanej/szacowanej szybkości dyfuzji przez błonę komórkową.</li>
		<li>Pod koniec eksperymentu NMR zastąp probówkę zawierającą komórki pustą probówką i przepłucz jednostkę przepływową wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Czyszczenie bioreaktora na miejscu.
	<ol>
		<li>Oczyścić jednostkę przepływu, przepuszczając następujące roztwory o stężeniu 1 ml/min: 0,2 M wodorotlenku sodu (NaOH), 3 M kwasu cytrynowego, 0,2 M NaOH przez co najmniej 30 minut każdy, a następnie sterylnie przefiltrowaną ultraczystą wodą przez >2 godziny.</li>
		<li>Wyczyść i autoklawuj zbiornik, butelkę i zespół rurek po każdym uruchomieniu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Eksperymenty NMR
<ol>
	<li>Konfiguracja eksperymentów NMR. 
	UWAGA: Wykonaj te czynności wcześniej, przed przygotowaniem próbki NMR w komórce, aby uniknąć opóźnień między pobraniem komórek a akwizycją danych.
	<ol>
		<li>Utwórz nowy zestaw danych w spektrometrze NMR i ustaw parametry dla żądanych eksperymentów NMR.</li>
		<li>Ustawianie parametrów dla eksperymentów 1D 1H NMR.</li>
		<li>Wyśrodkuj częstotliwość nośną 1H na 4.7 ppm na sygnale wody.</li>
		<li>Wybierz program impulsowy zgesgp, ustaw szerokość widmową na 20 ppm i impuls kwadratowy 1,000 μs 180° do tłumienia wody. Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 1 s. Uzyskaj widmo za pomocą 32 skanów.</li>
		<li>Dla komórek wyrażających nieznakowany CA II: wybierz program impulsowy p3919gp, ustaw szerokość widma na 30 ppm, aby pokryć obszar imino widma i dostosuj opóźnienie dwumianowego tłumienia wody tak, aby maksymalne wzbudzenie było wyśrodkowane na przesunięciach chemicznych sygnałów będących przedmiotem zainteresowania (d7 = 20 μs przy 950 MHz). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na ≥1 s. Zdobądź za pomocą 512 skanów.</li>
		<li>Dla komórek wyrażających 15znakowanych N SOD1: wybierz program impulsów sfhmqf3gpph, ustaw szerokości widma 1H i 15N odpowiednio na 16 i 50 ppm, przesunięcie impulsu kształtowego i szerokość pasma wzbudzenia odpowiednio na 8,5 i 6 ppm oraz impuls 350 μs dla schematu rozprzęgania (garp4 lub inny w zależności od instrumentu). Ustaw opóźnienie między skanowaniami na 0,3 s. Rejestracja z 16 skanami i 128 przyrostami w wymiarze 15N.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Akwizycja widm NMR w czasie rzeczywistym.
	<ol>
		<li>Po włożeniu bioreaktora do spektrometru NMR odczekaj kilka minut, aby umożliwić wymianę pożywki. 
		UWAGA: Proces ten można łatwo monitorować od momentu pojawienia się sygnału blokady, ponieważ PBS jest zastępowany medium zawierającym 2% D2O.</li>
		<li>Dostosuj dopasowanie i dostrojenie kanału 1H, podkładkę magnesu i oblicz długość impulsu twardego 1H 90°.</li>
		<li>Dostosuj poziomy mocy 1H w każdej sekwencji impulsów zgodnie z twardym impulsem 1H.</li>
		<li>Zapisać pierwsze widmo zgesgp 1H, aby sprawdzić zawartość próbki i jednorodność pola.</li>
		<li>Skopiuj eksperymenty zgesgp i p3919gp/sfhmqcf3gpph na żądaną liczbę i umieść je w kolejce w buforze akwizycji. 
		UWAGA: Widma zgesgp służą wyłącznie do kontroli stanu próbki i jednorodności pola; Dlatego można je pominąć lub rzadziej nagrywać.</li>
		<li>W przypadku komórek wykazujących ekspresję nieznakowanego CA II: przetwarzaj widma p3919gp, stosując wypełnienie zerem i funkcję wykładniczego rozszerzania linii (LB = 20 Hz).</li>
		<li>Dla komórek wyrażających 15znakowanych N SOD1: przetwarzaj widma sfhmqcf3gpph, stosując wypełnienie zerowe i funkcję kwadratowego okna dzwonka sinusoidalnego (SSB = 2) w obu wymiarach. 
		UWAGA: Rozmiar przetwarzanych widm można dodatkowo zmniejszyć, usuwając obszary wolne od sygnałów (w Topspin odbywa się to poprzez ustawienie żądanych wartości STSR i STSI).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. Analiza MCR-ALS
<ol>
	<li>Do analizy widm CA II zaimportuj regiony spektralne 1D w MATLAB R2019b.
	<ol>
		<li>W oprogramowaniu utwórz listę eksperymentów do wyeksportowania w menu Lista zestawów danych procesów.</li>
		<li>Korzystając ze zmodyfikowanej wersji programu au convbin2asc, wyeksportuj interesujący Cię obszar widmowy w formacie ASCII dla każdego spektrum. 
		UWAGA: Spowoduje to utworzenie pliku tekstowego o nazwie ascii-spec.txt w każdym podkatalogu widma.</li>
		<li>W programie MATLAB zaimportuj regiony spektralne za pomocą niestandardowego skryptu Load_ascii_spectra. 
		UWAGA: Ten skrypt wymaga katalogu zestawu danych jako danych wejściowych i tworzy widma tablicowe 2D zawierające skumulowane widma 1D oraz tablicę 1D cs zawierającą przesunięcia chemiczne.</li>
		<li>Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 1D. 
		UWAGA: Ten skrypt tworzy tablicę 1D times_hours zawierającą przyrost czasu dla każdego widma wyrażony w godzinach, z początkowym widmem w czasie = 0.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Do analizy widm SOD1 zaimportuj widma 2D w MATLAB R2020b.
	<ol>
		<li>W Topspin utwórz listę eksperymentów do wyeksportowania w menu Lista zestawów danych procesów.</li>
		<li>W programie MATLAB zaimportuj widma 2D za pomocą niestandardowego skryptu Load_2D_spectra. 
		UWAGA: Ten skrypt wymaga katalogu zestawu danych jako danych wejściowych i tworzy tablicę 3D Spectra zawierającą skumulowane widma 2D oraz tablicę 1D cs zawierającą przesunięcia chemiczne.</li>
		<li>Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 2D.</li>
		<li>Określ obszary widmowe zainteresowania w niestandardowym Cut_2D_spectra skryptu i uruchom skrypt, aby wyciąć podtablice 3D [(1H x 15N) intensywności widma) x czas]; przekształcić je w tablice 2D (punkty czasowe x intensywności spektralne) i połączyć je ze sobą. 
		UWAGA: W ten sposób powstaje JoinSpec_flat tablicy 2D zawierającej przekształcone i połączone obszary widmowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uruchom MCR-ALS 2.0 w trybie GUI.
	<ol>
		<li>Otwórz graficzny interfejs użytkownika MCR-ALS 2.0, uruchamiając skrypt mcr_main.</li>
		<li>Na karcie Wybór danych załaduj widma lub macierz JoinSpec_flat. Dane można wykreślić w celu sprawdzenia.</li>
		<li>Oceń liczbę składników za pomocą dekompozycji wartości osobliwych (SVD) lub ręcznie. 
		UWAGA: Liczba składników powinna odpowiadać liczbie odrębnych gatunków obecnych w doświadczeniu. W tym przypadku n = 2, co odpowiada wolnemu i związanemu białku.</li>
		<li>Wybierz metodę wstępnego oszacowania czystych widm. Można zastosować detekcję najczystszych zmiennych lub analizę czynnikową ewolucji (EFA).</li>
		<li>W oknie Wybór zbioru danych wybierz opcję Kontynuuj.</li>
		<li>Ustaw ograniczenia dla stężeń w oknie Ograniczenia: Tryb wiersza. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierz fnnls (Szybkie najmniejsze kwadraty ograniczone nieujemnością) jako "implementacja i 2 gatunki". Zastosuj ograniczenie 1 zamknięcia, ustaw ograniczenie na 1, warunek zamknięcia jako "równy" i zastosuj do wszystkich gatunków. 
		UWAGA: Wymusza to, aby suma stężeń każdego gatunku była równa 1, tak aby uzyskane profile każdego gatunku były znormalizowane w odniesieniu do całkowitego stężenia białka.</li>
		<li>Ustaw ograniczenia dla widm w oknie Ograniczenia: Tryb kolumny. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierz fnnls jako "implementacja i 2 gatunki". 
		UWAGA: To ograniczenie nie powinno być stosowane, jeśli w widmach NMR występują sygnały ujemne.</li>
		<li>W ostatnim oknie ustaw 50 iteracji i kryterium zbieżności 0,01. Określ nazwy wyjściowe dla stężeń, widm i odchylenia standardowego. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić złączkę MCR-ALS. 
		UWAGA: Okno graficzne pokaże wynik dopasowania z wykresami profili stężeń i widmami czystych składników.</li>
		<li>W przypadku zestawu danych SOD1: użyj niestandardowego skryptu Rebuild_2D_spectra, aby zrekonstruować obszary spektralne 2D z danych wyjściowych 1D MCR-ALS i wykreślić je.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Test niebieskiego trypana
<ol>
	<li>Odzyskaj zawartość probówki NMR za pomocą pipety Pasteura i przenieś nitki agarozy do probówki z nakrętką o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Usunąć pozostałą pożywkę, przepłukując nitki agarozy 600 μl PBS i odwirować je przy 4 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 250 μl PBS i 50 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego.</li>
	<li>Inkubować przez 2 minuty z ciągłym pipetowaniem.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 600 μl PBS, odrzucając supernatant.</li>
	<li>Umieść kilka nitek agarozy na szkiełku mikroskopowym i posiekaj je żyletkami, aby uzyskać małe plasterki żelu. Wybierz najcieńsze warstwy (grubość < 0,4 mm, najlepiej ~0,2 mm) do analizy.</li>
	<li>Przenieś plastry żelu do samodzielnie wykonanej komory do liczenia komórek składającej się z dwóch szkiełek umieszczonych w odstępach trzech warstw folii parafinowej (o całkowitej grubości ~0,4 mm) z każdej strony. 
	UWAGA: Można również zastosować zjeżdżalnię komorową; Jednak plastry żelu grubsze niż wysokość komory (0,1 mm) zostałyby ściśnięte, rozrywając osadzone komórki.</li>
	<li>Uzyskaj obrazy komórek wewnątrz agarozy i policz białe i niebieskie komórki.</li>
	<li>Oblicz żywotność komórek jako (całkowita liczba komórek - niebieskie komórki) / całkowita liczba komórek.</li>
</ol>

<ol><li>Inomata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+multi-dimensional+NMR+spectroscopy+of+proteins+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-resolution multi-dimensional NMR spectroscopy of proteins in human cells.</a> Nature. 458 (7234), 106-109 (2009).</li>
<li>Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR%3A+a+topical+review%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR: a topical review.</a> IUCrJ. 4, Pt 2 108-118 (2017).</li>
<li>Dzatko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+stability+of+DNA+i-motifs+in+the+nuclei+of+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the stability of DNA i-motifs in the nuclei of living mammalian cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 57 (8), 2165-2169 (2018).</li>
<li>Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+in+human+cells%3A+direct+protein+expression+allows+structural+studies+of+protein+folding+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR in human cells: direct protein expression allows structural studies of protein folding and maturation.</a> Accounts of Chemical Research. 51 (6), 1550-1557 (2018).</li>
<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+protein+3D+structure+determination+in+living+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">High-resolution protein 3D structure determination in living eukaryotic cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (22), 7284-7288 (2019).</li>
<li>Siegal, G., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells%2C+drugs+and+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">Cells, drugs and NMR.</a> Journal of Magnetic Resonance. 306, San Diego, Calif. 202-212 (1997).</li>
<li>Banci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+monitoring+of+protein+maturation+in+live+human+cells+by+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution monitoring of protein maturation in live human cells by NMR.</a> Nature Chemical Biology. 9 (5), 297-299 (2013).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+reveals+potential+precursor+of+toxic+species+from+SOD1+fALS+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR reveals potential precursor of toxic species from SOD1 fALS mutants.</a> Nature Communications. 5, 5502(2014).</li>
<li>Theillet, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+disorder+of+monomeric+%CE%B1-synuclein+persists+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural disorder of monomeric α-synuclein persists in mammalian cells.</a> Nature. 530 (7588), 45-50 (2016).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+metal+binding+and+redox+behavior+of+human+DJ-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+inorganic+chemistry%3A+JBIC%3A+A+Publication+of+the+Society+of+Biological+Inorganic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Intracellular metal binding and redox behavior of human DJ-1.</a> Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: A Publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 23 (1), 61-69 (2018).</li>
<li>Banci, L., Barbieri, L., Luchinat, E., Secci, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+redox-controlled+protein+fold+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualization of redox-controlled protein fold in living cells.</a> Chemistry & Biology. 20 (6), 747-752 (2013).</li>
<li>Mercatelli, E., Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+structural+evidence+of+protein+redox+regulation+obtained+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Direct structural evidence of protein redox regulation obtained by in-cell NMR.</a> Biochimica Et Biophysica Acta. 1863 (2), 198-204 (2016).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+interaction+patterns+in+different+cellular+environments+are+revealed+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Protein interaction patterns in different cellular environments are revealed by in-cell NMR.</a> Scientific Reports. 5, 14456(2015).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+in+human+cells+by+NMR+spectroscopy+allows+the+early+assessment+of+drug+potency%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Drug screening in human cells by NMR spectroscopy allows the early assessment of drug potency.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (16), 6535-6539 (2020).</li>
<li>Luchinat, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+binding%2Funbinding+kinetics+of+approved+drugs+to+carbonic+anhydrase+II+observed+by+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Intracellular binding/unbinding kinetics of approved drugs to carbonic anhydrase II observed by in-cell NMR.</a> ACS Chemical Biology. 15 (10), 2792-2800 (2020).</li>
<li>DeMott, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+inhibitors+of+mycobacterium+tuberculosis+growth+identified+by+using+in-cell+NMR-based+screening%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Potent inhibitors of mycobacterium tuberculosis growth identified by using in-cell NMR-based screening.</a> ACS Chemical Biology. 13 (3), 733-741 (2018).</li>
<li>Krafcikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+DNA-ligand+interactions+in+living+human+cells+using+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Monitoring DNA-ligand interactions in living human cells using NMR spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (34), 13281-13285 (2019).</li>
<li>Broft, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-cell+NMR+of+functional+riboswitch+aptamers+in+eukaryotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">In-cell NMR of functional riboswitch aptamers in eukaryotic cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).</li>
<li>Sharaf, N. G., Barnes, C. O., Charlton, L. M., Young, G. B., Pielak, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioreactor+for+in-cell+protein+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+magnetic+resonance%22%5BJournal%5D)">A bioreactor for in-cell protein NMR.</a> Journal of magnetic resonance. 202 (2), San Diego, Calif. 140-146 (2010).</li>
<li>Kubo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel-encapsulated+bioreactor+system+for+NMR+studies+of+protein-protein+interactions+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">A gel-encapsulated bioreactor system for NMR studies of protein-protein interactions in living mammalian cells.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 52 (4), 1208-1211 (2013).</li>
<li>Inomata, K., Kamoshida, H., Ikari, M., Ito, Y., Kigawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+cellular+health+conditions+on+the+protein+folding+state+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of cellular health conditions on the protein folding state in mammalian cells.</a> Chemical Communications. 53 (81), Cambridge, England. 11245-11248 (2017).</li>
<li>Breindel, L., DeMott, C., Burz, D. S., Shekhtman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+in-cell+nuclear+magnetic+resonance%3A+ribosome-targeted+antibiotics+modulate+quinary+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time in-cell nuclear magnetic resonance: ribosome-targeted antibiotics modulate quinary protein interactions.</a> Biochemistry. 57 (5), 540-546 (2018).</li>
<li>Cerofolini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+insights+into+biological+events%3A+in-cell+processes+and+protein-ligand+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time insights into biological events: in-cell processes and protein-ligand interactions.</a> Biophysical Journal. 116 (2), 239-247 (2019).</li>
<li>Breindel, L., Burz, D. S., Shekhtman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+metabolism+unmasks+functional+protein-protein+interactions+in+real+time+in-cell+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Active metabolism unmasks functional protein-protein interactions in real time in-cell NMR.</a> Communications Biology. 3, (2020).</li>
<li>Luchinat, E., Barbieri, L., Campbell, T. F., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+quantitative+in-cell+NMR%3A+ligand+binding+and+protein+oxidation+monitored+in+human+cells+using+multivariate+curve+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time quantitative in-cell NMR: ligand binding and protein oxidation monitored in human cells using multivariate curve resolution.</a> Analytical Chemistry. 92 (14), 9997-10006 (2020).</li>
<li>Koczula, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+plasticity+in+CLL%3A+adaptation+to+the+hypoxic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Metabolic plasticity in CLL: adaptation to the hypoxic niche.</a> Leukemia. 30 (1), 65-73 (2016).</li>
<li>Alshamleh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+NMR+spectroscopy+for+studying+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Real-time NMR spectroscopy for studying metabolism.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 59 (6), 2304-2308 (2020).</li>
<li>Supuran, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbonic+anhydrases%3A+novel+therapeutic+applications+for+inhibitors+and+activators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Carbonic anhydrases: novel therapeutic applications for inhibitors and activators.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 7 (2), 168-181 (2008).</li>
<li>Neri, D., Supuran, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+pH+regulation+in+tumours+as+a+therapeutic+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Interfering with pH regulation in tumours as a therapeutic strategy.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (10), 767-777 (2011).</li>
<li>Alterio, V., Di Fiore, A., D'Ambrosio, K., Supuran, C. T., De Simone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+binding+modes+of+inhibitors+to+carbonic+anhydrases%3A+how+to+design+specific+drugs+targeting+15+different+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multiple binding modes of inhibitors to carbonic anhydrases: how to design specific drugs targeting 15 different isoforms.</a> Chemical Reviews. 112 (8), 4421-4468 (2012).</li>
<li>Capper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cysteine-reactive+small+molecule+ebselen+facilitates+effective+SOD1+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The cysteine-reactive small molecule ebselen facilitates effective SOD1 maturation.</a> Nature Communications. 9 (1), 1693(2018).</li>
<li>Trist, B., Hilton, J. B., Crouch, P. J., Hare, D. J., Double, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+in+health+and+disease%3A+How+a+front-line+antioxidant+becomes+neurotoxic%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 in health and disease: How a front-line antioxidant becomes neurotoxic.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). , (2020).</li>
<li>Tauler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivariate+curve+resolution+applied+to+second+order+data%5BTitle%5D)+AND+%22Chemometrics+and+Intelligent+Laboratory+Systems%22%5BJournal%5D)">Multivariate curve resolution applied to second order data.</a> Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 30 (1), 133-146 (1995).</li>
<li>Barbieri, L., Luchinat, E., Banci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+proteins+by+in-cell+NMR+spectroscopy+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterization of proteins by in-cell NMR spectroscopy in cultured mammalian cells.</a> Nature Protocols. 11 (6), 1101-1111 (2016).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenár, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR+spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR spectroscopy of aqueous solutions.</a> Journal of biomolecular NMR. 2 (6), 661-665 (1992).</li>
<li>Vasa, S. K., Singh, H., Grohe, K., Linser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+a+large+enzyme-drug+complex+by+proton-detected+solid-state+NMR+spectroscopy+without+deuteration%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Ed.+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Assessment of a large enzyme-drug complex by proton-detected solid-state NMR spectroscopy without deuteration.</a> Angewandte Chemie (International Ed. in English). 58 (17), 5758-5762 (2019).</li>
<li>Schanda, P., Brutscher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+fast+two-dimensional+NMR+spectroscopy+for+real-time+investigation+of+dynamic+events+in+proteins+on+the+time+scale+of+seconds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Very fast two-dimensional NMR spectroscopy for real-time investigation of dynamic events in proteins on the time scale of seconds.</a> Journal of the American Chemical Society. 127 (22), 8014-8015 (2005).</li>
<li>Ogino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+NMR+signals+from+proteins+introduced+into+living+mammalian+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+using+a+pore-forming+toxin%2C+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Observation of NMR signals from proteins introduced into living mammalian cells by reversible membrane permeabilization using a pore-forming toxin, streptolysin O.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (31), 10834-10835 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Celem wykorzystania bioreaktora do eksperymentu NMR w komórce jest utrzymanie komórek przy życiu i aktywności metabolicznej przez dłuższy czas. Aby osiągnąć ten cel, należy wziąć pod uwagę szereg kluczowych aspektów. Po pierwsze, niezwykle ważne jest, aby uniknąć zanieczyszczenia bakteryjnego podczas przygotowywania próbki komórki i podczas pozyskiwania danych NMR. Jeśli w laboratorium stosuje się szczepy E. coli lub inne bakterie powszechnie stosowane do klonowania genów i ekspresji rekombinowanych białek, mogą one zanieczyścić komórki podczas przygotowywania próbki. Po umieszczeniu w bioreaktorze bakterie będą szybko rosły, wykorzystując świeżą pożywkę wzrostową i spowodują śmierć komórek z powodu produkcji endotoksyn. Zanieczyszczenie bakteryjne jest wykrywane dopiero w zaawansowanym stadium, kiedy zmienia kolor podłoża na żółty i mętny. Ponadto niepełne czyszczenie bioreaktora może spowodować zanieczyszczenie pompy lub przewodów bakteriami, drożdżami lub powszechnymi pleśniami.
Warunkiem powodzenia eksperymentu jest uniknięcie tworzenia się pęcherzyków gazu. Pęcherzyki gazu uwięzione między nitkami agarozy w objętości czynnej cewki NMR wprowadziłyby duże niejednorodności pola magnetycznego, powodując niepełne tłumienie sygnałuH2Oi poważną utratę jakości widmowej (ryc. 2d). Pęcherzyki mogą być spowodowane przez powietrze uwięzione w układzie lub przez tworzenie się gazowego CO2 . Tego pierwszego można łatwo uniknąć, przepłukując system pożywką przed włożeniem próbki komórki, podczas gdy w celu uniknięcia tego drugiego zaleca się zmniejszenie stężeniaNaHCO3 w pożywce wzrostowej i utrzymywanie wszystkich części systemu w stałej temperaturze, aby zminimalizować różnice w rozpuszczalności CO2 . Komórkowy metabolizm tlenowy może również powodować powstawanie gazowego CO2 , czemu można zapobiec poprzez zwiększenie natężenia przepływu.
Żywotność komórek powinna być sprawdzana po każdym przebiegu za pomocą testu błękitu trypanowego. Nie daje to jednak wglądu w aktywność metaboliczną. Aby uzyskać pełniejszy obraz stanu metabolicznego komórek podczas pracy bioreaktora, można wykonać widma 31P NMR w celu oceny produkcji ATP w funkcji czasu23,25. Jednak często do tego pomiaru niezbędna jest dedykowana sonda, która może pozwolić na jednoczesny zapis z 1H NMR.
W przypadku CA II obecność dobrze rozdzielonych sygnałów reporterowych w nietypowym regionie widma 1H ułatwia analizę z prostych widm 1D NMR i nie wymaga wzbogacania izotopów podczas ekspresji białek. Ogólnie rzecz biorąc, inne białka mogą powodować powstawanie sygnałów 1H przydatnych do monitorowania zmian widmowych w innych regionach, takich jak ten typowy dla hydrofobowego rdzenia białka między 0 a -1 ppm11; jednak regiony te są zwykle zatłoczone dla pofałdowanych białek większych niż ~10 kDa. W tym przypadku, jak pokazano w przypadku SOD1, lepiej jest wzbogacić białko w 15N, dostarczając równomiernie 15 pożywki wzbogaconej w 15N podczas ekspresji białka oraz monitorować zmiany w czasie rzeczywistym w widmach 2D 1 H-15N NMR. Widma 2D są importowane jako tablice 2D w programie MATLAB, przestawiane do tablic 1D i układane w stos przed analizą MCR-ALS. To ostatnie podejście ma ogólne zastosowanie do każdego białka wewnątrzkomórkowego, które powoduje powstawanie wykrywalnych sygnałów i dostarcza informacji o zmianach konformacyjnych białka na poziomie pojedynczej reszty. Zasadniczo to ostatnie podejście można uogólnić na widma nD i inne schematy znakowania izotopów.
Jeśli chodzi o zastosowanie do różnych typów komórek, protokół powinien być łatwo dostosowany do różnych linii komórkowych i nie wymaga, aby białko będące przedmiotem zainteresowania było bezpośrednio wyrażane w komórkach. Dlatego inne podejścia do NMR w komórce można połączyć z tym protokołem, w którym makrocząsteczka będąca przedmiotem zainteresowania jest wytwarzana rekombinacyjnie lub syntetyzowana, a następnie wprowadzana do komórek przez elektroporację lub inne metody dostarczania 1,9,38. Podczas pracy z różnymi liniami komórkowymi lub protokołami przygotowania próbek, parametry takie jak stężenie agarozy, grubość nici i końcowa gęstość komórek w niciach agarozy mogą wymagać empirycznej optymalizacji. Co więcej, zastosowanie opisanego tutaj protokołu jest ograniczone do komórek, które tolerują enkapsulację agarozy. Inne typy komórek mogą wymagać różnych preparatów hydrożelowych, podczas gdy inna konfiguracja jest zalecana podczas analizy komórek, które natywnie rosną w zawiesinie, na przykład wykorzystując współosiową membranę mikrodializacyjną, aby zapewnić dyfuzję składników odżywczych, jednocześnie utrzymując zawieszone komórki zamknięte w probówce NMR23.
W porównaniu z innymi konstrukcjami bioreaktorów NMR 19,20,21,22, opisywane tutaj urządzenie opiera się na dostępnej na rynku jednostce przepływowej, dostosowanej z niewielkimi modyfikacjami. Dzięki temu urządzenie można łatwo powielać w różnych laboratoriach z wysoką powtarzalnością. Ponadto umożliwia standaryzację działania i pełną zgodność z surowymi przepisami bezpieczeństwa laboratoryjnego, jeśli zajdzie taka potrzeba. Ogólnie rzecz biorąc, elastyczność i łatwość obsługi bioreaktora powinna pozwolić na wiele innych zastosowań NMR roztworu, zarówno w komórkach, jak i in vitro, oprócz tych, o których już informowano23,25. Ostatecznie ten sam projekt bioreaktora może zostać zastosowany do próbek, które bardziej przypominają fizjologiczne środowisko tkanki, takich jak sferoidy lub organoidy, pod warunkiem, że zostaną znalezione odpowiednie rusztowania do utrzymania takich próbek przy życiu - lub nawet podtrzymania ich wzrostu - w spektrometrze NMR.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w komórce pojawiła się ostatnio jako potężne podejście do badania strukturalnych i dynamicznych właściwości makrocząsteczek w środowisku komórkowym1,2,3,4,5,6. In-cell NMR z powodzeniem zbadał funkcjonalnie istotne procesy, takie jak fałdowanie/nieprawidłowe fałdowanie białek7,8,9, metal binding7,10, tworzenie wiązań dwusiarczkowych11,12, oraz białko-białko interakcja13, interakcja białko-ligand14,15,16, and nucleic acid-ligand interaction17,18 w żywych komórkach ludzkich. Jednym z czynników ograniczających zastosowania NMR w komórkach jest krótka żywotność komórek podczas eksperymentu. Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie bioreaktorów NMR. W tych urządzeniach do komórek stosuje się stały przepływ pożywki wzrostowej, która jest utrzymywana w spektrometrze NMR, w celu dostarczenia tlenu i składników odżywczych oraz usunięcia toksycznych produktów ubocznych. Po pojawieniu się NMR w komórce, opracowano kilka projektów bioreaktorów NMR w celu poprawy żywotności komórek przez dłuższy czas, w których komórki bakterii lub ssaków są zamknięte w hydrożelu19,20,21,22 lub przechowywane w zawiesinie i perfundowane za pomocą membrany do mikrodializy23. Takie bioreaktory pozwoliły na przeprowadzenie dłuższych eksperymentów NMR ze zwiększonym stosunkiem sygnału do szumu (S/N)5 i, co ważniejsze, mogą być wykorzystywane do badania procesów komórkowych w czasie rzeczywistym22,23,24. Dzięki wysokiej czułości chemicznej i konformacyjnej NMR, to ostatnie zastosowanie może dostarczyć cennych informacji na temat kinetyki procesów funkcjonalnych w żywych komórkach w rozdzielczości atomowej.
W tym protokole pokazujemy, jak skonfigurować i obsługiwać niedawno zgłoszony ulepszony bioreaktor25, który uzyskano poprzez połączenie istniejącego projektu modułowego bioreaktora23 z podejściem opartym na enkapsulacji komórek w hydrożelu, które zostało zapoczątkowane przez inne grupy19,20,21,22,26,27. Opisujemy zastosowanie bioreaktora do badań NMR w czasie rzeczywistym w komórce wewnątrzkomórkowych ligandów obserwujących białko w komórkach HEK293T. W bioreaktorze komórki są zamknięte w dużych gęstościach w nitkach żelu agarozowego i utrzymują wysoką żywotność i aktywność metaboliczną przez okres do 72 godzin, podczas których rejestrowane są eksperymenty NMR w czasie rzeczywistym. Bioreaktor składa się ze szklanej rurki, która pasuje do standardowych sond NMR 5 mm, która jest wodoszczelna i połączona z uchwytem probówki, dzięki czemu wewnętrzna komora próbki ma średnicę wewnętrzną 4,2 mm, wysokość 38 mm i objętość 526 μl. Wlot to kapilara PEEK o długości 7 metrów (o.d. = 1/32", i.d. = 0,5 mm) umieszczona w komorze próbki do ~6 mm od dołu, natomiast wylot to kapilara z PTFE o długości 7 metrów (o.d. = 1/32", ID = 0,5 mm) przymocowana w górnej części uchwytu rurki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). Rurka jest współosiowo wprowadzana do przewodu o kontrolowanej temperaturze połączonego z łaźnią wodną. Wlot i wylot są połączone rurką PEEK z 4-drogowym, 2-pozycyjnym zaworem podłączonym do pompy FPLC do sterowania przepływem medium i pojemnika na odpady.
Bioreaktor jest stosowany do badania kinetyki interakcji, wcześniej zgłoszonej14,25, pomiędzy dwoma lekami, acetazolamidem (AAZ) i metazolamidem (MZA), w komórkach ludzkich z drugą izoformą ludzkiej anhydrazy węglanowej (CA II), farmakologicznie istotnym celem28,29,30oraz kinetykę powstawania wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego, promowanego przez małą cząsteczkę ebselen25,31, niezawierającej miedzi, związanej z formy ludzkiej miedzi, dysmutazy ponadtlenkowej (SOD1), enzymu przeciwutleniającego biorącego udział w wystąpieniu stwardnienia zanikowego bocznego7,8,32. Na koniec w MATLABie przeprowadzana jest analiza ilościowa danych NMR w czasie rzeczywistym przy użyciu algorytmu MCR-ALS (Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares)33, za pomocą którego uzyskuje się czyste składowe widmowe i profile stężeń w funkcji czasu dla obserwowanych gatunków, które można dalej analizować w celu uzyskania odpowiednich parametrów kinetycznych.
Protokół zaczyna się od kolby T75 składającej się z komórek HEK293T (~3 x 10,7 komórek na kolbę) przejściowo nadekspresjonujących albo ludzki CA II (nieznakowany), albo ludzki SOD1 (15N-znakowany). Komórki hodowano i utrzymywano w kolbach T75 z wysokim poziomem glukozy DMEM przez 1:10 pasaży co 3-4 dni i transfekowano cDNA kodującym białko będące przedmiotem zainteresowania 48 godzin przed eksperymentem. Kroki związane z tą fazą są szczegółowo opisane w innym miejscu34.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>251275</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>453366</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza</td><td>Life Technologies</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka glukoza, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>10270</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td><td>Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej żeli, proszek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4018</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, proszek</td><td>Carlo Erba</td><td>478537</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina&ndash; streptomycyna (10 000 U/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, granulki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego (0,4% (wag./vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>Zwrot(y) wskazujący rodzaj zagrożenia: H350 może powodować raka.</td></tr><tr><td>Trypsyna&ndash; EDTA (0,05% (wag./vol))Life</td> <td>Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Avance III Spektrometr wyposażony w sondę kriogeniczną 5 mm</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td>Wszystkie nowoczesne spektrometry i magnesy wąskootworowe wyposażone w sondy 5 mm są kompatybilne.</td></tr><tr><td>Jednostka przepływowa InsightMR</td><td>Bruker</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Moduł pompy P-920 firmy &Auml; KTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>n/a</td><td>Każda pompa perystaltyczna lub strzykawkowa FPLC, HPLC powinna być kompatybilna z jednostką przepływu.</td></tr></tbody></table>

monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego nmr w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Monitoring Protein-Ligand Interactions in Human Cells by Real-Time Quantitative In-Cell NMR using a High Cell Density Bioreactor

NMR w komórce to unikalne podejście do obserwacji strukturalnych i dynamicznych właściwości makrocząsteczek biologicznych w rozdzielczości atomowej bezpośrednio w żywych komórkach. Można zaobserwować fałdowanie białek, modyfikacje chemiczne i zmiany konformacyjne wywołane wiązaniem ligandów. W związku z tym metoda ta ma ogromny potencjał w kontekście opracowywania leków. Jednak krótka żywotność komórek ludzkich zamkniętych w spektrometrze NMR ogranicza zakres zastosowania NMR w komórce. Aby przezwyciężyć ten problem, stosuje się bioreaktory NMR, które mogą znacznie poprawić stabilność próbki komórki w czasie i, co ważne, umożliwić rejestrację widm NMR w czasie rzeczywistym. W ten sposób ewolucja procesów, takich jak penetracja ligandów i wiązanie się z wewnątrzkomórkowym celem białkowym, może być monitorowana w czasie rzeczywistym. Bioreaktory są często ograniczone przez niską żywotność komórek przy dużej liczbie komórek, co powoduje kompromis między ogólną czułością eksperymentu a żywotnością komórek. Niedawno informowaliśmy o bioreaktorze NMR, który utrzymuje dużą liczbę ludzkich komórek w stanie metabolicznym przez dłuższy czas, do 72 godzin. Układ ten zastosowano do monitorowania interakcji białko-ligand i modyfikacji chemicznej białek. Wprowadziliśmy również przepływ pracy do analizy ilościowej danych NMR w czasie rzeczywistym, w oparciu o rozdzielczość krzywych wielowymiarowych. Metoda dostarcza profile stężeń związków chemicznych obecnych w komórkach w funkcji czasu, które mogą być dalej analizowane w celu uzyskania odpowiednich parametrów kinetycznych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis konfiguracji bioreaktora NMR i jego zastosowania do monitorowania interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich.

Powyższy protokół umożliwia enkapsulację komórek w niciach hydrożelu w celu maksymalizacji żywotności komórek przez długi czas, co jest niezbędne do badania procesów wewnątrzkomórkowych w czasie rzeczywistym. W bioreaktorze komórki pozostają żywe i metabolicznie aktywne do 72 h, co potwierdzono testem z błękitem trypanu (Rycina 2a-c). W zasadzie protokół ten można zastosować do obserwacji dowolnych zmian konformacyjnych lub chemicznych białka wewnątrzkomórkowego, które jest przedmiotem zainteresowania. W pierwszej opisanej powyżej aplikacji bioreaktor zostaje wykorzystany do monitorowania w czasie rzeczywistym wiązania dwóch inhibitorów, AAZ i MZA, do CA II nadekspresyjnego w cytozolu komórek HEK293T. Pierwsze zarejestrowane widmo wzbudzenia 1H z rzeźbieniem sygnału (zgesgp) służy do oceny całkowitej intensywności sygnału (która jest proporcjonalna do liczby komórek), obecności sygnałów z nadekspresyjnego białka oraz jednorodności pola (Rycina 2d). W przypadku CA II wewnątrzkomórkowe wiązanie dwóch inhibitorów można monitorować za pomocą jednowymiarowych widm NMR 1H (p3919gp) z zastosowaniem sekwencji WATERGATE 3-9-1935, obserwując sygnały 1H w regionie między 11 a 16 ppm. Sygnały te pochodzą od histydyń koordynujących cynk oraz innych reszt aromatycznych CA II36 i ulegają zaburzeniu podczas wiązania liganda14,15. Stężenia ligandów można dobrać na podstawie szybkości dyfuzji lub, jeśli są dostępne, z wcześniej wyznaczonych wartości przepuszczalności14. Skuteczne wiązanie potwierdza się wizualnie poprzez pojawienie się dodatkowego zestawu sygnałów w interesującym regionie widma, który stopniowo zastępuje sygnały pierwotne (Rycina 3). Zależne od czasu krzywe wiązania uzyskuje się za pomocą analizy MCR-ALS, która rozdziela dwa zestawy sygnałów NMR pochodzące od wolnego i związanego CA II (Rycina 4a), a jednocześnie dostarcza względnych profili stężeń obu form (Rycina 4b). W drugiej aplikacji bioreaktor służy do monitorowania tworzenia wewnątrzmolekularnego mostka disiarczkowego w SOD1 związanym z cynkiem, indukowanego przez ebselen, mimetyk peroksydazy glutationowej, w komórkach ludzkich. Proces ten monitoruje się poprzez obserwację zmian w dwuwymiarowych widmach 1H-15N SOFAST-HMQC37 (które stanowią „odcisk palca” konformacji szkieletu białkowego) spowodowanych zaburzeniami struktury białka wywołanymi tworzeniem mostka disiarczkowego. W widmie 1H-15N pojawiają się dodatkowe sygnały pochodzące od utlenionego w formie disiarczkowej SOD1, które stopniowo zastępują sygnały z SOD1 zredukowanego w formie disiarczkowej. Analiza MCR-ALS wybranych obszarów widma 2D rozdziela sygnały pochodzące od obu form (Rycina 5a) i dostarcza ich względnych profili stężeń (Rycina 5b). Uzyskane krzywe stężeń można następnie analizować za pomocą dopasowania nieliniowego w celu uzyskania informacji o kinetyce badanych procesów25.
<img alt="Schemat przepływowego systemu NMR; przedstawia pompę, linię transferową oraz komorę z próbką do analizy chemicznej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat bioreaktora. Po lewej: przekrój pustej jednostki przepływowej. Po prawej: schemat zestawu bioreaktora. Wlotowa rurka z PEEK zaznaczona jest kolorem zielonym; wylotowa rurka z PTFE zaznaczona jest kolorem niebieskim. Panel lewy powielono za zgodą Luchinat i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wzrost komórek i analiza NMR; mikrografia, wykres żywotności, widma NMR; żywotność komórek, białko." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Test z błękitem trypanu na zamkniętych w kapsułkach komórkach oraz kontrola próbki za pomocą 1H NMR. Reprezentatywne plastry agarozy zawierające zatopione komórki, barwione błękitem trypanu (a) bezpośrednio po odlewaniu oraz (b) po 72 h w bioreaktorze; (c) żywotność komórek w funkcji czasu w bioreaktorze NMR przy aktywnym przepływie (czarny) i w warunkach statycznych (czerwony), zmierzona testem z błękitem trypanu. (d) Widma zgesgp 1H NMR zarejestrowane dla komórek zatopionych w agarozie z nadekspresją CA II w obecności (czerwony) i w nieobecności (czarny) pęcherzyków gazu w bioreaktorze. W tym drugim przypadku zmniejszona jednorodność pola powoduje poszerzenie linii i pojawienie się artefaktów supresji rozpuszczalnika. Oznaczono interesujące cechy widmowe. Panele (a-c) zostały powielone za zgodą Luchinat i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres spektroskopii NMR pokazujący wiązanie białko-ligand z rozdzielonymi w czasie piki przesunięcia chemicznego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Reprezentatywne dane 1H NMR w czasie rzeczywistym wewnątrz komórek uzyskane z komórek zamkniętych w agarozie w bioreaktorze. Wykresy kaskadowe (waterfall plots) widm 1D 1H NMR (region między 15,6 a 11,1 ppm) komórek HEK293T nadekspresujących CA II, a następnie traktowanych (a) 25 µM AAZ i (b) 10 µM MZA, zarejestrowane w funkcji czasu w bioreaktorze NMR. Moment dodania ligandu zaznaczono strzałką. Intensywność widma (a.u.) jest zakodowana kolorystycznie od niebieskiego (najniższa) do żółtego (najwyższa). Rycina powtórzona za zgodą Luchinat i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Dane widm NMR i wykresy frakcji kinetycznych dla wiązania CA II z AAZ, MZA; analiza oddziaływania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywny wynik MCR-ALS z widm 1D NMR. (a) Widma 1H NMR czystych komponentów zrekonstruowanych metodą MCR-ALS: CA II w obecności ligandów (czarny) oraz w kompleksie z AAZ (czerwony) lub MZA (magenta); (b) profile względnego stężenia wolnej (czarny) i związanej CA II w funkcji czasu po dodaniu AAZ (czerwony) lub MZA (magenta) uzyskane za pomocą MCR-ALS. Czasy traktowania ligandami są zaznaczone strzałkami. Rycina powielona za zgodą Luchinat et al.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Spektroskopia NMR: wykresy przesunięcia chemicznego i wykres kinetyczny dla analizy utlenionego przez mostki dwusiarczkowe białka SOD1." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62323/62323fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Reprezentatywny wynik analizy MCR-ALS ze spektrów NMR 2D. (a) obszary spektralne 1H-15N (oznaczone I-IV) czystych komponentów zrekonstruowanych za pomocą MCR-ALS: SOD1 zredukowanego przez mostki dwusiarczkowe (czarny) oraz SOD1 utlenionego przez mostki dwusiarczkowe (czerwony); (b) profil względnego stężenia czystych komponentów w funkcji czasu po dodaniu ebselenu (oznaczonego strzałką) uzyskany metodą MCR-ALS. Rycina została powielona za zgodą Luchinat i wsp.25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62323/62323fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Ten protokół opisuje konfigurację bioreaktora NMR w celu utrzymania żywotności zamkniętych komórek ludzkich przez okres do 72 godzin, po czym następuje czasowo-rozdzielcza akwizycja i analiza danych NMR w komórce. Metodologia ta jest stosowana do monitorowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-ligand w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

In-cell NMR is a unique approach to observe the structural and dynamic properties of biological macromolecules at atomic resolution directly in living ...

Spektroskopia NMR w komórce oferuje unikalne podejście do badania struktury i funkcji białek bezpośrednio w żywych komórkach oraz do monitorowania biologicznie istotnych procesów, takich jak interakcje białko-ligand. Ten bioreaktor NMR może utrzymać dużą liczbę komórek ludzkich przy życiu i metabolicznie aktywnych przez kilka dni w spektrometrze, umożliwiając aplikacje NMR w czasie rzeczywistym. Metodę tę można zastosować do dowolnego rozpuszczalnego, swobodnie rozpadającego się białka wewnątrzkomórkowego ulegającego zmianom konformacyjnym lub chemicznym.Znakowanie izotopowe dodatkowo rozszerza możliwości zastosowania tej metody. Aby rozpocząć, zmontuj jednostkę przepływu za pomocą drugiej rurki NMR jednostki przepływu, która później zostanie zastąpiona tą zawierającą komórki. Zapoznaj się z instrukcją obsługi jednostki przepływowej, aby uzyskać informacje na temat prawidłowego montażu.Ustaw łaźnię wodną podłączoną do regulatora temperatury jednostki przepływowej na 37 stopni Celsjusza i umieść butelkę ze zbiornikiem w łaźni wodnej. Podłącz rurkę FEP butelki zbiornika do pompy. Przekręć zawór bioreaktora, aby obejść i wstępnie napełnić pompę medium.Następnie przekręć zawór bioreaktora na przepływ i wstępnie napełnij bioreaktor medium z prędkością 0,1 mililitra na minutę. Pobrać kolbę T75 z transfekowanymi limfocytami T HEK 293 z inkubatora dwutlenku węgla i usunąć zużytą pożywkę. Dodaj dwa mililitry trypsyny EDTA do komórek i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej, aby odłączyć komórki.Dezaktywuj trypsynę za pomocą 20 mililitrów kompletnego DMEM i dokładnie ponownie zawiesić komórki, pipetując w górę iw dół. Następnie przenieś je do 50-mililitrowej probówki wirówkowej. Odwirować komórki przy 800X G przez pięć minut w temperaturze pokojowej i wyrzucić supernatant.Przenieś osad komórkowy do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej. Aby osadzić komórki w nitkach agarozy, rozpuść jedną porcję zestalonej agarozy w temperaturze 85 stopni Celsjusza w podgrzewaczu blokowym, a następnie trzymaj ją w roztworze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w podgrzewaczu blokowym. Za pomocą pipety Pasteura napełnij dno rurki NMR jednostki przepływowej 60 do 70 mikrolitrami 1,5% żelu agarozowego i umieść go na lodzie, aby utworzyć korek dolny o wysokości pięciu milimetrów.Podgrzej granulkę komórkową przez 15 do 20 sekund w podgrzewaczu blokowym i ostrożnie ponownie zawieś komórki w 450 mikrolitrach roztworu agarozy, unikając tworzenia się pęcherzyków. Odessać zawiesinę komórka/agaroza do 30-centymetrowej rurki chromatograficznej PEEK o średnicy wewnętrznej 0,75 milimetra połączonej ze strzykawką o pojemności jednego mililitra. Pozwól rurkom ostygnąć w temperaturze pokojowej przez dwie minuty.Wstępnie napełnij rurkę NMR jednostki przepływowej 100 mikrolitrami PBS w temperaturze pokojowej. Odlać nici komórek osadzonych w agarozie do rurki NMR jednostki przepływowej, delikatnie popychając strzykawkę. Wyjmij pustą rurkę NMR z jednostki przepływowej i zwiększ natężenie przepływu do dwóch mililitrów na minutę przez kilka minut, aby usunąć resztki pęcherzyków gazu z rurki dolotowej.Ustaw natężenie przepływu na 0,2 mililitra na minutę i włóż rurkę NMR zawierającą komórki, popychając ją powoli, ale stabilnie do góry. Zasilaj medium bioreaktora z natężeniem przepływu 0,1 mililitra na minutę. Ustaw temperaturę w spektrometrze NMR na 310 kelwinów i włóż jednostkę przepływu do spektrometru.Po włożeniu bioreaktora do spektrometru NMR odczekaj kilka minut, aby umożliwić wymianę medium. Dostosuj dopasowanie i dostrojenie kanału protonowego, podkładkę magnesu i oblicz długość twardego impulsu protonu o 90 stopni. Dostosuj poziomy mocy protonów w każdej sekwencji impulsów zgodnie z twardym impulsem protonu.Zarejestruj pierwsze widmo NMR protonów zgesgp, aby zarejestrować zawartość próbki w jednorodności pola. Skopiuj eksperymenty zgesgp i p3919gp lub SOFAST-HMQC na żądaną liczbę i umieść je w kolejce w buforze akwizycji. Wstrzyknąć stężony roztwór cząsteczki zewnętrznej do butelki ze zbiornikiem pożywki, przekłuwając silikonową rurkę sterylną strzykawką z długą igłą.Pod koniec eksperymentu NMR zastąp probówkę zawierającą komórki pustą probówką i przepłucz jednostkę przepływową wodą. W przypadku komórek wykazujących ekspresję nieznakowanej anhydrazy węglanowej należy przetworzyć widma p3919gp, stosując funkcję zerowego wypełnienia i wykładniczego poszerzania linii. W przypadku komórek wykazujących ekspresję dysmutazy ponadtlenkowej znakowanej azotem-15 należy przetworzyć widma SOFAST-HMQC, stosując funkcję wypełnienia zerowego i okna dzwonka ze znakiem kwadratowym w obu wymiarach.W programie MATLAB zaimportuj regiony spektralne za pomocą niestandardowego skryptu Load_ascii_spectra. Uruchom skrypt Load_acqus, aby wyodrębnić znaczniki czasu z widm 1D. Otwórz graficzny interfejs użytkownika MCR-ALS 2.0, uruchamiając skrypt mcr_main, a następnie w zakładce Wybór danych załaduj macierz widm.Sprawdź dane, wykreślając je. Oceń liczbę składników, albo przez dekompozycję wartości osobliwych, albo ręcznie, i wybierz metodę wstępnego oszacowania czystych widm. Można zastosować zarówno detekcję najczystszych zmiennych, jak i analizę czynników ewoluujących.W oknie Wybór zestawu danych wybierz pozycję Kontynuuj. Ustaw ograniczenia dla stężeń w oknie Ograniczenia:tryb wiersza. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierając fnnls jako implementację i two jako liczbę gatunków.Następnie zastosuj jedno ograniczenie zamknięcia, ustaw ograniczenie na jeden, warunek ograniczenia zamknięcia jako równy i zastosuj do wszystkich gatunków. Ustaw ograniczenia dla widm w oknie Ograniczenia:tryb kolumny. Zastosuj ograniczenie nieujemności, wybierając fnnl jako implementację i dwa jako liczbę gatunków.W ostatnim oknie ustaw 50 iteracji i kryterium konwergencji 0,01. Określ nazwy wyjściowe dla stężeń, widm i odchylenia standardowego. Kliknij przycisk Kontynuuj, aby uruchomić łącznik MCR-ALS.Komórki w bioreaktorze mogą być utrzymywane przy życiu do 72 godzin, co potwierdza test błękitu trypanowego. Bioreaktor wykorzystano do monitorowania w czasie rzeczywistym wiązania dwóch inhibitorów, acetazolamidu i metazolamidu, z nadekspresją anhydrazy węglanowej w cytozolu limfocytów T HEK 293. Obecność sygnałów z nadekspresji białka i jednorodność pola oceniano za pomocą pierwszego widma protonów rzeźbiących wzbudzenie.W przypadku anhydrazy węglanowej wewnątrzkomórkowe wiązanie dwóch inhibitorów monitorowano, obserwując sygnały protonowe w zakresie od 11 do 16 części na milion widma WATERGATE, powstające z histydyn koordynujących i innych reszt aromatycznych. Pomyślne wiązanie zostało potwierdzone pojawieniem się dodatkowych sygnałów. MCR-ALS wykorzystano do oddzielenia sygnałów NMR pochodzących z wolnej i związanej anhydrazy węglanowej oraz do przedstawienia względnych profili stężeń obu gatunków.Bioreaktor zastosowano do monitorowania powstawania wewnątrzcząsteczkowego wiązania dwusiarczkowego dysmutazy ponadtlenkowej związanego z promowanego przez ebselen, naśladowcę peroksydazy glutationowej. Analiza MCR-ALS na wybranych obszarach widma 2D rozdzieliła sygnały pochodzące od dwóch gatunków i dostarczyła ich względnych profili stężeń. Ważne jest, aby powoli i równomiernie wkładać i wyjmować rurkę NMR jednostki przepływu, aby uniknąć skoków ciśnienia, które mogą powodować tworzenie się pęcherzyków.Opracowanie bioreaktorów NMR utorowało drogę do badania procesów zależnych od czasu związanych z rozdzielczością atomową, takich jak kreślenie regulacji redux i interakcji lek/cel w żywych komórkach.

monitoring-protein-ligand-interactions-human-cells-real-time

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W tym filmie demonstrujemy technikę spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego w komórce do badania interakcji białko-ligand między nieznakowanymi białkami o nadekspresji a małymi cząsteczkami. Udana interakcja ligand-białko jest potwierdzona wizualnie przez pojawienie się dodatkowego zestawu pików w obszarze widmowym będącym przedmiotem zainteresowania, który stopniowo zastępuje pierwotne piki.

Ilościowa spektroskopia NMR wodoru w komórce do monitorowania interakcji białko-ligand

W tym protokole przedstawiono produkcję, konfigurację i podstawowe działanie mikroprzepływowego bioreaktora pikolitrowego (PLBR) do analizy pojedynczych komórek mikroorganizmów prokariotycznych. Mikroorganizmy istotne z przemysłowego punktu widzenia zostały przeanalizowane jako dowód zasadności, co pozwoliło na wgląd w tempo wzrostu, morfologię i niejednorodność fenotypową w określonych okresach czasu, co jest prawie niemożliwe przy użyciu konwencjonalnych metod.

Mikroprzepływowy bioreaktor pikoliterowy do analizy mikrobiologicznej pojedynczych komórek: produkcja, konfiguracja systemu i obsługa

Powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR) to bezznacznikowa metoda wykrywania interakcji biomolekularnych w czasie rzeczywistym. W niniejszym artykule opisano protokół eksperymentu interakcji białko błona / receptor, omawiając jednocześnie zalety i wady tej techniki.

Pomiary w czasie rzeczywistym interakcji białko-receptor błonowy przy użyciu powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR)

Przedstawiono szczegółowy protokół jednoczesnego działania 48 równoległych kultur komórkowych w różnych warunkach w systemie mikrobioreaktora. Opisano proces hodowli komórek, zbiór i późniejszą analizę miana przeciwciał.

Zastosowanie wysokowydajnego zautomatyzowanego systemu mikrobioreaktorów do produkcji modelowej IgG1 w komórkach CHO

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i oczyszczania białek znakowanych stabilnymi izotopami, a następnie charakteryzację oddziaływań białko-białko za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i eksperymentów termoforezy w mikroskali (MST).

Pomiar oddziaływań białek kulistych i nitkowatych za pomocą spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i termoforezy w mikroskali (MST)

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Tutaj przedstawiamy szczegółową procedurę przeprowadzania projektu eksperymentu w zautomatyzowanym mikro-bioreaktorze, a następnie zbierania komórek i kwantyfikacji białka za pomocą kolumny Białko A.

Optymalizacja procesów z wykorzystaniem zautomatyzowanych mikrobioreaktorów o wysokiej przepustowości w hodowli komórek jajnika chomika chińskiego

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do szybkiego i półilościowego pomiaru interakcji ligand-receptor w trans w heterologicznym systemie komórkowym za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Pomiar interakcji międzykomórkowych poprzez agregację białek w heterologicznym systemie komórkowym

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

Poznaj metodę ilościowego NMR w komórkach żywych z wykorzystaniem bioreaktora do monitorowania interakcji białko-ligand w komórkach HEK 293T. Technika ta umożliwia analizę zmian konformacyjnych w czasie rzeczywistym.

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek (Wideo) | JoVE Journal

Monitorowanie interakcji białko-ligand w komórkach ludzkich za pomocą ilościowego NMR w komórce w czasie rzeczywistym przy użyciu bioreaktora o dużej gęstości komórek

Przeglądaj więcej filmów