Name: Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Poznaj zoptymalizowany protokół ran ex vivo na ludzkiej skórze do oceny naprawy tkanek. Metoda umożliwia szybką, powtarzalną analizę gojenia się ran w próbkach skóry zdrowej i cukrzycowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Panom Paolo Matteuci i Panu George'owi Smithowi za dostarczenie tkanek pacjenta. Jesteśmy również wdzięczni Pani Amber Rose Stafford za pomoc w pobraniu tkanek oraz Daisy Appeal za udostępnienie sprzętu laboratoryjnego.

<ol><li>Lindholm, C., Searle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+management+for+the+21st+century%3A+combining+effectiveness+and+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Wound management for the 21st century: combining effectiveness and efficiency.</a> International Wound Journal. 13, 5-15 (2016).</li>
<li>Guest, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Health+economic+burden+that+different+wound+types+impose+on+the+UK%27s+National+Health+Service%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Health economic burden that different wound types impose on the UK's National Health Service.</a> International Wound Journal. 14 (2), 322-330 (2017).</li>
<li>Guest, J. F., Fuller, G. W., Vowden, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+foot+ulcer+management+in+clinical+practice+in+the+UK%3A+costs+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Wound+Journal%22%5BJournal%5D)">Diabetic foot ulcer management in clinical practice in the UK: costs and outcomes.</a> International Wound Journal. 15 (1), 43-52 (2018).</li>
<li>López-Valverde, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perioperative+and+long-term+all-cause+mortality+in+patients+with+diabetes+who+underwent+a+lower+extremity+amputation%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Research+and+Clinical+Practice%22%5BJournal%5D)">Perioperative and long-term all-cause mortality in patients with diabetes who underwent a lower extremity amputation.</a> Diabetes Research and Clinical Practice. 141, 175-180 (2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+estrogen+in+cutaneous+ageing+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Maturitas%22%5BJournal%5D)">The role of estrogen in cutaneous ageing and repair.</a> Maturitas. 103, 60-64 (2017).</li>
<li>Frykberg, R. G., Banks, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+the+treatment+of+chronic+wounds%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Challenges in the treatment of chronic wounds.</a> Advances in Wound Care. 4 (9), 560-582 (2015).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing%3A+cellular+mechanisms+and+pathological+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Wound healing: cellular mechanisms and pathological outcomes.</a> Open Biology. 10 (9), 200223(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Holden, K. A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+wound+repair%3A+Are+they+cutting+it%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Animal models of wound repair: Are they cutting it.</a> Experimental Dermatology. 21 (8), 581-585 (2012).</li>
<li>Elliot, S., Wikramanayake, T. C., Jozic, I., Tomic-Canic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modeling+conundrum%3A+murine+models+for+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A modeling conundrum: murine models for cutaneous wound healing.</a> Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 736-740 (2018).</li>
<li>Mazio, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-vascularized+dermis+model+for+fast+and+functional+anastomosis+with+host+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Pre-vascularized dermis model for fast and functional anastomosis with host vasculature.</a> Biomaterials. 192, 159-170 (2019).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Iveson, S., Catherall, P., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+silver+bioactive+glass+elicits+antimicrobial+efficacy+against+Pseudomonas+aeruginosa+and+Staphylococcus+aureus+in+an+ex+vivo+skin+wound+biofilm+model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel silver bioactive glass elicits antimicrobial efficacy against Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus in an ex vivo skin wound biofilm model.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 1450(2018).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+local+senescence+in+diabetic+wound+healing+is+linked+to+pathological+repair+via+CXCR2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated local senescence in diabetic wound healing is linked to pathological repair via CXCR2.</a> Journal of Investigative Dermatology. 139 (5), 1171-1181 (2019).</li>
<li>Wilkinson, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+iron+promotes+wound+repair+via+M2+macrophage+polarization+and+the+chemokine+%28CC+motif%29+ligands+17+and+22%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue iron promotes wound repair via M2 macrophage polarization and the chemokine (CC motif) ligands 17 and 22.</a> The American Journal of Pathology. 189 (11), 2196-2208 (2019).</li>
<li>Rhea, L., Dunnwald, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+excisional+wound+healing+model+and+histological+morphometric+wound+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Murine excisional wound healing model and histological morphometric wound analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 162, e61616(2020).</li>
<li>Ansell, D. M., Campbell, L., Thomason, H. A., Brass, A., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+statistical+analysis+of+murine+incisional+and+excisional+acute+wound+models%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">A statistical analysis of murine incisional and excisional acute wound models.</a> Wound Repair and Regeneration. 22 (2), 281-287 (2014).</li>
<li>Rizzo, A. E., Beckett, L. A., Baier, B. S., Isseroff, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+linear+excisional+wound%3A+an+improved+model+for+human+ex+vivo+wound+epithelialization+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Skin+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">The linear excisional wound: an improved model for human ex vivo wound epithelialization studies.</a> Skin Research and Technology. 18 (1), 125-132 (2012).</li>
<li>Olsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+humanistic+and+economic+burden+of+chronic+wounds%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The humanistic and economic burden of chronic wounds: a systematic review.</a> Wound Repair and Regeneration. 27 (1), 114-125 (2019).</li>
<li>Mendoza-Garcia, J., Sebastian, A., Alonso-Rasgado, T., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+an+ex+vivo+wound+healing+model+in+the+adult+human+skin%3A+Functional+evaluation+using+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Optimization of an ex vivo wound healing model in the adult human skin: Functional evaluation using photodynamic therapy.</a> Wound Repair and Regeneration. 23 (5), 685-702 (2015).</li>
<li>Brownhill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+assessment+of+single-use+negative+pressure+wound+therapy+during+in+vivo+porcine+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Wound+Care%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical assessment of single-use negative pressure wound therapy during in vivo porcine wound healing.</a> Advances in Wound Care. , (2020).</li>
<li>Diekmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+three-dimensional+skin+equivalent+reflecting+some+aspects+of+in+vivo+aged+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">A three-dimensional skin equivalent reflecting some aspects of in vivo aged skin.</a> Experimental Dermatology. 25 (1), 56-61 (2016).</li>
<li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Nguyen, H., Cairns, D. M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skin+equivalents+demonstrate+need+for+neuro-immuno-cutaneous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biosystems%22%5BJournal%5D)">Human skin equivalents demonstrate need for neuro-immuno-cutaneous system.</a> Advanced Biosystems. 3 (1), 1800283(2019).</li>
<li>Dijkgraaf, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+patrol+by+resident+memory+CD8%2B+T+cells+in+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue patrol by resident memory CD8+ T cells in human skin.</a> Nature Immunology. 20 (6), 756-764 (2019).</li>
<li>He, X., de Oliveira, V. L., Keijsers, R., Joosten, I., Koenen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+isolation+from+human+skin+for+phenotypic+analysis+and+ex+vivo+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte isolation from human skin for phenotypic analysis and ex vivo cell culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e52564(2016).</li>
<li>Pupovac, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+immunocompetent+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Toward immunocompetent 3D skin models.</a> Advanced Healthcare Materials. 7 (12), 1701405(2018).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+in+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: in vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microscale%2C+full-thickness%2C+human+skin+on+a+chip+assay+simulating+neutrophil+responses+to+skin+infection+and+antibiotic+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microscale, full-thickness, human skin on a chip assay simulating neutrophil responses to skin infection and antibiotic treatments.</a> Lab on a Chip. 19 (18), 3094-3103 (2019).</li>
<li>Jardet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+Th17-driven+ex+vivo+skin+inflammation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human Th17-driven ex vivo skin inflammation model.</a> Experimental Dermatology. 29 (10), 993-1003 (2020).</li>
<li>Chen, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metformin+attenuates+diabetes-induced+tau+hyperphosphorylation+in+vitro+and+in+vivo+by+enhancing+autophagic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Metformin attenuates diabetes-induced tau hyperphosphorylation in vitro and in vivo by enhancing autophagic clearance.</a> Experimental Neurology. 311, 44-56 (2019).</li>
<li>Demirovic, D., Rattan, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin+induces+stress+response+and+hormetically+modulates+wound+healing+ability+of+human+skin+fibroblasts+undergoing+ageing+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Curcumin induces stress response and hormetically modulates wound healing ability of human skin fibroblasts undergoing ageing in vitro.</a> Biogerontology. 12 (5), 437-444 (2011).</li>
<li>Wilkinson, H. N., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+senescence%3A+A+functional+link+between+diabetes+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Wound senescence: A functional link between diabetes and ageing.</a> Experimental Dermatology. 30 (1), 68-73 (2020).</li>
<li>Fisher, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+fragmentation+promotes+oxidative+stress+and+elevates+matrix+metalloproteinase-1+in+fibroblasts+in+aged+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin.</a> The American Journal of Pathology. 174 (1), 101-114 (2009).</li>
<li>Quan, T., Little, E., Quan, H., Voorhees, J. J., Fisher, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+matrix+metalloproteinases+and+collagen+fragmentation+in+photodamaged+human+skin%3A+impact+of+altered+extracellular+matrix+microenvironment+on+dermal+fibroblast+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Elevated matrix metalloproteinases and collagen fragmentation in photodamaged human skin: impact of altered extracellular matrix microenvironment on dermal fibroblast function.</a> Journal of Investigative Dermatology. 133 (5), 1362(2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

W tym protokole eksperymentalnym opisujemy zoptymalizowaną metodę oceny zamykania ran w ludzkiej skórze ex vivo za pomocą barwienia tkanek całych. Jest to ważne źródło umożliwiające krytyczną ocenę potencjalnych metod leczenia ran i zapewniające lepsze zrozumienie reakcji na gojenie ran u ludzi. Opublikowaliśmy ocenę gojenia się ran skóry ex vivowcześniej 12,13, jednak w tych raportach nie zastosowano podejścia opartego na barwieniu całej góry do pomiaru zamknięcia rany. Barwienie w całości jest znacznie łatwiejsze i wymaga mniejszego doświadczenia technicznego niż standardowa histologia, która obejmuje zatapianie i cięcie próbek parafiną lub OCT. Procedura pełnego mocowania zmniejsza również zmienność eksperymentalną, umożliwiając ilościowe określenie całej rany, a nie tylko pojedynczego przekroju poprzecznego w określonym miejscu w tkance (patrz rysunek 4B w celu zilustrowania porównawczego). W pełni popieramy znaczenie ilościowego określenia gojenia całej niesymetrycznej struktury rany, co zostało wyraźnie podkreślone przez Rhea i Dunnwald w przypadku ostrych ran u myszy14. Autorzy ci wykazali, jak ważne jest seryjne cięcie ran wycinających in vivo dla powtarzalnych i precyzyjnych pomiarów morfologii rany. Seryjne sekcje mogą być równie dobrze stosowane do ludzkich ran ex vivo; Jednak w celu dokładnego ilościowego określenia zamknięcia rany i ponownego nabłonkowania preferowaną metodą powinno być barwienie całokształtowe o wysokiej przepustowości. Zwracamy uwagę, że ten protokół barwienia całego montażu powinien być również kompatybilny z późniejszym przetwarzaniem (woskiem lub OCT) do tradycyjnej analizy histologicznej.
Barwienie w całości nie jest pozbawione wad. Chociaż zapewnia większą powtarzalność w eksperymentach z gojeniem się ran, wymaga użycia większej ilości tkanki do analizy niż standardowe techniki histologiczne. Może to stanowić problem, gdy dostęp do tkanek jest ograniczony, szczególnie gdy konieczne jest oszacowanie wielu przeciwciał. Alternatywnym podejściem byłoby zastosowanie metody ran ciętych, w której szerokość rany jest względnie jednolita, a zmienność zmniejszona (jak pokazano w przypadku ran u myszy i ludzi 15,16). Jednak rany wycinające mają większe zastosowanie w przypadku większości patologicznych typów ran17.
W tym badaniu utworzono rany o częściowej grubości 2 mm w środku eksplantatów skóry o średnicy 6 mm. Metoda ta może być zoptymalizowana pod kątem alternatywnych rozmiarów ran wycinających i eksplantatów na różnych głębokościach skóry18. Ponadto siła wymagana do wytworzenia ran będzie się różnić w zależności od dawcy, przy czym starzejąca się skóra będzie wymagała mniejszej siły do biopsji. Unikalibyśmy również używania skóry z widocznymi rozstępami lub innymi zmianami strukturalnymi. Przeprowadziliśmy walidację szeregu przeciwciał, aby uwzględnić różne aspekty odpowiedzi leczniczej ex vivo. Protokół ten może być również stosowany z innymi przeciwciałami istotnymi dla skóry, w przypadku których konieczne będzie zoptymalizowanie stężenia przeciwciał i czasu inkubacji. Niemniej jednak uważamy, że nasz protokół jest najbardziej odpowiedni do bezwzględnej kwantyfikacji całkowitego zamknięcia rany, a następnie do oceny przestrzennej określonych białek będących przedmiotem zainteresowania. Podczas gdy całościowe mocowanie zapewnia zmniejszoną rozdzielczość immunolokalizacji w porównaniu ze standardową analizą histologiczną skrawków tkanki, zapewnia dodatkowe informacje 3D, których brakuje w standardowej histologii 2D.
Jednym z zastrzeżeń związanych z oceną gojenia skóry ex vivo w porównaniu z modelami in vivo jest to, że brakuje odpowiedzi ogólnoustrojowej. Ważnym aspektem gojenia się ran jest stan zapalny i późniejsza ziarnina tkanek, która jest spowodowana napływem komórek zapalnych i komórek śródbłonka z układu krwionośnego19. Pomimo tego ograniczenia, skóra ex vivo nadal zapewnia lepszą rekapitulację gojenia klinicznego niż testy ran oparte na komórkach. Eksperymenty in vitro na ogół obejmują monowarstwy lub kokultury pojedynczych typów komórek hodowane na plastikowych kulturach tkankowych, podczas gdy skóra ex vivo zapewnia natywne środowisko do badania zachowania komórek. Ostatnio pojawiło się wiele systemów równoważnych dla skóry, w których skóra jest hodowana w warunkach laboratoryjnych ze sztucznej matrycy i izolowanych komórek skóry20,21. Chociaż modele te naśladują ludzką skórę lepiej niż większość podejść in vitro, nadal nie symulują w pełni rodzimego środowiska tkankowego i są na ogół zbyt delikatne, aby można je było ponownie uszkodzić. Ponadto wykazaliśmy (i inni), że ludzka tkanka skórna ex vivo zachowuje rezydujące komórki odpornościowe, które bez wątpienia przyczynią się do naprawy22,23. Przyszłe prace powinny teraz koncentrować się na rozszerzeniu żywotności i kompetencji immunologicznych modelu ex vivo do oceny gojenia na późnym etapie24. Jedną z opcji jest dalszy rozwój obiecujących technologii narządów na chipie, które są w stanie przedłużyć żywotność tkanek i utrzymać natywną architekturę skóry przez okres do dwóch tygodni w hodowli25. Modele ex vivo zaczęły również uwzględniać znaczenie reakcji zapalnej skóry poprzez skuteczne włączanie komórek odpornościowych, takich jak neutrofile, do tkanki gospodarza26 lub wstrzykiwanie do tkanki gospodarza przeciwciał w celu wywołania reakcji immunologicznej27. Oczekujemy, że odkrycia te utorują drogę do opracowania bardziej wyrafinowanych i tłumaczalnych metod w przyszłości.
Główną korzyścią płynącą z zastosowania skóry ex vivo do pomiaru zamykania ran jest możliwość porównania szybkości gojenia w tkankach zdrowych (np. bez cukrzycy) i patologicznych (np. cukrzycowych lub starych). Tutaj wykazaliśmy, że reepitelializacja i tworzenie bariery są rzeczywiście upośledzone w przypadku ran cukrzycowych w porównaniu ze zdrowymi ranami ex vivo. W rzeczywistości zapewnia to drogę do przedklinicznej oceny patologicznej naprawy, w której starzenie się i cukrzyca są głównymi czynnikami ryzyka rozwoju ran przewlekłych1. Chociaż istnieją modele patologiczne in vitro, takie jak komórki wyizolowane ze starzejącej się tkanki i cukrzycowej lub komórki hodowane w wysokiej glukozie w celu naśladowania hiperglikemii28,29, komórki te mogą szybko stracić swój fenotyp po usunięciu z mikrośrodowiska in vivo. Ważnym składnikiem zewnętrznego patologicznego środowiska gojenia jest macierz skórna, która ulega zmianie zarówno w procesie starzenia się, jak i cukrzycy30. Rzeczywiście, ta zaburzona matryca wpływa na zachowanie rezydentnych i naiwnych fibroblastów31,32. W związku z tym nie można lekceważyć znaczenia badania komórek w środowisku tkankowym gospodarza.
Podsumowując, nasz protokół stanowi ważną platformę do ilościowego określania reepitelializacji ran u ludzi, badania czynników regulacyjnych oraz testowania ważności i skuteczności potencjalnych terapii12,13. Podczas gdy badania przedkliniczne nadal wymagają podejść in vivo, połączona strategia wykorzystująca tkanki ludzkie ex vivo i zranienia myszy in vivo powinna udoskonalić ścieżkę przedkliniczną, ograniczając wykorzystanie zwierząt przy jednoczesnym zwiększeniu translatywalności międzygatunkowej.

Przewlekłe, niegojące się rany, które są często częste u osób starszych i chorych na cukrzycę, są głównie niedocenianym obszarem klinicznych niezaspokojonych potrzeb. Rany te stanowią poważne obciążenie fizyczne i psychiczne dla pacjentów i kosztują świadczeniodawców opieki zdrowotnej miliardy rocznie na leczenie1. Pomimo lepszego zrozumienia biologii ran i postępu technologicznego, do 40% ran przewlekłych nadal nie goi się zgodnie z najlepszymi standardami opieki2. Tak więc 14-26% pacjentów z owrzodzeniami stopy cukrzycowej wymaga następnie amputacji3, podczas gdy wskaźnik śmiertelności po 5 latach po amputacji wynosi około 70%4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania nowych, skutecznych terapii w celu poprawy jakości życia pacjentów, przy jednoczesnym zmniejszeniu znacznego obciążenia opieki zdrowotnej wynikającego ze złego gojenia się ran. Słabo predykcyjne modele przedkliniczne pozostają istotną przeszkodą w opracowywaniu nowych, skutecznych terapii.
Naprawa ran to dynamiczny i wieloaspektowy proces obejmujący różnorodne typy komórek, niezliczone poziomy komunikacji i środowisko tkankowe, które jest czasowo przebudowywane. Gojenie się skóry opiera się na czterech głównych etapach naprawczych: hemostazie, zapaleniu, proliferacji i przebudowie macierzy. Etapy te ostatecznie zapobiegają utracie krwi i infekcji, zamykają powierzchnię rany (proces nazywany reepitelializacją) i przywracają skórę do stanu nieuszkodzonego5. Rany przewlekłe wiążą się z różnorodną etiologią i rozległymi zaburzeniami procesów gojenia6, co dodatkowo komplikuje identyfikację celów terapeutycznych. Niemniej jednak opracowano szeroką gamę modeli, aby zarówno wyjaśnić molekularne i komórkowe czynniki patologii ran, jak i przetestować nowe podejścia terapeutyczne7.
Najczęściej używanym modelem leczenia ran jest ostre zranienie u myszy. Myszy są bardzo podatne na badania mechanistyczne i dostarczają zweryfikowanych modeli starzenia się i cukrzycy8. Pomimo ogólnych podobieństw wykazanych między leczeniem myszy i ludzi, utrzymują się różnice między gatunkami w budowie skóry i dynamice gojenia. Oznacza to, że większość badań nad ranami mysimi nie przekłada się łatwo na clinic9. W związku z tym nastąpił nacisk na systemy in vitro i ex vivo o wysokiej stosowalności i translatowalności10,11.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół wykonywania ran wycinających częściową grubość w ludzkiej skórze ex vivo. Przedstawiamy również nasze podejście do barwienia całego wierzchowania jako wysoce powtarzalną metodę oceny gojenia się ludzkiej skóry ex vivo. Pokazujemy trajektorię naprawy naskórka (reepitelializacji) i późniejszego tworzenia bariery, oceniając szybkość zamykania się ran w zdrowej i cukrzycowej skórze ludzkiej. Na koniec pokazujemy, w jaki sposób barwienie w całości można dostosować do stosowania z szeregiem przeciwciał w celu oceny różnych aspektów odpowiedzi leczniczej.

<table><tbody><tr><td>50 ml Falcon Tubes</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td>Do mycia skóry</td></tr><tr><td>1.5&nbsp; ml Probówki do mikrowirówek TubeOne, naturalne (sterylne)</td> <td>Starlab</td><td>S1615-5510</td><td>Do barwienia całego mocowania</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka CytoOne, z powłoką TC</td><td>Starlab</td><td>CC7682-7548</td><td>Do barwienia całościowego</td></tr><tr><td>Kwas octowy Glacial</td><td>Fisher Chemical</td><td>A/0400/PB15</td><td>Część utrwalacza</td></tr><tr><td>bromek</td> <td>alkilotrimetyloamoniowySigma-Aldrich</td><td>M7635</td><td>Część utrwalacza</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-alfa aktynowe mięśni gładkich [1A4]</td><td>Abcam</td><td>ab7817</td><td>Barwi naczynia krwionośnePrzeciwciało</td></tr> <tr><td>anty-kolagenowe I</td><td>Abcam</td><td>ab34710</td><td>Stains collagen</td></tr><tr><td>Anti-Cytokeratin 14 Przeciwciało [LL002]</td><td>Abcam</td><td>ab7800</td><td>Plamy naskórka</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD1A (CTB6)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-5265</td><td>Barwie Komórki Langerhansa</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62247</td><td>Przeciwbarwienie do jąder komórkowych</td></tr><tr><td>Falcon 60mm szalki Petriego</td><td>Falcon</td><td>353004</td><td>Ludzka hodowla ex vivo</td></tr><tr><td>Fibronektyna Przeciwciało (EP5)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8422</td><td>Barwie fibronektyna</td></tr><tr><td>Formaldehyd, ekstra czysta, roztwór 37-41%, SLR</td><td>Fisher Chemical</td><td>F/1501/PB17</td><td>Część utrwalacza</td></tr><tr><td>wacików z gazy</td><td>Medisave</td><td>CS1650</td><td>Do oczyszczania skóry</td></tr><tr><td>Gibco&trade; Roztwór antybiotykowo-przeciwgrzybiczy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15240062</td><td>Human ex vivo culture</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11960044</td><td>Ludzka hodowla ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10500064</td><td>Ludzka hodowla ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco HBSS, bez wapnia, bez magnezu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170088</td><td>Ludzka hodowla ex vivo</td></tr><tr><td>Gibco L-Glutamina (200 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Hodowla człowieka ex vivo</td></tr><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><<td>em>Do barwienia immunoperoksydazą</td></tr><tr><td>ImageJ Software</td><td>National Institutes of Zdrowie</td><td>N/A</td><td>Do analizy obrazu</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Adsorbowany krzyżowo kozio-anty-mysz, Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11001</td><td>Stosowane przeciwciało drugorzędowe zależy od wymaganych fluorochromów i przeciwciała pierwszorzędowego</td></tr><tr><td>Invitrogen IgG (H+L) Adsorbowany krzyżowo kozioł anty-królik, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11012</td><td>Stosowane przeciwciało drugorzędowe zależy od wymaganych fluorochromów i przeciwciała pierwszorzędowego</td></tr><tr><td>Invitrogen ŻYWY/MARTWY Zestaw do żywotności/cytotoksyczności, dla komórek ssaków</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td>Do oceny żywotności tkanek</td></tr><tr><td>Kleszcze do irysów, 10 cm, zakrzywione, 1x2 zęby</td><td>World Precision Instruments</td><td>15917</td><td>Do tworzenia ran</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów, 11 cm, zakrzywione, SuperCut, Precyzyjne instrumenty z węglika wolframu</td><td></td><td></td> <td>501264Do tworzenia ran</td></tr><tr><td>Nożyczki do irysów, 11 cm, proste, SuperCut, Precyzyjne instrumenty z węglika wolframu</td><td></td><td>501263</td><td>Do usuwania tkanki tłuszczowej</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne Keratyna 1, oczyszczone</td><td>Biolegend</td><td>905201</td><td>Plamy naskórka</td></tr><tr><td>Przeciwciało poliklonalne keratyny 14, oczyszczone</td><td>Biolegend</td><td></td> <td>905301Plami naskórek</td></tr><tr><td>LSM 710 Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy</td><td>Carl Zeiss</td><td>Wycofane</td> <td>Do obrazowania fluorescencyjnego</td></tr><tr><td>Merck Millipore Wkładki chłonne</td><td>Merck Millipore</td><td>AP10045S0</td><td>Ludzka kultura ex vivo</td></tr><tr><td>Merck Millipore Nylon Hydrofilowe filtry membranowe</td><td>Merck Millipore</td><td>HNWP04700</td><td>Ludzka kultura ex vivo</td></tr><tr><td>Normalny roztwór surowicy koziej</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td> Stosowana surowica zwierzęca zależy od przeciwciała drugorzędowego</td></tr><tr><td>Fosforanowy roztwór buforowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>Do buforu do mycia</td></tr><tr><td>Azydku sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Do blokowania buforu</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Bioodczynniki</td><td>BP358-212</td><td>Część utrwalacza</td></tr><tr><td>Woreczki do sterylizacji</td><td>Medisave</td><td>SH3710</td><td>Do sterylizacji narzędzi</td></tr><tr><td>Stiefel Stemple do biopsji 2 mm</td><td>Medisave</td><td>BI0500</td><td>Do ran o częściowej grubości</td></tr><tr><td>Stiefel Stemple do biopsji 6 mm</td><td>Medisave</td><td>BI2000</td><td>Do eksplantatu zewnętrznego</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sterilin Standard 90mm szalki Petriego</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>101VR20</td><td>Do przygotowania skóry</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Chemical</td><td>T/3751/08</td><td>Do mycia buforu</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit, Peroksydaza (IgG królika)</td><td>Wektor Laboratoria</td><td>PK-6101</td><td>Do barwienia immunoperoksydazą; Używany zestaw HRP zależy od przeciwciała pierwotnego</td></tr><tr><td>Vector NovaRED Substrate Kit, peroksydaza (HRP)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td>Do barwienia immunoperoksydazą</td></tr><tr><td>Bezprzewodowy mikroskop cyfrowy</td><td>Jiusion</td><td>N/A</td><td>Do obrazowania w jasnym polu</td></tr></tbody></table>

ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Human Ex vivo Wound Model and Whole-Mount Staining Approach to Accurately Evaluate Skin Repair

Przewlekłe, niegojące się rany, które dotykają głównie osoby starsze i chore na cukrzycę, są znaczącym obszarem niezaspokojonych potrzeb klinicznych. Niestety, obecne metody leczenia ran przewlekłych są niewystarczające, a dostępne modele przedkliniczne słabo przewidują skuteczność kliniczną nowych terapii. W tym miejscu opisujemy wysokoprzepustowy, przedkliniczny model do oceny wielu aspektów reakcji naprawczej ludzkiej skóry. Rany o częściowej grubości powstały w ludzkiej skórze ex vivo i były hodowane w czasie gojenia. Biopsje rany skóry pobrano w utrwalaczu do procedury barwienia całego wierzchowca. Utrwalone próbki blokowano i inkubowano w przeciwciałie pierwszorzędowym, z wykrywaniem osiągniętym za pomocą fluorescencyjnie sprzężonego przeciwciała drugorzędowego. Rany były barwione przeciwstawnie i obrazowane za pomocą mikroskopii konfokalnej przed obliczeniem procentowego zamknięcia rany (reepitelializacji) w każdej biopsji. Stosując ten protokół, ujawniamy, że rany wycinające o średnicy 2 mm utworzone w zdrowej skórze dawcy są w pełni ponownie nabłonkowane do 4-5 dnia po zranieniu. Wręcz przeciwnie, tempo zamykania się ran skóry cukrzycowej jest znacznie zmniejszone, czemu towarzyszy zaburzona reforma bariery. Połączenie ran skóry u ludzi z nowatorskim podejściem do barwienia całego mocowania pozwala na szybką i powtarzalną metodę ilościowego określania gojenia ran ex vivo. Reasumując, protokół ten stanowi cenną platformę do oceny skuteczności potencjalnych terapii ran, przekształcając badania przedkliniczne i walidację.

W niniejszym raporcie przedstawiamy nowatorskie podejście do ex vivo ranienia skóry i barwienia całego preparatu (whole-mount staining) w celu oceny czynników wpływających na odpowiedź naprawczą ludzkiej skóry. Rycina 1A przedstawia schemat postępowania, które może być realizowane w ciągu 3–10 dni, w zależności od czasu inkubacji rany. Rany o częściowej grubości są hodowane na stosach membran na granicy powietrze : membrana i mogą być pobierane do barwienia całego preparatu, zatapiane w parafinie lub medium OCT do ogólnych badań histologicznych lub mrożone w ciekłym azocie do analizy biochemicznej (Rycina 1B). Zazwyczaj tworzymy rany o częściowej grubości o rozmiarze 2 mm w centrum eksplantów o średnicy 6 mm. Jednak rozmiar rany i otaczającego ją eksplantu może być zmieniony w zależności od wymagań. Procedura whole-mount została z sukcesem zaadaptowana zarówno dla metod barwienia immunoperoksydazowego, jak i immunofluorescencyjnego (Rycina 1C).
Immunofluorescencja umożliwia badanie tkanki z wykorzystaniem wielu przeciwciał. W tym celu zaleca się stosowanie przeciwciał pierwotnych wytworzonych u różnych gatunków oraz dopasowanych gatunkowo, sprzężonych z fluorochromem przeciwciał wtórnych, aby ograniczyć reaktywność krzyżową międzygatunkową. Konieczna będzie optymalizacja stężeń przeciwciał oraz czasów inkubacji. W przypadku zaobserwowania barwienia tła należy zmniejszyć stężenia przeciwciał, zwiększyć liczbę etapów płukania oraz dodać bufor blokujący do przeciwciał wtórnych. Żywotność świeżej tkanki można ocenić bezpośrednio za pomocą komercyjnych barwników do oceny żywotności (patrz Tabela materiałów). Wykazujemy również, że tkankę można utrwalić po barwieniu żywotności i pomyślnie obrazować, jeżeli jest to praktycznie możliwe (Rycina 1D).
<img alt="Proces gojenia ran skóry, schemat barwienia całego preparatu, analiza immunoperoksydazowa i immunofluorescencyjna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Metoda zadawania ran ex vivo oraz barwienia całego preparatu skóry ludzkiej. (A) Schemat przedstawiający przebieg procedury od pobrania skóry i zadania ran ex vivo, aż po barwienie tkanki i analizę danych. (B) Schemat przedstawiający system hodowli ran skóry ludzkiej ex vivo wraz z rutynowo wykonywanymi analizami tkanki. (C) Barwienie całego preparatu może być wykonywane zarówno techniką immunoperoksydazową, jak i immunofluorescencyjną. K14 = keratyna 14. (D) Żywa tkanka może być barwiona komercyjnymi barwnikami żywotności i skutecznie obrazowana po utrwaleniu. Pasek skali = 100 µm. Barwienie wykonano na skórze osoby niediabetycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Najbardziej powszechnym zastosowaniem barwienia całych preparatów ran jest określanie szybkości gojenia rany w sposób bardziej powtarzalny niż w przypadku przekrojów histologicznych. Procentowe zamknięcie rany określono jako procent reepitelizacji powierzchni rany, co przedstawiono na Rysunku 2A. Procentowe pokrycie obszaru specyficznych markerów można mierzyć w stosunku do całkowitej powierzchni rany lub jako procent reepitelializowanej rany. Scharakteryzowano proces gojenia w skórze zdrowej (niediabetycznej) w porównaniu ze skórą cukrzycową w ciągu siedmiu dni, pobierając próbki ran każdego dnia po zranieniu (obrazy reprezentatywne, Rysunek 2B). Rany w skórze zdrowej zamykały się w czasie zgodnie z oczekiwaniami, przy czym pełne zamknięcie zaobserwowano w większości próbek do 4-5 dnia. W przeciwieństwie do nich, rany w skórze cukrzycowej nie zamknęły się całkowicie w siedmiodniowym okresie analizy (Rysunek 2C). Znaczące opóźnienie w zamknięciu ran zaobserwowano pomiędzy ranami skóry zdrowej i cukrzycowej podczas porównywania tempa gojenia w każdym punkcie czasowym po urazie (P &lt; 0,001 do 6 dnia, P &lt; 0,05 w 6 dniu oraz P &lt; 0,05 do P &lt; 0,001 w 7 dniu).
Po ocenie ogólnych wskaźników zamykania się rany zmierzyliśmy procent całkowitego obszaru rany (obszar zewnętrzny na Rysunku 2A), w którym można było zwizualizować komórki K14-dodatnie (zielone barwienie na Rysunku 2B). Co ciekawe, zaobserwowaliśmy, że w zdrowych ranach skóry ex vivo barwienie K14 osiągało szczyt w 2. dniu, a następnie szybko spadało (istotność w każdym punkcie czasowym względem szczytu w 2. dniu, Rysunek 2D). Prawdopodobnie odzwierciedla to ponowne formowanie się wczesnej bariery epidermalnej, co wyklucza przenikanie przeciwciał K14 przez zróżnicowane warstwy naskórka (patrz schemat na Rysunku 2E). W procesie reepitelializacji keratynocyty warstwy podstawnej (K14+ve) migrują do wewnątrz nad otwartą raną, tak że naskórek bliżej zewnętrznej krawędzi rany formuje się wcześniej niż naskórek bliżej wewnętrznej krawędzi rany (front migrujący). Podczas gdy przednia krawędź nowo powstałego naskórka nadal migruje, aby zamknąć pozostałą otwartą ranę, naskórek na krawędzi zewnętrznej zaczyna się różnicować, aby odtworzyć pozostałe warstwy naskórka. W związku z tym w początkowej fazie gojenia spodziewalibyśmy się, że większość zreepitelializowanego obszaru składa się z komórek podstawnych (K14+ve), natomiast w późniejszej fazie naprawy barwienie K14 zanika w miarę różnicowania się naskórka od zewnątrz do wewnątrz (patrz obrazy całego preparatu na Rysunku 2E). Zatem spadek barwienia K14 pokazany na Rysunku 2D (strzałki w dół) koreluje ze zwiększonym różnicowaniem naskórka. Co ciekawe, widoczne barwienie K14 osiągnęło szczyt wcześniej w ranach zdrowych (2. dzień) niż w ranach cukrzycowych (4. dzień), co dodatkowo wykazuje, że reepitelializacja i następujące po niej różnicowanie naskórka są opóźnione w ranach skóry cukrzycowej.
<img alt="Badanie zamykania rany z barwieniem K14; obrazy z mikroskopii, schematy, wykresy; analiza skóry zdrowej i cukrzycowej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Barwienie całego preparatu (whole-mount) wykazuje zaburzone tempo gojenia w skórze cukrzycowej w porównaniu do zdrowej. (A) Metoda stosowana do ilościowego określenia zamykania rany na podstawie pomiarów zewnętrznej i wewnętrznej krawędzi rany. Obrazy w świetle przechodzącym pokazują barwienie keratyny 14 (K14) na czerwono. Pasek skali = 300 µm. (B) Reprezentatywne obrazy gojenia w czasie (dni po powstaniu rany) w skórze zdrowej i cukrzycowej. Pasek skali = 500 µm. K14 = zielony. DAPI = niebieskie jądra komórkowe. (C) Ilościowe określenie tempa zamykania ran (procent reepitelializacji), wykazujące, że rany ex vivo skóry zdrowej zamykają się znacznie szybciej niż rany ex vivo skóry cukrzycowej. H = zdrowa. Db = cukrzycowa. (D) Procent barwienia K14 osiąga szczyt wcześniej w skórze zdrowej niż w cukrzycowej, a następnie spada wraz ze wzrostem różnicowania naskórka (strzałki w dół). (E) Barwienie K14 (bazalne komórki naskórka) zanika w miarę różnicowania naskórka. D = zróżnicowane. ND = niezróżnicowane. Białe linie przerywane wyznaczają wewnętrzne i zewnętrzne krawędzie rany. Białe strzałki = kierunek migracji. n = 6 ran na dawcę, na punkt czasowy. Średnia +/- SEM. * = P &lt; 0,05, ** = P &lt; 0,01 oraz *** = P &lt; 0,001. Porównanie skóry zdrowej i cukrzycowej w każdym punkcie czasowym gojenia w punkcie C (wartość P dla najmniej istotnego porównania). Zmiana czasowa barwienia K14 w stosunku do szczytu dla każdego dawcy w punkcie D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Następnie zastosowaliśmy barwienie całych preparatów, aby zbadać ekspresję tkankową i lokalizację innych markerów istotnych dla gojenia ran w skórze niediabetycznej (Rysunek 3). Wszystkie użyte przeciwciała oraz ich stężenia robocze zostały podane w Tabeli Materiałów. Naczynia krwionośne w otwartej ranie barwiły się pozytywnie z przeciwciałem przeciwko alfa-aktynie mięśni gładkich (a-SMA), stosowanym w połączeniu z K14 w celu wyznaczenia krawędzi naskórka na obrazach przy niskim powiększeniu (Rysunek 3A). Macierz skóry właściwej została zabarwiona przeciwciałami przeciwko kolagenowi typu I (COL 1) i fibronektynie (Fn). Zaobserwowano tutaj obfite, grube włókna kolagenu, podczas gdy włókna fibronektyny były rzadkie, faliste i cienkie (Rysunek 3A). Nasza metoda barwienia całych preparatów pozwala również na uzyskanie rozdzielczości barwienia na poziomie pojedynczych komórek, co wykazano dla keratynocytów dodatnich pod względem K14 (Rysunek 3B).
Na koniec wykazujemy, że ludzkie rany ex vivo posiadają rezydentne komórki odpornościowe, przy czym komórki Langerhansa wykryto wokół nowo powstałego naskórka w 3. dobie po zranieniu (Rysunek 3C). Rzeczywiście, wyniki te sugerują, że barwienie całych preparatów może być wykorzystywane do badania kluczowych cech odpowiedzi gojenia, w tym stanu zapalnego, proliferacji oraz macierzy zewnątrzkomórkowej (Rysunek 4A). Podsumowując, nasze dane ujawniają, że połączona procedura zadawania ran skóry ex vivo oraz barwienia całych preparatów jest trafną metodą oceny różnych aspektów regeneracji zdrowej i cukrzycowej (patologicznej) skóry człowieka.
<img alt="Analiza histologiczna: immunofluorescencja DAPI/K14/α-SMA, gojenie ran, rozdzielczość komórkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3: Optymalizacja metody barwienia całego preparatu (whole-mount) do zastosowania z innymi przeciwciałami. (A) Naczynia krwionośne barwiono przeciwciałami przeciwko aktynie gładkich mięśni (α-SMA, zielony) i keratinie 14 (K14, czerwony), natomiast włókna macierzy barwiono kolagenem I (COL 1, czerwony) i fibronektyną (Fn, zielony). (B) Procedura whole-mount zapewnia rozdzielczość lokalizacji na poziomie pojedynczych komórek (K14, zielony; K1, czerwony). (C) Komórki Langerhansa CD1a+ (zielone) zaobserwowane w nowo powstałym naskórku. DAPI = niebieskie jądra. Pasek skali = 100 µm. Białe linie przerywane wyznaczają wewnętrzne i zewnętrzne krawędzie rany oraz oddzielają ranę od naskórka. Barwienie wykonano na skórze niecukrzycowej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Proces gojenia rany; diagramy porównujące barwienie całego preparatu z barwieniem histologicznym; analiza naskórka." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62326/62326fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Wiarygodność procedury barwienia całego preparatu w ocenie gojenia ran. (A) Ilustracja przedstawiająca sposób, w jaki technika barwienia całego preparatu pozwala oceniać procesy związane z gojeniem ran. Użyte przeciwciała = czerwony tekst. K14 = keratyna 14. COL 1 = kolagen 1. Fn = fibronektyna. (B) Procedura barwienia całego preparatu (niebieskie strzałki) wprowadza mniejszą zmienność do pomiarów zamykania się rany niż standardowa analiza histologiczna (czerwone strzałki). S1 = przekrój 1. WE = krawędź rany. Pasek skali = 300 µm. Barwienie wykonano w skórze niediabetycznej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62326/62326fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj demonstrujemy zoptymalizowaną technikę oceny gojenia ran za pomocą ludzkiej skóry ex vivo w połączeniu z podejściem polegającym na barwieniu całego wierzchowania. Metodologia ta stanowi przedkliniczną platformę do oceny potencjalnych terapii ran.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Chronic non-healing wounds, which primarily affect the elderly and diabetic, are a significant area of clinical unmet need. Unfortunately, current chronic ...

W tym artykule przedstawiamy zoptymalizowany protokół leczenia ran skóry ludzkiej ex vivo, który może dostarczyć ważnych danych dotyczących skuteczności w ramach klinicznego procesu translacyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na wysokoprzepustową i dokładną ocenę gojenia się ran w żywej skórze ludzkiej. Procedurę zademonstrują Elizabeth Roberts, badaczka z tytułem doktora, oraz Alexandria Kidd, asystentka naukowa z naszego laboratorium.Aby przygotować próbkę tkanki skórnej do zranienia, umieść skórę właściwą do dołu na 90-milimetrowej szalce Petriego i użyj sterylnych nożyczek do usunięcia tkanki tłuszczowej. Po usunięciu całego tłuszczu umieść skórę w 25 mililitrach HBSS uzupełnionych antybiotykami na 10 minut w temperaturze pokojowej z przerywanym wstrząsaniem, aby usunąć resztki krwi w tkance tłuszczowej. Po 10 minutach spłucz skórę w 25 mililitrach DPBS.Po 10 minutach powtórz płukanie HBSS bez antybiotyków, a następnie wykonaj końcowe płukanie w 25 mililitrach DPBS. Następnie umieść sterylną nylonową membranę filtracyjną na stosie wkładek chłonnych i osusz skórę od strony skóry na sterylnej gazie na 90-milimetrowej szalce Petriego, aby usunąć resztki DPBS. Umieść wysuszoną skórę właściwą stroną do dołu na czystej 90-milimetrowej pokrywce szalki Petriego, aby usunąć wszelkie pozostałości DPBS i osusz naskórek świeżą, sterylną gazą.Aby utworzyć ranę, przyciśnij dwumilimetrowy stempel biopsyjny do skóry, trzymając skórę mocno i delikatnie skręcając. Za pomocą zakrzywionych ząbkowanych kleszczy tkankowych podnieś każdą stronę rany o średnicy około dwóch milimetrów i zaczep zakrzywione nożyczki tęczówki pod raną. Użyj sześciomilimetrowego stempla biopsyjnego do biopsji wokół centralnej dwumilimetrowej rany, aby utworzyć sześciomilimetrowy eksplantat z częściową grubością dwumilimetrową raną pośrodku.Następnie umieść naskórek z praną do góry na stosie nylonowej membrany filtracyjnej na inkubację od jednego do siedmiu dni w temperaturze od 32 do 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W przypadku barwienia fluorescencyjnego należy zebrać eksplantaty ran w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych zawierających 500 mikrolitrów utrwalacza skóry na probówkę i inkubować eksplantaty przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zastąp utrwalacz jednym mililitrem buforu do płukania barwiący.Po przemyciu każdą próbkę należy zalać około 150 mikrolitrami buforu blokującego i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po usunięciu buforu blokującego dodać 150 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego rozcieńczonego w buforze blokującym na probówkę i inkubować eksplantaty ran przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego ranka przepłukać próbki 500 mikrolitrami barwiącego buforu płuczącego zawierającego 0,2% azydku sodu, a następnie trzykrotnie przepłukać go zwykłym buforem do mycia.Po przemyciu dodać 150 mikrolitrów odpowiedniego przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluorescencją rozcieńczonego w barwiącym buforze do płukania do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji przepłukać eksplant trzy razy przez 30 minut w 500 mikrolitrach buforu do płukania barwiącego na jedno pranie, a następnie przeciwbarwić każdy eksplant 150 mikrolitrami DAPI przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Na koniec umyj eksplant dwa razy przez 30 minut 500 mikrolitrami buforu myjącego na pranie.W przypadku obrazowania eksplantatu umieść 60-milimetrową szalkę Petriego na platformie obrazowania mikroskopu konfokalnego i dodaj około jednej mililitrowej warstwy DPBS do naczynia. Użyj kleszczy, aby przenieść eksplantaty z rany na naczynie. Po skonfigurowaniu oprogramowania do obrazowania zgodnie z eksperymentem, umieść ranę na środku płaszczyzny obrazowania i uzyskaj obrazy biopsji rany.Aby wykonać bezprzewodowe obrazowanie mikroskopem cyfrowym w celu uzyskania wysokiej jakości obrazów w ekonomiczny sposób, podłącz telefon lub laptop do bezprzewodowego mikroskopu cyfrowego. Umieść eksplantaty nawinięte stroną do góry na kawałku tkanki laboratoryjnej i usuń resztki buforu do płukania z próbki. Następnie umieść eksplant w środku pola widzenia mikroskopu i rejestruj obrazy za pomocą podłączonej kamery.Immunoperoksydaza i immunofluorescencja mogą być stosowane do barwienia całych tkanek mount. Ponadto barwienie żywe/martwe można wykonać na świeżej tkance i zobrazować przed lub po utrwaleniu. Barwienie ran na całej powierzchni wierzchowca może być wykorzystane do określenia szybkości zamykania ran w powtarzalny sposób.W tej reprezentatywnej analizie zdrowe zamknięcie rany skóry zaobserwowano po czterech do pięciu dniach, podczas gdy rany skóry z cukrzycą nie zamknęły się całkowicie w ciągu siedmiodniowego okresu analizy. Ekspresja K14 osiągnęła szczyt w drugim dniu w zdrowych ranach skóry, po czym gwałtownie spadła wraz ze zwiększonym różnicowaniem naskórka. Ta reepitelializacja i późniejsze różnicowanie naskórka było opóźnione w cukrzycowych ranach skóry.Reformacja wczesnej bariery naskórkowej wyklucza przenikanie przeciwciał K14 w obrębie zróżnicowanych warstw naskórka. Na wczesnym etapie procesu reepitelializacji keratynocyty warstwy podstawnej K14 dodatniej migrują do wewnątrz nad otwartą raną, tak że naskórek bliżej zewnętrznej krawędzi rany tworzy się wcześniej niż naskórek bliżej wewnętrznej krawędzi rany. Później, na etapie naprawy, barwienie K14 jest tracone, ponieważ naskórek różnicuje się od zewnątrz do wewnątrz.Barwienie całego wierzchowca może być również wykorzystane do badania ekspresji i lokalizacji innych markerów istotnych dla rany w skórze, a także obecności komórek odpornościowych będących przedmiotem zainteresowania w miejscu rany na różnych etapach gojenia. Generowanie powtarzalnych ran po rozcięciu może być na początku trudne. Radzimy przećwiczyć procedurę ranienia przy użyciu nadmiaru skóry.

human-ex-vivo-wound-model-whole-mount-staining-approach-to-accurately

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Unaczynienie jest kluczem do skutecznego podejścia do inżynierii tkankowej. W związku z tym potrzebne są niezawodne technologie do oceny rozwoju sieci naczyniowych w konstruktach tkankowych. Tutaj przedstawiamy prostą i opłacalną metodę wizualizacji i ilościowego określania unaczynienia in vivo.

Pełny model ubytku skóry do oceny unaczynienia biomateriałów in vivo

Podczas rozwoju ssaków, rany skóry na wczesnym etapie ciąży goją się bez blizny. Tutaj szczegółowo opisujemy wiarygodny i powtarzalny model gojenia się ran bez blizn płodu w grzbietu skóry zarodków myszy E16.5 (bez blizn) i E18.5 (bliznowaciejących).

Model skóry płodu myszy z gojeniem ran bez blizn

Celem tego protokołu jest stworzenie trójwymiarowego odpowiednika skóry o pełnej grubości, który przypomina naturalną skórę. Dzięki specjalnie skonstruowanemu zautomatyzowanemu urządzeniu do nawijania można generować precyzyjne i powtarzalne rany przy zachowaniu bezpłodności.

Generowanie trójwymiarowego ekwiwalentu skóry o pełnej grubości i automatycznego nawijania

Opisane tutaj jest ustanowienie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów reakcji na uszkodzenia tkanek nabłonkowych w ich naturalnym mikrośrodowisku.

Opracowanie klinicznie istotnego modelu symulowanej operacji zaćmy ex vivo do badania naprawy ran nabłonkowych w rodzimym mikrośrodowisku

Opisujemy nieinwazyjny protokół obrazowania in vivo, który jest uproszczony i opłacalny, wykorzystując L-012, chemiluminescencyjny analog luminolu, do wizualizacji i ilościowego określenia reaktywnych form tlenu (ROS) generowanych w mysim modelu rany wycinającej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie reaktywnych form tlenu w mysim modelu rany

Tutaj prezentujemy protokół dla testu in vitro z użyciem pierwotnych fibroblastów oraz dla testu in vivo gojenia ran skóry na myszach. Oba testy są prostymi metodami oceny gojenia się ran in vitro i in vivo.

Test migracji zadrapań i komora grzbietowego fałdu skórnego do analizy gojenia się ran in vitro i in vivo

Tutaj opisane są dwa modele gojenia ran u myszy, jeden przeznaczony do oceny reakcji na gojenie się ran komórkowych i cytokinowych, a drugi do ilościowego określania szybkości zamykania ran. Metody te mogą być stosowane w złożonych modelach chorób, takich jak cukrzyca, w celu określenia mechanizmów różnych aspektów złego gojenia się ran.

Ocena ostrego gojenia się ran za pomocą grzbietowej podskórnej implantacji gąbki z polialkoholu winylowego i wycinających raki skóry ogona.

Celem tego badania było opracowanie mysiego modelu gojenia się ran po oparzeniach. Oparzenie termiczne wywołano na skórze grzbietowej myszy za pomocą podgrzanego mosiężnego szablonu. Spaloną tkankę oczyszczono i pokryto przeszczepem skóry pobranym z ogona genetycznie podobnej myszy dawcy.

Mysi model rany oparzeniowej zrekonstruowany za pomocą allogenicznego przeszczepu skóry

Ten protokół opisuje, jak generować obustronne rany wycinające o pełnej grubości u myszy oraz jak następnie monitorować, zbierać i przygotowywać rany do analizy morfometrycznej. Dołączono szczegółowy opis sposobu wykorzystania seryjnych odcinków histologicznych do definiowania, precyzyjnego określania ilościowego i wykrywania wad morfometrycznych.

Mysi model gojenia ran wycinających i histologiczna morfometryczna analiza ran

Opisano zostało szczurze modele rany skóry, które umożliwiają ocenę różnych środków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych lub patologicznych na różnych etapach procesu gojenia. Ponadto szczegółowo opisano protokół do wykonywania manualnej planimetrji w celu monitorowania szybkości kurczenia się rany w trakcie naprawy tkanki.

Model szczurzych ran chirurgicznych: podejście do badań nad gojeniem się ran i oceną biomateriałów

Poznaj zoptymalizowany protokół ran ex vivo na ludzkiej skórze do oceny naprawy tkanek. Metoda umożliwia szybką, powtarzalną analizę gojenia się ran w próbkach skóry zdrowej i cukrzycowej.

Ludzki model ran ex vivo i barwienie całej góry w celu dokładnej oceny naprawy skóry

Przeglądaj więcej filmów