Name: Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do wprowadzania genu w liniach makrofagów i limfocytów T z użyciem reporterów fluorescencyjnych i sortowania komórek. Technika umożliwia szybką identyfikację zmodyfikowanych komórek bez selekcji lekowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy podstawowemu ośrodkowi cytometrii przepływowej Uniwersytetu Medycznego Xinxiang. Rozwój takiej technologii został wsparty grantami NSFC 81601360 dla LZ, 81471595 i 32070898 dla YL. Prace są również wspierane przez Fundację Komitetu Edukacyjnego Henan nr 21IRTSTHN030.

1. Projektowanie i budowa plazmidu sgRNA ukierunkowanych na locus rosa26
<ol>
	<li>Projektowanie przewodników RNA wokół pożądanego miejsca insercji
	<ol>
		<li>Upewnij się, że miejsce insercji mysiego eksperymentu z wkłuciem Rosa26 (dalej oznaczonego jako mRosa26) znajduje się w pierwszym intronie mRosa26; to miejsce było używane w poprzednich badaniach28,29. W przypadku eksperymentów knock-in na komórkach ludzkich należy upewnić się, że miejsce insercji znajduje się w ludzkim locus ROSA26 (zwanym dalej hROSA26), który został zidentyfikowany jako ludzki homolog mRosa2630.</li>
		<li>Użyj sekwencji genomowych gatunków myszy i ludzi uzyskanych odpowiednio z Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) i Ensembl genome browser (http://www.ensembl.org/index.html). Skopiuj 50 par zasad (bp) sekwencji genomowej locus mRosa26 lub hROSA26 po każdej stronie po bokach pożądanego miejsca insercji.</li>
		<li>Projektowanie przewodnika RNA za pomocą internetowego narzędzia internetowego CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Wklej 100 pz sekwencji wejściowej z 1.1.2. Wybierz dwa przewodnikowe RNA o wysokim wyniku swoistości, wysokim wyniku wydajności i niskiej aktywności poza celem. Ponadto wybieraj przewodniki RNA z wyższymi wynikami Doench i unikaj tych oznaczonych jako "Nieefektywne"32. 
		UWAGA: Alternatywne narzędzia do projektowania CRISPR są również cenne i publicznie dostępne, na przykład narzędzie do projektowania CRISPR Benchling (https://benchling.com/crispr). Aby zwiększyć częstotliwość występowania zmutowanych komórek knock-in, w których pośredniczy CRISPR/Cas9, wybierz dwa prowadzące RNA w pobliżu żądanego miejsca insercji, jeśli to możliwe33.</li>
		<li>Dla locus mRosa26 użyj dwóch sąsiednich przewodnikowych RNA oznaczonych jako mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTCTCTAGAAGAT -3') i mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). Dla locus hROSA26 użyj dwóch sąsiednich przewodnikowych RNA, a mianowicie hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') i hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B). 
		UWAGA: Czynności edycji genomu mR26-sg1 i mR26-sg2 oraz hR26-sg1 i hR26-sg2 oceniano odpowiednio w komórkach RAW264.7 i komórkach Jurkat (patrz plik uzupełniający, rysunek S1).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klonowanie wektorów ekspresyjnych CRISPR zawierających sgRNA ukierunkowanych na locus Rosa26
	<ol>
		<li>Synteza oligonukleotydów do przodu i do tyłu dla jednego przewodnika RNA (patrz plik uzupełniający). 
		UWAGA: Zaleca się dodanie nukleotydu "G" na początku sekwencji prowadzącej, co pomaga w ekspresji sterowanej przez promotor U6. Na przykład, aby sklonować wspomniany mR26-sg1, przedni oligo to CACCGCTCCAGTCTCTCTAGAAGAGAT, a odwrotny oligo to AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Dodatkowe G w oligo do przodu i jego dopełnienie w odwróconym oligo są zaznaczone pogrubioną czcionką.</li>
		<li>Klonuj syntetyczne oligonukleotydy odpowiadające przewodnikowym RNA do uniwersalnego wektora ekspresji CRISPR pX458-DsRed2 wygenerowanego w naszej poprzedniej pracy21 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C) przy użyciu ogólnego protokołu klonowania gRNA opracowanego przez Zhang's Lab (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); jednak pomiń etap oczyszczania żelu i oczyść strawiony wektor za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (patrz Tabela materiałów). 
UWAGA: W poprzednich protokołach przeprowadzano oczyszczanie żelu wektora strawionego przez BbsI; Jednak ten krok jest czasochłonny. W niniejszym protokole strawiony produkt jest oczyszczany przy użyciu zestawu do oczyszczania PCR i stosowany bezpośrednio w dalszej reakcji ligacji, która na ogół wytwarza dodatnie kolonie o porównywalnej wydajności.</li>
		<li>Przekształć 10 μl produktu ligacji (krok 1.2.2) w 50 μl komórekEscherichia coli DH5α zgodnie z instrukcjami producenta. Losowo wybierz trzy kolonie z płytki agarowej LB ampicyliną (100 μg / ml) i zaszczep każdą z nich w 3 ml pożywki LB ampicyliną do hodowli przez noc.</li>
		<li>Użyć 1 ml nocnej kultury bakteryjnej do sekwencjonowania Sangera, a resztę przechowywać w temperaturze 4 °C, dopóki nie zostanie potwierdzone, że konstrukt jest prawidłowy: pDsR-mR26-sg1 i pDsR-mR26-sg2 dla locus mRosa26 oraz pDsR-hR26-sg1 i pDsR-hR26-sg2 dla locus hROSA26.</li>
		<li>Przygotować plazmidowe DNA o wysokim stężeniu (około 2 μg/μl) za pomocą zestawu maxiprep do oczyszczania plazmidu o stopniu transfekcji (patrz Tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Projektowanie i budowa wektorów docelowych jako szablonów rekombinacji homologicznej
<ol>
	<li>Zaprojektuj szablon naprawy ukierunkowany na homologię
	<ol>
		<li>Zaprojektuj wektor ukierunkowany, aby konstytutywnie wyrazić punkt POI za pomocą kasety wyrażeń zoptymalizowanej na podstawie poprzedniego badania29, która zawiera promotor hybrydy CAG, miejsce restrykcyjne AscI umożliwiające klonowanie cDNA POI, reporter IRES-EBFP2 i sygnał poliadenylacji bydlęcego hormonu wzrostu (bGH-polyA) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B i plik uzupełniający).</li>
		<li>Zaprojektuj ramiona homologii (HA), które mają wspólną homologię z sekwencjami genomowymi locus mRosa26 lub hROSA26. Dołącz ~1 kb 5' HA odpowiadającego sekwencji genomowej poprzedzającej od żądanego miejsca insercji po lewej stronie kasety ekspresyjnej. Podobnie, dołącz ~1 kb 3' HA odpowiadającego sekwencji genomowej znajdującej się poniżej od miejsca insercji po prawej stronie kasety ekspresyjnej. 
		UWAGA: Kaseta z wyrażeniami jest umieszczana jak najbliżej miejsc cięcia CRISPR/Cas934. Aby uniknąć ponownego cięcia docelowego allelu przez CRISPR/Cas9, włącz zmiany nukleotydów do sekwencji motywu sąsiadującego z protospacerem (PAM) (5'-NGG-3') w wektorze docelowym34,35.</li>
		<li>Aby umożliwić linearyzację wektora docelowego, należy wstawić unikalne miejsce EcoRI tuż przed 5' HA i unikalne miejsce BamHI tuż za HA 3'.</li>
		<li>Poproś komercyjnego dostawcę o zsyntetyzowanie wektorów docelowych i oznaczenie ich jako pKR26-iBFP i pKhR26-iBFP odpowiednio dla mRosa26 i hROSA26 knock-in.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Skonstruuj wektor kierowania jako szablon naprawy ukierunkowany na homologię
	<ol>
		<li>Aby wyrazić POI, uzyskaj sekwencję cDNA (sekwencję kodującą) z przeglądarki genomu Ensembl i wybierz transkrypt posiadający najdłuższą sekwencję białka. Na przykład cDNA ludzkiego genu ACE2 to ACE2-202 ENST00000427411.2, a cDNA ludzkiego genu RASGRP1 to RASGRP1 ENSG00000172575.</li>
		<li>Zsyntetyzuj cDNA punktu POI z pomocą komercyjnego dostawcy. Możliwe jest również sklonowanie cDNA poprzez amplifikację PCR (nie opisane tutaj). Umieść sekwencję GGCGCGCCACC (5' - 3'), która obejmuje miejsce restrykcyjne AscI (kursywa i pogrubienie) oraz miejsce inicjacji translacji konsensusu Kozaka (podkreślone), bezpośrednio przed kodonem inicjacji ATG cDNA i innym miejscem restrykcyjnym AscI (5'- GGCGCGCC -3') po kodonie stop cDNA.</li>
		<li>Strawić zsyntetyzowaną sekwencję za pomocą AscI i oczyścić za pomocą zestawu do oczyszczania PCR przeznaczonego do oczyszczania fragmentów DNA po trawieniu restrykcyjnym, zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Zlikulować oczyszczoną wstawkę cDNA do linearyzowanego wektora szkieletowego AscI pKR26-iBFP lub pKhR26-iBFP za pomocą ligazy DNA T4 zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Zweryfikuj ostateczny wektor kierowania, pKR26-POI-iBFP lub pKhR26-POI-iBFP, poprzez sekwencjonowanie. Użyj maxiprep do oczyszczenia zweryfikowanych konstruktów zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Strawić wektor docelowy za pomocą EcoRI lub BamHI i oczyścić produkt trawienia za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta. Przechowuj zlinearyzowany wektor celowniczy (~0,8 μg/μL) w temperaturze -20 °C do momentu elektroporacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Elektroporacja makrofagów i linii limfocytów T
<ol>
	<li>Przygotowanie kultur komórkowych do elektroporacji
	<ol>
		<li>Przygotuj Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) jako kompletną pożywkę wzrostową dla limfocytów T Jurkat. Przygotuj zmodyfikowane podłoże Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS do hodowli makrofagów RAW264.7. Uzupełnij wszystkie kompletne pożywki wzrostowe penicyliną o stężeniu 100 μg/ml i streptomycyną o stężeniu 100 μg/ml (Pen/Strep), z wyjątkiem pożywek stosowanych do inkubacji po transfekcji przed sortowaniem komórek.</li>
		<li>Wykonaj subkulturację limfocytów T RAW264.7 i Jurkat zgodnie z instrukcjami dostawcy (patrz tabela materiałów). Podczas subhodowli komórek RAW264.7 użyj roztworu trypsyny-EDTA (0,25%) do odłączenia komórek. Użyj FBS uzupełnionego 10% (v/v) DMSO jako pożywki do kriokonserwacji dla komórek RAW264.7 i Jurkat.</li>
		<li>Zbieraj komórki w ilości 250 × g przez 5 minut dla makrofagów RAW264.7 i 90 × g przez 8 minut dla limfocytów T Jurkat. Następnie przemyć 5-10 ml 1× DPBS (bez jonówCa2+ lubMg2+). Usuń DPBS.</li>
		<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 2 ml 1× DPBS. Użyj 10 μl komórek i wymieszaj z równą objętością 0,2% błękitu trypanowego, aby oszacować liczbę komórek i ich żywotność. 
		UWAGA: Upewnij się, że hodowla komórkowa ma >90% żywotności w dniu transfekcji.</li>
		<li>W przypadku pojedynczego eksperymentu knock-in należy wykonać elektroporację za pomocą 10 μl końcówek nukleofekcyjnych z pięcioma powtórzeniami. Obliczyć objętość potrzebną na 2,0 × 106 komórek i zagnieździć komórki przez odwirowanie. Ponownie umyj osad komórkowy za pomocą 1× DPBS, jak opisano w kroku 3.1.3. 
		UWAGA: W przypadku stosowania końcówek nukleofekcyjnych o pojemności 10 μl potrzeba 4,0 ×10 5 ogniw na elektroporację. W związku z tym przygotuj co najmniej 2,0 × 106 komórek na jeden eksperyment knock-in.</li>
		<li>Przygotować 24-dołkową płytkę z 0,5 ml kompletnego podłoża wzrostowego (przygotowanego w kroku 3.1.1) na dołek bez wstrzykiwacza/paciorkowca i ogrzać w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektroporacja komponentów CRISPR/Cas9 i wektora docelowego
	<ol>
		<li>Włącz system elektroporacji. Użyj parametrów elektroporacji zoptymalizowanych w poprzednim badaniu21: 1,400 V/20 ms/2 impulsy dla makrofagów RAW264.7 i 1350 V/20 ms/2 impulsy dla limfocytów T Jurkat.</li>
		<li>Biorąc pod uwagę ubytek próbki spowodowany pipetowaniem, należy przygotować mieszaninę do elektroporacji o objętości 55 μl w sterylnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml, zawierającą 2,5 μg każdego wektora CRISPR/Cas9, 2,4 μg zlinearyzowanego wektora docelowego i bufor do rezawieszania R. 
		UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, mieszaninę do elektroporacji można przygotować podczas wirowania (krok 3.1.5).</li>
		<li>Zawiesić 2,0 ×10 6 ogniw (przygotowanych w kroku 3.1.5) w mieszaninie do elektroporacji o objętości 55 μl z kroku 3.2.2.</li>
		<li>Odessać mieszaninę ogniwo/elektroporacja z kroku 3.2.3 za pomocą końcówki nukleofekcyjnej o pojemności 10 μl z pipetą. 
		UWAGA: Podczas pipetowania należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, które mogą spowodować awarię elektroporacji.</li>
		<li>Dodać próbkę do probówki wypełnionej 3 ml buforu E z zestawu do elektroporacji.</li>
		<li>Zastosuj parametry elektroporacji dla dwóch typów ogniw zgodnie z opisem w kroku 3.2.1.</li>
		<li>Przenieść próbkę do jednego dołka na 24-dołkowej płytce z podgrzanym podłożem z kroku 3.1.6.</li>
		<li>Powtórz kroki 3.2.4-3.2.7 dla pozostałych czterech powtórzeń, a także tylko dla kontrolek wektora docelowego i tylko wektora wyrażenia CRISPR. 
		UWAGA: Zmień końcówkę nukleofekcji i rurkę podczas przełączania na inny typ komórki/plazmidowe DNA.</li>
		<li>Hodować transfekowane komórki przez 48-72 godziny, aby umożliwić odzysk po elektroporacji i ekspresji składników CRISPR/Cas9 przed analizą cytometrii przepływowej lub sortowaniem komórek aktywowanym fluorescencją (FACS). Zbadaj ekspresję DsRed2 za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w czerwony kanał po 24 godzinach od transfekcji. 
		UWAGA: Zaletą monitorowania ogniw fluorescencyjnych DsRed2 jest to, że można oszacować wydajność elektroporacji i przewidzieć przydatność do dalszego sortowania komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek w celu wyizolowania przypuszczalnych komórek knock-in
<ol>
	<li>Przed sortowaniem FACS należy przemyć transfekowane komórki raz kompletną pożywką wzrostową. Komórki osadu należy odwirować zgodnie z opisem w kroku 3.1.3 i ponownie zawiesić osad w 500 μl świeżej pożywki.</li>
	<li>Ustaw sortownik komórek (umieszczony w szafie bezpieczeństwa biologicznego) z dyszą 85 μm i niskim natężeniem przepływu. Wybierz tryb "pojedynczej komórki" do sortowania i przetestuj wydajność i precyzję sortowania pojedynczych komórek, sortując 20-30 komórek na pokrywie 96-dołkowej mikropłytki. Jedna kropla zlokalizowana w środku każdej studzienki wskazuje na prawidłowe ustawienie instrumentu.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową z kroku 4.1 do sterylnych probówek FACS i dodać SYTOX Red Dead Cell Stain do końcowego stężenia 1 nM.</li>
	<li>Analizuj próbki w sortowniku komórek. SYTOX Red i EBFP2 są wzbudzane przez laser 405 nm i wykrywane odpowiednio przez kanały V450/BV421 i APC. DsRed2 jest wzbudzany przez laser o długości fali 488 nm i wykrywany przez kanał PE. Użyj komórek nietransfekowanych oraz pojedynczych komórek dodatnich EBFP2 i DsRed2 jako kontroli kompensacji spektralnej.</li>
	<li>Sortuj 10 pojedynczych komórek do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki zawierającej 150 μl na studzienkę wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki wzrostowej. Użyj mikropłytek z okrągłym dnem do hodowli linii komórek zawiesinowych, takich jak limfocyty T Jurkat, i mikropłytek z płaskim dnem do przylegających makrofagów RAW264.7. 
	UWAGA: Sortowanie 10 komórek na studzienkę jest zoptymalizowaną strategią poprawy przeżywalności komórek i zminimalizowania liczby 96-dołkowych mikropłytek, które muszą zostać wysiane, oraz liczby próbek, które muszą być badane za pomocą cytometrii przepływowej i genotypowania; W przypadku sortowania tylko jednej komórki na dołek, wymagane jest wysianie większej liczby mikropłytek, aby zwiększyć szansę na uzyskanie poprawnie edytowanych komórek.</li>
</ol>
5. Badanie przesiewowe i walidacja dodatnich komórek knock-in
<ol>
	<li>Badania przesiewowe w kierunku potencjalnych komórek knock-in za pomocą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>Inkubować komórki z kroku 4.5 przez 10-15 dni i dodawać kompletną pożywkę wzrostową co 3 dni, aby zastąpić płyn utracony w wyniku parowania. W przypadku limfocytów T Jurkat przenieś komórki wyhodowane na 96-dołkowej płytce z okrągłym dnem na płaską płytkę, aby zoptymalizować proliferację komórek.</li>
		<li>Przenieś rozprężone posortowane komórki na płytki 48-dołkowe w celu dalszej ekspansji.</li>
		<li>Gdy komórki są bliskie konfluencji, użyj połowy kultury do badania przesiewowego ekspresji EBFP2 za pomocą cytometrii przepływowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Zwykle połowa kultury w 48-dołkowej płytce po zlewającym się wzroście odpowiada 0,5-1,0 × 105 komórek, co jest wystarczające do analizy jednej próbki za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
		<li>Przenieś pozostałe komórki na płytki 24-dołkowe w celu dalszej proliferacji.</li>
		<li>Zachowaj populacje komórek kandydujących posiadające wysoki odsetek komórek EBFP2-dodatnich do dalszych eksperymentów genotypowania. 
		UWAGA: Ponieważ 10 komórek jest sortowanych do każdej studzienki 96-dołkowej mikropłytki, możliwe jest, że komórki knock-in będą rosły z komórkami, które nie wyrażają genu knock-in. Dlatego normalne jest wykonanie dodatkowej rundy sortowania komórek w celu oddzielenia komórek EBFP2-dodatnich od komórek ujemnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe w kierunku potencjalnych komórek knock-in metodą PCR i sekwencjonowania
	<ol>
		<li>Zbierz 2 × 105 kandydujących komórek. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do przygotowania DNA (patrz tabela materiałów).</li>
		<li>Aby sprawdzić, czy precyzyjna naprawa ukierunkowana na homologię (HDR) nastąpiła w locus mRosa26, a nie w losowych miejscach w genomie komórek kandydujących do knock-in, wykonaj PCR ze starterami obejmującymi każdą stronę HA (<silna klasa = "xfig">Figura 4). Wybierz jeden starter znajdujący się w regionie genomowym poza wektorem docelowym (oligo zewnętrzny) i drugi starter znajdujący się wewnątrz wektora docelowego (oligonugolaktykus wewnętrzny). 
		UWAGA: Podobny schemat jest używany do weryfikacji HDR w locus hROSA26. Startery PCR można również łatwo zaprojektować do wykrywania wstawiania sekwencji POI. Ponadto genotypy alleli typu dzikiego i knock-in można jednocześnie wykryć za pomocą PCR z trzema starterami (patrz plik uzupełniający, rysunek S2).</li>
		<li>Sklonować produkty z dodatnim wynikiem PCR za pomocą zestawu do szybkiego klonowania (patrz tabela materiałów). Przekształć mieszaninę reakcyjną w komórki kompetentne DH5α.</li>
		<li>Losowo wybierz 8-10 pojedynczych kolonii bakteryjnych na transformację i zsekwencjonuj produkty PCR z kroku 5.2.3 za pomocą sekwencjonowania Sangera.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Walidacja dodatnich komórek knock-in za pomocą analizy immunoblot i oczyszczania powinowactwa 
	UWAGA: Komórki kandydujące są poddawane analizie immunoblot w celu walidacji insercji POI lub oczyszczania powinowactwa (AP) w celu zbadania interakcji białko-białko.
	<ol>
		<li>Wykonaj analizę immunoblot zgodnie z instrukcjami producenta przeciwciał. Patrz tabela materiałów, aby uzyskać informacje dotyczące stosowania przeciwciał pierwszorzędowych i przeciwciał drugorzędowych.</li>
		<li>Poddaj lizaty komórek knock-in wyrażających POI oznaczone OST AP za pomocą kulek Strep-Tactin Sepharose zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów).</li>
		<li>Wykrywanie chemiluminescencji za pomocą imagera.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W naszych eksperymentach pokazaliśmy, jak przeprowadzić edycję knock-in w komórkach odpornościowych, od projektu konstruktu do badania przesiewowego i walidacji komórek knock-in, używając jako przykładów ludzkich limfocytów T Jurkat i mysich makrofagów RAW264.7. Zarówno limfocyty T, jak i linie komórkowe makrofagów są odporne na transfekcję36,37; jednak problem niskiej wydajności dostarczania CRISPR/Cas9 można przezwyciężyć za pomocą reporterów fluorescencyjnych ...

Komórki odpornościowe są kluczowe dla obrony przed patogenami. Zarówno odporność wrodzona, jak i nabyta są wymagane do usuwania czynników infekcyjnych i utrzymania homeostazy tkanek1,2. Modele linii komórkowych są niezbędnymi narzędziami do zrozumienia molekularnych podstaw układu odpornościowego ssaków; Są one stosowane w testach funkcjonalnych in vitro, takich jak te modelujące aktywację ludzkich limfocytów T, oraz do określania funkcji czynników genetycznych w aktywacji lub tłumieniu odpowiedzi immunologicznej3,4. Ważne jest, aby pamiętać, że układ odpornościowy ssaków jest niezwykle niejednorodny i, co równie ważne, ogromna liczba cząsteczek kontroluje różnicowanie, migrację i funkcję danego typu komórki5,6.
Narzędzia do edycji genomu Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9 pozwalają na manipulację genetyczną określonymi typami komórek, co ułatwia funkcjonalną adnotację genów w precyzyjny sposób7,8. Kilka opublikowanych protokołów opisało dostarczanie CRISPR/Cas9 w postaci kompleksów RNA prowadzących Cas9, znanych jako rybonukleoproteiny (RNP) w komórkach HEK293, liniach komórkowych Jurkat, pierwotnych limfocytach T9,10, makrofagi11,12,13, komórki macierzyste14 i inne15,16. W tych protokołach znakowanie genów jest zwykle osiągane poprzez fuzję znacznika fluorescencyjnego z białkami endogennymi17,18. Podjęto jednak niewiele prób użycia podwójnych reporterów fluorescencyjnych, które są kompatybilne z sortowaniem pojedynczych komórek, aby ułatwić eksperymenty typu knock-in19,20, szczególnie w komórkach odpornościowych.
Dogłębne analizy mechanistyczne mające na celu zrozumienie funkcji nowego czynnika genetycznego w komórkach odpornościowych zazwyczaj wymagają specyficznej dla typu komórki delecji genu, genetycznych eksperymentów ratunkowych i najlepiej identyfikacji jego interaktorów. Mimo że opublikowano metody optymalizacji genetycznej delecji genów w komórkach odpornościowych9,15,21, opisano znacznie mniej metod wprowadzania alleli knock-in o wszechstronnych funkcjach w celu zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. Dlatego w tym protokole staramy się szczegółowo opisać skuteczny i wysoce powtarzalny protokół ekspresji białka będącego przedmiotem zainteresowania (POI) w locus bezpiecznej przystani Rosa26 zarówno w ludzkich, jak i mysich liniach komórek odpornościowych. Zaprojektowaliśmy dwukolorowy system reporterowy, aby wzbogacić komórki transfekowane plazmidami eksprymującymi CRISPR/Cas9 (DsRed2) i rekombinowaną matrycą DNA (EBFP2), którą można wyizolować przez sortowanie komórek. Postępując zgodnie z tym protokołem, uzyskaliśmy wiele linii knock-in ludzkiej linii komórek T Jurkat i mysich makrofagów RAW264.7 do analiz funkcjonalnych słabo zbadanych białek.
Jako przykład, pokazujemy w tym protokole, jak uzyskać makrofagi RAW264.7 stabilnie eksprymujące ludzki ACE2 (receptor SARS-Cov-2)22. Ponieważ wrodzone komórki odpornościowe są zaangażowane w patogenezę Covid-1923,24, a ludzki ACE2 jest uważany za główny receptor wymagany do wniknięcia wirusa do komórek przed replikacją, makrofagi z knock-in ludzkiego ACE2 mogą służyć jako przydatne narzędzie do mechanistycznych badań namnażania się wirusa wewnątrz makrofagów. Równolegle prezentujemy również przykład knock-in genu w ludzkim locus ROSA26 w celu ekspresji białka RASGRP1, które zostało połączone na swoim końcu aminowym z powinowactwem Twin-Strep-tag (OST). Limfocyty T są kluczowymi komórkami docelowymi w terapiach immunologicznych, a coraz więcej badań koncentruje się na manipulacji ich reakcją na raka25,26. Ponieważ wiadomo, że Rasgrp1 jest kluczową cząsteczką sygnałową znajdującą się za receptorem limfocytów T, a jej interaktorzy nie są dobrze wyjaśnieni27, model knock-in OST-RASGRP1 stanowi podstawę do identyfikacji interaktorów regulujących odpowiedź komórek T na nowotwory i infekcje. Podsumowując, narzędzia te mogą być wykorzystywane do badań nad Covid-19 i odkrywania nowych cząsteczek oddziałujących z Rasgrp1.

<table><tbody><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>Ge Opieka zdrowotna</td><td></td><td>Obrazowanie chemiluminescencji</td></tr><tr><td>Ampicylina, sól sodowa</td><td>MP Biomedicals</td><td>194526</td><td></td></tr><tr><td>Anty-królicza IgG,</td><td>technologia sygnalizacji komórkowej</td> przeciwciał związanych z HRP <td>7074</td><td>w rozcieńczeniu 1/5000</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-RasGRP1, klon 10,1</td><td>Merck</td><td>MABS146</td><td>1,0 i mu; g/ml stężenia roboczego</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-aktyna (D6A8)</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>8457</td><td>w rozcieńczeniu 1/1000</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>Nowa Anglia BioLabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>Celometr Mini automatyczny licznik komórek</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli DH5&alpha; Kompetentne komórki</td><td>Takara</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Suloxidide)</td> <td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Zestawy tkanek</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>odczynnik do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>DPBS (10X), bez wapnia, bez magnezu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z Hyklonem o wysokiej zawartości glukozy</td><td></td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria&trade; Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>wyposażony w szafę bezpieczeństwa biologicznego</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACS Canto</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml polistyrenowa probówka z okrągłym dnem</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo wersja 10.7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (D16H11) XP&nbsp; Technologia</td><td>sygnalizacji komórkowej</td> mAb królika <td>5174</td><td>w rozcieńczeniu 1/1000</td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) Drugorzędowe, HRP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31430</td><td>w rozcieńczeniu 1/5000</td></tr><tr><td>Immobilon ECL Ultra Western HRP Substrate</td><td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-PSQ PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat</td><td>ATCC</td><td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>Siarczan kanamycyny</td><td>MP Biomedicals</td><td>194531</td><td></td></tr><tr><td>LB agar w proszku</td><td>ThermoFisher Scientific 22700041</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeta wielokanałowa (30-300 &mu; L)</td> <td>Eppendorf lub podobny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>system transfekcji neonowej</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfekcja, 10 &mu; Zestaw L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL Stożkowe sterylne probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq&reg; Gorący start Szybkie ładowanie&reg; 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td> <td>(M0489)</td> <td>do szablonu o wysokim GC%</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 do 180 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipety 0,1-20 i mikro; l</td><td>Eppendorf lub podobny</td><td>0030 075.005</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet 2-200&micro; l</td><td>Eppendorf lub podobny</td><td>0030 075.021</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do pipet 50-1000&micro; l</td><td>Eppendorf lub podobny</td><td>0030 075.064</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>pX458-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>112219</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>oczyszcza plazmid z trawienia restrykcyjnego</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>Rekombinowane przeciwciało anty-ACE2 [EPR4435(2)]</td><td>Abcam</td><td>ab108252</td><td>w rozcieńczeniu 1/1000</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Średni</td><td>Hyklon</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose Beads</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1201-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX&handel; Barwienie martwych komórek na czerwono, do wzbudzenia 633 lub 635 nm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaza DNA</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 Kinaza polinukleotydowa</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór trypsyny-EDTA (0,25%), z czerwienią fenolową</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescencyjny obrazownik komórek ZOE</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówki, PCR-clean</td><td>Eppendorf lub podobne</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe przezroczyste płytki wielodołkowe z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe przezroczyste mikropłytki z płaskiego dna polistyrenu poddane działaniu TC</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa, przezroczysta, okrągłodenna, mikropłytka z powłoką TC</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

knock-in genu przez crispr/cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów t

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

Badania genomiki funkcjonalnej układu odpornościowego wymagają manipulacji genetycznych, które obejmują zarówno delecję docelowych genów, jak i dodawanie elementów do interesujących białek. Identyfikacja funkcji genów w modelach linii komórkowych jest ważna dla odkrywania genów i badania mechanizmów wewnętrznych komórek. Jednak manipulacje genetyczne komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i linie komórkowe makrofagów, przy użyciu knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9, są trudne ze względu na niską wydajność transfekcji tych komórek, zwłaszcza w stanie spoczynku. Aby zmodyfikować geny w komórkach odpornościowych, zwykle stosuje się selekcję lekooporności i wektory wirusowe w celu wzbogacenia komórek wyrażających system CRIPSR/Cas9, co nieuchronnie prowadzi do niepożądanej interwencji komórek. W poprzednim badaniu zaprojektowaliśmy podwójne reportery fluorescencyjne sprzężone z CRISPR/Cas9, które ulegały przejściowej ekspresji po elektroporacji. To rozwiązanie techniczne prowadzi do szybkiej delecji genów w komórkach odpornościowych; jednak knock-in genów w komórkach odpornościowych, takich jak limfocyty T i makrofagi, bez użycia selekcji lekooporności lub wektorów wirusowych, jest jeszcze większym wyzwaniem. W tym artykule pokazujemy, że wykorzystując sortowanie komórek do wspomagania selekcji komórek przejściowo eksprymujących konstrukty CRISPR / Cas9 ukierunkowane na locus Rosa26 w połączeniu z plazmidem dawcy, można osiągnąć knock-in genu zarówno w limfocytach T, jak i makrofagach bez wzbogacania oporności na leki. Jako przykład pokazujemy, jak wyrazić ludzki ACE2, receptor SARS-Cov-2, który jest odpowiedzialny za obecną pandemię Covid-19, w makrofagach RAW264.7, wykonując eksperymenty knock-in. Takie genowe komórki knock-in mogą być szeroko stosowane do badań mechanistycznych.

Kierując się opisanym powyżej protokołem w celu przeprowadzenia eksperymentów knock-in w locus mRosa26 z wykorzystaniem mysich makrofagów RAW264.7, zaprojektowaliśmy wektor celujący do ekspresji ludzkiego białka ACE2, receptora dla wirusa SARS-Cov-2 (Rysunek 2A). Stosując podobny projekt, wygenerowaliśmy ludzkie limfocyty T Jurkat z knock-in białka fuzyjnego RASGRP1 z tagiem OST (Rysunek 2C). Po transfekcji trzech plazmidów, z których dwa służyły do eks...

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne reportery i sortowanie komórek, aby uprościć eksperymenty z wykorzystaniem fagów i linii komórek T. Do tych uproszczonych eksperymentów knock-in stosuje się dwa plazmidy, a mianowicie plazmid z ekspresją CRISPR/Cas9 i DsRed2 oraz plazmid dawcy z ekspresją rekombinacji homologicznej EBFP2, który jest trwale zintegrowany w locus Rosa26 w komórkach odpornościowych.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

Celem tego protokołu jest uproszczenie eksperymentu knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w liniach makrofagów i komórek T, za pomocą fluorescencyjnych reporterów i wpłynięcie na sortowanie komórek. Locus ROSA26 jest znany jako genomiczne miejsce bezpiecznej przystani do wprowadzania transgenów. Jest to zwykle białko będące przedmiotem zainteresowania z atakiem lub bez ataku w świecie myszy o 26 locus lub w ludzkim ortologu.Część 1: Projektowanie i budowa plazmidu sgRNA ukierunkowanych na locus Rosa26. Najpierw zaprojektuj sgRNA z mysiego locus Rosa26, używając sekwencji z informatyki genomu myszy i Ensemble Genome Browser, a następnie pobierz sekwencję genomową mysiego genu Rosa26. Przejdź do internetowego narzędzia internetowego CRISPOR, wklej 100 par zasad sekwencji wejściowej z locus Rosa26.Następnie wybierz genom, na przykład Mus musculus-mouse reference genome 2011. Następnie wybierz typ PAM. Użyj motywu 20bp NGG"PAM, rozpoznawanego przez spCas9.Kliknij przycisk Prześlij. Wybierz przewodnik z wysokim wynikiem szczegółowości, wysokim wynikiem wykonania i mniejszą liczbą odbiegających od celu. Należy unikać przewodników wskazywanych jako nieefektywne.Warto zauważyć, że preferowane jest wybranie dwóch prowadnic z nakładającymi się sekwencjami, co może zwiększyć wydajność wciskania, jak podano. Aby uzyskać ciepłą sekwencję obiadową, zsyntetyzuj nielegalne do przodu i nielegalne odwrócenie, które wyżarzane fosforyzowane i gotowe do klonowania do czynnika. Przygotuj linearyzowany spadek na Vactor, do którego mogę wyrazić, że muszę zgłosić przez BBS jedno trawienie, takie jak uzyskać Neal, legals do linearyzowanego wektora, aby wygenerować końcowy konstrukt, który jednocześnie wyraża przewodnik RNA i jądro CAS dziewięć połączonych z DSRIP dwa fluorescencyjne reportery.Część druga: Budowa wektora celowniczego jako szablonu rekombinacji homologicznej. Do wyrażania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla przykładu, człowiek przetrwał.Chcesz zsyntetyzować sekwencję cDNA za pomocą komercyjnego źródła i znacznika OST powinowactwa lub innego powszechnie stosowanego ataku w celu oczyszczenia białka, który można połączyć z sekwencją cDNA. Pamiętaj, aby dołączyć sekwencję konsensusu Kazak przed inicjacją cDNA. Trawiony przez enzym restrykcyjny Asc1 i podobnie jak dostać płytę CD i wkładkę do kręgosłupa.Vactor, a mianowicie pKhR26-IBFP IBP dający końcowy celownik koncentruje pojemnik, każdy KB z pięciu pierwszych i trzech pierwszych ramion homologicznych. Zestaw obsady ekspresji zawiera promotora CG, restaurację UST, jeśli chcesz, region Koonin jest powiązany z Iris, jeśli reporter VFD i fundusze poli AC. Wreszcie, na horyzoncie wektora docelowego przy użyciu unikalnych enzymów tnących, takich jak EcoR1 lub BamH1, trawienie i produkt są oczyszczane w magazynie, który minus 20 stopni na nuty elektroporacji.Zaleca się uzyskanie wysokiego stężenia zlinearyzowanego wektorowego DNA. Część trzecia: Elektroporacja linii makrofagów i komórek T przygotowuje hodowlę komórkową po separacji komórek Geritalk. Optymalna gęstość komórek wynosiła około 0,5 miliona komórek na ML w momencie transfekcji.Pełna elektroporacja w dziesięciu makro małych formatach końcówek nuklearnych przygotuj 24-dołkową płytkę zawierającą 500 mikrolitrów całkowitego wzrostu, pożywkę bez antybiotyków w każdym dołku. Rozgrzej talerze w nawilżonym 37 stopniach, 5%przykrywając ten inkubator do ustawiania. Zmniejsz parametry elektroporacji wejściowej elektrycznego systemu operacyjnego dla jet cat lub Rosales.Przygotuj badania następcze mieszaniny DNA komórkowego lub operację pobrania komórek kurczaka. Curchin 25 centymetrów kwadratowych kolby przenosi komórki u 15 zwierząt. Skoro probówka, to Phillip komórki przez centrofugację w temperaturze 90 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej, poproś o to, supernatanty.Do mycia ponownie zawiesić komórki za pomocą pięciu ml PBS, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez odwirowanie w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku. Usuń pliki DPP. I ponownie zawieś poduszki komórkowe za pomocą dwóch ML DBS.Pozostajesz mikro małą zawiesiną komórek i mieszasz z równą objętością 0,2% Trepan Ballou, aby oszacować próbkę obciążenia komórek pod względem szczeliny do liczenia, włóż Connie suwak do automatycznej komórki Connor i wyświetl sam obraz. Następnie uzyskaj wynik zliczania komórek. Oblicz, że 2 miliony ogniw znajdą reputację elektroporacji na eksperyment stukania, przenieś liczbę komórek do 1,5 ML.Odwiruj dwie komórki granulek przez wirowanie.Aby zaoszczędzić czas, podczas wirowania można przygotować mieszaninę do elektroporacji, która dodaje 2,5 mikrograma każdego z dziewięciu wektorów CRISPR CAS po 2,4 mikrograma ryżu Belinda, wektora gadatliwego i zawiesiny Buffalo. Nasza łączna objętość 55 makrośmieci w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml delikatnie wierzchołka i. Krótko odstawić, aby dobrze wymieszać.Przed użyciem pozostaw mieszaninę ciśnieniową Luxor i temperaturę pokojową. Po odwirowaniu aspart, DTB jest tym zasadniczo bezpiecznikiem przez dodatkowe 30 sekund, usuń jak najwięcej supernatantu, jak to możliwe, ponownie zawiesić ogniwa, delikatnie dodając przygotowaną mieszaninę do elektroporacji, pipetę w górę iw dół. Elektroporacja poprosiła o mieszalnik do elektroporacji ogniw za pomocą 10 mikro małych końcówek frakcji jądrowej, które były ważne.Unikaj pęcherzyków powietrza podczas głaskania pi, będzie to kosztować awarię galwanizacji. Naciśnij start. po czym operacja przenosi próbkę za chwilę.Studzienka z 24 dołkami z wstępnie ostrzegającym medium brutto wykonuje takie samo ciśnienie elektryczne i procedury, jak powyżej na pozostałych czterech replikowanych próbkach, delikatnie kołysze płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w inkubatorze pod kątem 37 stopni przez 48 do 72 godzin. Przed faktem sortowanie komórek W 24 godziny po transfekcji zbadaj ekspresję zakłócenia dwa dla reportera restauracji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej odłączonej od rypsa dla nas samych wskazuje, że elektroporacja działa prawidłowo.Część 4: sortowanie komórek w celu wyizolowania przypuszczalnych komórek knock-in. Przed sortowaniem komórek przygotuj, w 96 dołkach z 150 mikro małymi pożywkami brutto dla danego typu komórki na studzienkę, użyj niewłaściwego dolnego mikromiejsca na hodowlę i siebie oraz płaskiego dna mikro miejsca dla wszystkich komórek, przenieś komórki do sterylnego FACS, aby utrzymać probówkę na lodzie i umieścić pudełko na ścieżce przez okno, Podłączenie do sortowni komórek, jeśli ma to zastosowanie, ustaw sortownik komórek z dyszą o długości 85 mikrometrów i niskim natężeniem przepływu do sortowania komórek odpornościowych Aby osiągnąć optymalną ocenę i przeżycie komórek, należy na krótko pobrać próbki z wierzchołka okna przepustowego i załadować próbkę do akwizycji. Champer skonfigurował łyżwiarstwo faktograficzne do sortowania komórek, najpierw zdefiniował lejki sprzedażowe dla rozproszenia Forda i rozpraszania bocznego, a następnie zdefiniował komórki życia, uzyskując zestaw rozmów z czerwonymi komórkami ujemnymi.Następnie znajdują żywe pojedyncze komórki za pomocą pojedynczego bramkowania singletowego przy użyciu FSC H w porównaniu z FSE, wielowymiarowym blokiem. Na koniec ustaw bramkę dla żądanych DSR dwa i B, jeśli subpopulacja dodatnia Volvo, co oznacza, że komórki pomyślnie transfekowały się z wektorem CRISPR i wektorem kieszeniowym. Tak więc 10 pojedynczych komórek w każdym dołku 96, płytki dołkowej uzupełnionej podgrzewanym, kompletnym podłożem wzrostowym w trybie okresowym lub trybie pojedynczej komórki po sortowaniu inkubuje 96, dołkowe płytki w inkubatorze do hodowli komórek w celu ekspansji komórek.Część piąta: badanie przesiewowe podniesienia dodatnich komórek knock-in Po około dwóch tygodniach ekspansji komórek po przeżyciu, komórki w 48-dołkowej płytce oceniają ekspresję BFP lub cytometrii przepływowej przy użyciu niewielkiej części proliferacji przy użyciu komórek typu ścianowego jako kontroli ujemnej Populacje komórek, posiadające wyższy odsetek komórek dodatnich BFP, są utrzymywane w celu spełnienia walidacji ekstrakcji genomowego DNA z komórek, które powinniśmy eksprymować BFP przechodzi przez izolowany genomowy DNA metodą PCR ze starterami obejmującymi każdą stronę ramion homologicznych, a mianowicie jedną pierwotną lokalizację w sekwencji genomowej, na zewnątrz wektora docelowego. Patrząc na stronę rozmowy z wektorem w tym eksperymencie, przewidywana wielkość produktu PCR amplifikowanego pierwotnym wynosi 1,2 KV. A z F dwa i R dwa to 1,2 KB wyników sekwencjonowania Sangera. Tak więc produkty PCR pokazują sekwencje każdego złącza integracyjnego, demonstrując prawidłową i stukającą pozycję w Rosa 26 Lucas.Mówię, że immuno blotting umożliwia walidację prawidłowego stukania na poziomie białka część szósta reprezentatywne wyniki. Jako przykład, opublikowany w poprzednim badaniu, stwierdziliśmy, że 45 cząsteczek przyczepia się do tagu OSD, a następnie w taktach T przy kasie było 26 locus. Dostaję 45 i reżyserów incydentów lub ściągniętych w dół przez oczyszczanie powinowactwa i poddany spektrometrii mas.Dane proteomiczne ujawniły interakcję limfocytów T. W związku z tym ta pula produktów znacznie ułatwiła poszukiwanie nowych interkalatorów w celu wyjaśnienia funkcji danego białka. Ta prezentacja techniczna wykazała, że poprzez wyrażenie przejściowe zwiększone zapytanie ofertowe na linię odlewaną z koekspresją wektora mówiącego i BFP dla locus Rosa 26.Uzyskaliśmy linie komórkowe stukające ze stałą ekspresją genów zarówno w limfocytach T, jak i makrofagach, które są trudne do wykonania w manipulacjach genetycznych. Te metody i zalecenia mają zastosowanie do Chrisa dozwolonego w twierdzeniach o dużym segmencie DNA do badań mechanistycznych komórek odpornościowych, takich jak identyfikacja białka, badanie interakcji białek.

gene-knock-crisprcas9-cell-sorting-macrophage-t-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy edycję genomu opartą na CRISPR-Cas9 w hodowanych komórkach, gdzie Cas9 i sgRNA są dostarczane jako pojedynczy konstrukt plazmidowy do komórek. System CRISPR-Cas9 i pożądany gen, który ma zostać wstawiony, został wprowadzony do komórek za pomocą techniki elektroporacji, aby ułatwić pomyślną edycję genów.

Kompleksowa edycja genomu CRISPR: metoda homologii sterowanej naprawą genów w hodowanych komórkach przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Ten film demonstruje test do edycji genów w ludzkich limfocytach T przy użyciu technologii CRISPR-Cas9. Mieszanina pierwotnych limfocytów T CD4 + i CD8 + jest połączona z kompleksem rybonukleoproteinowym CRISPR-Cas9, ukierunkowanym na określone geny w celu nokautu. Po elektroporacji sgRNA kieruje Cas9 do docelowej sekwencji DNA, tworząc precyzyjne cięcia. Cięcia te są następnie naprawiane przez niehomologiczny mechanizm łączenia końców komórki, co prowadzi do nokautu genu.

Technika CRISPR-Cas9 do edycji genów w limfocytach T

W tym protokole opisujemy metody efektywnej transfekcji linii komórkowych mysich makrofagów za pomocą siRNA za pomocą 96-dołkowego systemu Amaxa Nucleofector Shuttle System, stymulacji makrofagów lipopolisacharydem i monitorowania wpływu na produkcję cytokin zapalnych.

Wykorzystanie interferencji RNA do zbadania wrodzonej odpowiedzi immunologicznej u makrofagów myszy

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy proces edycji genów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) do analizy sieci klastrów mikroRNA, który pozwala na szybkie wygenerowanie panelu genetycznie zmodyfikowanych linii komórkowych zawierających unikalne kombinacje delecji członków klastra miRNA o wielkości 35 kb w jednym eksperymencie.

Narzędzie do edycji genów CRISPR do analizy sieci klastrów mikroRNA

Ten protokół opisuje procedurę edycji genomu w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego myszy przy użyciu kompleksów rybonukleoprotein Cas9-sgRNA składanych in vitro i dostarczanych przez elektroporację.

Wysokowydajne rozrywanie genów w pierwotnych makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego przy użyciu elektroporowanych kompleksów Cas9-sgRNA

W miarę jak protokoły związane z CRISPR stają się coraz bardziej użyteczne i dostępne, w określonych warunkach eksperymentalnych nadal mogą pojawić się komplikacje i przeszkody. Protokół ten przedstawia w zarysie tworzenie wchodzącej w interakcję z receptorem ludzkiej linii komórkowej kinazy serynowo-treoninowej 1 (RIPK1/RIP1) przy użyciu CRISPR/Cas9 i podkreśla potencjalne wyzwania napotkane podczas tego procesu.

Generowanie linii komórkowej U937 z nokautem RIP1 przy użyciu systemu CRISPR-Cas9

Linia komórkowa THP-1 jest szeroko stosowana jako model do badania funkcji ludzkich monocytów/makrofagów w różnych obszarach badawczych związanych z biologią. W tym artykule opisano protokół wydajnej inżynierii opartej na CRISPR-Cas9 i izolacji klonów pojedynczych komórek, umożliwiający uzyskanie solidnych i powtarzalnych danych fenotypowych.

Nokaut genów za pośrednictwem CRISPR-Cas9 oparty na elektroporacji w komórkach THP-1 i izolacja klonów pojedynczych komórek

Poznaj metodę CRISPR/Cas9 do wprowadzania genu w liniach makrofagów i limfocytów T z użyciem reporterów fluorescencyjnych i sortowania komórek. Technika umożliwia szybką identyfikację zmodyfikowanych komórek bez selekcji lekowej.

Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Przeglądaj więcej filmów