Knock-in genu przez CRISPR/Cas9 i sortowanie komórek w liniach makrofagów i limfocytów T

Celem tego protokołu jest uproszczenie eksperymentu knock-in za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w liniach makrofagów i komórek T, za pomocą fluorescencyjnych reporterów i wpłynięcie na sortowanie komórek. Locus ROSA26 jest znany jako genomiczne miejsce bezpiecznej przystani do wprowadzania transgenów. Jest to zwykle białko będące przedmiotem zainteresowania z atakiem lub bez ataku w świecie myszy o 26 locus lub w ludzkim ortologu.

Część 1: Projektowanie i budowa plazmidu sgRNA ukierunkowanych na locus Rosa26. Najpierw zaprojektuj sgRNA z mysiego locus Rosa26, używając sekwencji z informatyki genomu myszy i Ensemble Genome Browser, a następnie pobierz sekwencję genomową mysiego genu Rosa26. Przejdź do internetowego narzędzia internetowego CRISPOR, wklej 100 par zasad sekwencji wejściowej z locus Rosa26.

Następnie wybierz genom, na przykład Mus musculus-mouse reference genome 2011. Następnie wybierz typ PAM. Użyj motywu 20bp NGG"PAM, rozpoznawanego przez spCas9.

Kliknij przycisk Prześlij. Wybierz przewodnik z wysokim wynikiem szczegółowości, wysokim wynikiem wykonania i mniejszą liczbą odbiegających od celu. Należy unikać przewodników wskazywanych jako nieefektywne.

Warto zauważyć, że preferowane jest wybranie dwóch prowadnic z nakładającymi się sekwencjami, co może zwiększyć wydajność wciskania, jak podano. Aby uzyskać ciepłą sekwencję obiadową, zsyntetyzuj nielegalne do przodu i nielegalne odwrócenie, które wyżarzane fosforyzowane i gotowe do klonowania do czynnika. Przygotuj linearyzowany spadek na Vactor, do którego mogę wyrazić, że muszę zgłosić przez BBS jedno trawienie, takie jak uzyskać Neal, legals do linearyzowanego wektora, aby wygenerować końcowy konstrukt, który jednocześnie wyraża przewodnik RNA i jądro CAS dziewięć połączonych z DSRIP dwa fluorescencyjne reportery.

Część druga: Budowa wektora celowniczego jako szablonu rekombinacji homologicznej. Do wyrażania białka będącego przedmiotem zainteresowania. Dla przykładu, człowiek przetrwał.

Chcesz zsyntetyzować sekwencję cDNA za pomocą komercyjnego źródła i znacznika OST powinowactwa lub innego powszechnie stosowanego ataku w celu oczyszczenia białka, który można połączyć z sekwencją cDNA. Pamiętaj, aby dołączyć sekwencję konsensusu Kazak przed inicjacją cDNA. Trawiony przez enzym restrykcyjny Asc1 i podobnie jak dostać płytę CD i wkładkę do kręgosłupa.

Vactor, a mianowicie pKhR26-IBFP IBP dający końcowy celownik koncentruje pojemnik, każdy KB z pięciu pierwszych i trzech pierwszych ramion homologicznych. Zestaw obsady ekspresji zawiera promotora CG, restaurację UST, jeśli chcesz, region Koonin jest powiązany z Iris, jeśli reporter VFD i fundusze poli AC. Wreszcie, na horyzoncie wektora docelowego przy użyciu unikalnych enzymów tnących, takich jak EcoR1 lub BamH1, trawienie i produkt są oczyszczane w magazynie, który minus 20 stopni na nuty elektroporacji.

Zaleca się uzyskanie wysokiego stężenia zlinearyzowanego wektorowego DNA. Część trzecia: Elektroporacja linii makrofagów i komórek T przygotowuje hodowlę komórkową po separacji komórek Geritalk. Optymalna gęstość komórek wynosiła około 0,5 miliona komórek na ML w momencie transfekcji.

Pełna elektroporacja w dziesięciu makro małych formatach końcówek nuklearnych przygotuj 24-dołkową płytkę zawierającą 500 mikrolitrów całkowitego wzrostu, pożywkę bez antybiotyków w każdym dołku. Rozgrzej talerze w nawilżonym 37 stopniach, 5%przykrywając ten inkubator do ustawiania. Zmniejsz parametry elektroporacji wejściowej elektrycznego systemu operacyjnego dla jet cat lub Rosales.

Przygotuj badania następcze mieszaniny DNA komórkowego lub operację pobrania komórek kurczaka. Curchin 25 centymetrów kwadratowych kolby przenosi komórki u 15 zwierząt. Skoro probówka, to Phillip komórki przez centrofugację w temperaturze 90 razy G przez osiem minut w temperaturze pokojowej, poproś o to, supernatanty.

Do mycia ponownie zawiesić komórki za pomocą pięciu ml PBS, a następnie odwirować zawiesinę komórek przez odwirowanie w tych samych warunkach, co w poprzednim kroku. Usuń pliki DPP. I ponownie zawieś poduszki komórkowe za pomocą dwóch ML DBS.

Pozostajesz mikro małą zawiesiną komórek i mieszasz z równą objętością 0,2% Trepan Ballou, aby oszacować próbkę obciążenia komórek pod względem szczeliny do liczenia, włóż Connie suwak do automatycznej komórki Connor i wyświetl sam obraz. Następnie uzyskaj wynik zliczania komórek. Oblicz, że 2 miliony ogniw znajdą reputację elektroporacji na eksperyment stukania, przenieś liczbę komórek do 1,5 ML.Odwiruj dwie komórki granulek przez wirowanie.

Aby zaoszczędzić czas, podczas wirowania można przygotować mieszaninę do elektroporacji, która dodaje 2,5 mikrograma każdego z dziewięciu wektorów CRISPR CAS po 2,4 mikrograma ryżu Belinda, wektora gadatliwego i zawiesiny Buffalo. Nasza łączna objętość 55 makrośmieci w nowej probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml delikatnie wierzchołka i. Krótko odstawić, aby dobrze wymieszać.

Przed użyciem pozostaw mieszaninę ciśnieniową Luxor i temperaturę pokojową. Po odwirowaniu aspart, DTB jest tym zasadniczo bezpiecznikiem przez dodatkowe 30 sekund, usuń jak najwięcej supernatantu, jak to możliwe, ponownie zawiesić ogniwa, delikatnie dodając przygotowaną mieszaninę do elektroporacji, pipetę w górę iw dół. Elektroporacja poprosiła o mieszalnik do elektroporacji ogniw za pomocą 10 mikro małych końcówek frakcji jądrowej, które były ważne.

Unikaj pęcherzyków powietrza podczas głaskania pi, będzie to kosztować awarię galwanizacji. Naciśnij start. po czym operacja przenosi próbkę za chwilę.

Studzienka z 24 dołkami z wstępnie ostrzegającym medium brutto wykonuje takie samo ciśnienie elektryczne i procedury, jak powyżej na pozostałych czterech replikowanych próbkach, delikatnie kołysze płytką, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek. Inkubować komórki w inkubatorze pod kątem 37 stopni przez 48 do 72 godzin. Przed faktem sortowanie komórek W 24 godziny po transfekcji zbadaj ekspresję zakłócenia dwa dla reportera restauracji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej odłączonej od rypsa dla nas samych wskazuje, że elektroporacja działa prawidłowo.

Część 4: sortowanie komórek w celu wyizolowania przypuszczalnych komórek knock-in. Przed sortowaniem komórek przygotuj, w 96 dołkach z 150 mikro małymi pożywkami brutto dla danego typu komórki na studzienkę, użyj niewłaściwego dolnego mikromiejsca na hodowlę i siebie oraz płaskiego dna mikro miejsca dla wszystkich komórek, przenieś komórki do sterylnego FACS, aby utrzymać probówkę na lodzie i umieścić pudełko na ścieżce przez okno, Podłączenie do sortowni komórek, jeśli ma to zastosowanie, ustaw sortownik komórek z dyszą o długości 85 mikrometrów i niskim natężeniem przepływu do sortowania komórek odpornościowych Aby osiągnąć optymalną ocenę i przeżycie komórek, należy na krótko pobrać próbki z wierzchołka okna przepustowego i załadować próbkę do akwizycji. Champer skonfigurował łyżwiarstwo faktograficzne do sortowania komórek, najpierw zdefiniował lejki sprzedażowe dla rozproszenia Forda i rozpraszania bocznego, a następnie zdefiniował komórki życia, uzyskując zestaw rozmów z czerwonymi komórkami ujemnymi.

Następnie znajdują żywe pojedyncze komórki za pomocą pojedynczego bramkowania singletowego przy użyciu FSC H w porównaniu z FSE, wielowymiarowym blokiem. Na koniec ustaw bramkę dla żądanych DSR dwa i B, jeśli subpopulacja dodatnia Volvo, co oznacza, że komórki pomyślnie transfekowały się z wektorem CRISPR i wektorem kieszeniowym. Tak więc 10 pojedynczych komórek w każdym dołku 96, płytki dołkowej uzupełnionej podgrzewanym, kompletnym podłożem wzrostowym w trybie okresowym lub trybie pojedynczej komórki po sortowaniu inkubuje 96, dołkowe płytki w inkubatorze do hodowli komórek w celu ekspansji komórek.

Część piąta: badanie przesiewowe podniesienia dodatnich komórek knock-in Po około dwóch tygodniach ekspansji komórek po przeżyciu, komórki w 48-dołkowej płytce oceniają ekspresję BFP lub cytometrii przepływowej przy użyciu niewielkiej części proliferacji przy użyciu komórek typu ścianowego jako kontroli ujemnej Populacje komórek, posiadające wyższy odsetek komórek dodatnich BFP, są utrzymywane w celu spełnienia walidacji ekstrakcji genomowego DNA z komórek, które powinniśmy eksprymować BFP przechodzi przez izolowany genomowy DNA metodą PCR ze starterami obejmującymi każdą stronę ramion homologicznych, a mianowicie jedną pierwotną lokalizację w sekwencji genomowej, na zewnątrz wektora docelowego. Patrząc na stronę rozmowy z wektorem w tym eksperymencie, przewidywana wielkość produktu PCR amplifikowanego pierwotnym wynosi 1,2 KV. A z F dwa i R dwa to 1,2 KB wyników sekwencjonowania Sangera. Tak więc produkty PCR pokazują sekwencje każdego złącza integracyjnego, demonstrując prawidłową i stukającą pozycję w Rosa 26 Lucas.

Mówię, że immuno blotting umożliwia walidację prawidłowego stukania na poziomie białka część szósta reprezentatywne wyniki. Jako przykład, opublikowany w poprzednim badaniu, stwierdziliśmy, że 45 cząsteczek przyczepia się do tagu OSD, a następnie w taktach T przy kasie było 26 locus. Dostaję 45 i reżyserów incydentów lub ściągniętych w dół przez oczyszczanie powinowactwa i poddany spektrometrii mas.

Dane proteomiczne ujawniły interakcję limfocytów T. W związku z tym ta pula produktów znacznie ułatwiła poszukiwanie nowych interkalatorów w celu wyjaśnienia funkcji danego białka. Ta prezentacja techniczna wykazała, że poprzez wyrażenie przejściowe zwiększone zapytanie ofertowe na linię odlewaną z koekspresją wektora mówiącego i BFP dla locus Rosa 26.

Uzyskaliśmy linie komórkowe stukające ze stałą ekspresją genów zarówno w limfocytach T, jak i makrofagach, które są trudne do wykonania w manipulacjach genetycznych. Te metody i zalecenia mają zastosowanie do Chrisa dozwolonego w twierdzeniach o dużym segmencie DNA do badań mechanistycznych komórek odpornościowych, takich jak identyfikacja białka, badanie interakcji białek.