Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Przerzuty są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Zjawisko to występuje, gdy komórki rakowe odłączają się od guza pierwotnego, przechodzą do krążenia krwi, aby w końcu dotrzeć do odległego narządu docelowego. Gdy te oderwane komórki dostaną się do krwi, nazywamy je wtórnymi komórkami nowotworowymi.

Stanowią one zmienny materiał, ponieważ z jednej strony są głównym winowajcą powstawania przerzutów, a z drugiej strony są łatwiejsze niż biopsje guza. Rzeczywiście, można je pobrać za pomocą prostego nakłucia krwi. Pomimo niewielkiej liczby tych komórek w próbce krwi, jesteśmy pierwszymi, którzy ustalili kilka krążących linii komórek nowotworowych z krwi pacjenta z większym niepokojem przy użyciu warunków kontrolowanych 3D.

Ta linia komórkowa może być używana na dowolnej komercyjnej linii komórkowej do rutynowych eksperymentów. Na przykład do genetycznych badań przesiewowych leków, do białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale także do eksperymentu in vivo w celu zbadania zdolności do inicjacji guza i ich potencjału przerzutowego. CTC, czyli krążące linie komórek nowotworowych, powinny być hodowane w warunkach 3D w niedotlenieniu.

Gdy CTC utworzy kulki, możemy umieścić je w pożywce i odwirować przez pięć minut przy 300 RCF. Odrzucić supernatant i dodać 500 mikrolitrów Accumax. Zawieszamy jeden i inkubujemy roztwór 20 minut w temperaturze 37 stopni.

Następnie umyj zdysocjowane kulki PBS i osadź komórki. Ponownie zawiesić osad za pomocą świeżo uzupełnionego DMEM / F12 i zobaczyć komórki w gęstości pięciu komórek na mikrolitr w nowej płytce 24 Low Attachment. Kulki wirówkowe CTC eliminują supernatant i dwukrotnie przemłukują osad PBS.

W 500 mikrolitrach PFE dobrze wymieszaj i inkubuj probówkę na lodzie przez 20 minut. Następnie odwirować stałe kulki i dwukrotnie przemyć osad PBS, eliminując maksymalną objętość PBS i dodać 20 mikrolitrów uformowanego HistoGel. Weź go do zawiesiny i zrób kropelkę na wazonie hodowlanym, pozostaw do wyschnięcia na 10 minut i odłącz za pomocą skalpela.

Możesz teraz przetwarzać w dowolny sposób, aby CTC były ukierunkowane na pożądane białko będące przedmiotem zainteresowania. Zbierz CTC i odłącz sfery od Accumax, jak opisano wcześniej. Wyeliminuj Accumax i ponownie zasmów osad trzema ml buforu blokującego i przenieś zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 14 mikrometrów, aby uzyskać roztwór jednokomórkowy.

Policz komórki i wyślij do probówek i dodaj objętość 200 000 komórek, odwiruj probówki i odrzuć supernatant. Zgodnie z kartą charakterystyki przeciwciał dodać do probówki żądaną objętość przeciwciała, a do innej probówki jego izotyp i kontynuować czynności zgodnie ze wskazówkami producenta. Pozostała tuba nie zostanie oznaczona, a w tym eksperymencie zdecydowanie sugeruje się wykorzystanie rynku rentowności.

Na cytometrze zacznij od nieoznakowanej rurki, aby ustawić napięcie w ujemnie oznaczonym obszarze. Następnie umieść probówkę z izotypem. Izotyp służyłby jako kontrola ujemna w celu rozróżnienia sygnału dodatniego od sygnału niespecyficznego.

I zakończ eksperyment z oznakowanymi komórkami z przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania, w których powinieneś zobaczyć przesunięcie w pozytywnie znakowanej bramce, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji. Powoduje to zawieszenie zdysocjowanych CTC w uzupełnionej pożywce o gęstości 200 000 komórek na ml. W nasadce Ultra Low 96, płytce dołkowej, uszczelnij objętość 50 mikrolitrów i inkubuj płytkę przez 24 godziny w niedotlenieniu.

Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów badanego leku o różnym stężeniu i dodaj taką samą objętość DMEM/F12 tylko w celu dalszego określenia podstawy żywotności komórkowej i inkubacji płytki przez kolejne 48 godzin. W trzecim dniu rozpuść środek i dodaj 70 mikrolitrów mieszanki do każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 20 minut, a następnie zmierz luminescencję.

Test ten jest użytecznym narzędziem do testowania dużej liczby leków w celu oceny ich wpływu na wzrost komórek CTC. W Eppendorf ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach PBS, uszczypnąć skórę z tyłu myszy i wprowadzić igłę pod skórę. Wstrzykuj powoli całą objętość w to samo miejsce i monitoruj wzrost guza co drugi dzień i składaj myszy, jeśli guz przekroczył rozmiar 1,5 centymetra sześciennego.

Przed zabiegiem należy wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy w grzbietowo-brzuszną stronę myszy, wykonać małe nacięcie poniżej 10. żebra. Delikatnie wyjmij śledzionę i połóż ją na sterylnej gazie. Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawieszonych CTC w PBS i odczekać trzy minuty bez wyjmowania igły.

Podwiązać naczynie tętnicze z jednej strony, a naczynie naczyniowe z drugiej strony. Następnie usuń śledzionę, przecinając bezpośrednio nad dwoma ligaturami. Zszyj otrzewną brzuszną i skórę i dobrze zdezynfekuj ten obszar.

Celem tego eksperymentu jest przetestowanie zdolności CTC pochodzących od pacjenta z rakiem jelita grubego do kolonizacji wątroby poprzez wywołanie, widocznego przewidywania przerzutowego. Wyizolowanie i ustalenie klinicznej linii komórek nowotworowych jest nowym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych. Na przykład, jeśli masz gen będący przedmiotem zainteresowania, w przypadku którego badania in vivo wykazały, że gen ten jest zaangażowany w migrację i zdolność inwazji linii komórkowych raka jelita grubego, wyeliminowanie tego genu w krążących liniach komórek nowotworowych przed wstrzyknięciem do śledziony myszy, aby umożliwić im kolonizację wątroby, może być dobrym narzędziem do potwierdzenia wyniku in vivo.

W przypadku badań translacyjnych naszą główną perspektywą izolowania krążących linii komórek nowotworowych jest wykorzystanie tego cennego materiału w medycynie spersonalizowanej. Z próbek krwi pacjenta izolowalibyśmy i amplifikowali CTC w hodowli przez dwa lub trzy tygodnie, aby mieć wystarczającą ilość materiału do przesiewu dostępnego panelu leków i oceny jego cytotoksyczności, aby ostatecznie przypisać