Name: Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Poznaj metody izolacji i hodowli krążących komórek nowotworowych z krwi pacjentów z rakiem jelita grubego. Techniki te umożliwiają badania przesiewowe leków oraz modelowanie metastaz in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt badawczy w laboratorium Pannequin był wspierany przez grant badawczy od SIRIC: Grant « INCa-DGOS-Inserm 6045 ». Prace doktorskie Guillaume'a Belthiera i Zeinab Homayed zostały wsparte przez Ligę Walki z Rakiem/Ligue contre le Cancer. Wynagrodzenie Céline Bouclier było finansowane przez "region Oksytania". Podziękowania dla Juliana Venablesa za angielską edycję.

Wszystkie protokoły in vivo zostały zatwierdzone przez agencje etyczne ds. zwierząt.
1. Amplifikacja CTC w warunkach hodowli 3D
<ol>
	<li>Aby wyhodować CTC w zawiesinie, pierwsze nasiona CTC w studzienkach 24-dołkowej płytki o ultra-niskim przyłączeniu (ULA) o maksymalnym stężeniu 5 komórek/μl i w 1 ml pożywki M12 (tj. zaawansowany DMEM-F12 uzupełniony 2 mM l-glutaminą, 100 jednostkami/ml penicyliny i streptomycyny, suplementem N2, 20 ng/ml naskórkowym czynnikiem wzrostu i 10 ng/ml czynnikiem wzrostu fibroblastów10).</li>
	<li>Aby umożliwić tworzenie się kuli i ekspansję komórek, inkubuj komórki w warunkach niedotlenienia (2%O2) od 6 do 10 dni.</li>
	<li>Gdy kule są wystarczająco duże (100 μm), aby zapobiec martwicy, należy je rozdzielić w celu amplifikacji.
	<ol>
		<li>Umieścić zawiesinę komórek w probówce o pojemności 2 ml lub probówce o pojemności 15 ml i odwirować przy 300 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Usunąć supernatant i dodać 500 μl delikatnego odczynnika dysocjacyjnego (np. Accumax) do osadu.</li>
		<li>Delikatnie wirować i inkubować zawiesinę komórkową z delikatnym odczynnikiem dysocjacyjnym przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Przekroczenie czasu inkubacji w delikatnym odczynniku dysocjacyjnym (Accumax) może spowodować nienormalne zwiększenie śmiertelności komórek.</li>
		<li>Dodać 1,5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i odwirować probówkę przez 5 minut przy 300 x g.</li>
		<li>Odlej sklarat i ponownie zawieś osad w świeżym podłożu M12, aby osiągnąć gęstość 1-5 komórek na μl.</li>
		<li>Wysiewać zawiesinę komórek w nowych dołkach z płytki o bardzo niskim przyłączeniu: 10 ml dla kolb T75, 2 ml dla płytek 6-dołkowych i 100 μl dla płytek 96-dołkowych</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie immunofluorescencyjne (IF) na przekrojach sfery CTC
<ol>
	<li>Odwirować kulki CTC do probówki o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut, odessać supernatant i dwukrotnie przepłukać osad PBS.</li>
	<li>Zawiesić osad z 500 μl 4% paraformaldehydu (PFA) i inkubować przez 20 minut na lodzie. Odwirować zawiesinę o stężeniu 300 x g i przemyć dwukrotnie 5 ml PBS.</li>
	<li>Zawiesić osad za pomocą (tj. 15 do 20 μl) gorącego i płynnego Histogelu. Za pomocą pipety pobrać całą zawiesinę i zrobić kroplę na wstępnie schłodzonej powierzchni w temperaturze 4 °C i pozostawić do polimeryzacji przez 5 do 10 minut. 
	UWAGA: Pracuj szybko, aby uniknąć polimeryzacji zawiesiny w końcówce.</li>
	<li>Odłącz stałą kroplę za pomocą ostrza skalpela i włóż ją do kasety do zatapiania z przegródkami.</li>
	<li>Wykonaj następujące kroki: inkluzja parafiny, sekcja parafiny, ponowne uwodnienie sekcji, pobranie antygenu i inkubacja przeciwciał. Kroki te są takie same, jak w przypadku każdego guza lub narządu zanurzonego w parafinie i przetworzonego w celu barwienia immunofluorescencyjnego12. 
	UWAGA: Kaseta może być przechowywana w 70% etanolu w temperaturze 4 °C do momentu zatopienia parafiny.</li>
</ol>
3. Analiza cytometryczna
<ol>
	<li>Odwirować kulki CTC do probówki o pojemności 15 ml o sile 300 x g przez 5 minut i dwukrotnie przepłukać osad PBS.</li>
	<li>Odessać supernatant i dodać 500 μl delikatnego odczynnika dysocjacyjnego do osadu.</li>
	<li>Delikatnie wirować i inkubować zawiesinę komórkową z delikatnym odczynnikiem dysocjacyjnym przez 20 do 30 minut w temperaturze 37 °C. 
	UWAGA: Przekroczenie 40 minut inkubacji w odczynniku do delikatnej dysocjacji (Accumax) może spowodować nienormalne zwiększenie śmiertelności komórek.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową przez 5 minut przy 300 x g, usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml buforu blokującego (tj. PBS z 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA)).</li>
	<li>Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 μm, aby wyeliminować pozostałe kulki.</li>
	<li>Po zliczeniu umieść 200 000 komórek w trzech probówkach do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), odwiruj przy 300 x g przez 5 minut i usuń supernatant. Użyj jednej z trzech probówek FACS jako kontrolki, która nie otrzyma żadnych odczynników barwiących.</li>
	<li>Zgodnie z arkuszem danych dodaj odpowiednie przeciwciało do dwóch pozostałych probówek FACS (tj. jednego sprzężonego przeciwciała przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, jednego sprzężonego wzorca izotypowego).</li>
	<li>Po upływie zalecanego czasu inkubacji dodać 300 μl buforu blokującego w celu przepłukania komórek, odwirować 3 probówki o stężeniu 300 x g i odessać supernatant. Powtórz ten krok dwukrotnie. Następnie ponownie zawiesić osad z buforem blokującym z odczynnikiem do barwienia żywotności komórek (z wyjątkiem kontroli probówki FACS bez barwienia).</li>
	<li>Trzymaj probówki na lodzie do czasu analizy FACS. Najpierw użyj probówki bez barwienia, aby zidentyfikować bramkę dla żywotności komórek i barwienia przeciwciałami. Następnie przeanalizuj probówkę FACS ze sprzężonym przeciwciałem przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania, aby określić ilościowo procent CTC wyrażającego interesujące białko. Rurka FACS ze sprzężoną kontrolą izotypu nie powinna wskazywać przesunięcia. Potwierdza to, że przesunięcie jest specyficzne dla docelowego białka będącego przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Jeśli to możliwe, należy użyć linii komórkowej wyrażającej wysoki poziom białka będącego przedmiotem zainteresowania jako kontroli dodatniej oraz linii komórkowej, która nie wykazuje ekspresji białka, jako kontroli ujemnej.</li>
</ol>
4. Test żywotności luminescencji (CellTiter-Glo)
<ol>
	<li>Zawiesić zdysocjowane CTC (jak opisano w sekcji 1.4.5) w pożywce M12. Policz komórki i dostosuj stężenie komórek do 200 000 komórek/ml.</li>
	<li>Na 96-dołkowej płytce ULA wysiewaj 10 000 zdysocjowanych CTC na dołek w 50 μl i inkubuj płytkę w hipoksji (2%O2) przez 24 godziny.</li>
	<li>Następnego dnia należy dodać 50 μL badanego leku do CTC. Wcześniej zaleca się wykonanie miareczkowania stężenia leku, w celu określenia połowy maksymalnego stężenia hamującego (IC50). Traktuj niektóre studzienki nośnikiem tylko w celu określenia żywotności komórek podstawnych. 
	UWAGA: Liczba zasianych komórek może się różnić między liniami CTC, w zależności od czasu ich podwojenia. Ponadto komórki powinny być wysiewane w trzech egzemplarzach, aby zminimalizować zmienność wyników.</li>
	<li>Inkubować płytki w hipoksji przez kolejne 48 godzin.</li>
	<li>W dniu 3 umieścić hodowane płytki oraz bufor żywotności komórek luminescencyjnych i substrat w temperaturze pokojowej i rozpuścić substrat w odpowiedniej objętości buforu, zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Dodać 70 μl mieszanki żywotności luminescencji do każdej płytki hodowlanej. Umieścić płytki na wytrząsarce orbitalnej na 20 minut w celu wywołania lizy komórek, a następnie przenieść 100 μl mieszaniny na nieprzezroczystą płytkę wielodołkową, kompatybilną z luminometrem.</li>
	<li>Pozostaw płytkę do odpoczynku w temperaturze pokojowej, przykryj ją folią aluminiową w celu ustabilizowania sygnału luminescencyjnego. 
	UWAGA: Sygnał luminescencyjny jest stabilny do 3 godzin.</li>
	<li>Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek (np. Tecan Infinite 200 Pro).</li>
	<li>Na potrzeby analizy danych należy obliczyć średnią z trzykrotnej względnej jednostki światła RLU dla każdego warunku. Aby ocenić procent żywotności w zależności od każdego potrzebnego stężenia leku: (RLU komórek poddanych działaniu substancji/RLU komórek nieleczonych) x 100.</li>
</ol>
5. Zastrzyki podskórne
<ol>
	<li>W probówce do mikrowirówek ponownie zawiesić komórki w 100 μl sterylnego PBS. Jeśli liczba wstrzykniętych komórek jest niska, ponownie zawieś komórki w 1:1 PBS/Matrigel, o zmniejszonej zawartości czynników wzrostu, aby skoncentrować komórki razem i przyspieszyć inicjację guza. 
	UWAGA: Gęstość komórek może wynosić od 10 komórek (w celu zakwestionowania zdolności inicjacji guza) do 1 miliona komórek, w zależności od pytania naukowego i celu eksperymentu.</li>
	<li>Pobrać pełną objętość w strzykawce insulinowej.</li>
	<li>U myszy z niedoborem odporności uszczypnij skórę boku między palcem wskazującym a serdecznym i delikatnie wbij igłę u podstawy skóry. 
	UWAGA: Ta procedura nie jest bolesna i jest wykonywana na przytomnych myszach.</li>
	<li>Powoli wstrzyknij objętość w to samo miejsce, aby zapobiec rozprzestrzenianiu się komórek. Spowoduje to powstanie małego pęcherzyka pod skórą.</li>
	<li>Delikatnie uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zapobiec cofaniu się objętości.</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza co drugi dzień za pomocą suwmiarki.</li>
	<li>Uśmierc zwierzę, jeśli guz przekracza 1500 mm3. W zależności od dostępności materiału, myszy należy poddać eutanazji poprzez wdychanie dwutlenku węgla lub gazów znieczulających lub zwichnięcie szyjki macicy.</li>
</ol>
6. Wstrzyknięcie dośledzionowe
<ol>
	<li>Przed rozpoczęciem należy autoklawować narzędzia chirurgiczne (nożyczki i kleszcze) w temperaturze 124 °C przez 15 minut i oczyścić wszystkie powierzchnie przestrzeni roboczej 70% etanolem.</li>
	<li>W probówce do mikrowirówki ponownie zawieś komórki w 50 μl sterylnego PBS i przechowuj je na lodzie. Gęstość komórek może wynosić od 0,5 do 1 miliona komórek. Większa liczba komórek może powodować rozwój skrzepów w krążeniu krwi.</li>
	<li>Przed wstrzyknięciem komórek należy wstrzyknąć podskórnie 100 μl buprenorfiny o stężeniu 0,015 mg/ml w celu złagodzenia bólu.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej, w której izofluran utrzymuje się na poziomie 3%, przez 2-3 minuty. Kiedy zwierzę przestaje reagować na ruch, połóż je na prawym boku na poduszce grzewczej i utrzymuj znieczulenie za pomocą maski na twarz z obwodem oddychania, która dostarcza mieszaninę gazówO2 i izofluranu.</li>
	<li>Nałóż lubrykant do oczu na każde oko, aby uniknąć wysuszenia oczu podczas zabiegu. Zdezynfekować okolicę klatki piersiowej roztworem jodu powidonu (tj. betadyną).</li>
	<li>Po stronie grzbietowo-brzusznej wykonaj małe nacięcie 0,5 cm za pomocą nożyczek poniżej 10. fałszywego żebra.</li>
	<li>Delikatnie wyjmij śledzionę i połóż ją na sterylnej gazie. Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć 50 μl CTC w końcówkę śledziony. Upewnij się, że strzykawka jest trzymana w pozycji pionowej i odczekaj 3-5 minut, aby uniknąć przepływu wstecznego, a następnie wyjmij igłę.</li>
	<li>Podwiązać naczynia śledziony z dwóch stron (tętnic i żył) i usunąć śledzionę, przecinając bezpośrednio nad dwoma ligaturami. Śledziona jest usuwana, aby zapobiec niepożądanemu tworzeniu się guza w tym narządzie.</li>
	<li>Zszyj otrzewną brzuszną, a następnie skórę za pomocą 5.0 degradowalnych sterylnych szwów.</li>
	<li>Utrzymuj mysz w cieple, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia.</li>
	<li>Monitoruj mysz 3 dni w tygodniu pod kątem nieprawidłowych funkcji organizmu, nieprawidłowych ruchów i postawy oraz utraty wagi.</li>
	<li>Zwierzę należy złożyć w ofierze, gdy osiągną humanitarne punkty końcowe (około 6 tygodni po operacji), aby przeanalizować przerzuty do wątroby.</li>
</ol>

<ol><li>Wittekind, C., Neid, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and metastasis.</a> Oncology. 69, Suppl 1 14-16 (2005).</li>
<li>Eger, A., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%3A+Disease+Models%22%5BJournal%5D)">Models of epithelial-mesenchymal transition.</a> Drug Discovery Today: Disease Models. 2, 57-63 (2005).</li>
<li>Palmirotta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+biopsy+of+cancer%3A+a+multimodal+diagnostic+tool+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Liquid biopsy of cancer: a multimodal diagnostic tool in clinical oncology.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 10, (2018).</li>
<li>Hong, B., Zu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+circulating+tumor+cells%3A+current+challenges+and+new+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Detecting circulating tumor cells: current challenges and new trends.</a> Theranostics. 3, 377-394 (2013).</li>
<li>vander Toom, E. E., Verdone, J. E., Gorin, M. A., Pienta, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+challenges+in+the+isolation+and+analysis+of+circulating+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Technical challenges in the isolation and analysis of circulating tumor cells.</a> Oncotarget. 7, 62754-62766 (2016).</li>
<li>Jin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+diagnostic+value+of+circulating+tumor+cells+with+CytoSorter%C2%AE+CTC+capture+system+in+patients+with+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Medicine%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the diagnostic value of circulating tumor cells with CytoSorter® CTC capture system in patients with breast cancer.</a> Cancer Medicine. 9, 1638-1647 (2020).</li>
<li>Huang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+circulating+tumor+cells+and+tumor+response+in+colorectal+cancer+patients+treated+with+chemotherapy%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Relationship between circulating tumor cells and tumor response in colorectal cancer patients treated with chemotherapy: a meta-analysis.</a> BMC Cancer. 14, 976(2014).</li>
<li>Yu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+culture+of+circulating+breast+tumor+cells+for+individualized+testing+of+drug+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Ex vivo culture of circulating breast tumor cells for individualized testing of drug susceptibility.</a> Science. 345, 216-220 (2014).</li>
<li>Aceto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cell+Clusters+are+Oligoclonal+Precursors+of+Breast+Cancer+Metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cell Clusters are Oligoclonal Precursors of Breast Cancer Metastasis.</a> Cell. 158, 1110-1122 (2014).</li>
<li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66, 1802-1810 (2017).</li>
<li>Lee, W. Y., Hong, H. K., Ham, S. K., Kim, C. I., Cho, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Colorectal+Cancer+in+Differentially+Established+Liver+Metastasis+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of Colorectal Cancer in Differentially Established Liver Metastasis Models.</a> Anticancer Research. 34, 3321-3328 (2014).</li>
<li>Giraud, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progastrin+production+transitions+from+Bmi1%2B%2FProx1%2B+to+Lgr5high+cells+during+early+intestinal+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Progastrin production transitions from Bmi1+/Prox1+ to Lgr5high cells during early intestinal tumorigenesis.</a> Translational Oncology. 14, (2020).</li>
<li>Xu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+Evaluation+of+a+Novel+Size+Based+Circulating+Tumor+Cell+Isolation+System%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimization and Evaluation of a Novel Size Based Circulating Tumor Cell Isolation System.</a> PLoS One. 10, 0138032(2015).</li>
<li>Beije, N., Jager, A., Sleijfer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cell+enumeration+by+the+CellSearch+system%3A+the+clinician%27s+guide+to+breast+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cell enumeration by the CellSearch system: the clinician's guide to breast cancer treatment.</a> Cancer Treatment Reviews. 41, 144-150 (2015).</li>
<li>Karabacak, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic%2C+marker-free+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic, marker-free isolation of circulating tumor cells from blood samples.</a> Nature Protocols. 9, 694-710 (2014).</li>
<li>Ozkumur, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inertial+Focusing+for+Tumor+Antigen-Dependent+and+-Independent+Sorting+of+Rare+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inertial Focusing for Tumor Antigen-Dependent and -Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells.</a> Science Translational Medicine. 5, (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych sprzecznych interesów, które mogliby ujawnić.

Opisany powyżej protokół był początkowo stosowany do charakterystyki funkcjonalnej CTC jelita grubego, ale może być stosowany w przypadku innych rodzajów raka, takich jak rak piersi i może być dostosowany do modeli mysich.
Prawdziwym czynnikiem ograniczającym jest liczba CTC obecnych w próbce krwi oraz skuteczność techniki zastosowanej do ich izolacji i namnażania. Opisano kilka technik izolacji CTC w oparciu o specyficzne właściwości CTC, takie jak Parsortix, urządzenie mikroprzepływowe, któr...

Pomimo ostatnich postępów we wczesnej diagnostyce raka i strategii terapeutycznej, ponad dziewięćdziesiąt procent zachorowalności na raka jest nadal spowodowane przerzutami1. Proces przerzutowy to wieloetapowa kaskada, która rozpoczyna się od miejscowego oderwania komórek od guza pierwotnego i ich wejścia do krwiobiegu, gdzie stają się krążącymi komórkami nowotworowymi (CTC), aby ostatecznie skolonizować odległe miejsca, takie jak wątroba i płuca, w przypadku raka jelita grubego (CRC)2. Ostatnio coraz częściej zwraca się uwagę na biopsje płynne, które są nieinwazyjnym narzędziem do wykrywania i liczenia CTC w próbkach krwi pacjentów. Niejednorodność genetyczna wewnątrz guza jest główną przyczyną oporności na leki; W związku z tym wyizolowanie reprezentatywnych komórek z materiału nowotworowego stanowi obiecujące narzędzie dla medycyny spersonalizowanej3.
Pomimo niskiej częstości występowania CTC we krwi (1 CTC na 106 - 107 leukocytów)4, opracowano kilka technik wykrywania i izolacji w oparciu o różnice w właściwościach między CTC a innymi składnikami krwi5. Sama liczba CTC w próbkach krwi pacjenta może dostarczyć informacji o stadium złośliwości, odpowiedzi na leczenie i postępie choroby6,7. W związku z tym izolacja CTC jest kluczowym narzędziem w badaniach translacyjnych w celu oceny heterogeniczności genetycznej lub przeprowadzania badań przesiewowych leków, a także w badaniach podstawowych w celu scharakteryzowania tych inwazyjnych komórek, ponieważ są one kluczowymi aktorami indukcji przerzutów8,9. Rzeczywiście, w porównaniu z komercyjnie ustalonymi liniami komórek rakowych, które z czasem zgromadziły tysiące mutacji, świeże CTC mają główne cechy pierwotnego guza pierwotnego, w tym silną zdolność do przerzutów, i są lepszym odzwierciedleniem choroby. Cechy te sprawiają, że są one solidnym narzędziem do badań podstawowych, zwłaszcza w eksperymentach z nokautem przewidywanych kluczowych czynników zaangażowanych w przerzuty. Wyniki tych eksperymentów można zweryfikować in vivo na myszach, jak opisano poniżej.
Po wyizolowaniu CTC, mogą one być rozwijane w warunkach hodowli nieprzylegającej, a następnie mogą być manipulowane tak jak każda dostępna linia komórek rakowych, tzn. mogą być równie dobrze hodowane w warunkach przylegających lub osadzone w Matrigel, w zależności od pytania naukowego10. Na przykład, aby przetestować ekspresję i lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania, kulki CTC mogą być hodowane w stanie zawiesiny i osadzone w Histogel w celu przeprowadzenia immunofluorescencji na odcinkach kuli. Ponadto, jeśli białko jest błoniaste, jego ekspresję na żywych komórkach można zmierzyć za pomocą cytometrii.
Do badań funkcjonalnych, w celu sprawdzenia roli interesującego białka, które może odgrywać rolę w kolonizacji wątroby, CTC z genami edytowanymi przez shRNA lub CRISPR/Cas9 można wstrzyknąć do śledziony myszy z niedoborem odporności. Ten ostatni eksperyment jest potężnym modelem naśladującym kolonizację przerzutów do wątroby11.
Zdolność CTC do inicjowania nowotworów może być oceniona poprzez wstrzyknięcie bardzo małej liczby komórek myszom z niedoborem odporności. Ponieważ inicjacja guza jest cechą charakterystyczną rakowych komórek macierzystych (CSC), test ten wskaże procent CSC w liniach CTC. Ten fenotyp komórek macierzystych sprawia, że krążące linie komórek nowotworowych są odporne na niektóre złote standardy terapii przeciwnowotworowych. Rozszerzone CTC mogą być zatem wykorzystywane do badań przesiewowych leków i określania najlepszego potencjalnego skutecznego leczenia dla pacjenta; Odpowiedź CTC na leczenie można badać in vitro, na przykład za pomocą testu żywotności luminescencji.
W perspektywie długoterminowej, badania przesiewowe leków na świeżo wyizolowanych i amplifikowanych CTC mogłyby być wykorzystane jako nowe narzędzie dla medycyny spersonalizowanej, aby pomóc w wyborze najbardziej efektywnego i dostosowanego leczenia dla pacjentów.
W niniejszym artykule szczegółowo opisane są protokoły hodowli linii CTC, barwienia określonych białek za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii, przeprowadzania testów cytotoksyczności, a także eksperymentów in vivo z ksenoprzeszczepami z CTC.

<table><tbody><tr><td>Rozwiązanie Accumax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7089</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F-12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Test żywotności komórek luminescencyjnych</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Matryca membrany podstawnej</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Costar 24-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment Wielokrotne Płytki studzienne,</td> <td>Corning</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>Histiogel Specimen Medium</td><td>LabStorage</td><td>HG-4000</td><td></td></tr><tr><td>Human EGF, premium klasa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>Human FGF-2, premium klasa</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-564</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (200 mM)</td> <td>Gibco</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Suplement</td><td>Gibco</td><td></td><td></td>17502048</tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr></tbody></table>

krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Circulating Tumor Cell Lines: an Innovative Tool for Fundamental and Translational Research

Przerzuty są główną przyczyną zgonów z powodu raka. Pomimo poprawy strategii leczenia, rak z przerzutami ma złe rokowanie. Stoimy zatem przed pilną potrzebą zrozumienia mechanizmów stojących za powstawaniem przerzutów, a tym samym zaproponowania skutecznych metod leczenia zaawansowanego nowotworu. Nowotwory z przerzutami są trudne do leczenia, ponieważ biopsje są inwazyjne i niedostępne. Ostatnio pojawiło się duże zainteresowanie płynnymi biopsjami, w tym zarówno krążącym bezkomórkowym kwasem dezoksyrybonukleinowym (DNA), jak i krążącymi komórkami nowotworowymi z krwi obwodowej, a my ustaliliśmy kilka krążących linii komórek nowotworowych od pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego, aby wziąć udział w ich charakterystyce. Rzeczywiście, aby funkcjonalnie scharakteryzować te rzadkie i słabo opisane komórki, kluczowym krokiem jest ich ekspansja. Po ustaleniu, krążące linie komórek nowotworowych (CTC) mogą być następnie hodowane w warunkach zawiesiny lub przylegania. Na poziomie molekularnym linie CTC mogą być dalej wykorzystywane do oceny ekspresji określonych markerów będących przedmiotem zainteresowania (takich jak różnicowanie, nabłonkowe lub nowotworowe komórki macierzyste) za pomocą analizy immunofluorescencyjnej lub cytometrycznej. Ponadto linie CTC mogą być wykorzystywane do oceny wrażliwości leków na chemioterapię o najwyższym standardzie, a także na terapie celowane. Zdolność linii CTC do inicjowania nowotworów można również przetestować poprzez podskórne wstrzyknięcie CTC myszom z niedoborem odporności.
Wreszcie, możliwe jest przetestowanie roli konkretnych genów, które mogą być zaangażowane w rozprzestrzenianie się raka, poprzez edycję genów CTC, za pomocą krótkiego kwasu rybonukleinowego (shRNA) lub Crispr/Cas9. Zmodyfikowane CTC mogą być zatem wstrzykiwane do śledziony myszy z niedoborem odporności, aby eksperymentalnie naśladować część procesu rozwoju przerzutów in vivo.
Podsumowując, linie CTC są cennym narzędziem dla przyszłych badań i medycyny spersonalizowanej, gdzie pozwolą przewidzieć skuteczność leczenia przy użyciu tych samych komórek, które są pierwotnie odpowiedzialne za przerzuty.

Ekspresja zarówno EpCAM, jak i CD26, zaobserwowana odpowiednio w IF (Rysunek 1A panel prawy) oraz FACS (Rysunek 1B), wskazuje, że linia CTC ma charakter nabłonkowy i wykazuje jedną z cech charakterystycznych CSC10. Tę cechę nabłonkową można dalej scharakteryzować poprzez barwienie przeciwciałami skierowanymi przeciwko innym markerom nabłonkowym i mezenchymalnym. Dzięki temu możliwe byłoby przybliżone określenie miejsca li...

Hodowla CTC pozwala na głębszą funkcjonalną charakterystykę raka, poprzez badanie specyficznej ekspresji markerów oraz ocenę oporności na leki i zdolności do kolonizacji wątroby. Ogólnie rzecz biorąc, hodowla CTC może być obiecującym narzędziem klinicznym dla medycyny spersonalizowanej w celu poprawy wyników leczenia pacjentów.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Metastasis is a leading cause of cancer death. Despite improvements in treatment strategies, metastatic cancer has a poor prognosis. We thus face an ...

Przerzuty są główną przyczyną zgonów związanych z rakiem. Zjawisko to występuje, gdy komórki rakowe odłączają się od guza pierwotnego, przechodzą do krążenia krwi, aby w końcu dotrzeć do odległego narządu docelowego. Gdy te oderwane komórki dostaną się do krwi, nazywamy je wtórnymi komórkami nowotworowymi.Stanowią one zmienny materiał, ponieważ z jednej strony są głównym winowajcą powstawania przerzutów, a z drugiej strony są łatwiejsze niż biopsje guza. Rzeczywiście, można je pobrać za pomocą prostego nakłucia krwi. Pomimo niewielkiej liczby tych komórek w próbce krwi, jesteśmy pierwszymi, którzy ustalili kilka krążących linii komórek nowotworowych z krwi pacjenta z większym niepokojem przy użyciu warunków kontrolowanych 3D.Ta linia komórkowa może być używana na dowolnej komercyjnej linii komórkowej do rutynowych eksperymentów. Na przykład do genetycznych badań przesiewowych leków, do białka będącego przedmiotem zainteresowania, ale także do eksperymentu in vivo w celu zbadania zdolności do inicjacji guza i ich potencjału przerzutowego. CTC, czyli krążące linie komórek nowotworowych, powinny być hodowane w warunkach 3D w niedotlenieniu.Gdy CTC utworzy kulki, możemy umieścić je w pożywce i odwirować przez pięć minut przy 300 RCF. Odrzucić supernatant i dodać 500 mikrolitrów Accumax. Zawieszamy jeden i inkubujemy roztwór 20 minut w temperaturze 37 stopni.Następnie umyj zdysocjowane kulki PBS i osadź komórki. Ponownie zawiesić osad za pomocą świeżo uzupełnionego DMEM / F12 i zobaczyć komórki w gęstości pięciu komórek na mikrolitr w nowej płytce 24 Low Attachment. Kulki wirówkowe CTC eliminują supernatant i dwukrotnie przemłukują osad PBS.W 500 mikrolitrach PFE dobrze wymieszaj i inkubuj probówkę na lodzie przez 20 minut. Następnie odwirować stałe kulki i dwukrotnie przemyć osad PBS, eliminując maksymalną objętość PBS i dodać 20 mikrolitrów uformowanego HistoGel. Weź go do zawiesiny i zrób kropelkę na wazonie hodowlanym, pozostaw do wyschnięcia na 10 minut i odłącz za pomocą skalpela.Możesz teraz przetwarzać w dowolny sposób, aby CTC były ukierunkowane na pożądane białko będące przedmiotem zainteresowania. Zbierz CTC i odłącz sfery od Accumax, jak opisano wcześniej. Wyeliminuj Accumax i ponownie zasmów osad trzema ml buforu blokującego i przenieś zawiesinę przez sitko do komórek o średnicy 14 mikrometrów, aby uzyskać roztwór jednokomórkowy.Policz komórki i wyślij do probówek i dodaj objętość 200 000 komórek, odwiruj probówki i odrzuć supernatant. Zgodnie z kartą charakterystyki przeciwciał dodać do probówki żądaną objętość przeciwciała, a do innej probówki jego izotyp i kontynuować czynności zgodnie ze wskazówkami producenta. Pozostała tuba nie zostanie oznaczona, a w tym eksperymencie zdecydowanie sugeruje się wykorzystanie rynku rentowności.Na cytometrze zacznij od nieoznakowanej rurki, aby ustawić napięcie w ujemnie oznaczonym obszarze. Następnie umieść probówkę z izotypem. Izotyp służyłby jako kontrola ujemna w celu rozróżnienia sygnału dodatniego od sygnału niespecyficznego.I zakończ eksperyment z oznakowanymi komórkami z przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania, w których powinieneś zobaczyć przesunięcie w pozytywnie znakowanej bramce, jeśli białko będące przedmiotem zainteresowania ulega ekspresji. Powoduje to zawieszenie zdysocjowanych CTC w uzupełnionej pożywce o gęstości 200 000 komórek na ml. W nasadce Ultra Low 96, płytce dołkowej, uszczelnij objętość 50 mikrolitrów i inkubuj płytkę przez 24 godziny w niedotlenieniu.Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów badanego leku o różnym stężeniu i dodaj taką samą objętość DMEM/F12 tylko w celu dalszego określenia podstawy żywotności komórkowej i inkubacji płytki przez kolejne 48 godzin. W trzecim dniu rozpuść środek i dodaj 70 mikrolitrów mieszanki do każdej studzienki. Umieść płytkę na wytrząsarce orbitalnej na 20 minut, a następnie zmierz luminescencję.Test ten jest użytecznym narzędziem do testowania dużej liczby leków w celu oceny ich wpływu na wzrost komórek CTC. W Eppendorf ponownie zawiesić komórki w 100 mikrolitrach PBS, uszczypnąć skórę z tyłu myszy i wprowadzić igłę pod skórę. Wstrzykuj powoli całą objętość w to samo miejsce i monitoruj wzrost guza co drugi dzień i składaj myszy, jeśli guz przekroczył rozmiar 1,5 centymetra sześciennego.Przed zabiegiem należy wstrzyknąć podskórnie środek przeciwbólowy w grzbietowo-brzuszną stronę myszy, wykonać małe nacięcie poniżej 10. żebra. Delikatnie wyjmij śledzionę i połóż ją na sterylnej gazie. Za pomocą strzykawki insulinowej wstrzyknąć 50 mikrolitrów zawieszonych CTC w PBS i odczekać trzy minuty bez wyjmowania igły.Podwiązać naczynie tętnicze z jednej strony, a naczynie naczyniowe z drugiej strony. Następnie usuń śledzionę, przecinając bezpośrednio nad dwoma ligaturami. Zszyj otrzewną brzuszną i skórę i dobrze zdezynfekuj ten obszar.Celem tego eksperymentu jest przetestowanie zdolności CTC pochodzących od pacjenta z rakiem jelita grubego do kolonizacji wątroby poprzez wywołanie, widocznego przewidywania przerzutowego. Wyizolowanie i ustalenie klinicznej linii komórek nowotworowych jest nowym narzędziem zarówno w badaniach podstawowych, jak i translacyjnych. Na przykład, jeśli masz gen będący przedmiotem zainteresowania, w przypadku którego badania in vivo wykazały, że gen ten jest zaangażowany w migrację i zdolność inwazji linii komórkowych raka jelita grubego, wyeliminowanie tego genu w krążących liniach komórek nowotworowych przed wstrzyknięciem do śledziony myszy, aby umożliwić im kolonizację wątroby, może być dobrym narzędziem do potwierdzenia wyniku in vivo.W przypadku badań translacyjnych naszą główną perspektywą izolowania krążących linii komórek nowotworowych jest wykorzystanie tego cennego materiału w medycynie spersonalizowanej. Z próbek krwi pacjenta izolowalibyśmy i amplifikowali CTC w hodowli przez dwa lub trzy tygodnie, aby mieć wystarczającą ilość materiału do przesiewu dostępnego panelu leków i oceny jego cytotoksyczności, aby ostatecznie przypisać

circulating-tumor-cell-lines-an-innovative-tool-for-fundamental

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Krążące komórki nowotworowe są izolowane z krwi pacjentów onkologicznych bez powodowania uszkodzeń komórkowych. Izolacja komórek nowotworowych jest realizowana przy użyciu bimolekularnej powierzchni E-selectiny oraz przeciwciał przeciwko markerom nabłonkowym. Powłoka z nanorurek specyficznie wspomaga adhezję komórek rakowych, co skutkuje wysoką czystością wychwytu.

Szybka izolacja żywych krążących komórek nowotworowych z próbek krwi pacjentów

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Krążące komórki nowotworowe (CTC) są prognostyczne w kilku nowotworach przerzutowych. Ten manuskrypt opisuje złoty standard systemu CellSearch (CSS) platformy wyliczania CTC i zwraca uwagę na typowe błędy błędnej klasyfikacji. Ponadto opisano dwa dostosowane protokoły do definiowanej przez użytkownika charakterystyki markerów CTC i liczenia CTC w przedklinicznych mysich modelach przerzutów przy użyciu tej technologii.

Adaptacja półautomatycznych testów na krążące komórki nowotworowe (CTC) do zastosowań klinicznych i przedklinicznych

Wykazano, że Wykazano, że krążące komórki nowotworowe (CTC) odgrywają ważną rolę w przerzutach nowotworowych. W tym miejscu opisano metodę izolacji i namnażania CTC z krwi pełnej syngenicznego modelu guza myszy z przerzutami raka wątrobowokomórkowego (HCC).

Izolacja i rozmnażanie krążących komórek nowotworowych z mysiego modelu raka

Przedstawiono protokół wykorzystania mikrofiltra pokrytego poli(N-izopropylolakrylamidem) (PIPAAm) do skutecznego wychwytywania i termoresponsywnego uwalniania żywotnych krążących komórek nowotworowych (CTC). Metoda ta umożliwia wychwycenie CTC z krwi pacjenta, a następnie uwolnienie żywego CTC do dalszej hodowli poza chipem, analiz i charakterystyki.

Wychwytywanie i uwalnianie żywotnych krążących komórek nowotworowych z krwi

Opisujemy powstawanie ortotopowych guzów jelita grubego poprzez wstrzykiwanie komórek nowotworowych lub organoidów do jelita ślepego myszy i późniejszą izolację krążących komórek nowotworowych (CTC) z tego modelu.

Izolacja krążących komórek nowotworowych w ortotopowym mysim modelu raka jelita grubego

Tutaj prezentujemy zintegrowany przepływ pracy w celu identyfikacji cech fenotypowych i molekularnych, które charakteryzują krążące komórki nowotworowe (CTC). Łączymy barwienie immunologiczne na żywo i mikromanipulację mikromanipulacją pojedynczych i grupowanych CTC z technikami opartymi na pojedynczych komórkach do dalszej analizy i oceny zdolności do wysiewu przerzutów.

Mikromanipulacja krążącymi komórkami nowotworowymi w celu dalszej analizy molekularnej i oceny potencjału przerzutowego

Obecny protokół opisuje generowanie modeli hodowli 3D guzów z pierwotnych komórek nowotworowych i ocenę ich wrażliwości na leki za pomocą testów żywotności komórek i badań mikroskopowych.

Ustalanie trójwymiarowych sferoid na podstawie próbek guza pochodzących od pacjentów i ocena ich wrażliwości na leki

Kliniczny chip mikroprzepływowy jest ważną techniką analizy biomedycznej, która upraszcza wstępne przetwarzanie próbek krwi pacjenta klinicznego i immunofluorescencyjnie barwi krążące komórki nowotworowe (CTC) in situ na chipie, umożliwiając szybkie wykrycie i identyfikację pojedynczego CTC.

Kliniczna mikroprzepływowa platforma chipowa do izolacji wszechstronnych krążących komórek nowotworowych

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Poznaj metody izolacji i hodowli krążących komórek nowotworowych z krwi pacjentów z rakiem jelita grubego. Techniki te umożliwiają badania przesiewowe leków oraz modelowanie metastaz in vivo.

Krążące linie komórek nowotworowych: innowacyjne narzędzie do badań podstawowych i translacyjnych

Przeglądaj więcej filmów