Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Aby zbadać aspekty biologiczne brunatnej tkanki tłuszczowej, konieczne jest oczyszczenie oczyszczonej brunatnej tkanki tłuszczowej. Obecnie nie ma brązowego oczyszczania wielkości tkanki tłuszczowej i masy są dostępne. W tym badaniu opracowaliśmy prosty protokół, aby rozwiązać ten problem.

Teraz do tego protokołu wymagana jest jedna umiejętność. Wymaga znacznie mniej materiałów badawczych niż inne metody, a oczyszczona brązowa tkanka tłuszczowa może być bezpośrednio wykorzystana do analizy ekspresji genów i białek. Protokół ten zapewnia nową metodę badania biologii klasycznej wielkości brązowej tkanki tłuszczowej.

Może być również stosowany do badania procesu brązowienia białych adipocytów. Procedurę zademonstruje Amanda, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Rozpocząć od umieszczenia kolby z BAT i roztworem wytrawiającym na mieszadle magnetycznym z prędkością 60 obrotów na minutę w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na 30 minut.

Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra należy rozbić zagregowane grudki tkanek plasterków BAT wokół pręta mieszadła. Po roztrawieniu umieść filtr siatkowy o średnicy 70 mikrometrów na czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i odpipetuj około czterech mililitrów zawiesiny komórek przez sitko. Następnie umyj go czterema mililitrami 12% roztworu jodu.

Pipetować w górę iw dół, aby wymieszać komórki z roztworem jodiksanolu, a następnie przenieść mieszaninę komórek do dwóch przezroczystych pięciomililitrowych probówek z polistyrenu. Umieść rurki polistyrenowe zawierające mieszaninę komórek na lodzie na jedną godzinę, powodując, że BA utworzą warstwę na wierzchu. Wyjmij 20 mikrolitrów wyizolowanych BA do badania mikroskopowego.

W celu izolacji RNA i białka należy pipetować warstwę BA do dwóch 1,7 mililitrowych probówek mikrocentrycznych. Następnie ostrożnie usuń nadmiar roztworu jodu, nie naruszając warstwy BA. Następnie dodaj jeden mililitr TRIzolu do roztworu komórkowego, aby jednocześnie wyizolować RNA, DNA i białko i wymieszać wystarczająco dużo, aby utrzeć komórki.

Aby rozdzielić fazy, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i odwiruj do probówki o stężeniu 9,981 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu użyj fazy wodnej do izolacji RNA. Przenieś 300 mikrolitrów fazy organicznej do dwumililitrowej probówki mikrowirówki i dodaj 750 mikrolitrów 100% etanolu.

Po wirowaniu przez 10 sekund dodaj 200 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu i ponownie wiruj przez 10 sekund. Dodaj 600 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody przed wirowaniem przez 10 sekund. Odstawić zmieszany roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu dodawać 9 981 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Fazy zostaną oddzielone fazą białkową zlokalizowaną w środkowej warstwie. Usuń górny roztwór wodny i dodaj jeden mililitr 100% etanolu do pozostałego roztworu.

Po odwirowaniu w temperaturze 9,981 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant i przemyć osad jednym mililitrem 100% etanolu. Wirować w temperaturze 9 981 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu wysuszyć osad na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zmierzyć wagę mokrego osadu.

Dodaj 1% roztwór SDS w proporcji 20 mikrolitrów na miligram granulki. Całkowicie rozpuść osad, umieszczając probówkę w rozgrzanym shakerze o temperaturze 55 stopni Celsjusza i 11 G na pięć do 10 minut. W protokole PBS zawierający 3%BSA został wykorzystany do oddzielenia BA od BAT.

Wyizolowane komórki miały kształt maliny z wielopunktowymi kropelkami lipidów w środku i były tdTom dodatnie, co potwierdzało, że były to BA. Białko wyizolowano z BA za pomocą ulepszonego protokołu GTPC, a następnie zbadano za pomocą żelu SDS-PAGE. W próbce BA zaobserwowano dominujące prążki związane z BSA, co sugeruje jego ingerencję w ekstrakcję białek.

Aby uniknąć interferencji BSA, do izolacji BA użyto 6% roztworu jodu, który miał typowy malinowy kształt i zawierał wielopunktowe kropelki lipidów. Białka wyekstrahowane z tych BA zostały dobrze oddzielone w żelu SDS-PAGE. Okazało się, że komórki te są tdTomato dodatnie, podczas gdy komórki odzyskane z osadu były tdTomato ujemne bez widocznych kropelek lipidów, co sugeruje skuteczne oddzielenie BA od komórek beztłuszczowych.

W analizie ekspresji genów poziomy mRNA UCP1 i PDGFA były znacznie wyższe w izolowanych BA. Ale mRNA PDGFRA zostało wykryte tylko w BAT. Stwierdzono, że białko UCP1 jest wzbogacone w izolowane BA.

EDGFR alfa wykryto w BAT, ale nie w izolowanych BA. Wyniki te potwierdzają skuteczność metody izolowania BA i pokazują, że wyizolowane BA nadają się do badań nad ekspresją genów i białek. Próbując tego protokołu, użyj świeżego buforu trawiennego, aby zdysocjować brązową tkankę tłuszczową i uniknąć tworzenia się grudek tkanek w okresie trawienia.

Ta nowa metoda ułatwia badanie biologii brunatnej tkanki tłuszczowej na poziomie pojedynczego krana komórkowego. Stosując tę metodę, można przeprowadzić badania ekspresji GN i białka za pomocą czystych brązowych adipocytów, precyzyjnie precyzyjnie preparując program ekspresji genów brązowych adipocytów, nie martwiąc się o zanieczyszczenie pochodzące pierwotnie z komórek beztłuszczowych.