Name: Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji brązowych adipocytów z tkanki tłuszczowej myszy przy użyciu trawienia enzymatycznego i jodixanolu. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji genów i białek bez zanieczyszczeń.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z. Lin był wspierany przez fundusze National Institutes of Health HL138454-01 i Masońskiego Instytutu Badań Medycznych.

Wszystkie myszy były utrzymywane w warunkach wolnych od patogenów, a wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Masoński Komitet ds. Badań Medycznych i Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). UCP1::Cre9 i Rosa 26tdTomato mysze lines13 zostały zgłoszone wcześniej. Wszystkie myszy utrzymywano w temperaturze pokojowej z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.
1. Przygotowanie roztworów i brunatna tkanka tłuszczowa (BAT)
<ol>
	<li>Przygotować roztwór do wytrawiania i separacji w probówkach wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
	<li>10 ml roztworu do wytrawiania BAT: Do 10 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dodać 3,5 mg/ml dypazy II, 1 mg/ml kolagenazy II i 10 mM CaCl2, aby uzyskać roztwór do wytrawiania BAT.</li>
	<li>10 ml 12% roztworu jodiksanolu (roztwór do separacji): Wymieszaj 1 ml 10x PBS, 2 ml 60% jodiksanolu, 0,01 ml 1 M MgCl2, 0,025 ml 1 M KCl, 0,1 ml 0,2 M kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i 6,865 ml ddH2O, aby uzyskać 12% jodiksanolu.</li>
	<li>Poddaj eutanazji jedną dorosłą mysz z powodu przedawkowania CO2. Krótko napełnij klatkę myszy 100% CO2 przy szybkości przemieszczania 10-30% objętości klatki na minutę 5 minut później, potwierdź śmierć, sprawdzając, czy nie ma widocznego oddechu.</li>
	<li>Wypreparuj zwierzę i zbierz międzyłopatkowy BAT. Usuń warstwy WAT i mięśni pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Aby uzyskać wystarczające roztrawienie, należy pokroić każdy płat BAT na części o wielkości ~ 3 mm3 i umieścić je w czystej kolbie o pojemności 50 ml z metalowym mieszadłem i 5 ml roztworu do wytrawiania. Przed rozpoczęciem mineralizacji pozostawić kolbę zawierającą BAT i bufor do mineralizacji na lodzie przez 1 godz. 
	UWAGA: W kolejnych krokach do izolacji brązowych adipocytów użyto około 80 mg BAT.</li>
</ol>
2. Procedura izolacji BA
<ol>
	<li>Umieścić kolbę na mieszadle magnetycznym, które jest zamknięte w inkubatorze. Ustawić prędkość mieszania odpowiednio na 60 obr./min i temperaturę inkubatora na 35 °C. Trawienie trwa około 30 minut. Jeżeli podczas trawienia plastry BAT tworzą grudki wokół pręta mieszadła, należy użyć końcówki pipety o pojemności 1 ml w celu rozerwania zagregowanych tkanek.</li>
	<li>Umieść filtr siatkowy o pojemności 70 μm na czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Odpipetować około 4 ml zawiesiny komórek przez sitko. Umyj sitko 4 ml 12% roztworu jodiksanolu. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać komórki i roztwór jodiksanolu. Przenieś mieszaninę komórek do dwóch przezroczystych probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml. 
	UWAGA: Pod koniec trawienia roztwór trawiący powinien być mętny, co wskazuje na wystarczające trawienie. Za każdym razem używaj świeżego roztworu do trawienia. Raz przygotowany roztwór do wytrawiania należy zużyć w ciągu 2 godzin.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 2.2 i 2.3 jeszcze raz, jeśli trawienie nie jest wystarczające.</li>
	<li>Pozostawić przezroczyste probówki z polistyrenu zawierające roztwór rozdzielający i BA na lodzie na 1 godzinę. BA utworzą warstwę na górze.</li>
	<li>Pobrać 20 μl wyizolowanych BA do badania mikroskopowego.</li>
</ol>
3. Izolacja RNA i białek z BA
<ol>
	<li>Odpipetować warstwę BA do dwóch probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml w celu izolacji RNA i białka. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu jodiksanolu, nie naruszając warstwy BAs.</li>
	<li>Dodaj 1 ml Trizolu, aby jednocześnie wyizolować RNA, DNA i białko do roztworu komórkowego. Wymieszaj tyle, aby komórki uległy lizie.</li>
	<li>Dodać 200 μl chloroformu, aby oddzielić fazy.</li>
	<li>Odwirować probówkę o stężeniu 9,981 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu użyj fazy wodnej do izolacji RNA. W tym badaniu do odwrotnej transkrypcji wykorzystano całkowite RNA, a ilościowy RT-PCR przeprowadzono za pomocą Real-Time PCR. Sekwencje podkładów są wymienione w Tabeli materiałów.</li>
	<li>Przenieść 300 μl fazy organicznej do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Do fazy organicznej dodaj 2,5 objętości 100% etanolu i wiruj przez 10 s.</li>
	<li>Dodaj 200 μl 1-bromo-3-chloropropanu i wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Dodaj 600 μl podwójnie destylowanej wody i wiruj przez 10 sekund.</li>
	<li>Odstawić zmieszany roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Wirować przy 9,981 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie fazy zostaną rozdzielone. Faza białkowa jest zlokalizowana w środkowej warstwie.</li>
	<li>Usuń górny roztwór wodny. Do pozostałego roztworu dodać 1 ml 100% etanolu.</li>
	<li>Wirować przez 10 min, 9 981 x g, 4 °C. Po odwirowaniu utworzy się osadek białka. Odrzucić supernatant.</li>
	<li>Umyj granulki 1 ml 100% etanolu.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut, 9981 x g, 4 °C. Zachować osad i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Suszyć granulat na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zmierz wagę mokrego granulatu. Dodać 1% roztwór SDS w proporcji 20 μL/mg granulki.</li>
	<li>Rozpuść osad, wkładając rurkę do rozgrzanego shakera. Ustaw temperaturę na 55 °C, a prędkość na 11 x g. Całkowite rozpuszczenie granulki białka zajmuje zwykle 5-10 minut. 
	UWAGA: Stężenie rozpuszczonego białka można zmierzyć za pomocą testu BCA14.</li>
</ol>

<ol><li>Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical%2C+physiological%2C+and+functional+diversity+of+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue.</a> Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).</li>
<li>Symonds, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Scientifica%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue growth and development.</a> Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).</li>
<li>Giralt, M., Villarroya, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White%2C+brown%2C+beige%2Fbrite%3A+Different+adipose+cells+for+different+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions.</a> Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).</li>
<li>Cannon, B., Nedergaard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+adipose+tissue%3A+function+and+physiological+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Brown adipose tissue: function and physiological significance.</a> Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adipose+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Prostaglandins%2C+Leukotrienes+and+Essential+Fatty+Acids%22%5BJournal%5D)">The adipose organ.</a> Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).</li>
<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beige+adipocytes+are+a+distinct+type+of+thermogenic+fat+cell+in+mouse+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human.</a> Cell. 150, 366-376 (2012).</li>
<li>Cypess, A. M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brown+fat+as+a+therapy+for+obesity+and+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">Brown fat as a therapy for obesity and diabetes.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).</li>
<li>Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+adipose+tissue+in+development+and+metabolic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li>
<li>Kong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRF4+is+a+key+thermogenic+transcriptional+partner+of+PGC-1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α.</a> Cell. 158, 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+origins+of+cold-induced+brown+adipocytes+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice.</a> The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).</li>
<li>Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pivotal+role+of+PDGF+and+its+receptor+isoforms+in+adipose-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells.</a> Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).</li>
<li>Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+mouse+and+human+adipocytes+for+the+analysis+of+browning+and+cellular+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Report%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity.</a> Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).</li>
<li>Madisen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+simultaneous+isolation+of+proteins+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids.</a> Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).</li>
<li>Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodixanol%3A+A+nonionic+iso-osmotic+centrifugation+medium+for+the+formation+of+self-generated+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients.</a> Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).</li>
<li>Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+senescent+cells+by+iodixanol+%28OptiPrep%29+density+gradient-based+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation.</a> Cell Proliferation. 52, 12674(2019).</li>
<li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((versatile+manufacturing+of+recombinant+adeno-associated+viral+vectors+at+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale.</a> Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).</li>
<li>Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELi+protocol%3A+Optimization+for+protein+extraction+from+white%2C+brown%2C+and+beige+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues.</a> MethodsX. 6, 918-928 (2019).</li>
<li>Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invited+Review%3A+effects+of+heat+and+cold+stress+on+mammalian+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression.</a> Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).</li>
<li>Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+autonomous+myogenic+cell+populations+revealed+by+ablation+of+Myf5-expressing+cells+during+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis.</a> Development. 135, 1597-1604 (2008).</li>
</ol>

W ramach tego badania opracowano nową metodę izolowania BA do analizy ekspresji genów i białek.
W opublikowanym protokole izolacji BA zastosowano 3% roztwór BSA w celu wzbogacenia BA12. Niemniej jednak, wzbogacone BA osiągnięte przez ten opublikowany protokół nie mogły być bezpośrednio wykorzystane do analizy ekspresji białek. Dzieje się tak, ponieważ skoncentrowany BSA istniejący w roztworze BA zakłóca następującą ekstrakcję białka. Gdy BA wzbogacone w 3% roztwór BSA p...

Zarówno myszy, jak i ludzie mają dwa rodzaje tkanki tłuszczowej: białą tkankę tłuszczową (WAT) i brązową tkankę tłuszczową (BAT)1. WAT magazynuje energię w postaci trójglicerydów w białych adipocytach, a brązowe adipocyty (BA) BAT rozpraszają energię chemiczną w postaci ciepła2. W oparciu o ich pochodzenie rozwojowe, BA są dalej klasyfikowane jako klasyczne BA (cBA), które powstały podczas rozwoju zarodka i BA pochodzące z białych adipocytów (komórki beżowe/brite, przekształcone z białych adipocytów w warunkach stresu)<klasa sup = 'xref'>3. BA są wielomiejscowe i wyrażają białko termogeniczne rozprzęgające białko 1 (UCP1)4. Magazyn międzyłopatkowy BAT (iBAT) jest jednym z głównych magazynów cBA u małych ssaków5, podczas gdy beżowe komórki są rozproszone w WAT6. 
Ze względu na ich naturę rozpraszania energii, BA cieszą się dużym zainteresowaniem jako cel terapeutyczny w celu zmniejszenia otyłości7. Aby wykorzystać BA do celów leczenia otyłości, konieczne jest zrozumienie mechanizmów molekularnych, które kontrolują funkcję, przeżycie i rekrutację BA. Tkanki tłuszczowe, w tym BAT i WAT, są niejednorodne. Oprócz adipocytów, tkanki tłuszczowe zawierają wiele innych typów komórek, takich jak komórki śródbłonka, mezenchymalne komórki macierzyste i makrofagi8. Chociaż dostępne są narzędzia genetyczne do specyficznego zubożania genów kandydujących u myszy BA, takie jak UCP1::Cre line9, techniki oczyszczania BA z BAT lub WAT są ograniczone, co utrudnia badanie BA na poziomie pojedynczej komórki. Ponadto, bez uzyskania czystych BA, relacje między BA i non-BA nie zostaną jasno określone. Na przykład receptor alfa płytkowego czynnika wzrostu (PDGFRα) został wykorzystany jako marker dla niezróżnicowanych komórek mezenchymalnych i ulega ekspresji w komórkach śródbłonka i śródmiąższu BAT. W BAT zestresowanym zimnem komórki progenitorowe PDGFRα dodatnie dają początek nowym BAs10. PDGFRα jest aktywowany przez swój ligand PDGF, czynnik wzrostu, który reguluje wzrost i proliferację komórek mezenchymalnych<klasa sup='xref'>11; jednak nie jest jasne, czy BA wpływają na zachowanie PDGFRα dodatnich komórek progenitorowych poprzez wydzielanie PDGF. 
Niedawno opublikowano protokół izolacji BAs, który opiera się na sortowaniu komórek aktywowanym fluorescencją (FACS)12. W tym protokole użyto 3% roztworu albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do oddzielenia BA od innych BA i wzbogaconych BA poddano dalszemu oczyszczaniu za pomocą FACS. Zastosowanie tego protokołu jest ograniczone wymogiem procesu FACS, który opiera się zarówno na sprzęcie, jak i doświadczeniach operacyjnych FACS. W ramach tego badania opracowano nowy protokół izolowania BA od BAT. BA wyizolowane za pomocą tego protokołu mogą być bezpośrednio wykorzystane do badań ekspresji genów i białek. Co więcej, dane z tego badania sugerują, że BA są głównym zasobem PDGF.

<table><tbody><tr><td><silne>Przeciwciała</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antygen</td><td>Firma</td><td>Katalog</td><td></td></tr><tr><td>PPAR&gamma;</td><td>LSBio</td><td>Ls-C368478</td><td></td></tr><tr><td>PDGFRa</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-398206</td><td></td></tr><tr><td>UCP1</td><td>R& System D</td><td>IC6158P</td><td></td></tr><tr><td>Chemical and solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenaza, typ II</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td></td></tr><tr><td>1-bromo-3-chloropropan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B62404</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)&nbsp;</td><td>Goldbio</td><td>A-421-10</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Bio Basic</td><td>CT1330</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>IBI Scientific</td><td>IB05040</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II, proteaza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5693</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>EB0107</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>IBI Scientific</td><td>IB15724</td><td></td></tr><tr><td>LiQuant Uniwersalny zielony qPCR Master Mix</td><td>LifeSct</td><td>LS01131905Y</td><td></td></tr><tr><td>Sześciowodny chlorek magnezu</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-855</td><td></td></tr><tr><td>OneScrip Plus Synteza cDNA SuperMix</td><td>ABM</td><td>G454</td><td></td></tr><tr><td>OptiPrep (jodiksanol)</td><td>Cosmo Bio USA</td><td>AXS-1114542</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL07</td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Caisson Labs</td><td>PBL06</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Boston BioProducts</td><td>P-1435</td><td></td></tr><tr><td>SimplyBlue bezpieczny barwnik</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol</td><td>Technologie życia</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Starters</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa genu (gatunek)&nbsp;</td><td>Do przodu</td><td>do tyłu</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfra (mysz)</td><td>CTCAGCTGTCTCCTCACACAgG</td><td>CAACGCATCTCAGAGAAAAGG</td><td></td></tr><tr><td>Pdgfa (Mysz)</td><td>TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG</td><td>TTGGCCACCTTGACACTGCG</td><td></td></tr><tr><td>36B4(Mysz)</td><td>TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC</td><td>TCTCCACAGACAATGCCAGGAC</td><td></td></tr><tr><td>Ucp1</td><td>ACTGCCACACCTCCAGTCATT</td><td>CTTTGCCTCACTCAGGATTGG</td><td></td></tr><<tr><td> silny>Sprzęt< / silny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa< / silny></td><td><silny>Firma< / silny></td><td><silny>Zastosowanie< / silny></td><td></td></tr><tr><td>Keyence BZ-X700</td><td>Keyence</td><td>Imaging brązowe adipocyty</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło magnetyczne</td><td>VWR</td><td>Disocjacja BAT</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Zastosowany system PCR w czasie rzeczywistym</td><td> Biosystem</td><td>Ilościowy PCR</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania Odyssey Fc</td><td>LI-COR</td><td>Western blot</td><td></td></tr></tbody></table>

izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Isolating Brown Adipocytes from Murine Interscapular Brown Adipose Tissue for Gene and Protein Expression Analysis

Brązowa tkanka tłuszczowa (BAT) jest odpowiedzialna za termogenezę bez dreszczy, a brązowe adipocyty (BA) są jednostkami funkcjonalnymi BAT. BA zawierają zarówno wielomiejscowe kropelki lipidów, jak i obfite mitochondria, a także wyrażają białko rozprzęgające 1 (UCP1). BA są podzielone na dwa podtypy w zależności od ich pochodzenia: klasyczne BA pochodzące z zarodków (cBA) i BA pochodzące z białych adipocytów. Ze względu na ich stosunkowo niską gęstość BA nie można wyizolować z BAT tradycyjną metodą wirowania. W tym badaniu opracowano nową metodę izolowania BA od myszy w celu analizy ekspresji genów i białek. W tym protokole BAT międzyłopatkowy od dorosłych myszy trawiono roztworem kolagenazy i dyspazy, a zdysocjowane BA wzbogacono 6% roztworem jodiksanalu. Wyizolowane BA poddano następnie lizie odczynnikiem Trizol w celu jednoczesnej izolacji RNA, DNA i białka. Po wyizolowaniu RNA do ekstrakcji białek wykorzystano fazę organiczną lizatu. Nasze dane wykazały, że 6% roztwór jodiksanolu skutecznie wzbogacił BA bez zakłócania dalszych badań ekspresji genów i białek. Płytkopochodny czynnik wzrostu (PDGF) jest czynnikiem wzrostu, który reguluje wzrost i proliferację komórek mezenchymalnych. W porównaniu z brunatną tkanką tłuszczową, izolowane BA miały znacznie wyższą ekspresję Pdgfa. Podsumowując, ta nowa metoda stanowi platformę do badania biologii brązowych adipocytów na poziomie pojedynczego typu komórki.

Przygotowanie BAT międzyłopatkowego do izolacji brązowych adipocytów 
Proces izolacji brązowych adipocytów (BAs) przedstawiono na Rysunku 1A. Cały proces, od przygotowania BAT i roztworów do trawienia/separacji po uzyskanie wyizolowanych BAs, zajmie około 4 h.
U dorosłych myszy w okolicy międzyłopatkowej występuje obfita BAT. Ta międzyłopatkowa BAT (iBAT) jest pokryta warstwami mięśni oraz WAT (Rysunek 1B). Przed r...

To badanie opisuje nową metodę izolowania mysich brązowych adipocytów do analizy ekspresji genów i białek.

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Brown adipose tissue (BAT) is responsible for non-shivering thermogenesis in mammals, and brown adipocytes (BAs) are the functional units of BAT. BAs ...

Aby zbadać aspekty biologiczne brunatnej tkanki tłuszczowej, konieczne jest oczyszczenie oczyszczonej brunatnej tkanki tłuszczowej. Obecnie nie ma brązowego oczyszczania wielkości tkanki tłuszczowej i masy są dostępne. W tym badaniu opracowaliśmy prosty protokół, aby rozwiązać ten problem.Teraz do tego protokołu wymagana jest jedna umiejętność. Wymaga znacznie mniej materiałów badawczych niż inne metody, a oczyszczona brązowa tkanka tłuszczowa może być bezpośrednio wykorzystana do analizy ekspresji genów i białek. Protokół ten zapewnia nową metodę badania biologii klasycznej wielkości brązowej tkanki tłuszczowej.Może być również stosowany do badania procesu brązowienia białych adipocytów. Procedurę zademonstruje Amanda, asystentka naukowa z mojego laboratorium. Rozpocząć od umieszczenia kolby z BAT i roztworem wytrawiającym na mieszadle magnetycznym z prędkością 60 obrotów na minutę w inkubatorze o temperaturze 35 stopni Celsjusza na 30 minut.Za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra należy rozbić zagregowane grudki tkanek plasterków BAT wokół pręta mieszadła. Po roztrawieniu umieść filtr siatkowy o średnicy 70 mikrometrów na czystej probówce wirówkowej o pojemności 50 mililitrów i odpipetuj około czterech mililitrów zawiesiny komórek przez sitko. Następnie umyj go czterema mililitrami 12% roztworu jodu.Pipetować w górę iw dół, aby wymieszać komórki z roztworem jodiksanolu, a następnie przenieść mieszaninę komórek do dwóch przezroczystych pięciomililitrowych probówek z polistyrenu. Umieść rurki polistyrenowe zawierające mieszaninę komórek na lodzie na jedną godzinę, powodując, że BA utworzą warstwę na wierzchu. Wyjmij 20 mikrolitrów wyizolowanych BA do badania mikroskopowego.W celu izolacji RNA i białka należy pipetować warstwę BA do dwóch 1,7 mililitrowych probówek mikrocentrycznych. Następnie ostrożnie usuń nadmiar roztworu jodu, nie naruszając warstwy BA. Następnie dodaj jeden mililitr TRIzolu do roztworu komórkowego, aby jednocześnie wyizolować RNA, DNA i białko i wymieszać wystarczająco dużo, aby utrzeć komórki.Aby rozdzielić fazy, dodaj 200 mikrolitrów chloroformu i odwiruj do probówki o stężeniu 9,981 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu użyj fazy wodnej do izolacji RNA. Przenieś 300 mikrolitrów fazy organicznej do dwumililitrowej probówki mikrowirówki i dodaj 750 mikrolitrów 100% etanolu.Po wirowaniu przez 10 sekund dodaj 200 mikrolitrów 1-bromo-3-chloropropanu i ponownie wiruj przez 10 sekund. Dodaj 600 mikrolitrów podwójnie destylowanej wody przed wirowaniem przez 10 sekund. Odstawić zmieszany roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej.Po odwirowaniu dodawać 9 981 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Fazy zostaną oddzielone fazą białkową zlokalizowaną w środkowej warstwie. Usuń górny roztwór wodny i dodaj jeden mililitr 100% etanolu do pozostałego roztworu.Po odwirowaniu w temperaturze 9,981 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odrzucić supernatant i przemyć osad jednym mililitrem 100% etanolu. Wirować w temperaturze 9 981 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po usunięciu supernatantu wysuszyć osad na powietrzu przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zmierzyć wagę mokrego osadu.Dodaj 1% roztwór SDS w proporcji 20 mikrolitrów na miligram granulki. Całkowicie rozpuść osad, umieszczając probówkę w rozgrzanym shakerze o temperaturze 55 stopni Celsjusza i 11 G na pięć do 10 minut. W protokole PBS zawierający 3%BSA został wykorzystany do oddzielenia BA od BAT.Wyizolowane komórki miały kształt maliny z wielopunktowymi kropelkami lipidów w środku i były tdTom dodatnie, co potwierdzało, że były to BA. Białko wyizolowano z BA za pomocą ulepszonego protokołu GTPC, a następnie zbadano za pomocą żelu SDS-PAGE. W próbce BA zaobserwowano dominujące prążki związane z BSA, co sugeruje jego ingerencję w ekstrakcję białek.Aby uniknąć interferencji BSA, do izolacji BA użyto 6% roztworu jodu, który miał typowy malinowy kształt i zawierał wielopunktowe kropelki lipidów. Białka wyekstrahowane z tych BA zostały dobrze oddzielone w żelu SDS-PAGE. Okazało się, że komórki te są tdTomato dodatnie, podczas gdy komórki odzyskane z osadu były tdTomato ujemne bez widocznych kropelek lipidów, co sugeruje skuteczne oddzielenie BA od komórek beztłuszczowych.W analizie ekspresji genów poziomy mRNA UCP1 i PDGFA były znacznie wyższe w izolowanych BA. Ale mRNA PDGFRA zostało wykryte tylko w BAT. Stwierdzono, że białko UCP1 jest wzbogacone w izolowane BA.EDGFR alfa wykryto w BAT, ale nie w izolowanych BA. Wyniki te potwierdzają skuteczność metody izolowania BA i pokazują, że wyizolowane BA nadają się do badań nad ekspresją genów i białek. Próbując tego protokołu, użyj świeżego buforu trawiennego, aby zdysocjować brązową tkankę tłuszczową i uniknąć tworzenia się grudek tkanek w okresie trawienia.Ta nowa metoda ułatwia badanie biologii brunatnej tkanki tłuszczowej na poziomie pojedynczego krana komórkowego. Stosując tę metodę, można przeprowadzić badania ekspresji GN i białka za pomocą czystych brązowych adipocytów, precyzyjnie precyzyjnie preparując program ekspresji genów brązowych adipocytów, nie martwiąc się o zanieczyszczenie pochodzące pierwotnie z komórek beztłuszczowych.

isolating-brown-adipocytes-from-murine-interscapular-brown-adipose

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Pierwotne białe preadipocyty wyizolowane z białych tkanek tłuszczowych u myszy mogą być różnicowane na komórki beżowe/brite. Przedstawiono niezawodny system modelu komórkowego do badania molekularnej regulacji "brązowienia" białego tłuszczu.

Izolacja i różnicowanie komórek naczyniowych zrębu do komórek beżowych/brite

Ze względu na drastyczny i negatywny związek między otyłością a innymi chorobami współistniejącymi, uzasadnione są badania nad rolą tłuszczu w chorobach i ogólnym zdrowiu. Przedstawiamy protokół izolacji i wycinania magazynów tłuszczowych pozwalający na badanie tkanki tłuszczowej metodami in situ i in vitro.

Lokalizacja, identyfikacja i wycięcie mysich magazynów tłuszczu

Tutaj opisujemy protokół efektywnej immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), a następnie wysokoprzepustowego sekwencjonowania DNA (ChIP-seq) brunatnej tkanki tłuszczowej (BAT) wyizolowanej od myszy. Protokół ten nadaje się zarówno do mapowania modyfikacji histonów, jak i badania lokalizacji w całym genomie białek niehistonowych będących przedmiotem zainteresowania in vivo.

Immunoprecypitacja chromatyny mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej

Ta publikacja opisuje protokół izolacji jąder z dojrzałych adipocytów, oczyszczania przez sortowanie aktywowane fluorescencją oraz transkryptomiki na poziomie pojedynczej komórki.

Izolacja jąder tkanki tłuszczowej do zastosowań genomicznych pojedynczych komórek

Ten protokół opisuje techniczne podejście do izolowania subpopulacji komórek zrębu adipogennych i włóknisto-zapalnych z mysich magazynów białej tkanki tłuszczowej (WAT) w jamie brzusznej poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją lub separację kulek immunomagnetycznych.

Izolacja adipogennych i włóknisto-zapalnych subpopulacji komórek zrębu z mysich wewnątrzbrzusznych magazynów tłuszczu

Ten raport opisuje protokół jednoczesnej izolacji pierwotnych brązowych i białych preadipocytów od nowonarodzonych myszy. Wyizolowane komórki można hodować w hodowli i indukować do różnicowania się w pełni dojrzałe białe i brązowe adipocyty. Metoda umożliwia genetyczną, molekularną i funkcjonalną charakterystykę pierwotnych komórek tłuszczowych w hodowli.

Izolacja i różnicowanie pierwotnych białych i brązowych preadipocytów od nowonarodzonych myszy

Preadipocyty są izolowane z frakcji naczyniowej zrębu międzyłopatkowej brązowej tkanki tłuszczowej od nowonarodzonych myszy i różnicowane w komórki, które gromadzą kropelki lipidów, wyrażają markery molekularne i pokazują morfologię mitochondriów dojrzałych brązowych adipocytów. Komórki te są dalej analizowane za pomocą immunofluorescencji i transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Różnicowanie i obrazowanie brązowych adipocytów z frakcji zrębowej naczyniowej tkanki tłuszczowej śródłopatkowej od nowonarodzonych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną izolację frakcji zrębu naczyniowego (SVF) z mysiej tkanki tłuszczowej w celu uzyskania preadipocytów i osiągnięcia różnicowania adipocytów in vitro. Użycie dysocjatora tkankowego do trawienia kolagenazy zmniejsza zmienność eksperymentalną i zwiększa odtwarzalność.

Półautomatyczna izolacja zrębu frakcji naczyniowej z mysiej białej tkanki tłuszczowej za pomocą dysocjatora tkankowego

Tutaj oferujemy praktyczną procedurę preparowania i przeprowadzania analiz histologicznych oraz analiz ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej.

Rozwarstwienie, przetwarzanie histologiczne i analiza ekspresji genów mysiej brunatnej tkanki tłuszczowej nadobojczykowej

Niniejszy artykuł opisuje metodologię wyznaczania odpowiedzi chemotaktycznej leukocytów na specyficzne ligandy oraz identyfikacji oddziaływań między receptorami powierzchniowymi komórek a białkami cytozolowymi przy użyciu technik obrazowania żywych komórek.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym migracji komórek zapośredniczonej przez leukotrien B4 oraz oddziaływań BLT1 z β-arrestyną

Poznaj metodę izolacji brązowych adipocytów z tkanki tłuszczowej myszy przy użyciu trawienia enzymatycznego i jodixanolu. Technika ta umożliwia precyzyjną analizę ekspresji genów i białek bez zanieczyszczeń.

Izolowanie brązowych adipocytów z mysiej brązowej tkanki tłuszczowej między łopatkami w celu analizy ekspresji genów i białek

Przeglądaj więcej filmów