Name: Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-05T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Poznaj przygotowanie szklistych blaszek z erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum do kriotomografii elektronowej. Ta metoda umożliwia obserwację struktur pasożyta w stanie bliskim naturalnemu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało sfinansowane w całości lub w części przez Wellcome Trust (212916/Z/18/Z). Dla celów otwartego dostępu autor zastosował publiczną licencję CC BY na podstawie praw autorskich do każdej wersji Manuskryptu zaakceptowanej przez Autora powstałej w wyniku tego zgłoszenia.
Ten projekt, dla którego ta metoda została opracowana, został sfinansowany z grantu Rady Badań Medycznych MR/P010288/1 przyznanego Helen R. Saibil, Rolandowi A. Fleckowi i Michaelowi J. Blackmanowi. Kultury P. falciparum zostały wyhodowane w Instytucie Francisa Cricka, przy wsparciu członków grupy Michaela J. Blackmana. Autorzy chcieliby podziękować dr Ser Ying (Michele) Tan za dostarczenie obrazów schizontów traktowanych związkiem 2 i E64 w cienkich rozmazach krwi. Większość lameli została wyprodukowana przy wsparciu pracowników eBIC i jesteśmy wdzięczni za dostęp do dwuwiązkowego krioFIB-SEM Scios w ramach projektu badawczego NT21004. Autorzy doceniają również wsparcie programu stypendialnego Royal Society Industry Fellowship (INF\R2\202061) w kontynuowaniu rozwoju techniki mielenia FIB w ramach CUI. Autorzy chcieliby również podziękować Helen R. Saibil za użyteczne dyskusje w odniesieniu do tej pracy metodologicznej i nadzór nad projektem.

Ludzka krew została pobrana od anonimowych dawców za pośrednictwem brytyjskiego Krajowego Urzędu Krwi i Transplantacji i jest wykorzystywana w ciągu 2 tygodni od otrzymania. Do jego stosowania nie jest wymagana żadna aprobata etyczna.
1. Przygotowanie i zamrażanie wgłębne czerwonych krwinek zakażonych Plasmodium falciparum
<ol>
	<li>Wyizoluj dojrzałe schizonty przez odwirowanie (1,580 x g) na pożywce o gradientzie gęstości izotonicznej 70% (v/v) (standardowe procedury hodowli bezpłciowych stadiów krwi 3D7 Plasmodium falciparum w ludzkich erytrocytach patrz Blackman M.J., 199537).</li>
	<li>Utrwalić wysuszone na powietrzu cienkie warstwy krwi na szkiełku ze 100% metanolem, aby sprawdzić jednorodność morfologiczną schizontów przed barwieniem 10% barwnikiem Giemsa w 6,7 mM buforze fosforanowym o pH 7,1, 
	UWAGA: Aby wzbogacić przygotowanie do schizontów zatrzymanych w określonych punktach wyjścia, schizonty mogą być dalej synchronizowane z inhibitorami związku 2 i E64 (patrz Reprezentatywne wyniki i <silna klasa="xfig">Rysunek 1 dla wyjaśnienia działania tych inhibitorów). 
	UWAGA: Plasmodium falciparum jest ludzkim patogenem i może być przenoszony wyłącznie w odpowiednim pomieszczeniu przechowawczym, zgodnie z lokalnymi wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.</li>
	<li>Delikatnie odwirować schizonty (240 x g) w celu ich osadzenia i ponownie zawiesić w 2 razy większej objętości osadu komórkowego pożywki RPMI, co daje 50% zawiesinę hematokrytu.</li>
	<li>Na ręcznym urządzeniu do zamrażania wgłębnego nałóż 2,5 μl schizontów na węglową stronę rozładowanej jarzeniowej (użyj ustawień jednostki jarzeniowej 60 s, 30 mA w powietrzu, traktując tylko węglową stronę siatki) Siatka miedziana o siatce 200 mesh z 2/4 dziurawą folią węglową i osuszaj przez ~ 20 s z tyłu siatki za pomocą bibuły filtracyjnej klasy 1 z rozdartą krawędzią. Zanurz się w ciekłym ciekłym etanie chłodzonym azotem i przenieś kratki do magazynowania (patrz Tabela materiałów dla sprzętu używanego w tym badaniu). 
	UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać w ciekłym azocie na czas nieokreślony. 
	UWAGA: Ciekły azot jest środkiem duszącym i powoduje odmrożenia; Z monitorowaniem tlenu należy obchodzić się ostrożnie w odpowiednim środowisku. 
	UWAGA: Ciekły etan powoduje poważne oparzenia i jest łatwopalny; Stosować w dygestoria z dala od źródeł zapłonu. 
	UWAGA: Zanurzane mrożone schizonty nie są już opłacalne. Ustalono to, inkubując ludzką krew z kilkoma złotymi siatkami rozmrożonych na powietrzu schizontów zamrożonych wgłębnie i obserwując brak wzrostu pasożyta po kilku dniach, w porównaniu z niezamrożonymi kontrolami. Zamrożone siatki schizontów są zatem bezpieczne do obchodzenia się z nimi poza obiektami przechowawczymi przy użyciu normalnych procedur bezpieczeństwa i odkażania (rękawice, sterylizacja powierzchni/narzędzi przy użyciu >70% etanolu i utylizacja siatek w >70% etanolu).</li>
	<li>Przesiewaj siatki za pomocą kriostolika pod mikroskopem świetlnym, zwracając szczególną uwagę na gradient lodu w poprzek siatki. W cieńszych obszarach lodu sprawdź poszczególne kwadraty siatki pod kątem pokrycia komórek. 
	UWAGA: Najlepsze kwadraty powinny mieć grubość jednej komórki w środku kwadratu siatki (Rysunek 2). Gwarantuje to, że lamelę można frezować w poprzek środka kwadratu bez uderzania o grubszy lód na krawędziach o pręty siatki. W tym miejscu eksperyment można wstrzymać, a siatki można przechowywać pod ciekłym azotem w nieskończoność. Jeśli komórki zawierają marker fluorescencyjny, siatki mogą być również przesiewane przez cryoCLEM w celu zlokalizowania interesujących pozycji X/Y, które można skorelować z lokalizacjami siatki w krioFIB-SEM w celu bezpośredniego mielenia.</li>
</ol>
2. Mielenie FIB na siatce zamrożonych komórek wgłębnych
<ol>
	<li>Zaznacz przód obrzeży automatycznej siatki specyficznych dla cryoFIB czarnym, niezmywalnym markerem, aby wskazać środek sekcji przekroju i przeciwną stronę obręczy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3). Ustaw stację klipsowania i przypnij kratki do oznaczonych pierścieni stroną węglową do dołu.</li>
	<li>Załaduj siatki do czółenka cryoFIB-SEM (zwykle 2 siatki, w zależności od czółenka) stroną węglową do góry i nałóż platynową warstwę napylaną w atmosferze argonu (5 x 10-2 mbar) (5 mA przez 60 s - grubość jest zmienna) lub powłokę obrotową węglowo-platynową wiązką elektronową (grubość ~4 nm) na powierzchnię komórek. 
	UWAGA: Oba rodzaje powłok wspomagają rozpraszanie ładunku podczas obrazowania SEM. Zaletą powlekarki rotacyjnej e-beam jest możliwość określenia dokładnej grubości powłoki.</li>
	<li>Załaduj wózek do cryoFIB-SEM i oceń rozkład ogniw w każdej sieci za pomocą SEM przy napięciu 5 kV (13 pA lub 25 pA). Zrób przegląd w małym powiększeniu (~100x), aby spojrzeć na gradienty lodu na siatce. Następnie wykonaj zdjęcia w większym powiększeniu (~5,000x), aby przyjrzeć się poszczególnym kwadratom siatki i zidentyfikować obszary siatki z widocznymi cechami komórkowymi i niskim zanieczyszczeniem powierzchni do zmielenia.</li>
	<li>Nałożyć warstwę z żywicy organicznej o grubości >2 μm na powierzchnię każdej siatki za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). W tym celu włóż igłę GIS do komory nad siatką i podgrzej źródło metaloplatynowca do ustalonej temperatury przez określony czas (na przykład ~27 °C przez 3-10 s), aby wytworzyć przepływ pary. 
	UWAGA: Kąt aplikacji, temperatura i czas nakładania powłoki z metaloplatyny za pomocą igły GIS powinny być zoptymalizowane, aby zmaksymalizować równomierną powłokę. Będzie to zależało od konkretnego zastosowanego krioFIB-SEM (więcej informacji na ten temat można znaleźć w reprezentatywnych wynikach).</li>
	<li>Przechyl próbkę tak, aby płaszczyzna siatki znajdowała się ~10° od kąta padania wiązki jonów i przesuń środek odpowiedniego kwadratu siatki, aby był widoczny zarówno na obrazach SEM, jak i FIB.</li>
	<li>Zbadaj siatkę za pomocą wiązki jonów o niskim natężeniu prądu (nominalnie 1,5 pA, 30 kV) i przejdź do wystarczająco dużego powiększenia (~7,000x), aby uwidocznić komórki w środku kwadratu siatki. Ustawić ostrość próbki przy pierwszym prądzie mielenia (300 pA) i skorygować astygmatyzm. Dostosuj jasność i kontrast, a następnie zaznacz dwa prostokątne wzory do frezowania, jeden powyżej, a drugi poniżej chronionego obszaru o grubości 3 μm, którego środek jest pożądanym miejscem końcowej blaszki. 
	UWAGA: Wybrana szerokość wzorów będzie zależeć od topografii otaczającej warstwy komórek i rozmiaru komórki. 7-20 μm to odpowiednia szerokość dla schizontów, ale szersze lamele potrzebują więcej czasu na frezowanie. Wybrana wysokość wzorów dla pierwszego etapu mielenia zależy od grubości próbki i zaczyna się od około 6 μm; Może być konieczne dostosowanie tego podczas frezowania. Frezowanie odbywa się kierunkowo od zewnętrznej górnej i dolnej krawędzi wzorów w kierunku czoła lameli. Można to zrobić równolegle, gdzie oba wzory są frezowane równolegle lub sekwencyjnie, najpierw usuwając materiał z górnej części lameli, a następnie od spodu.</li>
	<li>Rozpocznij frezowanie przy pierwszym prądzie; monitoruj postęp na żywo w widoku wiązki jonów i z przerwami za pomocą SEM (5 kV, 13 lub 25 pA). Sprawdź, czy wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru. Jeśli nie, zwiększ wysokość prostokątnych wzorów, aby usunąć więcej materiału. Zatrzymaj się, gdy powierzchnia powyżej i poniżej lameli jest całkowicie gładka w widoku wiązki jonów. 
	UWAGA: Wiązka jonów przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru, gdy wnętrze prostokątnych wzorów nie zawiera żadnych cech w płaszczyźnie ogniskowej. Niektóre funkcje, takie jak paski siatki, mogą być nieostre w tle.</li>
	<li>Zmień na następny prąd mielenia (100 pA); ustaw ostrość i dostosuj jasność/kontrast. Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 1,5 μm i zmniejsz wysokość wzoru, aby pokryć tylko niefrezowany materiał. Rozpocznij frezowanie przy nowym prądzie, aż powierzchnia nad i pod lamelą będzie całkowicie gładka.</li>
	<li>Powtarzaj ten proces krok po kroku, aż do osiągnięcia grubości 0,3 μm, za każdym razem zmniejszając prąd wiązki jonów zgodnie ze schematem mielenia w tabeli 1.</li>
	<li>Frezować kilka lameli (ilość zależy od grubości próbki i dostępnego czasu) na jednej lub obu siatkach do grubości 0,3 μm, zapisać pozycję X/Y/Z każdej lameli i zarezerwować ~1-2 h na koniec sesji na wypolerowanie lameli do ich ostatecznej grubości (60-200 nm).</li>
	<li>Zrób przegląd SEM w małym powiększeniu całej siatki i zaplanuj trasę polerowania, zaczynając od lameli z przodu siatki (bliżej źródła wiązki jonów) do lameli z tyłu siatki (najdalej od źródła wiązki jonów) (<silna klasa="xfig">Rysunek 5). 
	UWAGA: Zmniejsza to ponowne osadzanie się ablowanego materiału z powrotem na powierzchni polerowanych lameli.</li>
	<li>Zmniejsz odstęp między dwoma prostokątnymi wzorami do 100-200 nm i rozpocznij ostatni etap polerowania przy prądzie wiązki jonów 30 pA. Monitoruj postęp za pomocą SEM przy napięciu 2-3 kV (13 pA, dwell = 300 n, 3072 x 2048, ~2 s dla pełnej klatki) i przerwij polerowanie, gdy kontrast w blaszce zostanie utracony przez SEM lub gdy powłoka organicoorganiczna samej lameli zaczyna tracić integralność.</li>
	<li>Przed usunięciem siatek należy uzyskać obraz SEM całej siatki w małym powiększeniu i zapisać obrazy każdej blaszki. Użyj ich, aby sprawdzić siatkę w dalszej części TEM. Przerwij eksperyment w tym miejscu i przechowuj siatki z lamelami pod ciekłym azotem - obchodź się z nimi ostrożnie. 
	UWAGA: Siatki mogą być lekko napylane po wyjęciu z cryoFIB-SEM, co może pomóc w ograniczeniu dryftu i ładowania w TEM przy dużym powiększeniu, ale należy to robić ostrożnie, ponieważ zbyt duża powłoka napylająca może zasłaniać zawartość biologiczną wewnątrz lameli. Na tym etapie możliwe jest przesiewanie lameli pod kątem fluorescencji; Jednak uzyskanie wystarczającej ilości sygnału będzie zależało od obfitości znakowanego białka w grubości blaszki. Należy zachować szczególną ostrożność podczas obchodzenia się z kratkami, aby ograniczyć uszkodzenia lameli i zapobiec zanieczyszczeniu powierzchni.</li>
</ol>
3. Akwizycja serii Tilt i ogólny przegląd przetwarzania danych
<ol>
	<li>Załaduj siatki do TEM, wyrównując kierunek frezowania prostopadle do osi pochylenia stolika. 
	UWAGA: Wyrównanie siatek odbywa się na oko za pomocą znaczników na obręczy automatycznej siatki. Dopuszczalny jest margines błędu ~10°, w przeciwnym razie ściany wykopu po obu stronach lameli mogą zasłaniać lamelę podczas nachylania siatki.</li>
	<li>Zdobądź mapę w małym powiększeniu (~150x) całej siatki i zlokalizuj lamele; następnie zdobądź mapę w średnim powiększeniu (~1,500x, w zależności od wielkości lameli) każdej lameli i zlokalizuj obszary zainteresowania.</li>
	<li>Wstępnie przechylić siatkę o ±10°, aby płaszczyzna lameli (nie siatki) była prostopadła do osi optycznej 
	UWAGA: Kierunek wstępnego pochylenia można określić na podstawie położenia przedniej krawędzi lameli (szukając pozostałej powłoki metaloorganicznej) na mapach o małym i średnim powiększeniu. W przypadku zastosowanego tutaj TEM siatki wymagają wstępnego pochylenia +10°, jeśli przednie krawędzie lameli są skierowane w górę na mapach, i wymagają wstępnego pochylenia -10°, jeśli są skierowane w dół. Każda siatka może się różnić ze względu na sposób, w jaki zostały pobrane i włożone do automatycznego ładowania.</li>
	<li>Uzyskaj symetryczne pod względem dawki tilt-series38 (na przykład od -54° do +54° z krokiem co 3-5°) przy rozmiarze piksela, który pozwala zarówno na pole widzenia, jak i rozdzielczość wymaganą dla obszaru zainteresowania. Używaj zakresu wartości rozmycia od -2 do -5 μm. Zbieraj filmy z 3-10 klatkami w każdym kroku i w tym celu dostosuj te parametry w zależności od rozmiaru piksela, aby uzyskać całkowitą dawkę ~150 e-/Å 2 (dla TEM 300 kV). 
	UWAGA: Należy unikać pęknięć w blasze, ponieważ te obszary mogą dryfować. Należy również unikać zanieczyszczenia powierzchni, ponieważ może ono zasłaniać obszar zainteresowania lub obszar ostrości przy dużym nachyleniu.</li>
	<li>Animacja filmów jest korygowana za pomocą programu takiego jak MotionCor239. Zastosuj filtr ważenia dawki do poprawionych obrazów (skumulowany e-/image)40 i oszacuj rozmycie każdego obrazu za pomocą programu, takiego jak CTFFIND441.</li>
	<li>Użyj wyrównania bez odniesienia (śledzenia łatek) w programie takim jak etomo (IMOD)42, aby obliczyć wyrównanie i relację kątową obrazów w serii pochylenia.</li>
	<li>Wprowadź informacje o wyrównaniu i obrocie wraz z wartościami rozmycia do programu, który może zastosować trójwymiarową korekcję CTF, na przykład NovaCTF43. Oblicz skorygowany tomogram, aby uzyskać tomogramy wyjściowe ze współczynnikami kategoryzacji istotnymi dla dalszej analizy.</li>
	<li>Przeanalizuj rekonstrukcje i przygotuj się do dalszego przetwarzania, na przykład filtrowania, segmentacji lub uśredniania subtomogramu.</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas gdy mielenie krioFIB staje się coraz bardziej rutynowe, przygotowanie optymalnych próbek do mielenia nie; w związku z tym większość krytycznych etapów w tym protokole ma miejsce, zanim próbka dotrze do cryoFIB-SEM. Optymalizacja próbki poprzez wiele rund przygotowania komórek, zamrażanie wgłębne oraz przesiewanie za pomocą mikroskopii świetlnej i elektronowej jest wymagana w celu uzyskania najlepszej możliwej próbki przed próbą mielenia. Posiadanie najlepszej możliwej próbki nie tylko zwiększa szanse na sukces, ale także optymalizuje wykorzystanie sprzętu. Z tego powodu większość krajowych zakładów wymaga dowodu, że przed przyznaniem czasu na ich maszynach przeprowadzono wystarczającą optymalizację. Po wejściu do cryoFIB-SEM maksymalizacja skuteczności powłoki z metaloorganicznej platyny ma kluczowe znaczenie dla wytworzenia jednolicie cienkich blaszek. Wreszcie, cierpliwość i dobre obchodzenie się z próbką jest umiejętnością niezbędną od użytkownika, który będzie musiał siedzieć przez wiele dni produkując, a następnie przenosząc siatki zawierające delikatne blaszki. Może się to zmienić wraz z wprowadzeniem zautomatyzowanych strategii mielenia47,48, ale jak dotąd cały proces mielenia w większości zakładów jest nadal w dużej mierze ręczny.
Chociaż prace koncentrowały się wyłącznie na P. falciparum schizonts, przedstawioną tutaj metodę można łatwo zmodyfikować w celu optymalizacji przygotowania siatki i mielenia dla innych typów komórek. Ważnymi czynnikami, które należy wziąć pod uwagę, są gęstość komórek nakładanych na siatkę, rodzaj siatki (miedź jest toksyczna dla niektórych komórek), rozmiar i odstępy między otworami w folii węglowej, czas blottingu oraz metoda blottingu (jednostronna/dwustronna, ręczna lub automatyczna). Dodatkowo, jeśli komórki są hodowane na siatkach (zwykle złotych siatkach z dziurawym filmem węglowym), zbieganie można sprawdzić za pomocą mikroskopii świetlnej przed osuszeniem i zamrożeniem. Strategia mielenia zależy od tego, w jaki sposób komórki są osadzane na siatce. W przypadku czerwonych krwinek zakażonych malarią siatka jest zasadniczo pokryta nieprzerwaną warstwą komórek, grubszą w niektórych obszarach i cieńszą w innych. Mielenie odbywa się w wielu punktach w jednym regionie wzdłuż tego gradientu, gdzie grubość lodu generuje blaszki o odpowiedniej wielkości dla tomografii. Takie podejście działa dobrze w przypadku mniejszych komórek, ponieważ można wytworzyć blaszki zawierające plasterek przez wiele komórek. W przypadku większych komórek lub skupisk komórek może się zdarzyć, że jedna komórka lub zlepek komórek może wytworzyć jedną blaszkę.
Obsługa siatki i transfer próbek pozostają jednym z głównych wyzwań tego przepływu pracy. Lamele mogą zostać utracone z powodu pęknięć lub pęknięć, artefaktów kurtynowych zasłaniających biologię, nadmiernego zanieczyszczenia powierzchni, a także problemów z orientacją siatki w TEM, co wymaga dodatkowego kroku w celu zmiany położenia siatki. Stopień strat różni się w zależności od dnia na dzień i od sieci do sieci, ale z czasem ulega poprawie dzięki praktyce i doświadczeniu w obsłudze. W tym badaniu stwierdzono, że kratki mogą być wielokrotnie ostrożnie orientowane w automatycznej ładowarce bez niszczenia lameli, co czasami ma tę zaletę, że zmywa lód powierzchniowy. Innym głównym ograniczeniem tego przepływu pracy jest czas potrzebny na wyprodukowanie lameli. Ponieważ produkcja jest powolna, bardzo ważne jest, aby mieć odpowiednio zoptymalizowaną próbkę, dzięki której mielenie będzie tak wydajne, jak to tylko możliwe.
W ostatnim czasie wprowadzono szereg adaptacji do mielenia FIB szklistych próbek biologicznych. Przełomem jest zastosowanie w komorze cryoFIB-SEM chłodzonych kriogenicznie narzędzi do wyciągania, które umożliwiają mielenie większych bloków materiału z zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem. Bloki można przymocować do metalowego pręta lub podnieść w chwytaku i przesunąć do drugiej pozycji próbki, zawierającej specjalnie zmodyfikowaną siatkę EM. Bloki można następnie pokryć ognioorganicznymi platynami i zmielić w celu wytworzenia lameli. Zdolność do mielenia blaszek z zamrożonego materiału pod wysokim ciśnieniem oznacza, że można przetwarzać znacznie większe komórki i tkanki, w szczególności celując w obszary za pomocą korelacyjnej mikroskopii fluorescencyjnej12. Inne niedawne adaptacje metody mielenia FIB obejmują redukcję artefaktów kurtyny poprzez wstępne mielenie klinowe próbki16, kriofiksację mikroprzepływową49 oraz fotomikrowzorcowanie siatek mikroskopii elektronowej w celu poprawy rozmieszczenia komórek50. Wykazano również, że frezowanie szczelin mikrodylatacyjnych po obu stronach blaszki może złagodzić ściskanie przez otaczającą próbkę, gdy osiąga ona swoją końcową cienkość51. Może to być szczególnie przydatne podczas frezowania ciągłych warstw komórek, takich jak próbka w tym badaniu, gdzie czasami obserwuje się wyginanie lameli podczas końcowego etapu polerowania.
Przyszłością mikroskopii elektronowej będzie prawdopodobnie oznaczanie struktur molekularnych in situ za pomocą uśredniania subtomogramowego, a mielenie FIB jest ważnym narzędziem, które ułatwi produkcję szklistych próbek biologicznych dla tego typu przepływów pracy. Podczas gdy mielenie FIB jest wciąż w powijakach dla zastosowań biologicznych, rozwój metod odbywa się w szybkim tempie dzięki ciężkiej pracy naukowców, zarówno akademickich, jak i w ośrodkach krajowych, a także komercyjnym inwestycjom w rozwój technologii cryoFIB-SEM w celu wspierania badań.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated from:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University
to:
Claudine Bisson1,2 
Corey W. Hecksel3,4 
James B. Gilchrist3 
M. Alejandra Carbajal1 
Roland A. Fleck1 
1Centre for Ultrastructural Imaging, New Hunt&#8217;s House, Guy&#8217;s Campus, King&#8217;s College London 
2Department of Biological Science, Birkbeck College, University of London 
3Electron Bio-Imaging Centre, Diamond Light Source, Harwell Science and Innovation Campus 
4SLAC National Accelerator Laboratory, Stanford University

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62350">Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Tylko zawartość komórkowa próbek biologicznych o grubości <500 nm może być skutecznie zobrazowana za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w temperaturach kriogenicznych, ograniczając zakres próbek do wirusów, prokariontów, prostych organizmów jednokomórkowych i cieńszych regionów większych komórek eukariotycznych1. Mielenie skupionej wiązki jonów (FIB) w siatce umożliwia rozrzedzanie grubszych próbek biologicznych zamrażanych wgłębnie do przezroczystych blaszek elektronowych w temperaturach kriogenicznych (< -150 °C). Powstałe blaszki są następnie przenoszone do TEM w celu wizualizacji i gromadzenia danych tomograficznych, umożliwiając rekonstrukcje 3D w wysokiej rozdzielczości cech komórkowych i molekularnych wewnątrz komórek (przeglądy patrz Rigort et al., 20122, Oikonomou et al., 20163, oraz Wagner et al., 20204).
Mielenie FIB wywodzi się z dziedziny materiałoznawstwa, gdzie próbki są rutynowo rozrzedzane, aby przygotować je do dalszej analizy5. Odbywa się to w skaningowym mikroskopie elektronowym (SEM), który ma dwie kolumny optyczne: konwencjonalną optykę skaningowego mikroskopu elektronowego i drugą kolumnę zawierającą optykę zdolną do generowania i precyzyjnego kontrolowania skupionej wiązki jonów (FIB) - zwanej FIB-SEM. Pozwala to na ablację określonego obszaru próbki przez jony generowane przez źródło galu, usuwając nadmiar materiału i pozostawiając blaszkę6. Proces mielenia jest prowadzony przez obrazowanie SEM topografii próbki, które służy do lokalizowania obszarów zainteresowania i monitorowania postępu mielenia. W przypadku zastosowań biologicznych podstawowa konfiguracja jest w dużej mierze taka sama, ale mielenie odbywa się w temperaturach kriogenicznych. Wymagało to dostosowania standardowych FIB-SEM do stopni chłodzonych kriogenicznie, które utrzymują stałą temperaturę i niskie wskaźniki zanieczyszczenia powierzchni, a także śluz powietrznych ułatwiających przenoszenie próbek bez dewitryfikacji lub zanieczyszczenia. Transportery próbek zostały również zmodyfikowane, aby umożliwić montaż szeregu różnych nośników wewnątrz krioFIB-SEM, w tym siatek TEM, planszetek i kapilarni. Kilka kluczowych grup badaczy odegrało kluczową rolę w rozwoju tych metod i ciągłym postępie technologicznym w tej dziedzinie7,8,9,10,11,12. Komercyjne rozwiązania są obecnie szerzej dostępne dla biologicznego mielenia FIB w temperaturze kriogenicznej, a mielenie lameli na siatce staje się coraz bardziej rutynowe, biorąc pod uwagę zoptymalizowaną próbkę.
Szereg technik temperatury pokojowej i krioEM może być używany do wizualizacji informacji komórkowych we wszystkich skalach życia, od całych organizmów wielokomórkowych w umiarkowanej rozdzielczości, przez zrozumienie kontekstu złożonych procesów na poziomie komórkowym i jeszcze bardziej szczegółowo, aż po określenie struktur molekularnych in situ13,14,15,16,17,18,19. Klasyczne techniki stosowane w temperaturze pokojowej obejmują sekcje utrwalonych i wybarwionych, osadzonych w żywicy komórek i tkanek za pomocą ultramikrotomii w celu analizy morfologii komórkowej za pomocą TEM (przegląd patrz Studer et al., 200820). Opracowano alternatywne techniki wykorzystujące wtórne rozpraszanie elektronów przez SEM do obrazowania powierzchni bloków zachowanych komórek, przed stopniowym usuwaniem materiału za pomocą noża (obrazowanie czoła bloku szeregowego) lub skupionej wiązki jonów21,22,23. Technika ta została również z powodzeniem wdrożona w temperaturach kriogenicznych (określanych jako obrazowanie krioobjętościowe) za pomocą cryoFIB-SEM na szklistych, niebarwionych blokach komórek lub tkanek24. Alternatywnie, grubsze lamele (o grubości ~15 μm) mogą być frezowane i badane za pomocą obrazowania STEM25. Korzystając z tych technik, całe bloki zawierające wiele komórek mogą być obrazowane w celu zebrania informacji o populacji lub cały narząd/organizm może być obrazowany i zrekonstruowany w 3D. Jednak, aby uzyskać dostęp do informacji molekularnych o wysokiej rozdzielczości z komórek, próbki muszą być zachowane w stanie zbliżonym do natywnego, zamrożonego i uwodnionego, a zatem muszą być przygotowane w warunkach kriogenicznych. Krioelektronowa mikroskopia skrawków ciała szklistego (CEMOVIS) to technika polegająca na cięciu zamrożonych bloków materiału biologicznego pod wysokim ciśnieniem w warunkach kriogenicznych za pomocą ultramikrotomu. W ten sposób powstają wstęgi kriosekcji (o grubości 40-100 nm)26, które są dołączane do siatki EM i obrazowane w TEM. Jednak fizyczna interakcja noża z próbką ciała szklistego powoduje artefakty szczelinowania i kompresji, które mogą poważnie zniekształcić strukturę komórkową27,28,29,30. Grube sekcje są bardziej podatne na te artefakty, co sprawia, że niepraktyczne jest używanie sekcji grubszych niż ~70 nm26. To ograniczenie znacznie ogranicza widok 3D struktury biologicznej na tomogramie. Mielenie FIB w temperaturach kriogenicznych nie powoduje tych problemów, ale ma swoje własne artefakty spowodowane różnicami w tempie mielenia w różnych częściach próbki, co prowadzi do różnych grubości w lameli - zwanych kurtynami. Problem ten jest łagodzony przez nałożenie powłoki z metaloplatyny nakładanej za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS), który chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania31. Górna granica grubości próbki dla mielenia FIB na siatce jest zdefiniowana przez zdolność do zamrożenia próbki metodą zanurzeniową przy jednoczesnym zachowaniu jej szklistej 32, chociaż wraz z wprowadzeniem technik kriogenicznego podnoszenia i dostosowanych nośników próbek dla próbek biologicznych, mielenie FIB może być również stosowane do przetwarzania próbek mrożonych pod wysokim ciśnieniem31,33,34,35. Dodatkowo, próbki zamrożone wgłębnie nie mogą być zbyt cienkie, ponieważ musi być wystarczająco dużo materiału biologicznego, aby wytworzyć blaszkę o rozsądnej wielkości, która zapewni wystarczającą powierzchnię do zebrania serii pochyleń przy wymaganym powiększeniu. Problem ten można złagodzić poprzez mielenie grudek mniejszych komórek, takich jak bakterie lub drożdże. Ostateczna grubość lameli (~100-300 nm) jest zwykle podyktowana integralnością próbki i strategią mielenia. Cieńsze blaszki są lepsze do prac strukturalnych o wysokiej rozdzielczości, takich jak uśrednianie subtomogramowe, ale grubsze blaszki zawierają znacznie większe objętości komórkowe niż można osiągnąć za pomocą CEMOVIS, zapewniając większy kontekst komórkowy w próbce zachowanej niemal natywnie. Mielenie FIB może być również stosowane do rozrzedzania kryształów białek zamrożonych wgłębnie do badań dyfrakcji elektronów36.
Mielenie komórek szklistych jest warte czasu i wysiłku, jeśli pytanie naukowe wymaga wysokiej rozdzielczości szczegółów molekularnych zbliżonych do rodzimych próbek in situ. Dzięki dostępowi do większej liczby urządzeń do rutynowej produkcji lameli, etapem ograniczającym szybkość jest często optymalizacja próbki przed mieleniem, gdzie należy poświęcić czas na upewnienie się, że próbka jest szklista i ma odpowiednią grubość do wytworzenia wytrzymałych i jednolicie cienkich lameli. Opisano tutaj optymalizację próbki pod kątem mielenia FIB zamrożonych wgłębnie ludzkich krwinek czerwonych zakażonych pasożytami Plasmodium falciparum, czynnikiem wywołującym malarię, ale podejście to można dostosować do dowolnej próbki.

<table><tbody><tr><td>c-clips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1036171</td><td></td></tr><tr><td>Stacja do przycinania</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Bezpośrednia wycena z Thermo</td></tr><tr><td>Clipping station</td><td>Sub-angstrom</td><td>CSA-01</td><td></td></tr><tr><td>Związek 2</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Zsyntetyzowany przez dr Simona A. Osborne'a,</td></tr><tr><td>LifeArc Cryo-FIB specyficzne dla obręczy z automatyczną siatką</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>1205101</tr><tr><td>E64</td><td>Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Emitech K100X jednostka wyładowcza jarzeniowa</td><td>Kworum</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 media</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633012</td><td>Preparat stosowany do hodowli jest wykonany na zamówienie (REF 041-91762 A) i zawiera Albumax, glutaminę, HEPES i suplementy hipoksantyny</td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>VWR International</td><td>350864X</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Thermo Fisher Scientific</td><td>11562203</td><td></td></tr><tr><td>Skrzynki rusztowe</td><td>Sub-angstrom</td><td>PB</td><td>Do kratek przyciętych</td></tr><tr><td>Skrzynki kratowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>Do kratek przyciętych - bezpośrednia wycena z Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Skrzynki siatkowe</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>Domowa ręczna zamrażarka wgłębna</td><td>n/a</td><td>nie dotyczy</td><td>Z izolowanym zbiornikiem etanowym (pianka o dużej gęstości) i kąpielą w ciekłym azocie (polistyren) na blacie stołu w obiekcie przechowawczym.</td></tr><tr><td>Krew ludzka</td><td>nie</td><td>dotyczy nie dotyczy</td><td>brytyjskiej Narodowej Służby Krwi i Transplantacji</td></tr><tr><td>JEOL 4700F Z JSM z systemem chłodzenia stopnia Leica VCT500</td><td>JEOL</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Leica EM ACE600 z kriostopniem VCT500</td><td>Leica</td><td>bez</td><td>napylania napylającego</td></tr><tr><td>Leica EM ACE900</td><td>Leica</td><td>n/a</td><td>powlekarka rotacyjna z wiązką elektroniczną. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.</td></tr><tr><td>Stolik kriogeniczny Linkam do mikroskopu świetlnego</td><td>Linkam</td><td>Model nr. CMS196</td><td>Kasety do siatek przyciętych i nieprzyciętych. W pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Nikon Eclipse E200</td><td>Nikon</td><td>n/a</td><td>ze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>VWR International</td><td>17-0891-01</td><td>Roztwór do poduszki perkolu to 35 ml 10 ml PBS, 150 ml RPMI 1640 media i 315 ml Percoll</td></tr><tr><td>Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawy węgiel Siatki EM Finder</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCuH2-01</td><td>100 sztuk</td></tr><tr><td>Quantifoil miedź 200 mesh 2/4 dziurawe siatki węglowe EM</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C17nCu20-01</td><td>100 sztuk</td></tr><tr><td>Komora przygotowawcza Quorum PP3010 Quorum</td><td></td><td>nie dotyczy</td><td>napylarki</td></tr><tr><td>Scios dwubelkowej wyposażonej w stopień transferowy Quorum PP3010.</td><td>FEI</td><td>n/a</td><td>FIB-SEM</td></tr><tr><td>Staedtler Lumocolor cienki marker permanentny</td><td>Viking Direct</td><td>ND538522</td><td></td></tr><tr><td>TFS Titan Krios 300 kV TEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>n/a</td><td>TEM wyposażony w kamerę K2 lub K3.</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna Whatmann grade 1</td><td>Sigma</td><td>WHA1001150</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop świetlny Zeiss Axio Scope A1</td><td>Zeiss</td><td>n/a</td><td>ze stolikiem kriogenicznym Linkam w pomieszczeniu o kontrolowanej wilgotności.</td></tr></tbody></table>

przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Prezentowany tutaj jest protokół przygotowania krio-lameli z zamrożonych siatek ludzkich erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum, który można łatwo zaadaptować do innych próbek biologicznych. Podstawowe zasady przygotowywania próbek, mielenia i oglądania lameli są wspólne dla wszystkich przyrządów, a protokół może być przestrzegany jako ogólny przewodnik po przygotowaniu kriolameli w sieci do mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) i tomografii krioelektronowej (cryoET). Siatki mikroskopii elektronowej podtrzymujące komórki są zamrażane wgłębnie w ciekłym etanie chłodzonym azotem za pomocą ręcznej lub automatycznej zamrażarki wgłębnej, a następnie poddawane badaniom przesiewowym pod mikroskopem świetlnym wyposażonym w kriostolik. Zamrożone siatki są przenoszone do krioskaningowego mikroskopu elektronowego wyposażonego w skupioną wiązkę jonów (cryoFIB-SEM). Siatki są rutynowo napylane przed frezowaniem, co pomaga w rozpraszaniu nagromadzonego ładunku podczas mielenia. Alternatywnie można użyć powlekarki rotacyjnej z wiązką elektroniczną do nałożenia warstwy węglowo-platynowej na kratki, której dokładna grubość może być dokładniej kontrolowana. Po wejściu do krioFIB-SEM na powierzchnię siatki nakładana jest dodatkowa powłoka ze związku platynowca organicznego za pomocą systemu wtrysku gazu (GIS). Warstwa ta chroni przednią krawędź lameli podczas frezowania, której integralność ma kluczowe znaczenie dla uzyskania jednolicie cienkich lameli. Obszary zainteresowania są identyfikowane za pomocą SEM, a mielenie odbywa się w sposób krokowy, zmniejszając prąd wiązki jonów, gdy blaszka osiąga przezroczystość elektronów, aby uniknąć nadmiernego wytwarzania ciepła. Siatka z wieloma lamelami jest następnie przenoszona do transmisyjnego mikroskopu elektronowego (TEM) w warunkach kriogenicznych w celu akwizycji serii pochylenia. Solidny i wolny od zanieczyszczeń przepływ pracy w zakresie przygotowania lameli jest niezbędnym krokiem dla dalszych technik, w tym krioEMU komórkowego, cryoET i uśredniania subtomogramowego. Rozwój tych technik, zwłaszcza w zakresie wyjmowania i mielenia zamrożonych próbek pod wysokim ciśnieniem, ma wysoki priorytet w tej dziedzinie.

Używanie mielenia skupionej wiązki jonów do produkcji szklistych blaszek na siatce z zamrożonych próbek biologicznych do krioelektronowej tomografii.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Protokół ten określa przygotowanie blaszek szklistych krwinek czerwonych zakażonych Plasmodium-falciparum do kriotomografii elektronowej. Umożliwia to bezpośrednią obserwację szczegółowych informacji strukturalnych na temat tego, w jaki sposób pasożyt powoduje malarię. Kriotomografia elektronowa rejestruje informacje o wnętrzu komórek w wysokiej rozdzielczości.Jest wystarczająco silny, aby obserwować pojedyncze kompleksy białkowe in situ, które można obliczeniowo wyodrębnić i uśrednić, aby ujawnić trójwymiarowe informacje strukturalne o białkach. Protokół ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek i może być punktem wyjścia dla kogoś, kto dopiero zaczyna wytwarzać blaszki szkliste do kriotomografii elektronowej. To jest Alejandra Carbajal, która dzisiaj będzie przeprowadzać protokół.Na początek przesiewaj zamrożone miedziane siatki za pomocą CryoStage pod kątem mikroskopu świetlnego, zwracając szczególną uwagę na gradient lodu w poprzek siatki. Sprawdź poszczególne kwadraty siatki pod kątem pokrycia komórek w cieńszych obszarach lodu. Użyj czarnego, nieusuwalnego markera, aby zaznaczyć przód i przeciwną stronę felg Autogrid specyficznych dla Cryo-FIB-SEM.Załaduj przyciętą siatkę do wahadłowca Cryo-FIB-SEM stroną węglową do góry i nałóż na powierzchnię ogniw obrotową powłokę węglową lub platynową wiązką e-beam o grubości czterech nanometrów. Załaduj wózek do Cryo-FIB-SEM i oceń rozkład ogniw w każdej sieci za pomocą SEM przy pięciu kilowoltach. Przyjrzyj się przeglądowi w małym powiększeniu przy mocy 100, aby przyjrzeć się gradientom lodu na siatce.Następnie wykonaj zdjęcia w większym powiększeniu o mocy 5 000, aby przyjrzeć się pojedynczym kwadratom siatki. Nałożyć dwumikrometrową warstwę metaloplatynową na powierzchnię każdej siatki, wkładając igłę systemu wtrysku gazu do komory nad siatką i ogrzewając źródło metaloorganicznej platyny do ustalonej temperatury przez określony czas, aby wytworzyć przepływ pary. Aby obserwować próbkę, przechyl próbkę tak, aby płaszczyzna siatki znajdowała się około 10 stopni od kąta padania wiązki jonów i przesuń środek odpowiedniego kwadratu siatki, aby był widoczny zarówno na obrazach SEM, jak i FIB.używając wiązki jonów o niskim natężeniu prądu, Przyjrzyj się siatce w dużym powiększeniu, aby zwizualizować komórki w środku kwadratu siatki. Zaznacz dwa prostokątne wzory do frezowania, jeden powyżej, a drugi poniżej chronionego obszaru o grubości trzech mikrometrów. Następnie wybierz ustawienia wiązki i popraw astygmatyzm, dostosowując jasność i kontrast.po zakończeniu konfiguracji rozpocznij frezowanie przy prądzie 300 pikoamperów, monitorując postęp na żywo w widoku wiązki jonów i z przerwami przez SEM. Próbka jest sprawdzana w widoku SEM i po pierwszym mieleniu, Jeśli wiązka jonów nie przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru, usuń więcej materiału, zwiększając wysokość prostokątnych wzorów. Przerwij frezowanie, gdy powierzchnia nad i pod lamelą jest całkowicie gładka w widoku wiązki jonów.Powtarzaj proces mielenia krok po kroku, za każdym razem zmniejszając prąd wiązki jonów, aż do osiągnięcia grubości 300 nanometrów. Zapisz położenie X, Y, Z każdej blaszki. Aby wypolerować lamele pod koniec eksperymentu, użyj przeglądu SEM w małym powiększeniu, aby wybrać grupę lameli do polerowania i zaznaczyć nasadę polerską.Po zaznaczeniu korzenia polerskiego zmniejsz przestrzeń między dwoma prostokątnymi wzorami do 100 do 200 nanometrów i rozpocznij polerowanie przy prądzie wiązki jonów o natężeniu 30 pikoamperów. Monitoruj postęp za pomocą SEM przy dwóch do trzech kilowoltach. Przerwij polerowanie, gdy kontrast w blaszce zostanie utracony przez SEM lub gdy powłoka organiczno-platoorganiczna lub sama blaszka zaczyna tracić integralność.Pobieraj i zapisuj obrazy SEM każdej lameli w małym powiększeniu. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij czółenko z mikroskopu. Usuń siatki z lamelami i przechowuj je pod ciekłym azotem.Z kratkami należy obchodzić się ostrożnie. Aby zbadać morfologię, schizonty zostały zatrzymane na różnych etapach wychodzenia przy użyciu związku drugiego w inhibitorach E-64. W obecności związku drugiego granica między błonami parazytoforycznymi a otaczającą hemoglobiną w krwinkach czerwonych gospodarza była dobrze określona.Nienaruszona parazytoforyczna wakuola lub PV była wypełniona merozoitami w pojedynczym skupisku kryształów hemozyozy. Kiedy związek dwóch zsynchronizowanych schizontów został wypłukany do E-64, membrana PV została rozerwana, a merozoity rozprzestrzeniły się w RBC. Typowym przykładem dobrego rozmieszczenia komórek na siatce miedzianej są duże czerwone krwinki z dobrze zdefiniowanym obwodem i nienaruszoną błoną wakuoli.W częściowo zapadniętej czerwonej krwince gospodarza poszczególne merozoity zostały uwidocznione jako małe skupiska komórek. Każdy schizont miał w środku czarną plamkę wskazującą położenie kryształów hemoozy. Po zmieleniu siatki zostały załadowane do TEM w celu zidentyfikowania pozycji lameli i znalezienia odpowiednich obszarów do namierzenia za pomocą tomografii.Na mikrofotografii próbki można zobaczyć erytrocyty, które niedawno zostało zaatakowane przez merozoit. Merozoit otoczony błoną pochodzącą z komórki gospodarza można było zobaczyć w granicach RBC. Na wierzchołkowym końcu merozoitu wyraźnie widoczne były dwie błony otaczające komórkę i cztery błony ułożone w wierzchołku merozoitu związane z gęstą od elektronów cechą w kształcie grzyba.W cytoplazmie merozoitu zidentyfikowano zdarzenie fuzji między błoną plazmatyczną merozoitu a wielowarstwowym pęcherzykiem. W dodatkowej analizie TEM blaszki o grubości 230 nanometrów zaobserwowano typową morfologię dojrzałego merozoitu poddanego działaniu E-64. W błonie czerwonych krwinek błonę plazmatyczną merozoitu można zobaczyć z organellami, takimi jak kompleks błony wewnętrznej, pierścienie polarne, mikronemy, ryprotrie i otoczka jądrowa.Najważniejszą częścią tej techniki jest optymalizacja siatek, aby umożliwić powtarzalną i wydajną produkcję cienkich lameli. Dalszy rozwój tej techniki umożliwi naukowcom wizualizację pojedynczych cząsteczek białkowych w obrębie pasożytów malarii i określenie ich roli w wychodzeniu malarii.

preparing-lamellae-from-vitreous-biological-samples-using-dual-beam

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Aby zachować procesy neuronalne do analizy ultrastrukturalnej, opisujemy protokół posiewu pierwotnych neuronów na siatkach mikroskopii elektronowej, po którym następuje błyskawiczne zamrażanie, co daje próbki zawieszone w warstwie lodu szklistego. Próbki te można badać za pomocą mikroskopu krioelektronowego w celu wizualizacji struktur w skali nanometrowej.

Przygotowanie neuronów pierwotnych do wizualizacji neurytów w stanie zamrożono-uwodnionym za pomocą tomografii krioelektronowej

Kriomikroskopy elektronowe, zarówno skaningowe (SEM), jak i transmisyjne (TEM), są szeroko stosowane do charakteryzowania próbek biologicznych lub innych materiałów o wysokiej zawartości wody1. SEM/Focused Ion Beam (FIB) służy do identyfikacji interesujących cech próbek i ekstrakcji cienkiej, przezroczystej dla elektronów blaszki w celu przeniesienia do krio-TEM.

Przygotowanie próbki do mikroskopii krioelektronowej za pomocą skupionej wiązki jonów

Przedstawiamy protokół, jak wykorzystać wysokoprzepustową tomografię krioelektronową do określenia wysokiej rozdzielczości struktur in situ maszyn molekularnych. Protokół pozwala na przetwarzanie dużych ilości danych, pozwala uniknąć typowych wąskich gardeł i skraca przestoje zasobów, pozwalając użytkownikowi skupić się na ważnych kwestiach biologicznych.

Korzystanie z Tomoauto: protokół dla wysokowydajnej zautomatyzowanej tomografii krioelektronowej

Ten raport opisuje protokół przygotowania próbki i specyficzne warunki obrazowania do wykonywania skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej grubych próbek biologicznych.

Przygotowanie i obserwacja grubych próbek biologicznych metodą skaningowej transmisyjnej tomografii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Rosnące zapotrzebowanie na gromadzenie danych na dużą skalę w kriogenicznej tomografii elektronowej wymaga wysokoprzepustowych procedur akwizycji obrazów. Opisano tutaj protokół, który wdraża najnowsze osiągnięcia zaawansowanych strategii akwizycji mających na celu maksymalizację efektywności czasowej i przepustowości gromadzenia danych tomograficznych.

Strategie optymalizacji pozyskiwania danych z kriogenicznej tomografii elektronowej

Tutaj prezentujemy proces frezowania wiązki jonów z korelacją 3D, który kieruje przygotowaniem próbek komórkowych do tomografii krioelektronowej. Pozycja 3D fluorescencyjnie znakowanych białek będących przedmiotem zainteresowania jest najpierw określana za pomocą mikroskopii kriofluorescencyjnej, a następnie kierowana do mielenia. Protokół jest odpowiedni dla komórek ssaków, drożdży i bakterii.

Przygotowanie próbki za pomocą korelacyjnego mielenia wiązki jonów w 3D do tomografii krioelektronowej o wysokiej rozdzielczości

Ten proces umożliwia produkcję lamelli, ukierunkowaną na fluorescencyjne struktury biologiczne, które są małe (&lt;1 μm w zasięgu osiowym) i rzadkie (1 kopia na komórkę) przy użyciu kriogenicznej platformy obrazowania trójkokocyklnego. Ta platforma integruje mikroskopię fluorescencyjną, frezowanie wiązką jonową skupioną oraz skaningową mikroskopię elektronową w jednej pozycji ogniskowej, umożliwiając jednoczesną mikroskopię fluorescencyjną podczas frezowania.

Workflow z wykorzystaniem kriogenicznego mikroskopu fluorescencyjnego, elektronowo-jonowego do ukierunkowanego frezowania komórek

Ten protokół wideo ilustruje, jak wykonać skaningową tomografię elektronową mikroskopii transmisyjnej na próbkach wirusologicznych. Dla optymalnych rezultatów próbki przygotowuje się przez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem i późniejszą podstawienie zamrożenia.

Skaningowa transmisyjna tomografia elektronowa w wirusologii: obrazowanie 3D próbek zamrożonych i zamrożonych pod wysokim ciśnieniem

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Poznaj przygotowanie szklistych blaszek z erytrocytów zakażonych Plasmodium falciparum do kriotomografii elektronowej. Ta metoda umożliwia obserwację struktur pasożyta w stanie bliskim naturalnemu.

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Przeglądaj więcej filmów