Przygotowanie blaszek z szklistych próbek biologicznych przy użyciu dwuwiązkowego skaningowego mikroskopu elektronowego do kriotomografii elektronowej

Protokół ten określa przygotowanie blaszek szklistych krwinek czerwonych zakażonych Plasmodium-falciparum do kriotomografii elektronowej. Umożliwia to bezpośrednią obserwację szczegółowych informacji strukturalnych na temat tego, w jaki sposób pasożyt powoduje malarię. Kriotomografia elektronowa rejestruje informacje o wnętrzu komórek w wysokiej rozdzielczości.

Jest wystarczająco silny, aby obserwować pojedyncze kompleksy białkowe in situ, które można obliczeniowo wyodrębnić i uśrednić, aby ujawnić trójwymiarowe informacje strukturalne o białkach. Protokół ten można łatwo dostosować do różnych typów komórek i może być punktem wyjścia dla kogoś, kto dopiero zaczyna wytwarzać blaszki szkliste do kriotomografii elektronowej. To jest Alejandra Carbajal, która dzisiaj będzie przeprowadzać protokół.

Na początek przesiewaj zamrożone miedziane siatki za pomocą CryoStage pod kątem mikroskopu świetlnego, zwracając szczególną uwagę na gradient lodu w poprzek siatki. Sprawdź poszczególne kwadraty siatki pod kątem pokrycia komórek w cieńszych obszarach lodu. Użyj czarnego, nieusuwalnego markera, aby zaznaczyć przód i przeciwną stronę felg Autogrid specyficznych dla Cryo-FIB-SEM.

Załaduj przyciętą siatkę do wahadłowca Cryo-FIB-SEM stroną węglową do góry i nałóż na powierzchnię ogniw obrotową powłokę węglową lub platynową wiązką e-beam o grubości czterech nanometrów. Załaduj wózek do Cryo-FIB-SEM i oceń rozkład ogniw w każdej sieci za pomocą SEM przy pięciu kilowoltach. Przyjrzyj się przeglądowi w małym powiększeniu przy mocy 100, aby przyjrzeć się gradientom lodu na siatce.

Następnie wykonaj zdjęcia w większym powiększeniu o mocy 5 000, aby przyjrzeć się pojedynczym kwadratom siatki. Nałożyć dwumikrometrową warstwę metaloplatynową na powierzchnię każdej siatki, wkładając igłę systemu wtrysku gazu do komory nad siatką i ogrzewając źródło metaloorganicznej platyny do ustalonej temperatury przez określony czas, aby wytworzyć przepływ pary. Aby obserwować próbkę, przechyl próbkę tak, aby płaszczyzna siatki znajdowała się około 10 stopni od kąta padania wiązki jonów i przesuń środek odpowiedniego kwadratu siatki, aby był widoczny zarówno na obrazach SEM, jak i FIB.

używając wiązki jonów o niskim natężeniu prądu, Przyjrzyj się siatce w dużym powiększeniu, aby zwizualizować komórki w środku kwadratu siatki. Zaznacz dwa prostokątne wzory do frezowania, jeden powyżej, a drugi poniżej chronionego obszaru o grubości trzech mikrometrów. Następnie wybierz ustawienia wiązki i popraw astygmatyzm, dostosowując jasność i kontrast.

po zakończeniu konfiguracji rozpocznij frezowanie przy prądzie 300 pikoamperów, monitorując postęp na żywo w widoku wiązki jonów i z przerwami przez SEM. Próbka jest sprawdzana w widoku SEM i po pierwszym mieleniu, Jeśli wiązka jonów nie przebiła się przez próbkę powyżej i poniżej chronionego obszaru, usuń więcej materiału, zwiększając wysokość prostokątnych wzorów. Przerwij frezowanie, gdy powierzchnia nad i pod lamelą jest całkowicie gładka w widoku wiązki jonów.

Powtarzaj proces mielenia krok po kroku, za każdym razem zmniejszając prąd wiązki jonów, aż do osiągnięcia grubości 300 nanometrów. Zapisz położenie X, Y, Z każdej blaszki. Aby wypolerować lamele pod koniec eksperymentu, użyj przeglądu SEM w małym powiększeniu, aby wybrać grupę lameli do polerowania i zaznaczyć nasadę polerską.

Po zaznaczeniu korzenia polerskiego zmniejsz przestrzeń między dwoma prostokątnymi wzorami do 100 do 200 nanometrów i rozpocznij polerowanie przy prądzie wiązki jonów o natężeniu 30 pikoamperów. Monitoruj postęp za pomocą SEM przy dwóch do trzech kilowoltach. Przerwij polerowanie, gdy kontrast w blaszce zostanie utracony przez SEM lub gdy powłoka organiczno-platoorganiczna lub sama blaszka zaczyna tracić integralność.

Pobieraj i zapisuj obrazy SEM każdej lameli w małym powiększeniu. Po zakończeniu eksperymentu wyjmij czółenko z mikroskopu. Usuń siatki z lamelami i przechowuj je pod ciekłym azotem.

Z kratkami należy obchodzić się ostrożnie. Aby zbadać morfologię, schizonty zostały zatrzymane na różnych etapach wychodzenia przy użyciu związku drugiego w inhibitorach E-64. W obecności związku drugiego granica między błonami parazytoforycznymi a otaczającą hemoglobiną w krwinkach czerwonych gospodarza była dobrze określona.

Nienaruszona parazytoforyczna wakuola lub PV była wypełniona merozoitami w pojedynczym skupisku kryształów hemozyozy. Kiedy związek dwóch zsynchronizowanych schizontów został wypłukany do E-64, membrana PV została rozerwana, a merozoity rozprzestrzeniły się w RBC. Typowym przykładem dobrego rozmieszczenia komórek na siatce miedzianej są duże czerwone krwinki z dobrze zdefiniowanym obwodem i nienaruszoną błoną wakuoli.

W częściowo zapadniętej czerwonej krwince gospodarza poszczególne merozoity zostały uwidocznione jako małe skupiska komórek. Każdy schizont miał w środku czarną plamkę wskazującą położenie kryształów hemoozy. Po zmieleniu siatki zostały załadowane do TEM w celu zidentyfikowania pozycji lameli i znalezienia odpowiednich obszarów do namierzenia za pomocą tomografii.

Na mikrofotografii próbki można zobaczyć erytrocyty, które niedawno zostało zaatakowane przez merozoit. Merozoit otoczony błoną pochodzącą z komórki gospodarza można było zobaczyć w granicach RBC. Na wierzchołkowym końcu merozoitu wyraźnie widoczne były dwie błony otaczające komórkę i cztery błony ułożone w wierzchołku merozoitu związane z gęstą od elektronów cechą w kształcie grzyba.

W cytoplazmie merozoitu zidentyfikowano zdarzenie fuzji między błoną plazmatyczną merozoitu a wielowarstwowym pęcherzykiem. W dodatkowej analizie TEM blaszki o grubości 230 nanometrów zaobserwowano typową morfologię dojrzałego merozoitu poddanego działaniu E-64. W błonie czerwonych krwinek błonę plazmatyczną merozoitu można zobaczyć z organellami, takimi jak kompleks błony wewnętrznej, pierścienie polarne, mikronemy, ryprotrie i otoczka jądrowa.

Najważniejszą częścią tej techniki jest optymalizacja siatek, aby umożliwić powtarzalną i wydajną produkcję cienkich lameli. Dalszy rozwój tej techniki umożliwi naukowcom wizualizację pojedynczych cząsteczek białkowych w obrębie pasożytów malarii i określenie ich roli w wychodzeniu malarii.