Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek
26 kwietnia 2021
Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.
Stentor coeruleus od dawna jest wykorzystywany jako organizm modelowy do zrozumienia regeneracji jednokomórkowej. Podczas gdy oś czasu wizualnej regeneracji morfologicznej jest znana, oś czasu regeneracji funkcjonalnej pozostaje nieznana. Test ten śledzi ruchliwość populacji centrum przechodzącej zsynchronizowaną regenerację, tak aby można było określić ilościowo odzyskiwanie funkcji straty.
Można go dostosować do użytku z innymi typami komórek. Brak bezpiecznego uszczelnienia komory obrazowania spowoduje przeciekanie studzienek jedna w drugą lub tworzenie się pęcherzyków powietrza wewnątrz studzienek. Dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z używaniem silikonowych przekładek, zdecydowanie zalecamy, aby PSW lub inne czyste medium zostało odpipetowane do każdej ze studzienek w celu sprawdzenia szczelności przed użyciem.
Budowa komór na próbki jest łatwiejsza do pokazania niż do słownego opisania. Podobnie jak proces wyodrębniania wzorców ruchliwości z pozyskanych danych wideo. Na początek wytnij kawałek silikonowego arkusza dystansowego o grubości 250 mikrometrów, nieco mniejszy zarówno pod względem wysokości, jak i szerokości niż szkiełko mikroskopowe.
Użyj całego stempla, aby utworzyć okrągłe studnie, pozostawiając wystarczającą przestrzeń między sąsiednimi studniami, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Rozpocznij regenerację aparatu ustnego poprzez inkubację komórek stentora stentorowego sinawy w 10% sacharozie lub 2% moczu przez dwie minuty. Następnie umyj trzy razy świeżym podłożem.
Delikatnie odpipetować około 10 stentorów do każdej studzienki. Zwracanie uwagi na jak najdokładniejsze dopasowanie objętości próbki do objętości studzienki. Zamknij studzienki, delikatnie opuszczając kawałek szkła nakrywkowego na studzienki, zaczynając od jednej krawędzi.
Użyj wąskiego i lekko elastycznego przedmiotu, takiego jak końcówka do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby docisnąć szkło nakrywkowe w miejscu, w którym styka się z arkuszem silikonu, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw mikroskop na najmniejsze dostępne powiększenie, tak aby dobrze pasował do ramy. Rozpocznij film poklatkowy i nagraj dziesięciosekundowy film z prędkością 30 klatek na sekundę z każdego dołka w każdym punkcie czasowym.
Aby przeprowadzić kalibrację, uzyskaj wyraźny obraz szkiełka kalibracyjnego lub przezroczystej linijki przy tych samych ustawieniach powiększenia, co filmy. Korzystając z dowolnego programu do przeglądania obrazów, policz liczbę pikseli między znakami znanej odległości fizycznej. Pobierz dwa skrypty, śledź komórki i czyste ślady do łatwej do zapamiętania lokalizacji na komputerze i przenieś filmy z danymi również na ten komputer.
Uporządkuj filmy z danymi w folderach. Po jednym dla każdego punktu czasowego. Użyj komórek śledzenia skryptu, aby wykonać automatyczne śledzenie komórek w filmach z danymi, otwierając komórki ścieżki i uruchamiając skrypt Wybierz dodaj do ścieżki"jeśli pojawi się monit w wyskakującym okienku, co zwykle ma miejsce tylko wtedy, gdy skrypt jest uruchamiany po raz pierwszy z danego folderu.
Po wyświetleniu monitu wybierz co najmniej jeden film wideo z danymi, aby rozpocząć śledzenie. Przejdź do filmów z danymi i gdy jesteś zadowolony z listy plików, kliknij otwarty"Aby ręcznie odrzucić anomalne lub fałszywe ślady, otwórz czyste ślady w oknie edytora MATLAB, klikając dwukrotnie plik. Po wyświetleniu monitu wybierz dane wyjściowe folderu danych według komórek ścieżki.
Przejdź do jednego z utworzonych folderów i wybierz go. Po wyświetleniu monitu wprowadź jeden, aby zachować ślad, i zero, aby odrzucić ślad. Następnie naciśnij enter, aby przejść do następnego śladu.
Zacznij od pobrania skryptu zatytułowanego spaghetti plots. Otwórz i uruchom skrypt. Gdy pojawi się okno przeglądarki plików z monitem, wybierz folder, który chcesz otworzyć.
Przejdź do folderu jednego z punktów czasowych. Po wyświetleniu monitu o kalibrację, jaka jest liczba pikseli na milimetr? Wpisz wartość kalibracji i naciśnij enter.
W razie potrzeby dostosuj osie wykresu, zmieniając wiersz 55 skryptu, który domyślnie jest ustawiony na RR równa się cztery. dla uwzględnienia promienia do czterech milimetrów. Uratuj działkę.
Wyniki pokazują zbiorową ruchliwość populacji komórek stentorowych po dwóch, trzech, siedmiu i ośmiu godzinach procesu regeneracji aparatu ustnego. Wykresy te pokazują zarówno oczekiwany wzrost liczby ruchliwych osobników, jak i czterokrotny wzrost zasięgu najbardziej ruchliwych komórek w populacji. Najszybsze komórki pływające, jeśli zostaną uruchomione blisko krawędzi, nie mogą pływać całkowicie w linii prostej, a ich zakres ruchu wydaje się mniejszy.
Komórki przewodu pokarmowego podzielono na trzy odrębne kategorie: nieruchliwe bez widocznego trzymania mocno, nieruchliwe z widocznym mocnym trzymaniem i ruchliwe. Wynik pokazał ułożony w stos histogram podsumowujący względną liczbę komórek w tych kategoriach jako funkcję naszej regeneracji. W późniejszych czasach znaczna liczba komórek została znaleziona w koloniach z widocznymi mocami mocującymi, co silnie sugeruje, że badały środowisko i preferencyjnie przyczepiały się w pobliżu innych komórek swojego gatunku.
Ważne jest, aby wybrać wymiary studzienki próbki, które dobrze sprawdzają się w przypadku stentora sinawego, które mają około jednego milimetra. Obejmuje to silikonową przekładkę o średnicy 5/16 cala i 10 komórek na studzienkę. Liczby te należy dostosować podczas dostosowywania tego protokołu do innych typów komórek.
Test ten można przeprowadzić w połączeniu z RNA-I w celu zbadania i porównania regeneracji różnych fenotypów stentora.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia test służący do ilościowego pomiaru ruchliwości Stentor coeruleus podczas regeneracji aparatu gębowego (OA). Dzięki synchronizacji regeneracji i śledzeniu ruchu komórek w czasie, protokół ten umożliwia szczegółową analizę powrotu funkcji oraz zmian behawioralnych u jednokomórkowego organizmu modelowego. Metoda ta łączy autorskie komory obrazowania, mikroskopię poklatkową oraz zautomatyzowaną analizę wideo, aby zapewnić wiarygodne statystyki ruchliwości w dużych populacjach komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Biologia regeneracji
- Analiza behawioralna organizmów jednokomórkowych
Wstęp
- Stentor coeruleus jest klasycznym modelem badań nad regeneracją organizmów jednokomórkowych.
- Podczas gdy ramy czasowe regeneracji morfologicznej są znane, ramy czasowe powrotu funkcji są słabiej poznane.
- Badania transkryptomiczne ujawniły złożoną regulację genów podczas regeneracji, co sugeruje systemową reorganizację komórkową.
- Konieczne jest opracowanie ilościowych testów w celu powiązania faz ekspresji genów ze zmianami behawioralnymi.
Cel badania
- Opracowanie i zademonstrowanie testu do ilościowego oznaczania motywności podczas regeneracji OA u S. coeruleus.
- Uchwycenie skali czasowej i statystyk zmian w ruchu podczas regeneracji.
- Dostarczenie narzędzia możliwego do adaptacji w celu przesiewania fenotypów motywności w innych typach komórek.
Zastosowane metody
- Konstrukcja niestandardowych komór obrazujących z wykorzystaniem silikonowych dystansów i szkiełek podstawowych w celu utworzenia szczelnych dołków.
- Indukcja regeneracji OA poprzez inkubację komórek w 10% sacharozy lub 2% mocznika, a następnie przemywanie.
- Pozyskiwanie filmów time-lapse w określonych odstępach czasu przy użyciu mikroskopii o niskim powiększeniu.
- Zautomatyzowane śledzenie komórek i oczyszczanie ścieżek ruchu za pomocą niestandardowych skryptów MATLAB.
- Klasyfikacja stanów ruchliwości komórek i analiza statystyczna zachowania populacji w czasie.
Główne wyniki
- Po utracie OA S. coeruleus początkowo traci ruch ukierunkowany.
- Znaczący spadek prędkości pływania zaobserwowano między ~4 a ~8 godzinami po indukcji.
- Wraz z postępem regeneracji wzrastają wzorce i zakres ruchliwości, z czterokrotnym zwiększeniem zasięgu najbardziej ruchliwych komórek.
- Komórki sklasyfikowano do kategorii nieruchliwych (z uchwytem/bez uchwytu) i ruchliwych; późniejsze punkty czasowe wykazują zwiększone tworzenie kolonii i eksplorację środowiska.
Wnioski
- Test zapewnia ilościowe ramy do badania regeneracji funkcjonalnej u organizmów jednokomórkowych.
- Zmiany ruchliwości korelują z fazami regeneracji i mogą być powiązane z podstawową dynamiką ekspresji genów.
- Protokół można dostosować do innych typów komórek i łączyć z metodami perturbacji genetycznych, takimi jak RNAi.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza motoryki podczas regeneracji aparatu gębowego u Stentor coeruleus umożliwia funkcjonalne fenotypowanie regeneracji komórkowej, co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania. Test ten stanowi skalowalną platformę łączącą dynamikę ekspresji genów z obserwowalnymi efektami behawioralnymi, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów oraz screeningu fenotypowym. Jego adaptacyjność do innych typów komórek sprawia, że jest on narzędziem wielokrotnego zastosowania w ramach międzyportfelowych inicjatyw B+R.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie ram czasowych powrotu do sprawności funkcjonalnej po ukierunkowanej perturbacji.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez kwantyfikację wyników fenotypowych poszczególnych faz regulacji genów.
- Ułatwia zwiększenie pewności predykcyjnej w wiązaniu zdarzeń molekularnych z obserwowalnymi zachowaniami komórek.
- Zapewnia platformę do analizy porównawczej w obrębie różnych tła genetycznych lub interwencji.
Przesiewanie i rozwój testów
- Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wskaźniki ruchliwości do wysokoprzepustowego przesiewu fenotypowego.
- Umożliwia reprodukowalną klasyfikację stanów ruchliwości w dużych populacjach komórek.
- Wspiera skalowalność testów oraz ich adaptację do różnych modeli jednokomórkowych lub małych modeli wielokomórkowych.
- Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszych etapów funkcjonalnych lub genetycznych procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje funkcjonalne fenotypowanie z danymi transkryptomicznymi i molekularnymi w celu zapewnienia ciągłości translacyjnej.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju w oparciu o analizę ryzyka poprzez kwantyfikację regeneracji i punktów końcowych behawioralnych.
- Wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego w procesie wyboru i walidacji modeli przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten test śledzenia motylowości integruje się z ciągiem procesów badawczych, od wczesnego testowania hipotez, poprzez przesiewy fenotypowe, aż po walidację modeli przedklinicznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie powrotu funkcji i zmian behawioralnych powiązanych z fazami ekspresji genów.
- Przesiewanie: Zapewnienie powtarzalnych, ilościowych wyników ruchliwości do analiz porównawczych.
- Analityka: Generowanie odczytów statystycznych i rozkładów ruchliwości na poziomie populacji w celu rzetelnego porównania warunków.
- Badania translacyjne: Łączenie danych molekularnych i fenotypowych w celu optymalizacji wyboru modeli przedklinicznych.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Adaptowalny protokół umożliwiający szerokie zastosowanie w różnych typach komórek i w różnych liniach genetycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad regeneracją funkcjonalną.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje fenotypowanie motoryki i umożliwia skalowalne, reprodukowalne generowanie danych.
- Wartość strategiczna: Ułatwia podejmowanie decyzji typu go/no-go i zwiększa efektywność kapitałową poprzez powiązanie punktów końcowych na poziomie molekularnym i behawioralnym.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz decyzje dotyczące rozwoju wielu programów jednocześnie.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w hodowli komórek, obrazowaniu oraz ilościowej analizie danych.
- Wymaga dostępu do mikroskopii poklatkowej (time-lapse) oraz infrastruktury obliczeniowej do automatycznego śledzenia obiektów.
- Wymaga standaryzacji konstrukcji komory obrazowania i skryptów przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Adaptacja do innych typów komórek może wymagać optymalizacji wymiarów dołków oraz gęstości zasiewu komórek.
- Zapewnienie szczelności komory jest kluczowe dla uniknięcia artefaktów technicznych i zachowania jakości danych.
