Name: Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Poznaj metodę analizy ruchliwości Stentor coeruleus podczas regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórkowego i mikroskopii czasowej. Protokół umożliwia ilościową ocenę odbudowy funkcjonalnej w modelu jednokomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była częściowo wspierana przez Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Dziękujemy Evanowi Burnsowi, Mitowi Patelowi, Melanie Melo i Skylar Widman za pomoc w niektórych wstępnych analizach i testach kodu. Dziękujemy Markowi Slabodnickowi za dyskusję i sugestie. WFM potwierdza wsparcie z grantu NIH R35 GM130327.

UWAGA: Populacja około stu komórek S. coeruleus została wyhodowana zgodnie z wcześniej opublikowanym protokołem JoVE8.
1. Przygotowanie próbki
<ol>
	<li>Wytnij kawałek silikonowego arkusza dystansowego o grubości 250 μm (tabela materiałów) nieco mniejszego zarówno pod względem wysokości, jak i szerokości niż szkiełko mikroskopowe. Za pomocą dziurkacza 5/16" utwórz okrągłe studnie. Należy pamiętać o pozostawieniu wystarczającej przestrzeni między sąsiednimi studzienkami, aby zapewnić dobre uszczelnienie. 
	UWAGA: Uznano, że odstęp 3 mm między sąsiednimi studniami jest wystarczający. Przy odrobinie wprawy na jednym szkiełku można umieścić dziesięć studzienek.</li>
	<li>Rozpocznij regenerację choroby zwyrodnieniowej stawów poprzez inkubację komórek w 10% sacharozie lub 2% moczniku przez 2 minuty (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Następnie umyj trzy razy świeżym medium8. Delikatnie odpipetować około dziesięciu stentorów do każdej studzienki. Należy zachować ostrożność przy jak najdokładniejszym dopasowaniu objętości próbki do objętości studzienki. 
	UWAGA: W przypadku zastosowanych tutaj wymiarów studzienki do każdej studzienki odpipetowano 12,5 μl próbki.</li>
	<li>Zamknij studzienki, delikatnie opuszczając kawałek szkła nakrywkowego (patrz Tabela materiałów) nad studzienkami, zaczynając od jednej krawędzi. Użyj wąskiego i lekko elastycznego przedmiotu, takiego jak końcówka do pipety o pojemności 10 μl, aby docisnąć szklaną pokrywę w miejscu, w którym styka się z arkuszem silikonowym, aby zapewnić dobre uszczelnienie.</li>
</ol>
2. Mikroskopia światła widzialnego poklatkowa
<ol>
	<li>Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw powiększenie na najmniejsze dostępne, tak aby jedna studzienka zmieściła się w kadrze w całości. 
	UWAGA: W tym protokole w mikroskopie zastosowano adapter aparatu 1,6x i powiększenie 1x na obiektywie.</li>
	<li>Rozpocznij film poklatkowy. Uzyskaj 10-sekundowe wideo przy 30 klatkach na sekundę z każdej studni w każdym punkcie czasowym. Jeśli używasz zestawu mikroskopowego z zmotoryzowanym stolikiem XY, zautomatyzuj cały film poklatkowy. W przeciwnym razie upewnij się, że użytkownik jest obecny w każdym punkcie czasu, aby ręcznie przetłumaczyć próbkę w celu zarejestrowania każdego dołka. 
	UWAGA: Unikaj pozostawiania próbki oświetlonej, gdy nie obrazuje, aby uniknąć ogrzewania i parowania. Objętości próbek są małe, a parowanie doprowadzi do powstania pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Zapisywanie filmów w formacie TIFF, MOV lub AVI. 
	UWAGA: Są to najpopularniejsze typy plików wideo, które nie są zastrzeżone. W zależności od konkretnego oprogramowania mikroskopowego, filmy mogą być domyślnie zapisywane w zastrzeżonym typie pliku, ale następnie można je wyeksportować do jednego z wyżej wymienionych typów plików.</li>
	<li>Użyj współczynnika konwersji piksel na milimetr dla skali fizycznej i wykonaj kalibrację lub użyj znanego rozmiaru piksela z używanej kamery. Aby przeprowadzić kalibrację, uzyskaj wyraźny obraz szkiełka kalibracyjnego lub przezroczystej linijki przy tych samych ustawieniach powiększenia, co filmy. Korzystając z dowolnego programu do przeglądania obrazów, policz liczbę pikseli między znacznikami znanej odległości fizycznej. 
	UWAGA: Na przykład, jeśli na obrazie linijki znaki 1 mm i 2 mm są oddzielone od siebie o 100 pikseli, współczynnik konwersji wynosi 1 mm na 100 pikseli. Alternatywnie, aby określić ten współczynnik na podstawie rozmiaru piksela aparatu, po prostu pomnóż rozmiar piksela aparatu przez powiększenie. Na przykład, jeśli używany aparat ma piksele 3,45 μm, a użyte powiększenie wynosiło 1,6x, konwersja wynosi 3,45 μm * 1,6 = 5,52 μm na 1 piksel.</li>
</ol>
3. Śledzenie komórek
<ol>
	<li>Pobierz dwa skrypty, TrackCells.m i CleanTraces.m, do łatwej do zapamiętania lokalizacji na komputerze. Jeśli dane wideo nie znajdują się jeszcze na tym komputerze, przenieś je do tego komputera. 
	UWAGA: Filmy z danymi i skrypty nie muszą znajdować się w tym samym folderze.</li>
	<li>Uporządkuj filmy z danymi w folderach, po jednym dla każdego punktu czasowego. Najpierw użyj skryptu TrackCells.m, aby wykonać automatyczne śledzenie komórek w filmach wideo z danymi. Otwórz TrackCells.m i uruchom skrypt.</li>
	<li>Wybierz opcję Dodaj do ścieżki, jeśli pojawi się monit w wyskakującym okienku., co zwykle ma miejsce tylko wtedy, gdy skrypt jest uruchamiany po raz pierwszy z danego folderu. Po wyświetleniu monitu wybierz co najmniej jeden film wideo z danymi, aby rozpocząć śledzenie, przejdź do filmów wideo z danymi (sekcja 2). Zaznacz wiele plików wideo, klikając z wciśniętym Shift, klikając z wciśniętym Control lub przytrzymując lewy przycisk myszy podczas przesuwania nad plikami, aby je podświetlić.</li>
	<li>Po zadowoleniu z listy plików w polu Nazwa pliku: u dołu okna monitu kliknij Otwórz. Najpierw wykonaj test na jednym filmie, aby upewnić się, że wszystkie parametry są ustawione poprawnie (patrz dyskusja poniżej). 
	UWAGA: Ten skrypt utworzy teraz folder dla każdego wybranego pliku wideo. Następnie zapisze w tym folderze każdą klatkę wideo jako plik .jpg oraz plik o nazwie position_estimates.mat, który zawiera wszystkie ślady znalezione w filmie. W zależności od rozmiaru filmów, liczby filmów i szybkości komputera, działanie tego skryptu może zająć wiele godzin.</li>
</ol>
4. Weryfikacja śladów
<ol>
	<li>Przed kontynuowaniem sprawdź, czy kroki opisane w sekcji 3 zostały wykonane poprawnie, sprawdzając, czy nie ma żadnych komunikatów o błędach. Użyj skryptu CleanTraces.m, aby ręcznie odrzucić nietypowe lub fałszywe ślady. Otwórz CleanTraces.m w oknie edytora MATLAB, klikając dwukrotnie plik.</li>
	<li>Po wyświetleniu monitu Wybierz folder danych wyjściowych przez TrackCells.m. Będzie miał taką samą nazwę jak plik wideo, przejdź do jednego z folderów utworzonych zgodnie z opisem w sekcji 3. Wybierz tylko jeden folder. 
	UWAGA: Ten skrypt będzie teraz wyświetlał ślady jeden po drugim w wyskakującym okienku. Są one nakładane na klatkę wideo, w której zaczyna się ślad, w kolorze zielonym, oraz klatkę wideo, w której ślad się kończy, w kolorze karmazynowym. W związku z tym prawidłowy ślad powinien łączyć zieloną komórkę i komórkę karmazynową.</li>
	<li>Po wyświetleniu monitu wprowadź wartość 1, aby zachować ślad i 0, aby odrzucić ślad. Naciśnij Enter, aby przejść do następnego śladu. 
	UWAGA: Nowe ślady będą wyświetlane do momentu, gdy nie będzie już żadnych śladów lub nie zostanie pokazanych pierwszych sześćdziesięciu. Po zakończeniu tego procesu skrypt automatycznie utworzy folder o nazwie CLEAN TRACES do zapisywania danych wyjściowych i wyświetli wszystkie pozostałe ślady na pierwszej klatce wideo (Rysunek 1B). Ten obraz jest automatycznie zapisywany jako LabeledTraces.png do wykorzystania w przyszłości. Wszystkie ślady, które użytkownik zdecydował się zachować, zostaną zapisane w pliku clean_traces.mat.</li>
	<li>Wykonaj ten krok dla wszystkich filmów w jednym punkcie czasowym, zanim przejdziesz dalej. 
	UWAGA: W przypadku danych zawartych w tym manuskrypcie uzyskano jeden film wideo dla każdej studni w każdym punkcie czasowym, co daje w sumie dziesięć filmów wideo na punkt czasowy.</li>
</ol>
5. Wizualizacja danych
UWAGA: Aby wizualnie porównać ruchliwość całej populacji komórek w różnych punktach czasowych, wszystkie ślady z sekcji 4 zostały przetłumaczone tak, aby zaczynały się od początku i tworzyły jeden wykres przemieszczenia radialnego w funkcji czasu dla każdego punktu czasowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C-F, zobacz Rysunek Uzupełniający S1 dla wszystkich punktów czasowych).
<ol>
	<li>Zacznij od pobrania skryptu zatytułowanego SpaghettiPlots.m. Otwórz i uruchom skrypt. Gdy pojawi się okno przeglądarki plików z monitem Wybierz folder czasu zawierający dane studni (clean_traces.mat) do wykresu, przejdź do folderu jednego z punktów czasowych. Zwróć uwagę, że ten folder powinien zawierać w sobie folder dla każdego z analizowanych filmów.</li>
	<li>Po wyświetleniu monitu Kalibracja: Jaka jest liczba pikseli na milimetr?, wpisz wartość kalibracji znajdującą się w kroku 2.4 i naciśnij Enter. 
	UWAGA: Skrypt połączy teraz ślady ze wszystkich analizowanych filmów w tym momencie w jeden wykres (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C-F). Słabe kropkowane okręgi na wykresie wskazują przemieszczenia promieniowe 1, 2, 3 i 4 mm.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj osie wykresu, zmieniając wiersz 55 skryptu, który domyślnie jest ustawiony na rr = 4 w celu uwzględnienia promienia do 4 mm. Zapisz wykres.</li>
</ol>

<ol><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration%3B+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li>
<li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).</li>
<li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788(2017).</li>
<li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecnie istnieje wiele algorytmów śledzenia cząstek i komórek, niektóre całkowicie bezpłatne. Koszt i łatwość obsługi to często kompromisy wymagające kompromisu. Ponadto wiele z istniejących programów do śledzenia komórek jest zaprojektowanych do śledzenia powolnego ruchu pełzania komórek hodowli tkankowych, a nie szybkiego ruchu pływackiego Stentora, który obraca się podczas pływania i może ulegać nagłym zmianom kierunku. Po przetestowaniu wielu z tych opcji, przedstawiony tutaj protokół ma być kompleksowym roz...

Stentor coeruleus (Stentor) jest dobrze znanym organizmem modelowym, który był używany do badania regeneracji jednokomórkowej ze względu na jego duży rozmiar, zdolność do wytrzymania kilku technik mikrochirurgicznych i łatwość hodowli w warunkach laboratoryjnych1,2,3. Wczesne badania nad regeneracją koncentrowały się na największej i najbardziej morfologicznie odrębnej cesze Stentora – chorobie zrodowej stawów – która całkowicie znika po wstrząsie chemicznym4,5,6. Zastąpienie de novo utraconej choroby zwyrodnieniowej stawów rozpoczyna się od pojawienia się nowego pasma błoniastego – układu rzęsek, które stopniowo przesuwają się w kierunku przedniej części komórki, zanim utworzą funkcjonalną chorobę zwyrodnieniową stawów w ciągu ośmiu etapów morfologicznych3. Etapy te były obserwowane sekwencyjnie, niezależnie od temperatury, i stanowią uniwersalny punkt odniesienia dla prawie wszystkich badań5.
Mechanistyczna analiza regeneracji Stentora wymaga narzędzi do pomiaru czasu regeneracji, które są na tyle solidne i proste, że można je zastosować do wielu próbek jako część chemicznego lub molekularnego badania. Standardową metodą wykonywania testu komórkowego jest obrazowanie, w tym przypadku obrazowania powstawania nowej choroby zwyrodnieniowej stawów podczas regeneracji. Jednak takie testy oparte na obrazowaniu są najbardziej skuteczne, gdy regenerująca się struktura zawiera odrębne składniki molekularne, które można wykorzystać jako markery, tak aby można je było łatwo wykryć na obrazie fluorescencyjnym. W przypadku choroby zwyrodnieniowej stawów Stentor znane składniki (rzęski, ciała podstawne) są również obecne na pozostałej powierzchni komórki; w związku z tym rozpoznanie przywrócenia otwartego dostępu nie może być osiągnięte jedynie poprzez poszukiwanie obecności lub braku komponentu.
Raczej, jakaś forma rozpoznawania kształtu byłaby wymagana do wykrycia choroby zwyrodnieniowej stawów, co jest potencjalnie bardzo trudne, biorąc pod uwagę fakt, że komórki Stentora często zmieniają kształt poprzez szybki proces kurczenia. W pracy przedstawiono alternatywny test regeneracji, który opiera się na ruchliwej aktywności ciała i rzęsek w chorobie zwyrodnieniowej stawów. W miarę regeneracji choroby zwyrodnieniowej stawów nowo powstałe rzęski ulegają powtarzalnym zmianom położenia i aktywności, co z kolei wpływa na ruchliwość pływania komórki. Analizując ruchliwość, możliwe jest przeprowadzenie testu "regeneracji funkcjonalnej", który określa ilościowo regenerację poprzez ilościowe określenie funkcji zregenerowanych struktur. Poprzednia analiza funkcji rzęsek Stentor podczas regeneracji wykorzystywała prędkość obrazowania cząstek, w połączeniu z kulkami znacznikowymi dodanymi do pożywki zewnętrznej, aby zaobserwować zmiany we wzorcu przepływu na różnych etapach regeneracji7; Jednak takie podejście wymaga pracochłonnego obrazowania pojedynczych komórek i powiązanych z nimi pól przepływu, jedna po drugiej.
Używając ruchu samej komórki jako wskaźnika przepływu generowanego przez rzęski, możliwe byłoby równoległe analizowanie większej liczby komórek, przy użyciu systemów obrazowania o niskiej rozdzielczości, kompatybilnych z platformami przesiewowymi o wysokiej przepustowości. Test ten można w zasadzie wykorzystać do badania rozwoju i regeneracji funkcjonalnej innych organizmów pływających w skali od setek mikronów do milimetrów. Sekcja 1 protokołu opisuje konstrukcję wielodołkowego szkiełka do pobierania próbek, które pozwala na wysokoprzepustowe obrazowanie populacji komórek przez okres do całego dnia. Znajdują się szczegółowe informacje na temat dostosowywania do użytku z innymi typami komórek. Sekcja 2 protokołu obejmuje pozyskiwanie danych wideo do tego testu, które można przeprowadzić za pomocą mikroskopu preparacyjnego z cyfrową lustrzanką jednoobiektywową. Sekcja 3 protokołu zawiera przewodnik po śledzeniu komórek i obliczaniu prędkości komórek przy użyciu kodu MATLAB (informacje uzupełniające). Sekcja 4 protokołu wyjaśnia, jak przekształcić wyniki liczbowe w wykresy, jak pokazano na Rysunek 1C-F i Rysunek 2C dla łatwej interpretacji wyników.

<table><tbody><tr><td>Arkusz silikonowy o grubości 0,25 mm</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CWS-S-0,25</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50 mm, #1,5 szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1034527</td><td>Jak zauważono w Dyskusji, można użyć mniejszego szkła nakrywkowego, jeśli na jednym szkiełku umieści się mniej studzienek na próbki.</td></tr><tr><td>Użyliśmy aparatu</td><td></td><td></td> CCD <td>Użyliśmy Nikon D750</td></tr><tr><td>Chlamydomonas 137c WT szczep</td><td>Chlamydomonas Centrum zasobów</td><td>CC-125</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab Image Processing Toolbox</td><td>MATHWORKS</td><td></td><td>potrzebne dla TrackCells.m i CleanTraces.m</td></tr></tbody></table>

analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus jest dobrze znanym organizmem modelowym do badań nad regeneracją jednokomórkową. Analiza transkryptomiczna pojedynczych komórek ujawniła setki genów – wiele z nich nie jest związanych z aparatem ustnym (OA) – które są różnie regulowane w fazach podczas całego procesu regeneracji. Postawiono hipotezę, że ta systemowa reorganizacja i mobilizacja zasobów komórkowych w kierunku wzrostu nowej choroby zwyrodnieniowej stawów doprowadzi do obserwowalnych zmian w ruchu i zachowaniu odpowiadających w czasie fazom zróżnicowanej ekspresji genów. Jednak złożoność morfologiczna S. coeruleus wymagała opracowania testu w celu uchwycenia statystyk i skali czasowej. Do śledzenia komórek w krótkich filmach użyto niestandardowego skryptu, a statystyki zostały skompilowane na dużej populacji (N ~ 100). Po utracie choroby zwyrodnieniowej stawów S. coeruleus początkowo traci zdolność do ruchu kierunkowego; Następnie zaczynając od ~4 h, wykazuje znaczny spadek prędkości aż do ~8 h. Test ten stanowi użyteczne narzędzie do badań przesiewowych fenotypów ruchliwości i może być dostosowany do badania innych organizmów.

Celem niniejszego testu jest ilościowe określenie stopniowych zmian wzorców ruchu oraz etapowego wzrostu prędkości poruszania się komórek w obrębie dużej (N ~100) regenerującej się populacji Stentor. Aby ułatwić interpretację wyników, dołączony do niniejszego protokołu niestandardowy kod generuje dwa rodzaje wykresów: nałożenie wszystkich ścieżek ruchu komórek w zestawie danych wideo (Rysunek 1C-F oraz Rysunek S1) oraz wykres prędko...

Przedstawiamy protokół charakteryzacji ruchliwości i zachowania populacji komórek o rozmiarach stu mikronów do milimetrów za pomocą mikroskopii jasnego pola i śledzenia komórek. Ten test ujawnia, że Stentor coeruleus przechodzi przez cztery behawioralnie odrębne fazy podczas regeneracji utraconego aparatu ustnego.

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Stentor coeruleus od dawna jest wykorzystywany jako organizm modelowy do zrozumienia regeneracji jednokomórkowej. Podczas gdy oś czasu wizualnej regeneracji morfologicznej jest znana, oś czasu regeneracji funkcjonalnej pozostaje nieznana. Test ten śledzi ruchliwość populacji centrum przechodzącej zsynchronizowaną regenerację, tak aby można było określić ilościowo odzyskiwanie funkcji straty.Można go dostosować do użytku z innymi typami komórek. Brak bezpiecznego uszczelnienia komory obrazowania spowoduje przeciekanie studzienek jedna w drugą lub tworzenie się pęcherzyków powietrza wewnątrz studzienek. Dla badaczy, którzy nie są zaznajomieni z używaniem silikonowych przekładek, zdecydowanie zalecamy, aby PSW lub inne czyste medium zostało odpipetowane do każdej ze studzienek w celu sprawdzenia szczelności przed użyciem.Budowa komór na próbki jest łatwiejsza do pokazania niż do słownego opisania. Podobnie jak proces wyodrębniania wzorców ruchliwości z pozyskanych danych wideo. Na początek wytnij kawałek silikonowego arkusza dystansowego o grubości 250 mikrometrów, nieco mniejszy zarówno pod względem wysokości, jak i szerokości niż szkiełko mikroskopowe.Użyj całego stempla, aby utworzyć okrągłe studnie, pozostawiając wystarczającą przestrzeń między sąsiednimi studniami, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Rozpocznij regenerację aparatu ustnego poprzez inkubację komórek stentora stentorowego sinawy w 10% sacharozie lub 2% moczu przez dwie minuty. Następnie umyj trzy razy świeżym podłożem.Delikatnie odpipetować około 10 stentorów do każdej studzienki. Zwracanie uwagi na jak najdokładniejsze dopasowanie objętości próbki do objętości studzienki. Zamknij studzienki, delikatnie opuszczając kawałek szkła nakrywkowego na studzienki, zaczynając od jednej krawędzi.Użyj wąskiego i lekko elastycznego przedmiotu, takiego jak końcówka do pipety o pojemności 10 mikrolitrów, aby docisnąć szkło nakrywkowe w miejscu, w którym styka się z arkuszem silikonu, aby zapewnić dobre uszczelnienie. Umieść próbkę na stoliku mikroskopu i ustaw mikroskop na najmniejsze dostępne powiększenie, tak aby dobrze pasował do ramy. Rozpocznij film poklatkowy i nagraj dziesięciosekundowy film z prędkością 30 klatek na sekundę z każdego dołka w każdym punkcie czasowym.Aby przeprowadzić kalibrację, uzyskaj wyraźny obraz szkiełka kalibracyjnego lub przezroczystej linijki przy tych samych ustawieniach powiększenia, co filmy. Korzystając z dowolnego programu do przeglądania obrazów, policz liczbę pikseli między znakami znanej odległości fizycznej. Pobierz dwa skrypty, śledź komórki i czyste ślady do łatwej do zapamiętania lokalizacji na komputerze i przenieś filmy z danymi również na ten komputer.Uporządkuj filmy z danymi w folderach. Po jednym dla każdego punktu czasowego. Użyj komórek śledzenia skryptu, aby wykonać automatyczne śledzenie komórek w filmach z danymi, otwierając komórki ścieżki i uruchamiając skrypt Wybierz dodaj do ścieżki"jeśli pojawi się monit w wyskakującym okienku, co zwykle ma miejsce tylko wtedy, gdy skrypt jest uruchamiany po raz pierwszy z danego folderu.Po wyświetleniu monitu wybierz co najmniej jeden film wideo z danymi, aby rozpocząć śledzenie. Przejdź do filmów z danymi i gdy jesteś zadowolony z listy plików, kliknij otwarty"Aby ręcznie odrzucić anomalne lub fałszywe ślady, otwórz czyste ślady w oknie edytora MATLAB, klikając dwukrotnie plik. Po wyświetleniu monitu wybierz dane wyjściowe folderu danych według komórek ścieżki.Przejdź do jednego z utworzonych folderów i wybierz go. Po wyświetleniu monitu wprowadź jeden, aby zachować ślad, i zero, aby odrzucić ślad. Następnie naciśnij enter, aby przejść do następnego śladu.Zacznij od pobrania skryptu zatytułowanego spaghetti plots. Otwórz i uruchom skrypt. Gdy pojawi się okno przeglądarki plików z monitem, wybierz folder, który chcesz otworzyć.Przejdź do folderu jednego z punktów czasowych. Po wyświetleniu monitu o kalibrację, jaka jest liczba pikseli na milimetr? Wpisz wartość kalibracji i naciśnij enter.W razie potrzeby dostosuj osie wykresu, zmieniając wiersz 55 skryptu, który domyślnie jest ustawiony na RR równa się cztery. dla uwzględnienia promienia do czterech milimetrów. Uratuj działkę.Wyniki pokazują zbiorową ruchliwość populacji komórek stentorowych po dwóch, trzech, siedmiu i ośmiu godzinach procesu regeneracji aparatu ustnego. Wykresy te pokazują zarówno oczekiwany wzrost liczby ruchliwych osobników, jak i czterokrotny wzrost zasięgu najbardziej ruchliwych komórek w populacji. Najszybsze komórki pływające, jeśli zostaną uruchomione blisko krawędzi, nie mogą pływać całkowicie w linii prostej, a ich zakres ruchu wydaje się mniejszy.Komórki przewodu pokarmowego podzielono na trzy odrębne kategorie: nieruchliwe bez widocznego trzymania mocno, nieruchliwe z widocznym mocnym trzymaniem i ruchliwe. Wynik pokazał ułożony w stos histogram podsumowujący względną liczbę komórek w tych kategoriach jako funkcję naszej regeneracji. W późniejszych czasach znaczna liczba komórek została znaleziona w koloniach z widocznymi mocami mocującymi, co silnie sugeruje, że badały środowisko i preferencyjnie przyczepiały się w pobliżu innych komórek swojego gatunku.Ważne jest, aby wybrać wymiary studzienki próbki, które dobrze sprawdzają się w przypadku stentora sinawego, które mają około jednego milimetra. Obejmuje to silikonową przekładkę o średnicy 5/16 cala i 10 komórek na studzienkę. Liczby te należy dostosować podczas dostosowywania tego protokołu do innych typów komórek.Test ten można przeprowadzić w połączeniu z RNA-I w celu zbadania i porównania regeneracji różnych fenotypów stentora.

analysis-motility-patterns-stentor-during-after-oral-apparatus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Demonstrujemy, że nadekspresja receptorówy czynnika wzrostu naskórka (EGFR) zwiększa ruchliwość neuralnych komórek macierzystych (NSCs) z wykorzystaniem nowatorskiego urządzenia mikroprzepływowego opartego na żelu agarozy. Technologia ta może być łatwo zaadaptowana do innych systemów komórek ssaków, w których źródła komórek są ograniczone, takie jak ludzkie neuralne komórki macierzyste, a czas realizacji badania jest krytyczny.

Ocena mobilności neuronalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem mikroprzepływowego urządzenia opartego na żelu agarozy

Ocena motoryki okrężnicy w dystalnej części jelita grubego świnki morskiej przy użyciu monitora motoryki przewodu pokarmowego (Gastrointestinal Motility Monitor – GIMM) jest prostym i łatwym do opanowania podejściem do ilościowej oceny motoryki propulsywnej w przewodzie pokarmowym.

Monitor Motoryki Przewodu Pokarmowego (GIMM)

Obrazowanie time-lapse trójwymiarowych kultur tkankowych umożliwia badanie zachowań migracyjnych poszczególnych komórek pochodzących z wyniesienia zwojowego w reakcji na frakcjonowany ekstrakt białkowy z kory mózgu.

Zachowanie migracyjne komórek generowanych w kulturach eminencji zwojowej

Opisano wiarygodną metodę badania odpowiedzi ruchowych zewnętrznych komórek rzęskowych (OHC), obejmującą elektromotywność, motywność powolną oraz zginanie. Motywność OHC jest wywoływana poprzez stymulację zewnętrznym przemiennym polem elektrycznym, a metoda wykorzystuje szybką rejestrację obrazu, oświetlenie LED oraz najnowszej generacji oprogramowanie do analizy obrazu.

Badanie ruchliwości zewnętrznych komórek rzęskowych przy użyciu kombinacji zewnętrznej stymulacji zmiennym polem elektrycznym oraz wysokoprzepustowej analizy obrazu

Gigantyczny orzęsek Stentor coeruleus to klasyczny system do badania regeneracji i gojenia się ran w pojedynczych komórkach. Poprzez obrazowanie komórek Stentora jednocześnie przy małym i dużym powiększeniu, można mierzyć przepływy cytoplazmatyczne przed, w trakcie i po zranieniu.

Wizualizacja przepływu cytoplazmatycznego podczas gojenia się ran jednokomórkowych w stentorze sinawym

Naszym celem było zaprojektowanie, wyprodukowanie i przetestowanie ferromagnetycznych stentów do wychwytywania komórek śródbłonka. Dziesięć stentów przetestowano pod kątem złamań, a 10 kolejnych stentów przetestowano pod kątem magnetyzmu zatrzymanego. Na koniec przetestowano 10 stentów in vitro, a 8 kolejnych stentów wszczepiono 4 świniom, aby wykazać wychwytywanie i zatrzymywanie komórek.

Ferromagnetyczny stent z gołego metalu do wychwytywania i zatrzymywania komórek śródbłonka

Ostatnio dostępne techniki nagrywania wideo i mapowania czasoprzestrzennego (STmap) umożliwiają wizualizację i ilościowe określenie zarówno propagacji, jak i mieszania wzorców motoryki jelit. Celem tego protokołu jest wyjaśnienie generowania i analizy map STmap przy użyciu systemu monitorowania ruchliwości przewodu pokarmowego (GIMM).

Mapowanie czasoprzestrzenne ruchliwości jelit w preparatach ex vivo jelit

Ostatnie odkrycia sugerują, że bakteryjne silniki wiciowe wyczuwają różne sygnały środowiskowe i w odpowiedzi na nie przebudowują się. Oczekuje się, że omówione tutaj testy perełkowe pomogą wyjaśnić rolę przebudowy w adaptacji komórek do stresorów środowiskowych.

Biofizyczna charakterystyka funkcji motorycznych wici

Gigantyczny orzęsek, Stentor coeruleus, jest doskonałym systemem do badania regeneracji i gojenia się ran. Przedstawiono procedury zakładania hodowli komórek Stentor z pojedynczych komórek lub fragmentów komórek, indukowania regeneracji poprzez cięcie komórek, chemicznej indukcji regeneracji pasma błoniastego i aparatu jamy ustnej, obrazowania i analizy regeneracji komórek.

Metody badania regeneracji w stentorze

Wiele bakterii wykorzystuje ruchliwość sterowaną wiciami do poruszania się po swoim środowisku i kolonizowania korzystnego otoczenia, zarówno indywidualnie, jak i zbiorowo. Zademonstrowano tutaj zastosowanie trzech uznanych metod, które wykorzystują ruchliwość jako narzędzie selekcyjne do identyfikacji składników/ścieżek przyczyniających się do pływania i ruchliwości roju.

Badanie ruchliwości sterowanej wiciami u Escherichia coli poprzez zastosowanie trzech ustalonych technik w serii

Przedstawiamy protokół izolacji i hodowli pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymalnych podniebienia myszy do obrazowania poklatkowego dwuwymiarowego (2D) wzrostu i gojenia ran. Udostępniamy również metodologię analizy danych z obrazowania poklatkowego w celu określenia powstawania strumienia komórkowego i ruchliwości kierunkowej.

Izolacja i obrazowanie poklatkowe pierwotnych embrionalnych komórek mezenchymy podniebiennej myszy w celu analizy zbiorowych atrybutów ruchowych

Poznaj metodę analizy ruchliwości Stentor coeruleus podczas regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórkowego i mikroskopii czasowej. Protokół umożliwia ilościową ocenę odbudowy funkcjonalnej w modelu jednokomórkowym.

Analiza wzorców ruchliwości stentora w trakcie i po regeneracji aparatu jamy ustnej z wykorzystaniem śledzenia komórek

Przeglądaj więcej filmów