Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Jest to nowatorski, niewymagający litografii protokół do modelowania 3D skin-on-chip przy użyciu mikroobrabianych, samoprzylepnych warstw winylu i metodologii przepływu równoległego do generowania kompaktów skórnych. Mikroobrabiany winyl zapewnia większą prostotę procesu produkcji i wszechstronność w układzie urządzenia, pokonując niektóre ograniczenia PDMS i tradycyjnego podejścia litograficznego. Ta wielowarstwowa metoda typu skin-on-a-chip może być wykorzystywana do testowania leków i kosmetyków, ponieważ umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe przy niższych kosztach i może być wykorzystywana do modelowania kilku chorób.

Zacznij od zaprojektowania chipa mikroprzepływowego za pomocą oprogramowania Brother Canvas Workspace. Utwórz przestrzeń roboczą o wymiarach 30 na 30 centymetrów i wypełnij ją wzorcami projektowymi dla różnych warstw chipa przed zapisaniem jej w pliku svg. Wytnij arkusze winylu o wymiarach 30 na 30 centymetrów.

Przyklej go do maty samoprzylepnej o niskiej przyczepności i w razie potrzeby wyeliminuj wszystkie pęcherzyki powietrza. Za pomocą dysku USB prześlij plik svg do plotera krawędziowego i ustaw parametry cięcia jako ciśnienie cięcia na poziomie zero, ostrze tnące na poziomie trzecim i poziom pierwszy dla prędkości cięcia. Po ustawieniu parametrów należy umieścić matę samoprzylepną wraz z winylem w ploterze i rozpocząć proces wycinania wzorów kanałów na winylu o grubości 95 mikrometrów.

Zmontuj całe urządzenie za pomocą wyrównywacza do prawidłowej regulacji kanałów, wlotów i wylotów. Ułóż warstwę winylu z odpowiednią konstrukcją mikromaszyny do montażu dolnego kanału, zachowując taśmę zakrywającą dolnej warstwy, aby uniknąć przyklejania się do nakładki. Wytnij i umieść porowatą membranę poliwęglanową na górze dolnego kanału, nie zakrywając wlotów.

Dodaj 10 warstw winylu z konstrukcją górnej komory i przyklej ostatnią warstwę taśmy dwustronnej na wierzchu. Wyjmij chip z nakładki, aby przykleić go do szkiełka podstawowego. Umieść arkusz PDMS o grubości dwóch milimetrów na wierzchu warstwy winylu z taśmą dwustronną.

Aby upewnić się, że chip jest całkowicie wodoszczelny, pozostaw ciężarek na wierzchu chipa na noc. Następnego dnia wysterylizuj chip, przepłukując go 70% etanolem przez pięć minut, a następnie umyj wodą destylowaną. Podłącz pompę pierwszą i pompę drugą odpowiednio do wlotu pierwszej komory górnej i wlotu drugiej komory górnej.

Podłącz pompę trzecią do wlotu dolnej komory, a następnie podłącz wyloty górnej i dolnej komory do wanny na odpady. Podłączyć strzykawki do każdego wlotu za pomocą rurek PTFE i złączy ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18. Pompować PBS z pompą trzecią przez dolny wlot komory z prędkością 50 mikrolitrów na minutę, a z pompą drugą przez wlot górnej komory dwie z prędkością 100 mikrolitrów na minutę.

Następnie załaduj strzykawkę wstępnym żelem fibrynogenu, natychmiast umieść ją w pierwszej pompie i uruchom z prędkością 200 mikrolitrów na minutę. Gdy żel wstępny opuści wylot górnej komory, przerwij pompowanie pierwsze i drugie, a następnie, bez wyjmowania rurki, pozostaw chip do żelowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po galaretowi zablokować wlot górnej komory pierwszej nasadką i przepompować pożywkę hodowlaną przez wlot drugiej górnej komory pompą trzecią z pompą trzecią z prędkością 50 mikrolitrów na godzinę przez noc.

24 godziny po wytworzeniu komory skórnej sprawdzić, czy ludzkie pierwotne komórki fibroblastów są rozproszone w zespole, a następnie wprowadzić pięć razy 10 do 6 HKC na mililitr przez wlot górnego kanału dwa z prędkością 40 mikrolitrów na minutę przez jedną minutę. W celu przyłączenia komórek umieść chip na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nasyconym wilgocią. Rozpocznij pompowanie świeżej pożywki hodowlanej za pomocą pompy trzeciej tylko przez dolny wlot komory z prędkością 50 mikrolitrów na minutę.

W analizie reprezentatywnej wyświetlana jest wysokość hydrożelu wzdłuż górnej komory zespołu. Średnia wysokość 550 mikrometrów była optymalna dla funkcjonowania żelu przy natężeniach przepływu 100 i 200 mikrolitrów na minutę odpowiednio dla PBS ofiarnego i żelu wstępnego. Niepowodzenie przepłukania PBS przez dolny kanał doprowadziło do rozbieżności między teoretyczną wysokością żelu a zmierzoną, z różnicą 40%Po 24 godzinach od zainicjowania protokołu przepływu równoległego stwierdzono, że ludzkie pierwotne fibroblasty zostały pomyślnie rozprowadzone w żelu fibrynowym w górnej komorze zespołu, następnie HKC wykazujące ekspresję białek zielonej fluorescencji można skutecznie wysiać na wierzchu hydrożelu.

Usunięcie rurki bez zamykania systemu na noc, aby umożliwić osadzanie się HKCS, spowodowało powstanie niejednolitej, zlewającej się monowarstwy cells. 3D analiza konfokalna niezróżnicowanego modelu skóry w chipie mikroprzepływowym wyraźnie pokazała powierzchnię hydrożelu oddzielającego HKC na górze od fibroblastu osadzonego na dole. Wytworzona skóra może być wystawiona na działanie granicy faz powietrze/ciecz w celu uzyskania dojrzałego i zróżnicowanego naskórka, a następnie scharakteryzowana za pomocą kilku markerów skórnych i naskórkowych.

Technika ta pozwala na szybszą i tańszą produkcję urządzeń oraz generowanie wielowarstwowej skóry przy użyciu mikrofluidyki, zapewniając bardziej realistyczne podejście do testowania leków i kosmetyków.