Name: Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 30 s
Description: Poznaj metodę tworzenia uproszczonego modelu skin-on-a-chip z użyciem mikroobrabianych warstw winylowych i mikroprzepływowej platformy. Technika umożliwia szybkie, tanie generowanie trójwymiarowej skóry do testowania leków i kosmetyków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Serdecznie dziękujemy dr Javierowi Rodríguezowi, dr Maríi Luisie López, Carlosowi Matellánowi i Juanowi Francisco Rodríguezowi za bardzo pomocne sugestie, dyskusje i/lub wstępne dane. Serdecznie dziękujemy również Sergio Férnandezowi, Pedro Herrerosowi i Larze Stolzenburg za wkład w ten projekt. Specjalne podziękowania kierujemy do dr Marty Garcíi za hFB i hKC z oznaczeniem GFP. Na koniec doceniamy doskonałą pomoc techniczną ze strony Guillermo Vizcaíno i Angélicy Corral. Prace te były wspierane przez "Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid", Project S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Prace te były również wspierane przez "Programa de excelencia", Project EPUC3M03, CAM. CONSEJERÍA DE EDUCACIÓN E INVESTIGACIÓN.

1. Projekt układu i parametry mikrobiegłości
<ol>
	<li>Zaprojektuj warstwy układu mikroprzepływowego w darmowym programie do projektowania FreeCAD; wymiary kanałów znajdują się w Tabeli 1. W projekcie uwzględnij cztery otwory o średnicy 2.54 mm, aby umożliwić zastosowanie niestandardowego urządzenia pozycjonującego w celu poprawnej superpozycji warstw.</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Długość (μm)</td>
			<td>Szerokość (μm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komora dolna</td>
			<td>28,400</td>
			<td>800</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Komora górna</td>
			<td>31,000</td>
			<td>800</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Wymiary górnego i dolnego kanału urządzenia.
<ol start="2">
	<li>Przyciąć przezroczyste, samoprzylepne arkusze winylu o grubości 95 µm do kwadratów o wymiarach 30 cm x 30 cm, aby pasowały do plotera.</li>
	<li>Użyć oprogramowania Brother CanvasWorkspace do utworzenia obszaru roboczego o wymiarach 30 cm x 30 cm i wypełnić go zaprojektowanymi wzorami dla różnych warstw chipa (Rysunek 1A). Zapisać projekt w pliku .svg.</li>
	<li>Wyciąć arkusze winylu 30 cm x 30 cm za pomocą plotera (Rysunek 1B-D).
	<ol>
		<li>Przykleić arkusz winylu do maty z klejem o niskiej przyczepności i w razie potrzeby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza.</li>
		<li>Wgrać plik .svg do plotera i ustawić parametry cięcia: ostrze tnące: poziom 3; nacisk cięcia: poziom 0; prędkość cięcia: poziom 1. Umieścić matę z winylem w ploterze i rozpocząć proces wycinania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciąć wzór górnego kanału na dwustronnej taśmie winylowej o grubości 12 µm, postępując zgodnie z poprzednimi krokami.</li>
</ol>
<img alt="Proces wycinania z winylu, schemat, sprzęt, mata klejąca, wycinarka laserowa, przygotowanie materiału." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Projekt układu i proces mikrobobróbki. (A) Układ w oprogramowaniu przedstawiający obszar roboczy wypełniony wzorami górnym i dolnym zaprojektowanymi dla układu. (B) Ploter krawędziowy podczas procesu wycinania; przedstawiono ostrze tnące, cały arkusz winylu oraz matę klejącą. (C) Odrywanie wyciętego wzoru z winylu z arkusza. (D) Próbka klejącej warstwy winylu z wyciętym wzorem górnego kanału. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig1v2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
2. Wytwarzanie warstwy PDMS
<ol>
	<li>Wymieszaj PDMS z utwardzaczem w stosunku 10:1 (v/v), a następnie umieść mieszaninę w próżni na 15 min w celu usunięcia pęcherzyków powietrza. Wlej 55 mL mieszaniny do kwadratowej naczynia hodowlanego o powierzchni 55 cm2, aby uzyskać warstwę o grubości 2 mm. Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą igły.</li>
	<li>Utwardź mieszaninę (krok 2.1) w piekarniku przez 1 h w temperaturze 80 °C. Wyjmij PDMS z formy i potnij go na prostokąty o wymiarach odpowiadających chipowi. Wykonaj otwory na rurki za pomocą igły do strzykawki 18 G.</li>
</ol>
3. Montaż chipa
UWAGA: Aby lepiej zrozumieć proces, zapoznaj się z Rysunkiem 2.
<ol>
	<li>Zmontuj całe urządzenie, używając wyrównywacza do odpowiedniego dopasowania kanałów, wlotów i wylotów. Nałóż na siebie cztery warstwy winylu (z odpowiednim dolnym mikrowzorem) w celu zbudowania dolnego kanału, pozostawiając taśmę ochronną na dolnej warstwie, aby zapobiec przywieraniu do wyrównywacza.</li>
	<li>Wytnij i umieść porowatą membranę z poliwęglanu (PC) na górze dolnego kanału, aby oddzielić go od kanału górnego. Należy uważać, aby nie zasłonić wlotów dolnego kanału.</li>
	<li>Dodaj dziesięć warstw winylu z projektem górnej komory. Na górze naklej warstwę winylu z taśmą dwustronną i wzorem górnego kanału. Zdejmij chip z wyrównywacza i przyklej go do szkiełka przedmiotowego.</li>
	<li>Na warstwie winylu z taśmą dwustronną umieść arkusz PDMS o grubości 2 mm, aby zapewnić odpowiednie zakotwiczenie rurek i zapobiec wyciekom. Pozostaw obciążenie na chipie przez noc, aby upewnić się, że jest on całkowicie wodoszczelny. Sterylizuj chip, przepłukując go 70% v/v etanolem przez 5 min, a następnie przemyj wodą destylowaną H2O.</li>
</ol>
<img alt="Schemat montażu urządzenia mikroprzepływowego i ustawienie dla eksperymentów płynowych, warstwy PDMS, system membranowy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Montaż chipa mikroprzepływowego. (A) Ogólny schemat montażu urządzenia. Komory dolna i górna składają się odpowiednio z czterech i jedenastu nałożonych na siebie arkuszy winylu. (B) Widoki z góry i z boku chipa mikroprzepływowego. Kanały górny i dolny przedstawiono odpowiednio w kolorze różowym i niebieskim. (C) Obraz montażu chipa z użyciem specjalnie wykonanego pozycjonera. (D) Obraz chipa po całkowitym montażu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
4. Podłączenia pompy
UWAGA: Schematyczne przedstawienie połączeń pomp znajduje się na Rysunku 3.
<ol>
	<li>Podłącz pompę 1 do wlotu 1 górnej komory (UCi1).</li>
	<li>Podłącz pompę 2 do wlotu 2 górnej komory (UCi2).</li>
	<li>Podłącz pompę 3 do wlotu dolnej komory (LCi).</li>
	<li>Podłącz wylot górnej komory (UCo) oraz wylot dolnej komory (LCo) do rurki odpływowej.</li>
	<li>Podłącz strzykawki do każdego wlotu, używając rurek z politetrafluoroetylenu (PTFE) i stalowych złączek 18 G.</li>
</ol>
<img alt="Układ do cytometrii przepływowej z trzema pompami, systemem mikroprzepływowym i rurką odpływową. Schemat i zdjęcie z eksperymentu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Połączenia pomp oraz lokalizacja wlotów i wylotów. (A) Schemat przedstawiający połączenie trzech różnych pomp z ich odpowiednimi wlotami. Wyloty są połączone z pojemnikiem na odpady. (B) Zdjęcie chipa z oznakowanymi wlotami i wylotami. Skróty: LCi = wlot do dolnej komory; LCo = wylot z dolnej komory; UCi1 = wlot 1 do górnej komory; UCi2 = wlot 2 do górnej komory; UCo = wylot z górnej komory. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
5. Hodowla komórkowa
UWAGA: Linia komórkowa HaCaT pochodzenia komercyjnego. Ludzkie pierwotne fibroblasty pochodzą od zdrowych dawców i zostały pobrane z kolekcji próbek biologicznych pochodzenia ludzkiego zarejestrowanej w „Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III”.
<ol>
	<li>Pracuj w komorze do hodowli komórkowych, uprzednio wysterylizowanej światłem ultrafioletowym i przetartej etanolem.</li>
	<li>Rozmroź komórki H2B-GFP-HaCaT (ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty skóry, hKCs) oraz GFP-ludzkie pierwotne fibroblasty (hFBs) w temperaturze 37 °C, dodaj 2 mL pożywki hodowlanej i wiruj przez 7 min w temperaturze 20 °C przy 250 × g. 
	UWAGA: Komórki H2B-GFP-HaCaT to ludzkie unieśmiertelnione keratynocyty zmodyfikowane w celu ekspresji hybrydowej histony H2B-zielone białko fluorescencyjne (GFP), co nadaje ich jądrom zieloną fluorescencję. GFP-hFBs to ludzkie pierwotne fibroblasty przetransformowane wektorem pLZRS-IRES-EGFP w celu ekspresji cytoplazmatycznej zielonej fluorescencji. Komórki te zostały zmodyfikowane zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami30,31</li>
	<li>Hoduj zarówno hKCs, jak i hFBs w 1x DMEM uzupełnionym o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% roztworu antybiotyków/antymykotyków. Przed użyciem podgrzej pożywkę hodowlaną do temperatury 37 °C.</li>
	<li>Odczep komórki, przemywając je 1x solą fizjologiczną w buforze fosforanowym (PBS), dodając 2 mL trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) i inkubując przez 10 min w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zneutralizuj trypsynę, dodając 4 mL pożywki hodowlanej. Resuspenduj komórki i przenieś je do probówki o pojemności 15 mL. Pobierz 10 µL w celu zliczenia komórek w komorze Neubauera i ustalenia odpowiedniego stężenia.</li>
	<li>Wiruj probówkę 15 mL przez 7 min w temperaturze 20 °C przy 250 × g. Usuń nadsącz i resuspenduj osad do pożądanego stężenia: hFBs do 50 000 komórek/mL oraz hKCs do 5·× 106 komórek/mL.</li>
</ol>
6. Przygotowanie roztworu fibrinogenu przed żelowaniem
<ol>
	<li>Aktywować trombinę, dodając 1mL CaCl2 (1% w/v w NaCl) do fiolki.</li>
	<li>Dodać następujące składniki, aby otrzymać 1 mL hydrożelu fibrynowego o końcowym stężeniu fibryny 3,5 mg/mL: 59 µL aktywowanej trombiny (10 jednostek NIH/mL), 59 µL kwasu traneksamowego (Tabela Materiałów, 100 mg/mL), 764 µL pożywki hodowlanej zawierającej 50 000 hFBs/mL, 118 µL fibrynogenu (20 mg/mL w NaCl (0,9% w/v)). 
	UWAGA: Fibrynogen należy dodać na samym końcu.</li>
</ol>
7. Protokół przepływu równoległego
<ol>
	<li>Przez cały proces pompuj 1x PBS pompą 3 przez LCi z prędkością 50 µL/min.</li>
	<li>Pompuj płyn poświęcalny (1x PBS) pompą 2 przez UCi2 z prędkością 100 µL/min.</li>
	<li>Napełnij strzykawkę preżelem, szybko umieść ją w pompie 1 i uruchom z prędkością 200 µL/min (Rysunek 4A).</li>
	<li>Zatrzymaj pompy 1 i 2, gdy preżel opuści UCo.</li>
	<li>Pozostaw chip z podłączonymi przewodami w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 min, aby umożliwić żelowanie.</li>
	<li>Przez całą noc pompuj pożywkę hodowlaną pompą 3 przez UCi2 z prędkością 50 µL/h.</li>
	<li>Zablokuj UCi1 za pomocą korka.</li>
</ol>
8. Wysiewanie monowarstwy hKCs
<ol>
	<li>Pod mikroskopem należy sprawdzić, czy hFB są rozprzestrzenione 24 h po utworzeniu przedziału skórnego.</li>
	<li>Wprowadź hKCs za pomocą pompy 2 przez UCi2 w stężeniu 5 × 106 komórek/ml przy 40 µL/min przez 1 min (Rycina 4B).</li>
	<li>Pozostawić chip przez noc w 37 °C w inkubatorze z nasyconą wilgotnością w celu adhezji komórek.</li>
	<li>Pompowanie świeżej pożywki za pomocą pompy 3 wyłącznie przez LCi przy 50 µL/min (Rycina 4C).</li>
</ol>
<img alt="Schemat modelu skóry: warstwowanie hFb przed żelowaniem (A), integracja medium hodowlanego hkCs (B), ekspozycja na powietrze (C), przekrój poprzeczny (D)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62353/62353fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4: Protokół mikroprzepływowy dla generowania konstruktu skórno-epidermalnego. (A) Przekrój poprzeczny przedstawiający proces przepływu równoległego w celu wytworzenia przedziału skórnego. (B) Wysiew monowarstwy keratynocytów 24 h po wytworzeniu przedziału skórnego. (C) Utrzymywanie hodowli komórkowej wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego. (D) Rekonstrukcja przekroju poprzecznego skóry wewnątrz chipa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62353/62353fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
9. Test żywotności komórek
UWAGA: Zestaw Live/Dead barwi komórki na zielono lub czerwono w zależności od tego, czy są żywe, czy martwe. Aby uzyskać prawidłowe rozróżnienie żywotności, w tym kroku należy użyć niefluorescencyjnych hKCs i hFBs. Wszystkie etapy procedury są realizowane za pomocą UCi2 z pompą 2.
<ol>
	<li>Przemyć górny kanał 1x PBS przez 5 min z przepływem 50 µL/min, aby usunąć pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Przepompować powietrze, aby usunąć 1x PBS z przepływem 50 µL/min.</li>
	<li>Przygotować roztwór z zestawu Calcein AM/Ethidium homodimer-1 Kit (Live/Dead) zgodnie z instrukcją producenta.</li>
	<li>Przepompować roztwór Live/Dead z przepływem 50 µL/min przez 2 min.</li>
	<li>Inkubować przez 30 min w temperaturze 37 °C w ciemności.</li>
	<li>Przemyć górny kanał, pompując 1x PBS z przepływem 50 µL/min przez 2 min, aby usunąć pozostałości odczynnika.</li>
	<li>Obserwować próbkę pod mikroskopem konfokalnym. W przypadku komórek żywych i martwych zastosować odpowiednio długość fali wzbudzenia 495/590 nm oraz długość fali emisji 519/617 nm.</li>
</ol>

<ol><li>McNamee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+tiered+approach+to+the+use+of+alternatives+to+animal+testing+for+the+safety+assessment+of+cosmetics%3A+Eye+irritation%5BTitle%5D)+AND+%22Regulatory+Toxicology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation.</a> Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).</li>
<li>Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+skin+models+in+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">The use of skin models in drug development.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 81-102 (2014).</li>
<li>Abd, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+the+testing+of+transdermal+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Pharmacology%3A+Advances+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Skin models for the testing of transdermal drugs.</a> Clinical Pharmacology: Advances and Applications. 8, 163-176 (2016).</li>
<li>Flaten, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+skin+models+as+a+tool+in+optimization+of+drug+formulation%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">In vitro skin models as a tool in optimization of drug formulation.</a> European Journal of Pharmaceutical Sciences. 75, 10-24 (2015).</li>
<li>Avci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+skin+disease+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models of skin disease for drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 8 (3), 331-355 (2014).</li>
<li>Mak, I. W., Evaniew, N., Ghert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lost+in+translation%3A+animal+models+and+clinical+trials+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Lost in translation: animal models and clinical trials in cancer treatment.</a> American Journal of Translational Research. 6 (2), 114-118 (2014).</li>
<li>Pronko, P. P., VanRompay, P. A., Zhang, Z., Nees, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronko+et+al.+Reply%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Pronko et al. Reply.</a> Physical Review Letters. 86 (7-12), 1387(2001).</li>
<li>H.R.2858 - Humane Cosmetics Act. 114th Congress. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858">https://congress.gov/bill/114th-congress/house-bill/2858</a> (2016).</li>
<li>Global in-vitro toxicology testing market report: size, share & trends analysis 2014-2015. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html">https://www.prnewswire.com/news-releases/global-in-vitro-toxicology-testing-market-report-size-share--trends-analysis-2014-2025-300704958.html</a> (2018).</li>
<li>Zhang, Z., Michniak-Kohn, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineered+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Tissue engineered human skin equivalents.</a> Pharmaceutics. 4 (1), 26-41 (2012).</li>
<li>OECD. In vitro skin corrosion: reconstructed human epidermis (RhE) test method. Test Guideline No.431. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22OECD+Guideline+for+Testing+of+Chemicals%22">OECD Guideline for Testing of Chemicals</a>. , (2019).</li>
<li>Almeida, A., Sarmento, B., Rodrigues, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+on+in+vitro+models+for+safety+and+toxicity+assessment+of+cosmetic+ingredients%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients.</a> International Journal of Pharmaceutics. 519 (1-2), 178-185 (2017).</li>
<li>vanden Broek, L. J., Bergers, L. I. J. C., Reijnders, C. M. A., Gibbs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+future+Prospectives+in+Skin-on-Chip+Development+with+Emphasis+on+the+use+of+Different+Cell+Types+and+Technical+Challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Progress and future Prospectives in Skin-on-Chip Development with Emphasis on the use of Different Cell Types and Technical Challenges.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 418-429 (2017).</li>
<li>Ataç, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+on-a-chip%3A+In+vitro+skin+models+versus+ex+vivo+tissue+maintenance+with+dynamic+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Skin and hair on-a-chip: In vitro skin models versus ex vivo tissue maintenance with dynamic perfusion.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3555-3561 (2013).</li>
<li>Abaci, H. E., Gledhill, K., Guo, Z., Christiano, A. M., Shuler, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pumpless+microfluidic+platform+for+drug+testing+on+human+skin+equivalents%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Pumpless microfluidic platform for drug testing on human skin equivalents.</a> Lab on a Chip. 15 (3), 882-888 (2015).</li>
<li>Wu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-thickness+human+skin-on-chip+with+enhanced+epidermal+morphogenesis+and+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today%22%5BJournal%5D)">Full-thickness human skin-on-chip with enhanced epidermal morphogenesis and barrier function.</a> Materials Today. 21 (4), 326-340 (2017).</li>
<li>Materne, E. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multi-organ+chip+-+a+microfluidic+platform+for+long-term+multi-tissue+coculture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The multi-organ chip - a microfluidic platform for long-term multi-tissue coculture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (98), e52526(2015).</li>
<li>Schimek, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+of+a+full-thickness+skin+equivalent+in+a+96-well+insert+format+for+substance+permeation+studies+and+organ-on-a-chip+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Bioengineering of a full-thickness skin equivalent in a 96-well insert format for substance permeation studies and organ-on-a-chip applications.</a> Bioengineering. 5 (2), 43(2018).</li>
<li>Alberti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-chamber+microfluidic+platform+for+high-precision+skin+permeation+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Multi-chamber microfluidic platform for high-precision skin permeation testing.</a> Lab on a Chip. 17, 1625-1634 (2017).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+BIotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature BIotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+3D+cell+culture+to+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">From 3D cell culture to organs-on-chips.</a> Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).</li>
<li>Wufuer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-on-a-chip+model+simulating+inflammation%2C+edema+and+drug-based+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Skin-on-a-chip model simulating inflammation, edema and drug-based treatment.</a> Scientific Reports. 6, 37471(2016).</li>
<li>Ramadana, Q., Ting, F. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micro-physiological+immune-competent+model+of+the+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">In vitro micro-physiological immune-competent model of the human skin.</a> Lab on a Chip. 16, 1899-1908 (2016).</li>
<li>Kim, K., Jeon, H. M., Choi, K. C., Sung, G. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+effectiveness+of+Curcuma+longa+leaf+extract+on+a+skin+equivalent+using+a+pumpless+skin-on-a-chip+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Testing the effectiveness of Curcuma longa leaf extract on a skin equivalent using a pumpless skin-on-a-chip model.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3898(2020).</li>
<li>Halldorsson, S., Lucumi, E., Gómez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li>
<li>Huh, D., Matthews, B. D., Mammoto, A., Montoya-Zavala, M., Hsin, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituting+organ-level+lung+functions+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reconstituting organ-level lung functions on a chip.</a> Science. 328 (5986), 1662-1668 (2010).</li>
<li>Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+disease+model+of+drug+toxicity+-+induced+pulmonary+edema+in+a+lung-on-a-chip+microdevice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">A human disease model of drug toxicity - induced pulmonary edema in a lung-on-a-chip microdevice.</a> Scientific Translational Medicine. 4 (159), (2012).</li>
<li>Beckwitt, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+%27+organ+on+a+chip+%27%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Liver ' organ on a chip '.</a> Experimental Cell Research. 363 (1), 15-25 (2018).</li>
<li>Poceviciute, R., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-gut-microbiome+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Human-gut-microbiome on a chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 500-501 (2019).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Current Biology. 8 (7), 377-385 (1998).</li>
<li>Escámez, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+optimal+virus-mediated+growth+factor+gene+delivery+for+human+cutaneous+wound+healing+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Assessment of optimal virus-mediated growth factor gene delivery for human cutaneous wound healing enhancement.</a> Journal of Investigative Dermatology. 128 (6), 1565-1575 (2008).</li>
<li>Llames, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+plasma+as+a+dermal+scaffold+for+the+generation+of+a+completely+autologous+bioengineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Human plasma as a dermal scaffold for the generation of a completely autologous bioengineered skin.</a> Transplantation. 77 (3), 350-355 (2004).</li>
<li>Llames, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+results+of+an+autologous+engineered+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Bank%22%5BJournal%5D)">Clinical results of an autologous engineered skin.</a> Cell Tissue Bank. 7 (1), 47-53 (2006).</li>
<li>Cubo, N., Garcia, M., del Cañizo, J. F., Velasco, D., Jorcano, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+bioprinting+of+functional+human+skin%3A+production+and+in+vivo+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">3D bioprinting of functional human skin: production and in vivo analysis.</a> Biofabrication. 9 (1), 015006(2016).</li>
<li>Mori, N., Morimoto, Y., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+integrated+with+perfusable+vascular+channels+on+a+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Skin integrated with perfusable vascular channels on a chip.</a> Biomaterials. 116, 48-56 (2017).</li>
<li>Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contributions+of+microbiome+and+mechanical+deformation+to+intestinal+bacterial+overgrowth+and+inflammation+in+a+human+gut-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), 7-15 (2016).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidics-based+in+vitro+model+of+the+gastrointestinal+human-microbe+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A microfluidics-based in vitro model of the gastrointestinal human-microbe interface.</a> Nature Communications. 7, 11535(2016).</li>
<li>Marx, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-on-a-chip%27+developments%3A+A+translational+cuttingedge+alternative+to+systemic+safety+assessment+and+efficiency+evaluation+of+substances+in+laboratory+animals+and+man%5BTitle%5D)+AND+%22Alternatives+to+Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Human-on-a-chip' developments: A translational cuttingedge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man.</a> Alternatives to Laboratory Animals. 40 (5), 235-257 (2012).</li>
<li>Bein, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organ-on-a-chip+models+of+human+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organ-on-a-chip models of human intestine.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 659-668 (2018).</li>
<li>Bennet, D., Estlack, Z., Reid, T., Kim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+human+corneal+epithelium-on-a-chip+for+eye+drops+mass+transport+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microengineered human corneal epithelium-on-a-chip for eye drops mass transport evaluation.</a> Lab on a Chip. 18, 1539-1551 (2018).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a chip. 12, 2165-2174 (2012).</li>
<li>Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-on-a-chip+microenvironment+induces+human+intestinal+cells+to+undergo+villus+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Gut-on-a-chip microenvironment induces human intestinal cells to undergo villus differentiation.</a> Integrative Biology. 5 (9), 1130-1140 (2013).</li>
<li>O'Neill, A. T., Monteiro-Riviere, N. A., Walker, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microfluidic+human+epidermal+keratinocyte+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Characterization of microfluidic human epidermal keratinocyte culture.</a> Cytotechnology. 56 (3), 197-207 (2008).</li>
<li>Ren, K., Chen, Y., Wu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+materials+for+microfluidics+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">New materials for microfluidics in biology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 25, 78-85 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Motywacją do opracowania tej metody była chęć modelowania chorób skóry oraz badania efektów nowych i innowacyjnych terapii na platformie wysokoprzepustowej. Do tej pory laboratorium to wytwarza te dermo-naskórkowe odpowiedniki poprzez odlewanie - ręcznie lub za pomocą technologii biodruku 3D - żelu fibrynowego z fibroblastami do płytki wprowadzającej do hodowli komórkowej i umieszczanie na niej keratynocytów. Gdy keratynocyty osiągną zbieg, kultura 3D jest wystawiana na działanie granicy faz powietrze-ciecz, która induku...

Ostatnio poczyniono postępy w kierunku rozwoju i produkcji modeli ludzkiej skóry in vitro do analizy toksyczności produktów kosmetycznych i farmaceutycznych1. Naukowcy z branży farmaceutycznej i pielęgnacji skóry wykorzystują zwierzęta, w tym myszy najpowszechniejsze, do testowania swoich produktów2,3,4,5. Jednak testowanie produktów na zwierzętach nie zawsze pozwala przewidzieć reakcję u ludzi, co często prowadzi do niepowodzenia leczenia lub działań niepożądanych u ludzi, a w konsekwencji do strat ekonomicznych5,6. Wielka Brytania była pierwszym krajem, który zakazał wykorzystywania zwierząt do testów kosmetycznych w 1998 roku. Później, w 2013 roku, UE zakazała testowania i zatwierdzania kosmetyków na zwierzętach (rozporządzenie UE w sprawie kosmetyków nr 1223/2009)7.
Ten zakaz jest również rozważany przez inne kraje, np. w 'The Humane Cosmetics Act' w USA8. Oprócz obaw etycznych, różnice anatomiczne między skórą zwierzęcą a ludzką sprawiają, że testy na zwierzętach są czasochłonne, kosztowne i często nieskuteczne. Ponadto oczekuje się, że wielkość globalnego rynku badań toksykologicznych in vitro osiągnie 26,98 mld USD do 2025 r.9. Z tych powodów istnieje potrzeba opracowania nowych metod i alternatyw dla badań in vitro, takich jak bioinżynieryjne modele ludzkiej skóry, które umożliwiają badanie bezpieczeństwa i toksycznego działania kosmetyków i leków bez udziału zwierząt.
Istnieją dwa różne rodzaje dostępnych na rynku modeli ludzkiej skóry in vitro. Pierwszy typ składa się z warstwowych odpowiedników naskórka zawierających wiele warstw różnicujących się keratynocytów, które są osadzone na różnych materiałach. Niektóre z nich zostały zatwierdzone przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD) i zatwierdzone przez (Europejskie Centrum Walidacji Metod Alternatywnych (ECVAM) do badań działania i drażniącego na skórę, takich jak EpiDerm lub SkinEthic10,11,12. Drugi typ to pełnoskórne odpowiedniki z warstwą różnicujących się ludzkich keratynocytów umieszczonych na trójwymiarowym (3D) rusztowaniu zawierającym fibroblasty, takie jak T-Skin i EpiDerm-FT. Jednak modele te są hodowane w warunkach statycznych, co sprawia, że nie są w stanie dokładnie odwzorować warunków fizjologicznych człowieka.
Ostatnie zainteresowanie skupiło się na generowaniu modeli skóry in vitro 3D w formatach wstawiania do hodowli komórkowych (CCI) z dynamiczną perfuzją13,14,15,16,17,18,19. Systemów tych nie można jednak uznać sensu stricto za mikroprzepływowe typu skin-on-chips zgodnie z ich klasyczną definicją w tej dziedzinie. Definicja narządów na chipie według Ingbera mówi, że narząd musi być umieszczony wewnątrz kanałów mikroprzepływowych, co jest warunkiem, że tylko kilka urządzeń spełnia20,21. Do tej pory skin-on-chips modelowały głównie prosty nabłonek jako warstwy jednokomórkowe i/lub warstwy komórek skóry właściwej oddzielone porowatą błoną22,23. Chociaż poczyniono pewne postępy w modelowaniu skóry w układach mikroprzepływowych16,24, obecnie nie ma literatury pokazującej system narządów na chipie, który pasowałby do definicji Ingbera, zdolny do wytwarzania wielowarstwowej skóry in situ i zawierający zarówno składniki nabłonkowe, jak i zrębowe.
W tej pracy prezentowana jest nowa, opłacalna, solidna, oparta na winylu platforma mikroprzepływowa do zastosowań typu skin-on-a-chip. Platforma ta została stworzona przez mikroobróbkę, która zapewnia większą prostotę procesu produkcyjnego, a także zwiększoną elastyczność i wszechstronność w układzie urządzenia, pokonując niektóre ograniczenia PDMS25. Zaprojektowano również sposób na wprowadzenie uproszczonej konstrukcji skóry poprzez równoległy przepływ sterowany za pomocą pomp strzykawkowych. Przepływ równoległy umożliwia perfuzję dwóch płynów o bardzo różnych lepkościach (w tym przypadku buforu i fibryny wstępnej żelu) przez kanał bez mieszania się ze sobą. Jako dowód słuszności koncepcji, do urządzenia wprowadzono konstrukt skórno-naskórkowy zawierający fibroblasty osadzone w macierzy fibrynowej naśladującej skórę właściwą, na którą nałożono monowarstwę keratynocytów w celu naśladowania niezróżnicowanego naskórka. Wysokość komory skórnej można modulować, modyfikując natężenie przepływu. Główną nowością tej pracy, w porównaniu z poprzednio opisanymi modelami22,26,27,28,29, jest opracowanie konstrukcji 3D wewnątrz mikrokomory za pomocą mikrofluidyki. Chociaż w tym artykule przedstawiono uproszczoną, niezróżnicowaną skórę, długoterminowym celem jest wygenerowanie i scharakteryzowanie w pełni zróżnicowanego konstruktu skóry, aby zademonstrować jego żywotność i funkcjonalność do celów testów lekowych i kosmetycznych.

<table><tbody><tr><td>Amchafibryna</td><td>Rottafarm</td><td></td><td>Kwas traneksamowy</td></tr><tr><td>Antybiotyk/Przeciwgrzybiczy</td><td>Thermo Scientific HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane</td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Taśma dwustronna vynil</td><td>ATP Systemy klejowe</td><td></td><td>GM 107CC, 12 i mikro; m gruby</td></tr><tr><td>Ploter krawędziowy</td><td>Brother</td><td></td><td>Scanncut CM900</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Scientific HyClone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Ekstrahowany z ludzkiego osocza</td></tr><tr><td>Szkiełko</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP-Ludzkie fibroblasty skórne-Podstawowe</td><td></td><td></td><td>. Prezent od dr Marty Garc&iacute; </td></tr><tr><td>linia komórkowa H2B-GFP-HaCaT</td><td>ATCC</td><td></td><td>Unieśmiertelnione keratynocyty. Prezent od dr Marty Garc&iacute; </td></tr><tr><td>zestaw Live/dead</td>: <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membrana poliwęglanowa</td><td>Merk TM</td><td></td><td>5 &micro; m wielkość porów</td></tr><tr><td>Polidimetylosiloksan</td><td>Dow Corning</td><td></td><td>Sylgard 184</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>Terumo</td><td></td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>10 NIH/fiolka</td></tr><tr><td>Przezroczysty klej winylowy</td><td>Mactac</td><td></td><td>JT 8500 CG-RT, 95 &micro; m grube</td></tr> rurki <tr><td>Trypsin/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>IDEX</td><td></td><td>Teflon, 1/16" Średnica zewnętrzna, 0,020" Id</td></tr></tbody></table>

generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

Ta praca przedstawia nową, opłacalną i niezawodną platformę mikroprzepływową z potencjałem do generowania złożonych wielowarstwowych tkanek. Jako dowód słuszności koncepcji, wymodelowano uproszczoną i niezróżnicowaną skórę ludzką zawierającą przedział skórny (zrębowy) i naskórkowy (nabłonkowy). Aby to osiągnąć, opracowano wszechstronne i wytrzymałe urządzenie na bazie winylu podzielone na dwie komory, które przezwycięża niektóre wady obecne w urządzeniach mikroprzepływowych opartych na polidimetylosiloksanach (PDMS) do zastosowań biomedycznych, takich jak stosowanie drogiego i specjalistycznego sprzętu lub absorpcja małych, hydrofobowych cząsteczek i białek. Ponadto opracowano nową metodę opartą na przepływie równoległym, która umożliwia osadzanie in situ zarówno przedziałów skórnych, jak i naskórkowych. Konstrukt skóry składa się z macierzy fibrynowej zawierającej ludzkie fibroblasty pierwotne i monowarstwy unieśmiertelnionych keratynocytów usianych na wierzchu, która jest następnie utrzymywana w dynamicznych warunkach hodowli. Ta nowa platforma mikroprzepływowa otwiera możliwość modelowania chorób skóry u ludzi i ekstrapolacji metody w celu wygenerowania innych złożonych tkanek.

Zaprojektowany chip składa się z dwóch komór płynowych oddzielonych membraną poliwęglanową (PC) o rozmiarze porów 5 µm, która umożliwia wzrost komórek poprzez przepuszczanie cząsteczek promujących wzrost z dolnej komory. Górna komora zawiera konstrukt tkankowy, w tym przypadku monowarstwę hKCs na hydrożelu fibrynowym zawierającym hFBs.
Wysokość kanałów jest określona przez liczbę arkuszy klejących dodanych do każdego z nich. Dolna komora składa się z 4 warstw (380 µm), a górna z 10 warstw taśm...

Tutaj prezentujemy protokół do generowania trójwymiarowego, uproszczonego i niezróżnicowanego modelu skóry za pomocą mikroobrabianej platformy mikroprzepływowej. Podejście oparte na przepływie równoległym pozwala na osadzanie na miejscu komory skórnej w celu wysiewu komórek nabłonka na wierzchu, a wszystko to kontrolowane przez pompy strzykawkowe.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Jest to nowatorski, niewymagający litografii protokół do modelowania 3D skin-on-chip przy użyciu mikroobrabianych, samoprzylepnych warstw winylu i metodologii przepływu równoległego do generowania kompaktów skórnych. Mikroobrabiany winyl zapewnia większą prostotę procesu produkcji i wszechstronność w układzie urządzenia, pokonując niektóre ograniczenia PDMS i tradycyjnego podejścia litograficznego. Ta wielowarstwowa metoda typu skin-on-a-chip może być wykorzystywana do testowania leków i kosmetyków, ponieważ umożliwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe przy niższych kosztach i może być wykorzystywana do modelowania kilku chorób.Zacznij od zaprojektowania chipa mikroprzepływowego za pomocą oprogramowania Brother Canvas Workspace. Utwórz przestrzeń roboczą o wymiarach 30 na 30 centymetrów i wypełnij ją wzorcami projektowymi dla różnych warstw chipa przed zapisaniem jej w pliku svg. Wytnij arkusze winylu o wymiarach 30 na 30 centymetrów.Przyklej go do maty samoprzylepnej o niskiej przyczepności i w razie potrzeby wyeliminuj wszystkie pęcherzyki powietrza. Za pomocą dysku USB prześlij plik svg do plotera krawędziowego i ustaw parametry cięcia jako ciśnienie cięcia na poziomie zero, ostrze tnące na poziomie trzecim i poziom pierwszy dla prędkości cięcia. Po ustawieniu parametrów należy umieścić matę samoprzylepną wraz z winylem w ploterze i rozpocząć proces wycinania wzorów kanałów na winylu o grubości 95 mikrometrów.Zmontuj całe urządzenie za pomocą wyrównywacza do prawidłowej regulacji kanałów, wlotów i wylotów. Ułóż warstwę winylu z odpowiednią konstrukcją mikromaszyny do montażu dolnego kanału, zachowując taśmę zakrywającą dolnej warstwy, aby uniknąć przyklejania się do nakładki. Wytnij i umieść porowatą membranę poliwęglanową na górze dolnego kanału, nie zakrywając wlotów.Dodaj 10 warstw winylu z konstrukcją górnej komory i przyklej ostatnią warstwę taśmy dwustronnej na wierzchu. Wyjmij chip z nakładki, aby przykleić go do szkiełka podstawowego. Umieść arkusz PDMS o grubości dwóch milimetrów na wierzchu warstwy winylu z taśmą dwustronną.Aby upewnić się, że chip jest całkowicie wodoszczelny, pozostaw ciężarek na wierzchu chipa na noc. Następnego dnia wysterylizuj chip, przepłukując go 70% etanolem przez pięć minut, a następnie umyj wodą destylowaną. Podłącz pompę pierwszą i pompę drugą odpowiednio do wlotu pierwszej komory górnej i wlotu drugiej komory górnej.Podłącz pompę trzecią do wlotu dolnej komory, a następnie podłącz wyloty górnej i dolnej komory do wanny na odpady. Podłączyć strzykawki do każdego wlotu za pomocą rurek PTFE i złączy ze stali nierdzewnej o rozmiarze 18. Pompować PBS z pompą trzecią przez dolny wlot komory z prędkością 50 mikrolitrów na minutę, a z pompą drugą przez wlot górnej komory dwie z prędkością 100 mikrolitrów na minutę.Następnie załaduj strzykawkę wstępnym żelem fibrynogenu, natychmiast umieść ją w pierwszej pompie i uruchom z prędkością 200 mikrolitrów na minutę. Gdy żel wstępny opuści wylot górnej komory, przerwij pompowanie pierwsze i drugie, a następnie, bez wyjmowania rurki, pozostaw chip do żelowania w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po galaretowi zablokować wlot górnej komory pierwszej nasadką i przepompować pożywkę hodowlaną przez wlot drugiej górnej komory pompą trzecią z pompą trzecią z prędkością 50 mikrolitrów na godzinę przez noc.24 godziny po wytworzeniu komory skórnej sprawdzić, czy ludzkie pierwotne komórki fibroblastów są rozproszone w zespole, a następnie wprowadzić pięć razy 10 do 6 HKC na mililitr przez wlot górnego kanału dwa z prędkością 40 mikrolitrów na minutę przez jedną minutę. W celu przyłączenia komórek umieść chip na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze nasyconym wilgocią. Rozpocznij pompowanie świeżej pożywki hodowlanej za pomocą pompy trzeciej tylko przez dolny wlot komory z prędkością 50 mikrolitrów na minutę.W analizie reprezentatywnej wyświetlana jest wysokość hydrożelu wzdłuż górnej komory zespołu. Średnia wysokość 550 mikrometrów była optymalna dla funkcjonowania żelu przy natężeniach przepływu 100 i 200 mikrolitrów na minutę odpowiednio dla PBS ofiarnego i żelu wstępnego. Niepowodzenie przepłukania PBS przez dolny kanał doprowadziło do rozbieżności między teoretyczną wysokością żelu a zmierzoną, z różnicą 40%Po 24 godzinach od zainicjowania protokołu przepływu równoległego stwierdzono, że ludzkie pierwotne fibroblasty zostały pomyślnie rozprowadzone w żelu fibrynowym w górnej komorze zespołu, następnie HKC wykazujące ekspresję białek zielonej fluorescencji można skutecznie wysiać na wierzchu hydrożelu.Usunięcie rurki bez zamykania systemu na noc, aby umożliwić osadzanie się HKCS, spowodowało powstanie niejednolitej, zlewającej się monowarstwy cells. 3D analiza konfokalna niezróżnicowanego modelu skóry w chipie mikroprzepływowym wyraźnie pokazała powierzchnię hydrożelu oddzielającego HKC na górze od fibroblastu osadzonego na dole. Wytworzona skóra może być wystawiona na działanie granicy faz powietrze/ciecz w celu uzyskania dojrzałego i zróżnicowanego naskórka, a następnie scharakteryzowana za pomocą kilku markerów skórnych i naskórkowych.Technika ta pozwala na szybszą i tańszą produkcję urządzeń oraz generowanie wielowarstwowej skóry przy użyciu mikrofluidyki, zapewniając bardziej realistyczne podejście do testowania leków i kosmetyków.

generation-simplified-three-dimensional-skin-on-chip-model

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisujemy platformę opartą na chipie do trójwymiarowej hodowli komórek w mikrobioreaktorach. Jeden chip może pomieścić do 10 Mio. komórek, które mogą być hodowane w precyzyjnie określonych warunkach pod kątem przepływu cieczy, ciśnienia tlenu itp. w sterylnym, zamkniętym obiegu.

Trójwymiarowa hodowla komórek na chipie w przepływowych mikrobioreaktorach

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Platforma mikrokanałów na chipie została opracowana przez połączenie techniki fotorezystu fotolitografii rozpływowej, miękkiej litografii i mikrofluidyki. Platforma mikrokanalizacyjna naśladuje trójwymiarową (3D) geometrię mikronaczyń in vivo, działa w kontrolowanym ciągłym przepływie perfuzyjnym, umożliwia wysokiej jakości obrazowanie w czasie rzeczywistym i może być stosowana do badań mikronaczyniowych.

Procedura opracowywania wielogłębokościowych, okrągłych, śródbłonkowych mikrokanałów o przekroju międzybłonkowym na chipie

Przedstawiamy protokół uzyskiwania matryc pochodzących z komórek bogatych w białka macierzy zewnątrzkomórkowej, przy użyciu makromolekularnych crowderów (MMC). Ponadto przedstawiamy protokół, który włącza MMC do generowania 3D organotypowych kokultur skóry, co skraca czas hodowli przy zachowaniu dojrzałości konstruktu.

Ulepszanie modeli 2D i 3D skóry in vitro za pomocą stłoczenia makromolekularnego

Tutaj prezentujemy protokół, który opisuje wytwarzanie rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych urządzeń do hodowli komórek na poziomie narządów do rekapitulacji funkcjonalności na poziomie narządów in vitro.

Skalowalna produkcja rozciągliwych, dwukanałowych, mikroprzepływowych układów narządowych

Opisujemy metodę konstruowania urządzeń do hodowli 3D i eksperymentowania z komórkami i organoidami wielokomórkowymi. Urządzenie to umożliwia analizę odpowiedzi komórkowych na sygnały rozpuszczalne w mikrośrodowiskach 3D ze zdefiniowanymi gradientami chemoatraktantu. Organoidy są lepsze niż pojedyncze komórki w wykrywaniu słabych hałaśliwych sygnałów.

Analiza 3D wielokomórkowych odpowiedzi na gradienty chemoatraktantu

Bariera krew-mózg (BBB) to wielokomórkowa jednostka nerwowo-naczyniowa ściśle regulująca homeostazę mózgu. Łącząc ludzkie iPSC i technologie narządów na chipie, stworzyliśmy spersonalizowany chip BBB, odpowiedni do modelowania chorób i przewidywania penetracji leków do OUN. Opisano szczegółowy protokół generowania i działania chipa BBB.

Generacja ludzkiego chipa bariery krew-mózg opartego na iPSC

Ten protokół opisuje prostą metodę hodowli trójwymiarowego, zrekonstruowanego ludzkiego naskórka w powtarzalny i solidny sposób. Dodatkowo scharakteryzowano zależność struktura-funkcja modelu bariery naskórkowej. Przedstawiono również reakcje biologiczne zrekonstruowanego naskórka ludzkiego na bodźce prozapalne.

Hodowla trójwymiarowego zrekonstruowanego ludzkiego naskórka na dużą skalę

Celem tego protokołu jest wyjaśnienie i zademonstrowanie rozwoju trójwymiarowego (3D) modelu mikroprzepływowego wysoce wyrównanej tkanki serca ludzkiego, składającej się z kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych hodowanych wspólnie z fibroblastami serca (CF) w biomimetycznym hydrożelu na bazie kolagenu, do zastosowań w inżynierii tkankowej serca, badaniach przesiewowych leków i modelowaniu chorób.

Opracowywanie zorganizowanej w 3D ludzkiej tkanki serca w ramach platformy mikroprzepływowej

Obecny protokół opisuje możliwości i podstawowe metody hodowli Open-Top Organ-Chip do pomyślnego zakładania i dojrzewania pełnogrubych kultur narządów na chipach tkanek pierwotnych (skóry, pęcherzyków płucnych, dróg oddechowych i jelit), dając możliwość zbadania różnych funkcjonalnych aspektów interfejsu ludzkiej nabłonka/mezenchymalnej i niszy naczyniowej in vitro.

Odtwarzanie cytoarchitektury i funkcji tkanek nabłonka człowieka na otwartym chipie narządowym

W tym miejscu przedstawiamy protokół budowy systemu narządów na chipie (OOC) mającego naśladować pneumonektomię. System ten bada potencjalną korelację między upośledzeniem glikokaliksu a powikłaniami po pneumonektomii.

Modelowanie glikokaliksu śródbłonka po pneumonektomii w chipie fluidycznym 3D - podejście do wytwarzania systemu narządów na chipie opartych na naczyniach krwionośnych

Poznaj metodę tworzenia uproszczonego modelu skin-on-a-chip z użyciem mikroobrabianych warstw winylowych i mikroprzepływowej platformy. Technika umożliwia szybkie, tanie generowanie trójwymiarowej skóry do testowania leków i kosmetyków.

Generowanie uproszczonego trójwymiarowego modelu typu skin-on-a-chip w mikroobrabianej platformie mikroprzepływowej

Przeglądaj więcej filmów