Name: Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Poznaj ekstrakcję DNA z komarów Aedes aegypti metodą kulek magnetycznych. Protokół nie wymaga drogiego sprzętu automatycznego, zapewniając wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania całogenomowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Regionalnego Centrum Doskonałości ds. Chorób Przenoszonych przez Wektory na Południowo-Zachodnim Pacyfiku, ufundowane przez Amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (Umowa o współpracy 1U01CK000516), grant CDC NU50CK000420-04-04, Narodowy Instytut Żywności i Rolnictwa USDA (projekt Hatch 1025565), stypendium UF/IFAS Florida Medical Entomology Laboratory dla Tse-Yu Chen, grant NSF CAMTech IUCRC Phase II (AWD05009_MOD0030), oraz Departament Zdrowia Florydy (Kontrakt CODQJ). Ustalenia i wnioski zawarte w tym artykule są ustaleniami i wnioskami autora (autorów) i niekoniecznie reprezentują poglądy U.S. Fish and Wildlife Service.

1. Ogólne przechowywanie próbek i przygotowanie przed ekstrakcją DNA
<ol>
	<li>Uwodnić próbkę w 100 μl wody klasy PCR przez 1 godzinę (lub przez noc) w temperaturze 4 °C, jeśli próbka była przechowywana w >70% alkoholu w celu zmiękczenia tkanki.</li>
</ol>
2. Zakłócenie próbki
<ol>
	<li>Ustawić inkubator lub blok grzewczy z wytrząsaniem na temperaturę 56 °C.</li>
	<li>Przygotować mieszaninę buforazy K (PK) i enzymu. Do każdej pojedynczej ekstrakcji komarów wymagane jest 2 μl proteinazy K (100 mg/mL) i 98 μl buforu proteinazy K (łącznie 100 μl). Aby przygotować mieszankę wzorcową dla wielu próbek, należy zwiększyć całkowitą ilość (łącznie dla wszystkich pojedynczych próbek) o ~15%, aby zapewnić dostępność odpowiedniej objętości.</li>
	<li>Jeśli próbki zostały uwodnione przed ekstrakcją, należy wylać wodę z każdej probówki z próbką.</li>
	<li>Do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej tkankę komara dodać 100 μl mieszaniny buforu PK/enzymu.</li>
	<li>Homogenizować tkankę za pomocą tłuczka do probówek do mikrowirówek.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 1 minutę przy 9 600 x g w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Inkubować próbkę przez 2-3 godziny w temperaturze 56 °C.</li>
	<li>Podczas inkubacji przygotuj pozostałe odczynniki, korzystając z etapu ekstrakcji DNA (krok 3).</li>
</ol>
3. Ekstrakcja DNA
<ol>
	<li>Zrób mieszankę wzorcową z koralików magnetycznych. Dla każdej próbki wymieszać 100 μl buforu do lizy, 100 μl izopropanolu i 15 μl kulek magnetycznych (łącznie 215 μl). Aby przygotować mieszankę wzorcową do wielu reakcji, należy zwiększyć całkowitą ilość (łącznie dla wszystkich pojedynczych próbek) o ~20%, aby zapewnić dostępność odpowiedniej objętości.</li>
	<li>Po czasie inkubacji (krok 2.7) przenieść każdy lizat do czystej probówki do mikrowirówki lub studzienki na mikropłytkę za pomocą pipety.</li>
	<li>Do każdej próbki dodać 100 μl lizatu i 215 μl mieszanki wzorcowej z kulkami magnetycznymi.</li>
	<li>Użyj pipety, aby dobrze wymieszać przez 10-20 s, a następnie odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej. Od czasu do czasu delikatnie potrząsaj probówką, aby zmaksymalizować wiązanie kulek magnetycznych i DNA.</li>
	<li>Umieść probówkę/płytkę na magnetycznym separatorze kulkowym i poczekaj, aż roztwór będzie klarowny.</li>
	<li>Wylać płyn z probówki/płytki za pomocą pipety. Podczas usuwania supernatantu staraj się nie dotykać ani nie naruszać kulek magnetycznych trzymających DNA.</li>
	<li>Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 325 μl buforu płuczącego 1 do każdej studzienki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.6.</li>
	<li>Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 250 μl buforu płuczącego 1 do każdej studzienki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.6.</li>
	<li>Odsunąć probówkę/płytkę od magnetycznego separatora kulkowego i dodać 250 μl buforu płuczącego 2 do każdej próbki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.6.</li>
	<li>Odsunąć rurkę/płytkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 250 μl buforu płuczącego 2 do każdej studzienki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.5-3.6.</li>
	<li>Odsunąć probówkę/płytkę od magnetycznego separatora kulkowego i dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki.</li>
	<li>Dokładnie wymieszaj i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przesuń probówkę/płytkę na magnetycznym separatorze kulkowym i poczekaj, aż roztwór będzie klarowny.</li>
	<li>Odpipetować supernatant do nowej, czystej, 0,5 probówki do mikrowirówki lub studzienki na mikropłytkę.</li>
	<li>Próbki DNA należy przechowywać w temperaturze 4 °C (do 1 tygodnia) lub -80 °C. Jeśli używana jest mikropłytka, przykryj ją parafilmem.</li>
	<li>Określić wydajność DNA przy użyciu dowolnej odpowiedniej metody. 
	UWAGA: W tym badaniu wykorzystano odczyt fluorometru DNA i absorbancję przy 260/280 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany tutaj protokół można dostosować do innych gatunków owadów. Pierwotna wersja protokołu wprowadzona w Nieman et al.1 została przetestowana na wielu gatunkach, w tym Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, Anopheles arabiensis, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tuta absoluta i Keiferia lycopersicella<sup cl...

Niedawny rozwój ulepszonego protokołu ekstrakcji DNA1 umożliwił przeprowadzenie wielu ważnych dalszych badań obejmujących sekwencjonowanie całego genomu2,3,4,5,6. Ten protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych zapewnia wiarygodną wydajność DNA z pojedynczych próbek komarów, co z kolei zmniejsza koszty i czas związany z uzyskaniem wystarczającej liczby próbek z kolekcji terenowych.
Ostatnie postępy w genomice populacji i krajobrazu są bezpośrednio skorelowane z malejącymi kosztami sekwencjonowania całego genomu. Chociaż poprzedni protokół ekstrakcji DNA1 zwiększa wydajność związaną z sekwencjonowaniem o wysokiej przepustowości, mniejsze laboratoria/badania bez funduszy mogą zrezygnować z korzystania z tych nowych, potężnych narzędzi genomiki krajobrazowej i populacyjnej ze względu na koszty wdrożenia protokołu (np. koszty specjalistycznych instrumentów).
Tutaj prezentowany jest zmodyfikowany protokół ekstrakcji DNA, który wykorzystuje podobny etap ekstrakcji kulek magnetycznych jak Neiman et al.1 w celu uzyskania DNA o wysokiej czystości, ale nie polega na drogich instrumentach do lizy tkanek i ekstrakcji DNA. Protokół ten jest odpowiedni dla eksperymentów wymagających >10 ng wysokiej jakości DNA.

<table><tbody><tr><td>Bufor AE</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>Bufor elucyjny</td></tr><tr><td>AL Bufor</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>Bufor do lizy</td></tr><tr><td>AW1 Bufor</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>Bufor myjący 1</td></tr><tr><td>AW2 Bufor</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>Bufor myjący 2</td></tr><tr><td>Zawieszenie MagAttract G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>kulka magnetyczna</td></tr><tr><td>Separator magnetyczny</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Spektrofotometr mikroobjętościowy</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td></tr><tr><td>Bufor PK</td><td>Bufor ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>Bufor proteinazy K</td></tr><tr><td>Fluorometr</td><td>ThermoFisher</td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td></td></tr></tbody></table>

protokół ekstrakcji dna komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

Niedawno opublikowany protokół ekstrakcji DNA za pomocą kulek magnetycznych i automatycznego narzędzia do ekstrakcji DNA sugerował, że możliwe jest wydobycie wysokiej jakości i ilości DNA z dobrze zachowanego pojedynczego komara, wystarczającego do dalszego sekwencjonowania całego genomu. Jednak poleganie na drogim automatycznym przyrządzie do ekstrakcji DNA może być zaporowe dla wielu laboratoriów. W tym przypadku badanie zapewnia przyjazny dla budżetu protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych, który jest odpowiedni dla niskiej i średniej przepustowości. Opisany tutaj protokół został pomyślnie przetestowany przy użyciu pojedynczych próbek komarów Aedes aegypti. Obniżone koszty związane z wysokiej jakości ekstrakcją DNA zwiększą zastosowanie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości w laboratoriach i badaniach o ograniczonych zasobach.

Średnia wydajność DNA z tkanki głowy i klatki piersiowej pojedynczego komara wyniosła 4,121 ng/µL (N = 92, odchylenie standardowe 3,513), co zmierzono przy użyciu fluorometru po elucji w 100 µL buforu elucyjnego. Ilość ta jest wystarczająca, aby spełnić wymagania dotyczące wkładu genomowego DNA rzędu 10-30 ng, niezbędne do konstrukcji biblioteki całego genomu1,7. Ilość DNA może wahać się od 0,3-29,7 ng/µL w zależności od wielkości ciała komara i warunków konserwa...

Opisany tutaj jest protokół ekstrakcji DNA z wykorzystaniem kulek magnetycznych do produkcji wysokiej jakości ekstrakcji DNA od komarów. Ekstrakcje te są odpowiednie dla dalszego podejścia do sekwencjonowania nowej generacji.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

Ten niedrogi protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych sprawia, że sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości jest dostępne dla laboratoriów i badań o ograniczonych zasobach. Protokół ten nie wymaga drogiego sprzętu do ekstrakcji wysokiej jakości DNA i może być pomocny w niektórych sytuacjach diagnostycznych lub badawczych, w których uzyskanie wystarczającej ilości DNA o jakości umożliwiającej sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości jest trudne. Ten protokół jest łatwy do odtworzenia za pomocą jednorazowej demonstracji.Należy go najpierw wypróbować na niewielkiej liczbie próbek, aby zapoznać się z przepływem pracy. Na początek nawodnij próbki tkanek komara przechowywane w alkoholu o stężeniu większym niż 70%, dodając 100 mikrolitrów wody klasy PCR i inkubując przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zmiękczyć tkankę. Po inkubacji wylej wodę i dodaj 100 mikrolitrów mieszanki enzymów buforowych proteinazy K.Następnie użyj tłuczka do probówki do mikrowirówki, aby homogenizować tkankę. Po homogenizacji odwirować lizat tkanek i inkubować przez dwie do trzech godzin w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Aby wyekstrahować DNA, należy odpipetować 100 mikrolitrów lizatu tkankowego do nowej, czystej probówki do mikrowirówki.Następnie dodaj 215 mikrolitrów mieszanki wzorcowej kulek magnetycznych. Za pomocą pipety mieszaj lizat i mieszaninę kulek magnetycznych przez 10 do 20 sekund, a następnie odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji delikatnie potrząśnij probówką od czasu do czasu, aby zmaksymalizować wiązanie DNA z kulkami magnetycznymi.Następnie umieść rurkę na magnetycznym separatorze kulkowym, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie za pomocą pipety delikatnie odessaj płyn z probówki, nie naruszając kulek magnetycznych przytrzymujących DNA. Odsuń rurkę od magnetycznego separatora kulek i umyj kulki, dodając 325 mikrolitrów pierwszego bufora myjącego.Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieścić probówkę na magnetycznym separatorze kulkowym i usunąć supernatant, jak pokazano wcześniej, a następnie odsunąć probówkę od magnetycznego separatora kulek i raz umyć kulki pierwszym buforem myjącym. Po drugim przemyciu buforem pierwszym, w ten sam sposób przemyć kulki dwukrotnie 250 mikrolitrami buforu myjącego dwa.Po ostatnim płukaniu odsunąć probówkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego. Dokładnie wymieszać przez pipetowanie, a następnie inkubować probówkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem jej z powrotem na separatorze magnetycznym. Gdy roztwór stanie się klarowny, przenieś supernatant do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i odpowiednio przechowuj.Pokazany tutaj jako typowy mikroobjętościowy odczyt fluorometru DNA komara w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 milimolowego EDTA. Średni współczynnik absorbancji od 260 do 280 nanometrów wynosi 2,3. Poniższa tabela przedstawia koszty i liczbę próbek przetwarzanych w ciągu jednego dnia roboczego dla różnych metod ekstrakcji.Typowy koszt odczynnika i materiałów eksploatacyjnych do ekstrakcji za pomocą tego protokołu wynosi około 9,50 na próbkę. Koszt ten jest równoważny dowolnej typowej metodzie ekstrakcji opartej na kulkach magnetycznych. Główną korzyścią kosztową tego protokołu jest brak konieczności stosowania automatycznego instrumentu do ekstrakcji DNA.Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu DNA podczas pracy z wieloma próbkami. Do sekwencjonowania całego genomu używamy wysokiej jakości DNA wyekstrahowanego tą metodą. Obecnie wykorzystujemy dane z sekwencjonowania do identyfikacji nowych mutacji w oporności na insektycydy lub genach odpornościowych, które budzą obawy w zdrowiu publicznym i kontroli chorób.Przystępne cenowo rozwiązania do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości otwierają ekscytujące drzwi dla genomiki populacyjnej i genomiki krajobrazu, której celem jest zrozumienie rozprzestrzeniania się komarów i przepływu genów, co wpływa na sukces wielu nowatorskich strategii kontroli genetycznej.

a-magnetic-bead-based-mosquito-dna-extraction-protocol-for-next

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano szybką i niedrogą metodę ekstrakcji wysokiej jakości DNA pasożytów malarii oraz wektorów z okazów komarów. Wykorzystując właściwości chelatujące żywicy Chelex, ta prosta metoda umożliwia genotypowanie pasożytów malarii w fazach jelita środkowego i gruczołów ślinowych komarów, a także identyfikację molekularną gatunków bliźniaczych Anopheles za pomocą PCR.

Prosty protokół Chelex dla ekstrakcji DNA z Anopheles spp.

Protokół zubożenia rybosomalnego RNA (rRNA) został opracowany w celu wzbogacenia informacyjnego RNA (mRNA) dla sekwencyjnego RNA metatranskryptomu jelita komara. Z komara i jego mikroorganizmów jelitowych stworzono sondy rRNA specyficzne dla próbki, które użyto do usunięcia rRNA poprzez odejmowanie. Działanie protokołu może skutkować usunięciem około 90-99% rRNA.

Zubożenie rybosomalnego RNA dla metagenomicznego RNA-seq jelit komarów

Malowanie chromosomów jest użyteczną metodą do badania organizacji jądra komórkowego i ewolucji kariotypu. W tym miejscu demonstrujemy podejście do izolowania i amplifikacji określonych regionów zainteresowania z pojedynczych chromosomów politenowych, które są następnie wykorzystywane do dwu- i trójwymiarowej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).

Malowanie chromosomów 2D i 3D u komarów malarii

Opisujemy metodę opartą na sekwencjonowaniu RNA, która obejmuje przygotowanie indeksowanych bibliotek cDNA, hybrydyzację i przechwytywanie za pomocą niestandardowych sond oraz analizę danych w celu zbadania wybranych transkryptów pod kątem ekspresji genów, mutacji i fuzji genów. Ukierunkowany RNAseq pozwala na ekonomiczną, szybką ocenę wybranych transkryptów na sekwencerze stacjonarnym.

Ukierunkowany test sekwencjonowania RNA w celu scharakteryzowania ekspresji genów i zmian genomowych

Technologia nanoporowa do sekwencjonowania biomolekuł ma szerokie zastosowanie w naukach przyrodniczych, w tym do identyfikacji patogenów, monitorowania bezpieczeństwa żywności, analizy genomicznej, metagenomicznego monitorowania środowiska i charakterystyki oporności bakterii na antybiotyki. W artykule przedstawiono procedurę metagenomicznego sekwencjonowania DNA gleby w celu identyfikacji gatunków z wykorzystaniem technologii sekwencjonowania nanoporowego.

Sekwencjonowanie DNA w nanoporach do metagenomicznej analizy gleby

Tutaj opisujemy protokół uzyskiwania danych o sekwencji amplikonów mikrobiomów gleby, ryzosfery i korzeni. Informacje te mogą być wykorzystane do zbadania składu i różnorodności zbiorowisk mikrobiologicznych związanych z roślinami i nadają się do stosowania w odniesieniu do szerokiej gamy gatunków roślin.

Badanie mikrobiomu korzeni: ekstrakcja danych o społeczności bakteryjnej z gleby, ryzosfery i endosfery korzeni

Opisana tutaj jest uproszczona standardowa procedura operacyjna do profilowania mikrobiomu przy użyciu sekwencjonowania metagenomicznego 16S rRNA i analizy przy użyciu swobodnie dostępnych narzędzi. Protokół ten pomoże naukowcom, którzy są nowicjuszami w dziedzinie mikrobiomu, a także tym, którzy potrzebują aktualizacji metod osiągania profilowania bakteryjnego w wyższej rozdzielczości.

Analiza mikrobioty za pomocą dwuetapowej reakcji PCR i sekwencjonowania genów 16S rRNA nowej generacji

Ten protokół zapewnia kroki od ekstrakcji DNA do eksperymentalnego przygotowania do cyfrowego PCR kropelkowego (ddPCR), w tym analizę do identyfikacji i kwantyfikacji zdarzeń niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) w miejscach docelowych po indukowanym przez gRNA rozszczepieniu Cas9 i naprawie DNA. Inne zastosowania tej metody obejmują takie zastosowania, jak wykrywanie polimorfizmu i weryfikacja wariantów edycji genów.

Cyfrowa kropelkowa reakcja PCR w celu wykrycia mutacji indeli w genetycznie zmodyfikowanych populacjach komarów Anopheline

Ten artykuł opisuje protokół szybkiej identyfikacji indeli indukowanych przez CRISPR/Cas9 i selekcji linii mutantów u komara Aedes aegypti za pomocą analizy topnienia w wysokiej rozdzielczości.

Wykrywanie indel po mutagenezie CRISPR/Cas9 przy użyciu analizy stopienia w wysokiej rozdzielczości u komara Aedes aegypti

Protokół ten pokazuje, że bicie koralików w połączeniu z oczyszczaniem kulek wychwytywania DNA zapewnia szybką i spójną metodę ekstrakcji DNA z próbek Mycobacterium tuberculosis , co czyni ją skutecznym wyborem do zastosowań sekwencjonowania nowej generacji.

Ekstrakcja DNA prątków za pomocą bicia kulek w niestandardowym buforze, a następnie przepływu pracy NGS

Przedstawiamy zoptymalizowaną metodę ekstrakcji DNA z odkażonej plwociny przy użyciu metody ekstrakcji opartej na matrycy w połączeniu z oczyszczaniem kulek magnetycznych w celu dalszego ukierunkowanego sekwencjonowania Mycobacterium tuberculosis.

Ekstrakcja DNA oparta na matrycy do ukierunkowanego sekwencjonowania nowej generacji na odkażonych próbkach plwociny

Poznaj ekstrakcję DNA z komarów Aedes aegypti metodą kulek magnetycznych. Protokół nie wymaga drogiego sprzętu automatycznego, zapewniając wysokiej jakości DNA do sekwencjonowania całogenomowego.

Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Przeglądaj więcej filmów