Protokół ekstrakcji DNA komarów oparty na kulkach magnetycznych do sekwencjonowania nowej generacji

Ten niedrogi protokół ekstrakcji DNA oparty na kulkach magnetycznych sprawia, że sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości jest dostępne dla laboratoriów i badań o ograniczonych zasobach. Protokół ten nie wymaga drogiego sprzętu do ekstrakcji wysokiej jakości DNA i może być pomocny w niektórych sytuacjach diagnostycznych lub badawczych, w których uzyskanie wystarczającej ilości DNA o jakości umożliwiającej sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości jest trudne. Ten protokół jest łatwy do odtworzenia za pomocą jednorazowej demonstracji.

Należy go najpierw wypróbować na niewielkiej liczbie próbek, aby zapoznać się z przepływem pracy. Na początek nawodnij próbki tkanek komara przechowywane w alkoholu o stężeniu większym niż 70%, dodając 100 mikrolitrów wody klasy PCR i inkubując przez godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zmiękczyć tkankę. Po inkubacji wylej wodę i dodaj 100 mikrolitrów mieszanki enzymów buforowych proteinazy K.

Następnie użyj tłuczka do probówki do mikrowirówki, aby homogenizować tkankę. Po homogenizacji odwirować lizat tkanek i inkubować przez dwie do trzech godzin w temperaturze 56 stopni Celsjusza. Aby wyekstrahować DNA, należy odpipetować 100 mikrolitrów lizatu tkankowego do nowej, czystej probówki do mikrowirówki.

Następnie dodaj 215 mikrolitrów mieszanki wzorcowej kulek magnetycznych. Za pomocą pipety mieszaj lizat i mieszaninę kulek magnetycznych przez 10 do 20 sekund, a następnie odstaw na 10 minut w temperaturze pokojowej. Podczas inkubacji delikatnie potrząśnij probówką od czasu do czasu, aby zmaksymalizować wiązanie DNA z kulkami magnetycznymi.

Następnie umieść rurkę na magnetycznym separatorze kulkowym, aż roztwór stanie się klarowny. Następnie za pomocą pipety delikatnie odessaj płyn z probówki, nie naruszając kulek magnetycznych przytrzymujących DNA. Odsuń rurkę od magnetycznego separatora kulek i umyj kulki, dodając 325 mikrolitrów pierwszego bufora myjącego.

Dokładnie wymieszać pipetując i inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji umieścić probówkę na magnetycznym separatorze kulkowym i usunąć supernatant, jak pokazano wcześniej, a następnie odsunąć probówkę od magnetycznego separatora kulek i raz umyć kulki pierwszym buforem myjącym. Po drugim przemyciu buforem pierwszym, w ten sam sposób przemyć kulki dwukrotnie 250 mikrolitrami buforu myjącego dwa.

Po ostatnim płukaniu odsunąć probówkę od magnetycznego separatora kulek i dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego. Dokładnie wymieszać przez pipetowanie, a następnie inkubować probówkę przez dwie minuty w temperaturze pokojowej przed umieszczeniem jej z powrotem na separatorze magnetycznym. Gdy roztwór stanie się klarowny, przenieś supernatant do nowej, czystej probówki wirówkowej o pojemności 0,5 mililitra i odpowiednio przechowuj

Pokazany tutaj jako typowy mikroobjętościowy odczyt fluorometru DNA komara w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 milimolowego EDTA. Średni współczynnik absorbancji od 260 do 280 nanometrów wynosi 2,3. Poniższa tabela przedstawia koszty i liczbę próbek przetwarzanych w ciągu jednego dnia roboczego dla różnych metod ekstrakcji.

Typowy koszt odczynnika i materiałów eksploatacyjnych do ekstrakcji za pomocą tego protokołu wynosi około 9,50 na próbkę. Koszt ten jest równoważny dowolnej typowej metodzie ekstrakcji opartej na kulkach magnetycznych. Główną korzyścią kosztową tego protokołu jest brak konieczności stosowania automatycznego instrumentu do ekstrakcji DNA.

Pamiętaj, aby wymieniać końcówki pipet między próbkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu DNA podczas pracy z wieloma próbkami. Do sekwencjonowania całego genomu używamy wysokiej jakości DNA wyekstrahowanego tą metodą. Obecnie wykorzystujemy dane z sekwencjonowania do identyfikacji nowych mutacji w oporności na insektycydy lub genach odpornościowych, które budzą obawy w zdrowiu publicznym i kontroli chorób.

Przystępne cenowo rozwiązania do sekwencjonowania o wysokiej przepustowości otwierają ekscytujące drzwi dla genomiki populacyjnej i genomiki krajobrazu, której celem jest zrozumienie rozprzestrzeniania się komarów i przepływu genów, co wpływa na sukces wielu nowatorskich strategii kontroli genetycznej.