μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

Protokół ten pozwala na obserwację funkcji komórek smakowych w naturalnym mikrośrodowisku, w którym połączenia nerwowe i krążenie krwi pozostają nienaruszone. Korzystając z tej techniki, można badać komunikację międzykomórkową in vivo. Na początek napełnij zbiorniki ciśnieniowego systemu perfuzyjnego sztuczną śliną i degustatorami.

Podłącz przewód sprężonego powietrza do wejścia regulatora i ustaw ciśnienie powietrza w układzie dostarczania płynu na 30 do 50 funtów na cal kwadratowy. Ustaw ciśnienie wyjściowe regulatora na 0.4 funta na cal kwadratowy i sprawdź, czy płyn zaczyna wypływać z rurki. Podłącz kolektor ze zbiorników do portu wejściowego mikrojęzyka, a następnie podłącz port wyjściowy mikrojęzyczka do pompy strzykawkowej i pobieraj ciecz z prędkością około 300 mikrolitrów na minutę, aby ustalić stan ustalony.

Upewnij się, że objętość kropli wiszącej pod mikrojęzyczkiem pozostaje stała i wyreguluj ciśnienie powietrza i natężenie przepływu, aby uzyskać żądaną wysokość próbki. Po skonfigurowaniu systemu mikroprzepływowego odłącz przewód sprężonego powietrza i wyłącz pompę strzykawkową do czasu, aż mysz zostanie przygotowana do obrazowania in vivo. Po podaniu znieczulenia myszy, należy wstrzyknąć dożylnie TRITC-dekstran drogą zaoczodołową, aby obserwować krążenie krwi podczas obrazowania.

Trzymając mysz w pozycji leżącej, spryskaj jej głowę 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby lekko unieść skórę głowy, a następnie użyj nożyczek, aby odciąć około siedmiu milimetrów kwadratowych skóry. Po oczyszczeniu włosów wokół skóry głowy usuń okostną spod skóry i nałóż błyskawiczny klej na czaszkę.

Następnie przymocuj niestandardowy mocer głowicy. Gdy klej błyskawiczny stwardnieje, nałóż klej dentystyczny wokół utrwalacza głowy i zestal go przez oświetlenie niebieskim światłem. Za pomocą kleju błyskawicznego przyklej dolną wargę myszy do dolnej części mikrojęzyka, a następnie umieść mysz na płycie do przygotowania myszy i przymocuj dolną jednostkę na mikrojęzyku do słupków przytrzymujących, wyrównując otwory na krawędzi mikrojęzyczka ze słupkami.

Dokręć mocowanie głowicy myszy do uchwytu mocującego głowicę na płycie i wyreguluj odległość między głowicą myszy a urządzeniem. Następnie za pomocą uchwytu mocującego głowicę płynnie obróć głowicę myszy o około 45 stopni. Po przymocowaniu myszy do planszy za pomocą plastikowej pęsety delikatnie przeciągnij jej język.

Następnie za pomocą kleju błyskawicznego przymocuj brzuszną stronę języka do górnej strony dolnej części mikrojęzyka. Aby język był wilgotny, przetrzyj powierzchnię wilgotnym wacikiem, a następnie umieść kawałek chusteczki nasączonej sztuczną śliną na odsłoniętej powierzchni języka. Umieść zakrzywione podkładki na słupkach, przytrzymując dolną część mikrojęzyczka, a następnie przenieś przygotowanie myszy do stolika mikroskopowego.

Umieść odsłonięty język myszy pod przybliżonym środkiem obszaru obiektywu mikroskopu, uważając, aby nie odbiegać od zakresu dynamicznego stage, a następnie dokręć, aby mocno przymocować płytkę myszy do stage. Umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby utrzymać temperaturę ciała w zakresie od 36.5 do 37.5 stopni Celsjusza. Aby zapobiec przedostawaniu się płynu do tchawicy myszy, umieść cienki kawałek skręconego papieru w pysku myszy, a następnie usuń mokrą tkankę umieszczoną na powierzchni języka i umieść przygotowany mikrojęzyk na języku myszy tak, aby powierzchnia języka była widoczna przez okienko obrazowania.

Zabezpiecz mikro język, delikatnie przykręcając oba końce z minimalnym naciskiem. Aby rozpocząć pobieranie obrazów, otwórz oprogramowanie mikroskopu, a następnie włącz laser dwufotonowy o długości 920 nanometrów. Zamontuj obiektyw zanurzeniowy w wodzie na mikroskopie, a następnie opuść obiektyw na okienko obrazowania mikrojęzyka i zanurz obiektyw.

W trybie aparatu oświetl powierzchnię języka, włączając niebieskie światło z lampy rtęciowej. Aby znaleźć przybliżoną płaszczyznę ogniskową, wyreguluj oś Z i poszukaj sygnału autofluorescencji z brodawek nitkowatych. Następnie za pomocą pokrętła regulacji X i Y zlokalizuj kubek smakowy.

Przełącz się w tryb wielofotonowy, a następnie ustaw długość fali wzbudzenia, zestaw filtrów emisyjnych, tryb skanowania i rozmiar klatki do akwizycji obrazu. Mając kubek smakowy na środku okienka obrazowania, zlokalizuj naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy na około dwóch trzecich wysokości kubka smakowego i uwidocznij krążenie krwi. Jeśli przepływ krwi jest zatkany, lekko poluzuj mocujące, aby wznowić przepływ krwi.

Dostosuj oś Z, aby znaleźć płaszczyznę Z kubka smakowego zawierającego odpowiednią liczbę komórek smakowych, a następnie kontynuuj obrazowanie wapnia z częstotliwością od dwóch do sześciu Hz przez 80 sekund. Po rozpoczęciu obrazowania włącz zbiornik układu fluidycznego, aby zapewnić roztwór smakowy przez 20 sekund. Po 20 sekundach stymulacji smaku przełącz zbiornik z powrotem na sztuczną ślinę.

Podczas obrazowania odczekaj około trzech do czterech minut między sesjami, konsekwentnie dostarczając sztuczną ślinę, aby utrzymać wilgotny język i zmyć degustację pozostałą po poprzedniej sesji. Powierzchnia języka myszy Pirt-GCaMP6f-tdTomato pokryta jest autofluorescencyjnymi brodawkami nitkowatymi i słabo rozłożonymi kubkami smakowymi. Nitkowate brodawki w kolorze żółtym są rejestrowane za pomocą fotodetektora na głębokości od 500 do 550 nanometrów i można je obserwować z samej powierzchni języka na głębokość do około 25 mikrometrów.

Sygnały GCaMP w kolorze zielonym wykrywane przez filtr o długości od 500 do 550 nanometrów i sygnały tdTomato w kolorze czerwonym, wykrywane przez filtr o długości od 607 do 670 nanometrów, reprezentują komórki smakowe. Sygnał tdTomato jest uzyskiwany do analizy metryk wskaźnikowych. Naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy są pozyskiwane za pomocą zestawu filtrów o długości od 500 do 550 nanometrów w kolagenowej tkance łącznej, który strukturalnie wspiera kubek smakowy, jest pozyskiwany za pomocą zestawu filtrów o długości od 447 do 460 nanometrów.

W tym reprezentatywnym przykładzie badań przesiewowych smaku in vivo za pomocą obrazowania wapnia, każda komórka smakowa jest oznaczona liniami przerywanymi. W tym badaniu komórka 2 reagowała zarówno na słodkie, jak i umami smaki. Komórka 3 reagowała zarówno na degustacje o niskiej, jak i wysokiej soli.

Żadna z komórek w tym kubku smakowym nie reagowała na kwaśne smaki. Ponieważ celem tego eksperymentu jest obserwacja funkcji komórek smakowych w środowisku naturalnym, ważne jest, aby dostarczyć fluorescencje do naczyń krwionośnych na etapie przygotowania i potwierdzić ich krążenie podczas eksperymentu.