Name: μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Poznaj metodę obrazowania komórek smakowych in vivo przy użyciu mikrofluidycznego systemu µTongue u myszy. Technika umożliwia analizę funkcjonalną odpowiedzi na substancje smakowe w warunkach fizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Institute of Basic Science (IBS-R015-D1), grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3A9E2061789) oraz przez grant National Research Foundation of Korea (NRF) finansowany przez rząd Korei (MSIT) (nr 2019M3E5D2A01058329). Jesteśmy wdzięczni Eunsoo Kim i Eugene'owi Lee za ich pomoc techniczną.

Wszystkie procedury chirurgiczne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Sungkyunkwan i Uniwersytetu Narodowego w Seulu.
1. Przygotowanie roztworów: sztuczna ślina i degustatory
<ol>
	<li>Przygotować sztuczną ślinę, rozpuszczając 2 mM NaCl, 5 mM KCl, 3 mM NaHCO3, 3 mM KHCO3, 0,25 mM CaCl2, 0,25 mM MgCl2, 0,12 mM K2HPO4, 0,12 mM KH2PO4 i 1,8 mM HCl w wodzie destylowanej (>1 L) i dostosuj pH roztworu do 7 (patrz Tabela materiałów)12.</li>
	<li>Przygotować smaki, takie jak kwaśny: 10 mM kwasu cytrynowego; słony: 400 mM NaCl, opcjonalnie z 50 μM amilorydem; słodki: 40 mM acesulfam K; gorzki: mieszanina 5 mM chininy, 5 mM denatonium i 20 μM cykloheksymidu, rozpuszczając degustacyjną substancję chemiczną w sztucznej ślinie przygotowanej w kroku 1.1.</li>
</ol>
2. Przygotowanie układu mikroprzepływowego
UWAGA: Degustatory były dostarczane do języka myszy za pomocą ciśnieniowego, wielokanałowego systemu dostarczania płynów (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1 i Tabela materiałów).
<ol>
	<li>Napełnij zbiorniki ciśnieniowego systemu perfuzyjnego sztuczną śliną i degustatorami.</li>
	<li>Podłącz przewód sprężonego powietrza do wejścia regulatora i ustaw ciśnienie powietrza w zakresie od 30 do 50 psi w układzie dostarczania płynu.</li>
	<li>Ustaw ciśnienie wyjściowe regulatora na 0.4 psi i sprawdź, czy pod tym ciśnieniem płyn wypływa z rurki.</li>
	<li>Podłącz kolektor ze zbiorników do portu wejściowego μTongue.</li>
	<li>Podłącz port wyjściowy μTongue do pompy strzykawkowej i pobierz płyn za pomocą ~300 μL∙min-1, aby ustalić stan ustalony. Obserwuj stałą objętość wiszącej kropli pod μTongue. Dostosuj wartość parametru ustawienia w zależności od wysokości próbki.</li>
	<li>Odłączyć przewód sprężonego powietrza i zatrzymać pompę strzykawkową do czasu zakończenia kroku 3 protokołu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie myszy do obrazowania in vivo (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).
UWAGA: Wszystkie preparaty dla zwierząt były przeprowadzane w ciągu dnia w warunkach aseptycznych na stole laboratoryjnym.
<ol>
	<li>Znieczulenie myszy
	<ol>
		<li>Przygotuj 7-tygodniową lub starszą mysz dowolnej płci. Użyj genetycznie zmodyfikowanej linii myszy, która wyraża białka fluorescencyjne wykrywające wapń w komórkach smakowych.</li>
		<li>Mysz jest skrępowana do znieczulenia. Mieszaninę 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny wstrzykuje się dootrzewnowo do myszy13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>TRITC-dekstran (500 kDa) w buforze fosforanowym 2,5% w/V soli fizjologicznej jest podawany dożylnie myszy drogą zadoczodołową w celu obserwacji krążenia krwi podczas sesji obrazowania.</li>
	<li>Przymocuj narzędzie do mocowania głowy do czaszki myszy, aby zminimalizować artefakty ruchu.
	<ol>
		<li>Głowę myszy spryskuje się 70% ETOH, podczas gdy mysz jest umieszczona w pozycji leżącej. Lekko unieś skórę głowy kleszczami i odetnij około 7 mm2 nożyczkami.</li>
		<li>Oczyść włosy wokół skóry głowy, usuń okostną pod skórą, nałóż natychmiastowy klej na czaszkę i przymocuj niestandardowy łącznik do głowy.</li>
		<li>Po stwardnieniu kleju błyskawicznego nałóż klej dentystyczny wokół utrwalacza głowy i oświetl niebieskim światłem, aby zestalić klej dentystyczny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść język myszy na dolnej części μTongue.
	<ol>
		<li>Przymocuj dolną wargę myszy do dolnej części μTongue za pomocą kleju błyskawicznego.</li>
		<li>Umieść mysz na tablicy (tablica do przygotowania myszy w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B) i umieść dolną jednostkę μTongue na słupkach (μTongue hold post w <silna klasa="xfig">Rysunek 1B). Upewnij się, że otwory na krawędzi dolnej jednostki są wyrównane ze słupkiem.</li>
		<li>Dokręć mocowanie głowicy myszy do uchwytu mocownika głowicy na płycie. Następnie dostosuj odległość między głowicą myszy a urządzeniem. Obróć głowicę myszy płynnie o około 45° za pomocą uchwytu mocującego głowicę. Proces ten zapobiega fizycznemu kontaktowi nosa myszy z obiektywem mikroskopu.</li>
		<li>Delikatnie przeciągnij język myszy za pomocą plastikowej pęsety i przymocuj brzuszną stronę języka do górnej części dolnej części μTongue. Następnie przetrzyj powierzchnię języka myszy wilgotnym bawełnianym wacikiem.</li>
		<li>Namocz kawałek papieru w sztucznej ślinie i umieść go na odsłoniętej powierzchni języka myszy, aby utrzymać mokry stan.</li>
		<li>Umieść zakrzywione podkładki na słupkach, które przytrzymują oba końce dolnej części μTongue.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść preparat mysz na stoliku mikroskopowym. Umieść odsłonięty język myszy pod przybliżonym środkiem obszaru obiektywu mikroskopu. Pamiętaj, aby nie odbiegać od zakresu dynamiki sceny. Następnie dokręć deskę myszy na scenie za pomocą.</li>
	<li>Umieść poduszkę grzewczą pod korpusem myszy i utrzymuj temperaturę na poziomie 36.5 °C-37.5 °C. Monitoruj temperaturę korpusu myszy za pomocą czujnika temperatury i kontroluj temperaturę poduszki grzewczej za pomocą sygnału zwrotnego z czujnika temperatury.</li>
	<li>Przekręć cienki kawałek papieru i umieść go w ustach myszy, aby zapobiec przedostawaniu się płynu do tchawicy myszy.</li>
	<li>Usuń mokrą chusteczkę z języka myszy i umieść przygotowany μTongue na języku myszy. Umieść kanał mikroprzepływowy na języku i dostosuj jego położenie, aby obserwować powierzchnię języka przez okienko obrazowania.</li>
	<li>Zabezpiecz μTongue, delikatnie przykręcając oba końce z minimalnym naciskiem.</li>
</ol>
4. Akwizycja obrazowania
<ol>
	<li>Przed użyciem włącz laser dwufotonowy o długości fali 920 nm i mikroskop.</li>
	<li>Zamontuj obiektyw zanurzeniowy w wodzie (16x, NA 0.80 lub 25x, NA 1.1) na mikroskopie. Upuść wodę destylowaną na okienko obrazowania μTongue i zanurz obiektyw.</li>
	<li>W trybie aparatu włącz światło za pomocą lampy rtęciowej i oświetl powierzchnię języka.</li>
	<li>Dostosowując oś Z, przeszukaj sygnał autofluorescencyjny z brodawek nitkowatych, aby znaleźć przybliżoną płaszczyznę ogniskową. Następnie za pomocą pokrętła regulacji X i Y zlokalizuj kubek smakowy.</li>
	<li>Przełącz się w tryb wielofotonowy. Ustaw warunki akwizycji obrazu w następujący sposób: długość fali wzbudzenia: 920 nm; zestaw filtrów emisji: 447/60 nm, 525/50 nm i 607/70 nm; Dwukierunkowy tryb skanowania rastrowego, rozmiar ramki: 512 x 512.</li>
	<li>Dostosuj pozycje X i Y, aby umieścić kubek smakowy na środku okna obrazu.</li>
	<li>Przeszukaj naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy na około dwóch trzecich wysokości kubka smakowego. Wizualizacja krążenia krwi za pomocą wstrzyknięcia TRITC-dekstranu (500 kDa) z kroku protokołu 3.2. Jeśli przepływ krwi jest zatkany, lekko poluzuj mocujące, aby umożliwić przepływ krwi.</li>
	<li>Dostosuj oś Z i znajdź płaszczyznę Z kubka smakowego, która zawiera odpowiednią liczbę komórek smakowych.</li>
	<li>Kontynuuj obrazowanie wapnia z częstotliwością 2-6 Hz przez 80 s. Zapewnij roztwór smakowy przez 20 s, włączając zbiornik układu fluidycznego po rozpoczęciu obrazowania. Po 20 sekundach stymulacji smaku przestaw zbiornik z powrotem na sztuczną ślinę.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania sekwencyjnego należy odczekać około 3-4 minuty przed następną sesją obrazowania. Utrzymuj sztuczną ślinę płynącą do języka myszy, aby zmyć resztki smaku z poprzedniej sesji obrazowania. W zależności od projektu eksperymentu powtórz sesję w razie potrzeby.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania wapnia in vivo należy poddać mysz eutanazji zgodnie z procedurą IACUC. Mysz pod narkozą jest poświęcana w komorze CO2. 
	UWAGA: Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą odruchu szczypania palców u stóp. Podczas sesji obrazowania należy konsekwentnie pobierać sztuczną ślinę z rezerwuarów. Jeśli w oknie obrazowania μTongue pojawią się pęcherzyki, usuń je, przepychając je przez wejście lub wyjście μTongue za pomocą silnego ciśnienia cieczy.</li>
</ol>
5. Analiza obrazu (Rysunek 3)
<ol>
	<li>Konwersja obrazu
	<ol>
		<li>Otwórz surowe pliki obrazów za pomocą Fiji14 lub podobnego oprogramowania do analizy obrazu.</li>
		<li>Przekonwertuj plik obrazu na plik stosu RGB, aby użyć kodu NPL Bud Analyzer.
		<ol>
			<li>Kolor obrazu > > podzielone kanały</li>
			<li>Obraz > Kolor > Scal kanały i wybierz obraz z kroku 5.2.1.</li>
			<li>Stos kolorów > obrazu > do RGB</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rejestracja obrazu 
	UWAGA: Użyj niestandardowego kodu do analizy danych. Zapoznaj się z https://github.com/neurophotonic/Tastebud-analyzer.
	<ol>
		<li>Uruchom kod o nazwie Taste_GUI.m; pojawi się okno GUI o nazwie NPL Bud Analyzer. Kliknij przycisk Nowa analiza w prawym górnym rogu, a następnie załaduj przekonwertowany obraz z kroku 5.1. Ustaw liczbę klatek na sekundę nad załadowanym obrazem.</li>
		<li>Narysuj obszar zainteresowania (ROI) nad załadowanym obrazem w celu rejestracji. Kliknij dwukrotnie wybrany ROI, a rozpocznie się automatycznie obliczona rejestracja.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzyskać względne zmiany intensywności fluorescencji (ΔF/F)
	<ol>
		<li>Wróć do okna NPL Bud Analyzer, aby automatycznie wyświetlić zarejestrowany obraz z kroku 5.2. Jeśli użytkownik ma już plik reg, kliknij przycisk Załaduj dane i wybierz plik _reg.tif.</li>
		<li>Kliknij przycisk OKRĄG lub WIELOKĄT i umieść ROI komórki smakowej na obrazie kubka smakowego.</li>
		<li>Przedstawia on surową intensywność fluorescencji i ślad wapnia (ΔF/F) wybranej komórki smakowej automatycznie pod obrazem kubka smakowego.</li>
		<li>Kliknij Zapisz ślad, aby wyświetlić ślad wapnia (ΔF/F) po prawej stronie graficznego interfejsu użytkownika, podczas gdy ROI jest wyświetlany nad obrazem kubka smakowego. Powtarzaj kroki 5.3.2-5.3.4, aż wybór ROI zostanie zakończony. 
		UWAGA: Kliknij przycisk Usuń ślad, jeśli ROI jest błędnie wybrany, aby wyeliminować ostatnio wybrany zwrot z inwestycji i ślad wapnia.</li>
		<li>Po zakończeniu wyboru ROI wpisz nazwę pliku w prawym dolnym rogu i kliknij przycisk Zakończ, aby wyeksportować ślad wapnia ΔF / F w formacie .xls oraz obraz pąka tase z ROI w formacie .bmp.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza śladu wapnia
	<ol>
		<li>Przeanalizować śladową zawartość wapnia otrzymaną w kroku 5.3. Weź pod uwagę, że komórki smakowe zareagowały na degustację, gdy intensywność fluorescencji wzrosła o więcej niż dwa odchylenia standardowe od linii bazowej po dostarczeniu degustacji4, a wartości p są mniejsze niż 0,01, przy użyciu sparowanych lub niesparowanych testów t10.</li>
		<li>Rozważ komórkę smakową jako komórkę reagującą, jeśli reaguje na określony smak więcej niż dwa razy na trzy próby(~60%)15.</li>
		<li>Reprezentatywne śladowe ilości wapnia należy uzyskać, uśredniając poszczególne śladowe ilości wapnia uzyskane w kroku 5.4.1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+subcellular+targeting+of+GCaMP-type+genetically-encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically-encoded calcium indicators.</a> PLoS One. 3 (3), 1-10 (2008).</li>
<li>Shih, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+microscopy+as+a+tool+to+study+blood+flow+and+neurovascular+coupling+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1277-1309 (2012).</li>
<li>Choi, M., Kwok, S. J. J., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+fluorescence+microscopy%3A+Lessons+from+observing+cell+behavior+in+their+native+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">In vivo fluorescence microscopy: Lessons from observing cell behavior in their native environment.</a> Physiology. 30 (1), 40-49 (2015).</li>
<li>Caicedo, A., Samir Jafri, M., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Ca2%2B+imaging+reveals+neurotransmitter+receptors+for+glutamate+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In situ Ca2+ imaging reveals neurotransmitter receptors for glutamate in taste receptor cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (21), 7978-7985 (2000).</li>
<li>Tomchik, S. M., Berg, S., Kim, J. W., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+and+taste+coding+in+mammalian+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning and taste coding in mammalian taste buds.</a> Journal of Neuroscience. 27 (40), 10840-10848 (2007).</li>
<li>Dando, R., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-to-cell+communication+in+intact+taste+buds+through+ATP+signalling+from+pannexin+1+gap+junction+hemichannels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell-to-cell communication in intact taste buds through ATP signalling from pannexin 1 gap junction hemichannels.</a> The Journal of Physiology. 587 (24), 5899-5906 (2009).</li>
<li>Chandrashekar, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cells+and+peripheral+representation+of+sodium+taste+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The cells and peripheral representation of sodium taste in mice.</a> Nature. 464 (7286), 297-301 (2010).</li>
<li>Oka, Y., Butnaru, M., von Buchholtz, L., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+salt+recruits+aversive+taste+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High salt recruits aversive taste pathways.</a> Nature. 494 (7438), 472-475 (2013).</li>
<li>Choi, M., Lee, W. M., Yun, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopic+interrogation+of+peripheral+taste+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopic interrogation of peripheral taste sensation.</a> Scientific Reports. 5 (8661), 1-6 (2015).</li>
<li>Han, J., Choi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+functional+screening+of+taste+sensation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Comprehensive functional screening of taste sensation in vivo.</a> bioRxiv. 16419 (371682), 1-22 (2018).</li>
<li>Thestrup, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+ratiometric+calcium+sensors+for+functional+in+vivo+imaging+of+neurons+and+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized ratiometric calcium sensors for functional in vivo imaging of neurons and T lymphocytes.</a> Nature Methods. 11 (2), 175-182 (2014).</li>
<li>Danilova, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glossopharyngeal+nerves+to+taste+stimuli+in+C57BL+%2F+6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BME+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glossopharyngeal nerves to taste stimuli in C57BL / 6J mice.</a> BME Neuroscience. 15, 1-15 (2003).</li>
<li>Wu, A., Dvoryanchikov, G., Pereira, E., Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breadth+of+tuning+in+taste+afferent+neurons+varies+with+stimulus+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Breadth of tuning in taste afferent neurons varies with stimulus strength.</a> Nature Communications. 6 (8171), 1-11 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tan, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut-brain+axis+mediates+sugar+preference%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The gut-brain axis mediates sugar preference.</a> Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).</li>
<li>Roebber, J. K., Roper, S. D., Chaudhari, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+anion+in+salt+%28NaCl%29+detection+by+mouse+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the anion in salt (NaCl) detection by mouse taste buds.</a> The Journal of Neuroscience. 39 (32), 6224-6232 (2019).</li>
<li>Kusuhara, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taste+responses+in+mice+lacking+taste+receptor+subunit+T1R1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Taste responses in mice lacking taste receptor subunit T1R1.</a> Journal of Physiology. 591 (7), 1967-1985 (2013).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe: J. Han i M. Choi są wynalazcami opatentowanej technologii μTongue opisanej w tym artykule, a system μTongue jest komercyjnie dostępny za pośrednictwem SciTech Korea.

Poniżej opisano szczegółowy protokół zastosowania μTongue do badania aktywności funkcjonalnej komórek smakowych in vivo. W tym protokole przeprowadza się funkcjonalne obrazowanie komórek smakowych przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników wapnia. Oprócz wykorzystania myszy transgenicznych, alternatywną opcją może być elektroforetyczne ładowanie barwników wapniowych (lub barwników wykrywających napięcie) na komórki smakowe.
W tym eksperymencie użyto wszystkich roztworów smakowych o...

Mikroskop fluorescencyjny przyżyciowy jest szeroko stosowany do badania dynamiki czasoprzestrzennej na żywych tkankach. Naukowcy szybko rozwijają genetycznie kodowane czujniki, które zapewniają specyficzne i czułe transformacje procesów biologicznych w sygnały fluorescencyjne - które można łatwo rejestrować za pomocą powszechnie dostępnych mikroskopów fluorescencyjnych1,2. Chociaż większość narządów wewnętrznych u gryzoni została przebadana przy użyciu mikroskopu, jego udane zastosowanie na języku nie zakończyło się jeszcze sukcesem3.
Poprzednie badania nad obrazowaniem komórek smakowych wapniem były prowadzone ex vivo poprzez cienkie cięcie tkanki języka w celu uzyskania obwodowych kubków smakowych4,5,6 lub poprzez odklejanie nabłonka smakowego w celu uzyskania grzybokształtnych kubków smakowych7,8. Przygotowanie tych próbek było nieuchronnie inwazyjne, dlatego naturalne mikrośrodowiska, takie jak unerwienie nerwów, bariery przepuszczalności i krążenie krwi, były w dużej mierze zaburzone. Pierwsze okno obrazowania języka w obrębie przewodu przyżyciowego zostało zgłoszone w 2015 roku przez Choi i wsp., ale wiarygodne zapisy funkcjonalne nie były osiągalne ze względu na artefakty ruchowe i optyczne spowodowane płynnymi bodźcami degustacyjnymi9.
Niedawno wprowadzono mikrofluidykę na języku (μTongue)10. To urządzenie integruje system mikroprzepływowy z okienkiem obrazowania na języku myszy. Osiągając quasi-ustalony przepływ bodźców smakowych przez cały okres obrazowania, artefakty wynikające z ruchu płynu mogą zostać zminimalizowane (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Port wejściowy jest zasilany przez szereg wielokanałowych regulatorów ciśnienia, podczas gdy port wyjściowy jest podłączony do pompy strzykawkowej, która utrzymuje prędkość 0,3 ml/min. Dodatkowo, artefakty optyczne spowodowane różnicą w współczynnikach załamania światła roztworów degustacyjnych zostały zminimalizowane poprzez analizę ratiometryczną wprowadzającą wskaźnik niewrażliwy na wapń (tdTomato) oraz wskaźnik wapnia (GCaMP6)11. Taka konstrukcja zapewniła mikroskopijną stabilność komórek smakowych in vivo, nawet przy nagłym przełączaniu między kanałami płynowymi. W związku z tym μTongue wdraża niezawodne funkcjonalne badanie przesiewowe wielu smaków dla kubków smakowych myszy in vivo.
W tym protokole, procedury eksperymentalne są szczegółowo wyjaśnione dla obrazowania wapniowego kubków smakowych grzybów myszy in vivo za pomocą μTongue. Najpierw opisano przygotowanie sztucznej śliny i roztworów smakowych. Po drugie, wprowadza się ustawienie systemu mikroprzepływowego w celu osiągnięcia przepływu w stanie quasi-ustalonym. Po trzecie, opisano procedury używane do montażu języka myszy na μTongue, aby umożliwić akwizycję obrazu. Na koniec określono każdy etap analizy obrazu, w tym korekcję artefaktów ruchu bocznego i ratiometrię. Protokół ten można łatwo zaadaptować do każdego laboratorium badawczego wyposażonego w mysz i mikroskop dwufotonowy lub równoważny sprzęt.

<table><tbody><tr><td>acesulfam K</td><td>Sigma Aldrich</td><td>04054-25G</td><td>Sztuczna ślina / smaczny</td></tr><tr><td>roztwór chlorku wapnia</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>kwasu cytrynowego</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0759-100G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>cykloheksymid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>01810-5G</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>denatonium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5765-5G</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>Klej dentystyczny</td><td>Denkist</td><td>P0000CJT-A2</td><td>Preparat dla zwierząt</td></tr><tr><td>Obraz J</td><td>NIH</td><td>ImageJ</td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>IMP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57510-5G</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny</td><td>Loctite</td><td>Loctite 4161, Henkel</td><td>Preparat dla zwierząt</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P3786-100G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Yuhan</td><td>Ketamina 50</td><td>Preparat dla zwierząt</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0662-25G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>237205-500G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathwork</td><td>MATLAB</td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>MPG</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49601-100G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>Mutiphoton</td><td>mikroskop Thorlab</td><td>&nbsp; Bergamo II</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3014-500G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>792519-500G</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>N16XLWD-PF</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Octaflow</td><td>ALA Scientific Instruments</td><td>OCTAFLOW II</td><td>Sterowanie przepływem</td></tr><tr><td>PC</td><td>LG</td><td>Lg15N54</td><td>Miernik pH z kontrolą płynów</td></tr><tr><td></td><td>Thermoscientific</td><td>ORION STAR AZ11</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>Solanka buforowana fosforanami</td><td>Sigma Aldrich</td><td>806562</td><td>Sztuczna ślina / tastant</td></tr><tr><td>chinina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Q1125-5G</td><td>Sztuczna ślina / degustacja</td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Havard Apparatus</td><td>PHD ULTRA 4400</td><td>Kontrola</td></tr> <tr><td>płynówTRITC-dekstran</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52194-1G</td><td>Przygotowanie dla zwierząt</td></tr><tr><td>Ultraszybki laser</td><td>światłowodowy Toptica</td><td>FFultra920 01042</td><td>Mikroskop</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Bayer Korea</td><td>Rompun</td><td>Preparat dla zwierząt</td></tr></tbody></table>

μtongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

&#181;Tongue: A Microfluidics-Based Functional Imaging Platform for the Tongue In Vivo

Mikroskopia fluorescencyjna przyżyciowej jest szeroko stosowanym narzędziem do badania dynamiki wielokomórkowej u żywego zwierzęcia. Nie został jednak z powodzeniem zastosowany w narządzie zmysłów smaku. Dzięki zintegrowaniu mikrofluidyki z okienkiem obrazowania języka przyżyciowego, μTongue zapewnia wiarygodne obrazy funkcjonalne komórek smakowych in vivo pod kontrolowaną ekspozycją na wiele degustacji. W artykule przedstawiono szczegółową procedurę korzystania z systemu μTongue krok po kroku. Składa się z pięciu podsekcji: przygotowanie roztworów degustacyjnych, konfiguracja modułu mikroprzepływowego, montaż próbki, pozyskiwanie funkcjonalnych danych obrazowych oraz analiza danych. Przedstawiono również kilka wskazówek i technik rozwiązywania praktycznych problemów, które mogą pojawić się podczas korzystania z μTongue.

Do uzyskania obrazu pączka smakowego wykorzystano mysz Pirt-GCaMP6f-tdTomato. Powierzchnia języka myszy była pokryta autofluorescencyjnymi brodawkami nitkowatymi. Pączki smakowe są rzadko rozmieszczone na powierzchni języka (Rysunek 4A). Obrazy pączka smakowego i jego struktury pozyskano przy użyciu trzech różnych detektorów z filtrami. Przy użyciu zestawu filtrów 607/70 nm uzyskano sygnał tdTomato z komórek smakowych do analizy ratiometrycznej (Rysunek 4B). Prz...

Artykuł przedstawia urządzenie μTongue (mikrofluidyka na języku) do funkcjonalnego obrazowania komórek smaku in vivo poprzez integrację mikrofluidyki z okienkiem obrazowania przyżyciowego na języku.

μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

Intravital fluorescence microscopy is a tool used widely to study multicellular dynamics in a live animal. However, it has not been successfully used in ...

Protokół ten pozwala na obserwację funkcji komórek smakowych w naturalnym mikrośrodowisku, w którym połączenia nerwowe i krążenie krwi pozostają nienaruszone. Korzystając z tej techniki, można badać komunikację międzykomórkową in vivo. Na początek napełnij zbiorniki ciśnieniowego systemu perfuzyjnego sztuczną śliną i degustatorami.Podłącz przewód sprężonego powietrza do wejścia regulatora i ustaw ciśnienie powietrza w układzie dostarczania płynu na 30 do 50 funtów na cal kwadratowy. Ustaw ciśnienie wyjściowe regulatora na 0.4 funta na cal kwadratowy i sprawdź, czy płyn zaczyna wypływać z rurki. Podłącz kolektor ze zbiorników do portu wejściowego mikrojęzyka, a następnie podłącz port wyjściowy mikrojęzyczka do pompy strzykawkowej i pobieraj ciecz z prędkością około 300 mikrolitrów na minutę, aby ustalić stan ustalony.Upewnij się, że objętość kropli wiszącej pod mikrojęzyczkiem pozostaje stała i wyreguluj ciśnienie powietrza i natężenie przepływu, aby uzyskać żądaną wysokość próbki. Po skonfigurowaniu systemu mikroprzepływowego odłącz przewód sprężonego powietrza i wyłącz pompę strzykawkową do czasu, aż mysz zostanie przygotowana do obrazowania in vivo. Po podaniu znieczulenia myszy, należy wstrzyknąć dożylnie TRITC-dekstran drogą zaoczodołową, aby obserwować krążenie krwi podczas obrazowania.Trzymając mysz w pozycji leżącej, spryskaj jej głowę 70% etanolem. Użyj kleszczy, aby lekko unieść skórę głowy, a następnie użyj nożyczek, aby odciąć około siedmiu milimetrów kwadratowych skóry. Po oczyszczeniu włosów wokół skóry głowy usuń okostną spod skóry i nałóż błyskawiczny klej na czaszkę.Następnie przymocuj niestandardowy mocer głowicy. Gdy klej błyskawiczny stwardnieje, nałóż klej dentystyczny wokół utrwalacza głowy i zestal go przez oświetlenie niebieskim światłem. Za pomocą kleju błyskawicznego przyklej dolną wargę myszy do dolnej części mikrojęzyka, a następnie umieść mysz na płycie do przygotowania myszy i przymocuj dolną jednostkę na mikrojęzyku do słupków przytrzymujących, wyrównując otwory na krawędzi mikrojęzyczka ze słupkami.Dokręć mocowanie głowicy myszy do uchwytu mocującego głowicę na płycie i wyreguluj odległość między głowicą myszy a urządzeniem. Następnie za pomocą uchwytu mocującego głowicę płynnie obróć głowicę myszy o około 45 stopni. Po przymocowaniu myszy do planszy za pomocą plastikowej pęsety delikatnie przeciągnij jej język.Następnie za pomocą kleju błyskawicznego przymocuj brzuszną stronę języka do górnej strony dolnej części mikrojęzyka. Aby język był wilgotny, przetrzyj powierzchnię wilgotnym wacikiem, a następnie umieść kawałek chusteczki nasączonej sztuczną śliną na odsłoniętej powierzchni języka. Umieść zakrzywione podkładki na słupkach, przytrzymując dolną część mikrojęzyczka, a następnie przenieś przygotowanie myszy do stolika mikroskopowego.Umieść odsłonięty język myszy pod przybliżonym środkiem obszaru obiektywu mikroskopu, uważając, aby nie odbiegać od zakresu dynamicznego stage, a następnie dokręć, aby mocno przymocować płytkę myszy do stage. Umieść poduszkę grzewczą pod myszką, aby utrzymać temperaturę ciała w zakresie od 36.5 do 37.5 stopni Celsjusza. Aby zapobiec przedostawaniu się płynu do tchawicy myszy, umieść cienki kawałek skręconego papieru w pysku myszy, a następnie usuń mokrą tkankę umieszczoną na powierzchni języka i umieść przygotowany mikrojęzyk na języku myszy tak, aby powierzchnia języka była widoczna przez okienko obrazowania.Zabezpiecz mikro język, delikatnie przykręcając oba końce z minimalnym naciskiem. Aby rozpocząć pobieranie obrazów, otwórz oprogramowanie mikroskopu, a następnie włącz laser dwufotonowy o długości 920 nanometrów. Zamontuj obiektyw zanurzeniowy w wodzie na mikroskopie, a następnie opuść obiektyw na okienko obrazowania mikrojęzyka i zanurz obiektyw.W trybie aparatu oświetl powierzchnię języka, włączając niebieskie światło z lampy rtęciowej. Aby znaleźć przybliżoną płaszczyznę ogniskową, wyreguluj oś Z i poszukaj sygnału autofluorescencji z brodawek nitkowatych. Następnie za pomocą pokrętła regulacji X i Y zlokalizuj kubek smakowy.Przełącz się w tryb wielofotonowy, a następnie ustaw długość fali wzbudzenia, zestaw filtrów emisyjnych, tryb skanowania i rozmiar klatki do akwizycji obrazu. Mając kubek smakowy na środku okienka obrazowania, zlokalizuj naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy na około dwóch trzecich wysokości kubka smakowego i uwidocznij krążenie krwi. Jeśli przepływ krwi jest zatkany, lekko poluzuj mocujące, aby wznowić przepływ krwi.Dostosuj oś Z, aby znaleźć płaszczyznę Z kubka smakowego zawierającego odpowiednią liczbę komórek smakowych, a następnie kontynuuj obrazowanie wapnia z częstotliwością od dwóch do sześciu Hz przez 80 sekund. Po rozpoczęciu obrazowania włącz zbiornik układu fluidycznego, aby zapewnić roztwór smakowy przez 20 sekund. Po 20 sekundach stymulacji smaku przełącz zbiornik z powrotem na sztuczną ślinę.Podczas obrazowania odczekaj około trzech do czterech minut między sesjami, konsekwentnie dostarczając sztuczną ślinę, aby utrzymać wilgotny język i zmyć degustację pozostałą po poprzedniej sesji. Powierzchnia języka myszy Pirt-GCaMP6f-tdTomato pokryta jest autofluorescencyjnymi brodawkami nitkowatymi i słabo rozłożonymi kubkami smakowymi. Nitkowate brodawki w kolorze żółtym są rejestrowane za pomocą fotodetektora na głębokości od 500 do 550 nanometrów i można je obserwować z samej powierzchni języka na głębokość do około 25 mikrometrów.Sygnały GCaMP w kolorze zielonym wykrywane przez filtr o długości od 500 do 550 nanometrów i sygnały tdTomato w kolorze czerwonym, wykrywane przez filtr o długości od 607 do 670 nanometrów, reprezentują komórki smakowe. Sygnał tdTomato jest uzyskiwany do analizy metryk wskaźnikowych. Naczynia krwionośne otaczające kubek smakowy są pozyskiwane za pomocą zestawu filtrów o długości od 500 do 550 nanometrów w kolagenowej tkance łącznej, który strukturalnie wspiera kubek smakowy, jest pozyskiwany za pomocą zestawu filtrów o długości od 447 do 460 nanometrów.W tym reprezentatywnym przykładzie badań przesiewowych smaku in vivo za pomocą obrazowania wapnia, każda komórka smakowa jest oznaczona liniami przerywanymi. W tym badaniu komórka 2 reagowała zarówno na słodkie, jak i umami smaki. Komórka 3 reagowała zarówno na degustacje o niskiej, jak i wysokiej soli.Żadna z komórek w tym kubku smakowym nie reagowała na kwaśne smaki. Ponieważ celem tego eksperymentu jest obserwacja funkcji komórek smakowych w środowisku naturalnym, ważne jest, aby dostarczyć fluorescencje do naczyń krwionośnych na etapie przygotowania i potwierdzić ich krążenie podczas eksperymentu.

tongue-microfluidics-based-functional-imaging-platform-for-tongue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiono kompleksowy przegląd technik wykorzystywanych w tworzeniu mysiego modelu raka jamy ustnej oraz ilościowego monitorowania inwazji nowotworowej w obrębie języka za pomocą mikroskopii wielofotonowej komórek znakowanych. System ten może służyć jako użyteczna platforma do oceny molekularnej oraz skuteczności leków w przypadku związków przeciwinwazyjnych.

Obrazowanie wielofotonowe inwazji komórek nowotworowych w ortotopowym modelu mysim dla raka płaskonabłonkowego jamy ustnej

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis eksperymentalnego protokołu obrazowania z nowo opracowanym ręcznym systemem optoakustycznym (fotoakustycznym) do trójwymiarowego obrazowania funkcjonalnego i molekularnego w czasie rzeczywistym. Wykazana wysoka wydajność i wszechstronność mogą zdefiniować nowe obszary zastosowań technologii optoakustycznej w badaniach przedklinicznych i praktyce klinicznej.

Uniwersalna ręczna trójwymiarowa sonda do obrazowania optoakustycznego do angiografii tkanek głębokich i funkcjonalnych badań przedklinicznych w czasie rzeczywistym

To badanie z powodzeniem zaadaptowało metody ludzkiego wideofluoroskopowego badania połykania (VFSS) do użycia z modelami chorób mysich w celu ułatwienia badań nad dysfagią translacyjną.

Adaptacja metod badania wideofluoroskopowego jaskółki u ludzi do wykrywania i charakteryzowania dysfagii w modelach choroby myszy

Obrazowanie ultradźwiękowe może być używane do wyświetlania kształtu i ruchów języka w czasie rzeczywistym podczas mowy. Obrazy mogą być wykorzystane do określenia charakteru błędów dźwiękowych mowy. Wizualna informacja zwrotna języka może być wykorzystana do ułatwienia poprawy produkcji dźwięków mowy w populacjach klinicznych.

Obrazy ultrasonograficzne języka: samouczek do oceny i korygowania wad dźwiękowych mowy

Sondy specyficzne dla celu stanowią innowacyjne narzędzie do analizy mechanizmów molekularnych, takich jak ekspresja białek w różnych typach chorób (np. zapaleniu, infekcji i nowotworzenia). W tym badaniu opisano ilościową trójwymiarową ocenę tomograficzną infiltracji makrofagów jelitowych w mysim modelu zapalenia jelita grubego przy użyciu tomografii fluorescencyjnej specyficznej dla F4 / 80.

Tomografia fluorescencyjna do wykrywania i ilościowego oznaczania mysiego zapalenia jelit związanego z makrofagami

Opisujemy zabieg chirurgiczny na znieczulonym modelu szczura w celu określenia napięcia mięśniowego i właściwości lepkosprężystych języka. Zabieg polega na specyficznej stymulacji nerwów podjęzykowych i zastosowaniu biernych krzywych siły/deformacji Lissajous do mięśnia.

In vivo (in vivo) Ocena właściwości mechanicznych i lepkosprężystych języka szczura

Opracowaliśmy uogólniony protokół do dysocjacji dużej ilości wysokiej jakości pojedynczych komórek z nabłonka i mezenchymy/tkanki łącznej embrionalnych i dorosłych języków myszy.

Dysocjacja komórek z nabłonka języka i mezenchymy/tkanki łącznej myszy w wieku 12,5 dnia zarodkowego i 8 tygodni

Protokół przedstawia metodę hodowli i przetwarzania organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych wyizolowanych z tylnej brodawki smakowej dorosłych myszy.

Wytwarzanie i hodowla organoidów językowych pochodzących z komórek macierzystych smakowych dorosłych myszy

Balans folii wisiorek z kroplą powierzchni, zaimplementowany z wymianą wielofazową, nazywaną OCTOPUS, pozwala na naśladowanie warunków trawiennych poprzez sekwencyjną wymianę podfaz oryginalnego roztworu masowego z symulowanymi płynami żołądkowo-jelitowymi. Symulowane trawienie in vitro jest monitorowane poprzez rejestrowanie in situ napięcia międzyfazowego strawionej warstwy międzyfazowej.

Metody in vitro Trawienie emulsji w pojedynczej kropli poprzez wielofazową wymianę symulowanych płynów żołądkowo-jelitowych

Celem niniejszego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego podejścia do ilościowej oceny integralności bariery nabłonkowej dziąseł u myszy poprzez miejscowe nałożenie fluoroforowo oznaczonych dektranów o różnej wielkości cząsteczkowої na powierzchnię dziąseł in vivo, z późniejszym obrazowaniem ex vivo za pomocą systemu mikroskopu jednofotonowego.

Ocena funkcjonalności bariery nabłonkowej dziąseł mysich za pomocą fluorescencyjnych znaczników

Poznaj metodę obrazowania komórek smakowych in vivo przy użyciu mikrofluidycznego systemu µTongue u myszy. Technika umożliwia analizę funkcjonalną odpowiedzi na substancje smakowe w warunkach fizjologicznych.

μTongue: oparta na mikrofluidyce funkcjonalna platforma obrazowania języka in vivo

Przeglądaj więcej filmów