Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła
April 23rd, 2021
Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.
Krystalografia makromolekularna o długich falach wykorzystuje anomalny sygnał z atomów światła natywnie obecnych w białkach i kwasach nukleinowych. Technika ta służy do eksperymentalnego rozwiązania problemu czoła krystalograficznego oraz do określenia tożsamości i lokalizacji tych elementów. Beamline I23 w Diamond Light Source to unikalny instrument synchrotronowy zoptymalizowany do eksperymentów na długich falach do pięciu angstremów.
Umożliwia dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o wysokim znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor. Ze względu na znaczną absorpcję promieni rentgenowskich przez powietrze w reżimie długich fal, eksperymenty te są wykonywane w środowisku próżniowym. Aby utrzymać próbki w temperaturach kriogenicznych w środowisku próżniowym, kryształy są montowane na dedykowanych, przewodzących ciepło uchwytach na próbki.
Przenoszenie próbki kriogenicznej z ciekłego azotu do próżniowej stacji końcowej jest bardzo podobne do technik stosowanych w mikroskopii krioelektronowej. Protokół ten przedstawia procedurę przenoszenia kryształów do środowiska próżniowego przy użyciu narzędzi i sprzętu opracowanego w Diamond Light Source. Rozpocząć od oddzielenia wieczka od podstawy urządzenia CombiPuck w taki sposób, aby uchwyty na próbki pozostały przymocowane do podstawy, a fiolki pozostały w pokrywie.
Zanurz pokrywkę z fiolkami w ciekłym azocie, a następnie przymocuj uchwyt na próbkę i adapter do różdżki magnetycznej i zbierz kryształy. Schłodzić każdą próbkę bezpośrednio w CombiPuck, zwracając uwagę na położenie próbki. Aby zamknąć krążek, użyj różdżki krążka, aby przymocować podstawę do pokrywy.
Przenieś CombiPuck z ciekłego azotu do suchego transportera lub magazynu. Umieść podstawę krążka blokowego już wypełnionego pustymi blokami transferowymi na jego podstawie nośnej w pojemniku piankowym, a następnie napełnij ciekłym azotem. Następnie umieść CombiPuck w pojemniku piankowym wypełnionym ciekłym azotem, upewniając się, że podstawa krążka jest przymocowana do uchwytu magnetycznego wewnątrz pojemnika na piankę.
Wstępnie schłodzić wszystkie niezbędne narzędzia w ciekłym azocie. Następnie oddziel pokrywę od podstawy za pomocą separatora krążków na wysokim ustawieniu, tak aby podstawa pozostała przymocowana do uchwytu magnetycznego, odsłaniając uchwyty na próbki wewnątrz ciekłego azotu. Umieść różdżkę separatora nad uchwytem próbki i adapterem tak głęboko, jak to możliwe, upewniając się, że różdżka jest pionowa.
Przesuń kciukiem małą dźwignię na różdżce separatora w dół, aż usłyszysz kliknięcie, aby zamocować uchwyt próbki w środku, a następnie wyciągnij uchwyt na próbkę z adaptera. Opuść separator nad żądaną pozycję bloku transferowego, upewniając się, że jeden z trzech bolców pasuje do środkowego otworu bloku transferowego. Zwolnij uchwyt próbki, przesuwając dźwignię z powrotem do góry.
Aby załadować próbki do następnego bloku transferu, użyj narzędzia klucza karuzeli, aby obrócić pusty blok transferu do pozycji poziomej. Po przeniesieniu wszystkich uchwytów na próbki zamknij krążek blokowy, umieszczając pokrywkę w ciekłym azocie. Poczekaj, aż temperatura się wyrówna, a następnie załóż pokrywkę na podstawę i delikatnie podnieś, aby uwolnić z karuzeli.
Podłącz wahadłowiec do stacji. Otwórz zawory azotu i powietrza i upewnij się, że gazy przepływają. Następnie włącz CTS.
Zarówno wannę, jak i czółenko schłodzić ciekłym azotem. Umieść dostarczony lejek w porcie napełniania na wahadłowcu i powoli wlewaj ciekły azot do lejka, monitorując poziom na ekranie. Zatrzymaj się, gdy wskaźnik zmieni kolor z czerwonego na niebieski.
Napełnij wannę ciekłym azotem za pomocą lejka. Przenieś krążek blokowy z ciekłego azotu do kąpieli CTS za pomocą dołączonego narzędzia do separatora krążków. Zdejmij pokrywę krążka blokowego i zamknij pokrywę wanny CTS.
Aby wprowadzić blok transferowy do wózka, odblokuj uchwyt wahadłowy, obracając go o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przesuń go w kierunku wanny, tak aby prowadnica na uchwycie wymuszała prawidłowy tor jazdy. Po schłodzeniu pokrywy bloku przesuń uchwyt, aby wprowadzić blok do czółenka. Aby zablokować blok transferowy na czółenku, obróć uchwyt o 180 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
Cofnij uchwyt do pierwotnej tylnej pozycji i zablokuj go na miejscu, obracając o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Naciśnij przycisk Zamknij pompę zaworu wahadłowego na ekranie wyświetlacza, aby rozpocząć ewakuację wahadłowca. Gdy na ekranie dotykowym pojawią się komunikaty Wahadłowiec gotowy do ruchu i Nie przesuwaj pręta, zawór zamknięty, naciśnij dźwignię pod wahadłowcem i ostrożnie podnieś ją za pomocą uchwytu u góry.
Przenieś wahadłowiec do śluzy powietrznej na próżniowej stacji końcowej w pozycji pionowej i zamocuj go. Wybierz pustą pozycję bloku w zbiorniku, naciskając odpowiedni przycisk na ekranie dotykowym i przesuwając sample hotel do właściwej pozycji załadunku. Gdy sample hotel znajdzie się na swoim miejscu, naciśnij przycisk Otwórz, aby zainicjować sekwencję blokady podciśnienia.
Po zakończeniu sekwencji i zmianie statusu na Śluza powietrzna otwarta, zablokuj wahadłowiec, przekręć uchwyt o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby odblokować pręt. Delikatnie wepchnij pręt do naczynia tak, aby prowadzony tor wymuszał prawidłowy tor podróży w kierunku hotelu próbki. Powoli włóż blok transferowy do hotelu, korzystając z sygnału wideo wyświetlanego na ekranie w celu uzyskania wskazówek, upewniając się, że ikona pozycji bloku na wyświetlaczu dotykowym jest aktywna.
Po aktywacji obróć uchwyt o 180 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zwolnić blok transferowy i wyciągnąć pręt z naczynia. Po całkowitym schowaniu obróć uchwyt o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zablokować pręt. Naciśnij przycisk Zamknij, aby zamknąć zawór podciśnieniowy stacji końcowej i odpowietrzyć przestrzeń między wahadłowcem a naczyniem do ciśnienia atmosferycznego.
Wyjmij wahadłowiec, gdy na wyświetlaczu śluzy powietrznej pojawi się stan OK do odłączenia. Zwróć czółenko do kąpieli CTS i naciśnij przycisk Otwórz zawór wahadłowy, aby ewakuować czółenko przed załadowaniem następnego bloku próbki. Gdy sygnalizacja świetlna zmieni kolor na zielony i pojawi się komunikat OK, aby przesunąć pręt, do wahadłowca można wprowadzić następny blok transferowy.
Aby przygotować następny blok transferowy, obróć krążek blokowy wewnątrz wanny. Wciśnij wbudowany klucz obrotowy na górze akrylowej pokrywy w dół do zamka pośrodku krążka blokowego. Przytrzymując go, przekręć kluczyk, aby ustawić żądany blok transferowy w pozycji podbieracza.
Po przeniesieniu wszystkich bloków upewnij się, że zawór wahadłowy jest otwarty, naciśnij przycisk pieczenia na ekranie dotykowym, wybierz zarówno Bath, jak i Shuttle, a następnie naciśnij Rozpocznij pieczenie. Linia badawcza krystalografii makromolekularnej I23 o dużej długości fali w diamentowym źródle światła może uzyskać dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o dużym znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor, dając wzmocniony sygnał anomalny, który można wykorzystać do fazowania lub lokalizowania tych pierwiastków w makrocząsteczkach. Dane dyfrakcyjne zebrano z pojedynczego kryształu taumatyny o długości fali 2,75 angstrema, wybranego jako kompromis między zwiększonym sygnałem anomalnym a efektami absorpcji próbki na dłuższych falach.
Konfiguracja próżniowa zapewnia, że do detektora docierają tylko promienie rentgenowskie rozproszone przez próbkę, zapewniając niskie tło wokół odbić Bragga. Zestaw danych dostarczył bardzo silny sygnał anomalny, ułatwiając rozwiązanie struktury przez automatyczny rurociąg fazowy CRANK2. Wysoka jakość uzyskanej mapy gęstości elektronów umożliwiła pomyślne zbudowanie automatycznego modelu, z prawidłowym rozmieszczeniem 100% sekwencji aminokwasowej taumatyny.
16 reszt cysteiny w taumatynie tworzy osiem mostków dwusiarczkowych, które są wyraźnie widoczne na mapie gęstości elektronów. Ponieważ krystalografia białek o długich falach w próżni jest nową dziedziną, opracowaliśmy nowe narzędzia i sprzęt do obsługi próbek. Protokół ten prowadzi użytkowników do bezpiecznego przesyłania próbek do próżniowej stacji końcowej na linii badawczej I23 w Diamond Light Source.
Środowisko próżniowe otwiera unikalne możliwości wykonywania eksperymentów dyfrakcyjnych w zakresie długości fal niedostępnym na innych liniach badawczych. Krystalografia rentgenowska o dużej długości fali umożliwia eksperymentalne fazowanie makrocząsteczek bezpośrednio z natywnych kryształów. Pozwala również na jednoznaczną identyfikację jonów związanych z cząsteczkami.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół przygotowania kryogenicznej próbki i transferu kryształów do stacji końcowej w próżni na linii wiązki I23 w Diamond Light Source. Skupia się na eksperymentach długofalowej krystalografii rentgenowskiej makrocząsteczek, które wykorzystują anomalne sygnały z lekkich atomów w biologicznych makrocząsteczkach.
Kluczowe komponenty badania
Obszar nauki
- Krystalografia makrocząsteczek
- Biologia strukturalna
- Techniki promieniowania synchrotronowego
Tło
- Długofalowa krystalografia makrocząsteczek wykorzystuje anomalne sygnały z lekkich atomów.
- Linia wiązki I23 jest zoptymalizowana do eksperymentów długofalowych, umożliwiając dostęp do krytycznych elementów biologicznych.
- Eksperymenty są przeprowadzane w próżni, aby zminimalizować absorpcję promieni X przez powietrze.
- Kryogeniczne temperatury są utrzymywane za pomocą specjalistycznych uchwytów do próbek.
Cel badania
- Dostarczenie kompleksowego protokołu transferu kryształów do środowiska próżniowego.
- Zapewnić integralność próbek podczas procesu transferu.
- Fascynacja eksperymentami długofalowej krystalografii rentgenowskiej.
Stosowane metody
- Odłączenie pokrywy CombiPuck od podstawy dla dostępu do próbki.
- Zanurzenie próbek w ciekłym azocie do kryogenicznej konserwacji.
- Użycie narzędzia do oddzielania pucka dla precyzyjnego transferu próbek.
- Zastosowanie kontrolowanego środowiska próżniowego dla wprowadzania próbek.
Główne wyniki
- Sukces w transporcie kryogenicznie zachowanych kryształów do stacji końcowej w próżni.
- Wykazanie skuteczności protokołu w utrzymaniu integralności próbek.
- Walidacja procedury dla długofalowej krystalografii rentgenowskiej makrocząsteczek.
- Ustawienie niezawodnej metody dla przyszłych eksperymentów w Diamond Light Source.
Wnioski
- Protokół zapewnia solidną ramę dla kryogenicznego transferu próbek.
- Zwiększa wykonalność eksperymentów długofalowej krystalografii rentgenowskiej.
- Przyszłe zastosowania mogą budować na tej metodologii dla różnych badań biologicznych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography on beamline I23 enables direct experimental phasing and native ion identification in proteins and nucleic acids, eliminating the need for external labeling. This capability enhances predictive confidence in structural biology, supporting early discovery and target validation inflection points across biopharma portfolios. The protocol's reproducibility and data quality facilitate risk-adjusted advancement of structural targets for downstream drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct structure solution of macromolecules using native anomalous scatterers for robust target validation.
- Supports mechanistic de-risking by unambiguously identifying biologically relevant ions and cofactors.
- Improves predictive confidence in target structure and binding site characterization.
Screening & Assay Development
- Provides high-quality, reproducible structural data for assay development and compound screening campaigns.
- Facilitates standardization of sample preparation and transfer workflows across research teams.
- Enables reliable evaluation of ligand binding and structural perturbations in validated systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural insights with disease-relevant systems by resolving native ion binding and post-translational modifications.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by preserving sample integrity and data quality.
- Supports translational biomarker identification through precise structural mapping.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to lead identification and preclinical validation, leveraging in-vacuum crystallography for high-confidence structural outputs.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling native anomalous phasing and ion identification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative diffraction data supporting assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides robust statistical outputs and electron density maps for comparative analysis of structural conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical research by maintaining sample fidelity and enabling biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for structural studies across multiple targets and programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target structures.
- Operational Value: Standardizes sample handling and transfer, ensuring reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk through high-quality structural data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic sample handling and macromolecular crystallography.
- Demands access to specialized instrumentation, including the Cryogenic Transfer System and vacuum-compatible sample holders.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and transfer protocols.
- Adaptation may be needed for different macromolecular systems or crystal morphologies.
- Practical limitations include the need for vacuum-compatible infrastructure and specialized training.
