Name: Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj protokół przygotowania i transferu próbek do krystalografii długofalowej w próżni na linii I23 przy Diamond Light Source. Metoda umożliwia zachowanie integralności kryształów białkowych w warunkach kriogenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Adamowi Taylorowi, Adamowi Prescottowi, Kenowi Jonesowi, Arvinderowi Palaha i Kevinowi Wilkinsonowi za ich wsparcie w rozwoju Systemu Transferu Próbek Kriogenicznych (CTS). Ta praca została sfinansowana przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

1. Zbieranie kryształów
UWAGA: Używaj odpowiedniego sprzętu ochrony osobistej: gogli i rękawic, jeśli to możliwe.
<ol>
	<li>Po tym, jak SH dotrą do laboratorium użytkownika w kombipukach (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C), oddziel pokrywkę od podstawy kombikucji tak, aby SH pozostały przymocowane do podstawy, a fiolki zostały zatrzymane w pokrywie.</li>
	<li>Zanurzyć pokrywkę z fiolkami w ciekłym azocie. Podłącz adapter SH + (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B, po prawej) do magnetycznej różdżki i zbieraj kryształy jak zwykle.</li>
	<li>Schładzaj każdą próbkę bezpośrednio w kombikucie, zwracając uwagę na położenie próbki. Aby zamknąć krążek, użyj różdżki krążka, aby przymocować podstawę do pokrywy.</li>
	<li>Przenieś kombipuk z ciekłego azotu do suchego transportera lub dewara do przechowywania ciekłego azotu. Wyślij przesyłkę w stanie suchym do firmy Diamond (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Shipping-Samples.html).</li>
</ol>
2. Przeniesienie próbki do próżni
<ol>
	<li>Załadunek SH z kombipuku do bloku przeładowczego
	<ol>
		<li>Umieść podstawę krążka blokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H) już wypełniony pustymi blokami transferowymi (<silna klasa="xfig">Rysunek 3D) na jego podstawie nośnej wewnątrz ciekłego azotu w pojemniku piankowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3J-b). 
		UWAGA: Orientacja bloków transferowych jest ważna dla dokładności przenoszenia próbki wewnątrz naczynia próżniowego. W związku z tym klocki powinny być umieszczone na podstawie krążka blokowego, upewniając się, że pinezka oznaczona strzałką w Rysunek 3D znajduje się po lewej stronie bloku.</li>
		<li>Umieść krążek z fiolką w pojemniku piankowym wypełnionym ciekłym azotem, upewniając się, że podstawa krążka jest przymocowana do uchwytu magnetycznego wewnątrz pojemnika z pianką (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3J-a).</li>
		<li>Wstępnie schłodzić wszystkie niezbędne narzędzia w ciekłym azocie. Użyj narzędzia do separatora krążków pokazanego na <silna klasa="xfig">Rysunek 3G na wysokim ustawieniu H, aby oddzielić pokrywę od podstawy, tak aby podstawa pozostała przymocowana do uchwytu magnetycznego, a SH były odsłonięte wewnątrz ciekłego azotu.</li>
		<li>Aby wyjąć każdy SH z adaptera, użyj różdżki separatora (<silna klasa="xfig">Rysunek 3F), aby podnieść SH z podstawy kombajnu i umieść w odpowiedniej pozycji bloku transferowego w pozycji poziomej karuzeli w <silna klasa="xfig">Rysunek 3J-b.
		<ol>
			<li>Umieść różdżkę separatora nad adapterem SH + tak nisko, jak to możliwe, upewniając się, że różdżka jest pionowa, aby uniknąć dotykania próbki.</li>
			<li>Przesuń kciukiem małą dźwignię na różdżce separatora w dół, aż usłyszysz kliknięcie, aby zabezpieczyć SH w środku i wyciągnij SH z adaptera.</li>
			<li>Opuść separator nad żądaną pozycję bloku, upewniając się, że jeden z trzech bolców pasuje do środkowego otworu bloku.</li>
			<li>Zwolnij SH, przesuwając dźwignię z powrotem do góry. Powtórz te kroki dla każdego SH.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby załadować próbki do następnego bloku próbki, użyj narzędzia klucza karuzeli (Rysunek 3E), aby obrócić pusty blok do pozycji poziomej.</li>
		<li>Przymocuj narzędzie do separatora krążków pokazane na Rysunek 3G, używając niskiego ustawienia L do pokrywy krążka blokowego, przykręcając zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
		<li>Po przeniesieniu wszystkich SH, aby zamknąć krążek blokowy, umieść pokrywkę w ciekłym azocie i poczekaj, aż temperatura się wyrówna, a następnie załóż pokrywkę na podstawę, jak w <silna klasa="xfig">Rysunek 3I. Po dołączeniu narzędzia do separatora delikatnie podnieś, aby zwolnić z karuzeli.</li>
		<li>Na tym etapie krążek blokowy może zostać przeniesiony do CTS (<silna klasa="xfig">Rysunek 4B) lub do dewara magazynującego ciekły azot.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załadunek bloków transferowych do zbiornika próżniowego
	<ol>
		<li>Upewnij się, że wahadłowiec jest bezpiecznie przymocowany do stacji. Otwórz zawory azotu i powietrza i upewnij się, że gazy płyną. Włącz CTS.</li>
		<li>Jeśli na wyświetlaczu nie pojawią się żadne komunikaty ostrzegawcze, należy przystąpić do schładzania zarówno wanny, jak i czółenka ciekłym azotem. Umieść dostarczony lejek w porcie napełniania na wahadłowcu i powoli wlewaj ciekły azot do lejka, monitorując poziom na ekranie. Zatrzymaj się, gdy wskaźnik zmieni kolor z czerwonego na niebieski. 
		UWAGA: Wahadłowiec jest gotowy do użycia, gdy temperatura zimnego siedzenia wyświetlana na ekranie dotykowym jest niższa niż 100 K. Wanna stacji próbkowania może być napełniana jednocześnie za pomocą odpowiedniego lejka do poziomu oznaczonego na ściance wanny lub w 100% na wyświetlaczu poziomu ciekłego azotu. Czujniki poziomu ciekłego azotu i temperatury powinny być stale monitorowane przez cały czas pracy; Wymagane będzie kilka doładowań.</li>
		<li>Gdy temperatura zimnego siedzenia wahadłowca spadnie poniżej 100 K, a poziom ciekłego azotu na wózku i wannie ustabilizuje się, przenieś krążek blokowy z ciekłego azotu do kąpieli CTS za pomocą dołączonego separatora krążków. Zdejmij pokrywę krążka blokowego i zamknij pokrywę wanny CTS.</li>
		<li>Aby wprowadzić blok do wózka, należy otworzyć zawór CTS, jeśli nie jest jeszcze otwarty, naciskając przycisk Otwórz zawór wahadłowy na wyświetlaczu. Odblokuj uchwyt wahadłowy, obracając go o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przesuń go w kierunku wanny tak, aby prowadnica na uchwycie wymusiła prawidłową ścieżkę ruchu w kierunku wanny. Gdy osłona bloku jest widoczna wewnątrz wanny, pozwól jej ostygnąć. Po ustaniu bulgotania ciekłego azotu wokół pokrywy przejdź do bloku transferowego.</li>
		<li>Aby zablokować blok transferowy na wózku, obróć uchwyt o 180° zgodnie z ruchem wskazówek zegara.</li>
		<li>Cofnij uchwyt do pierwotnej tylnej pozycji, a następnie "zablokuj" go na miejscu, obracając o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
		<li>Naciśnij przycisk Zamknij zawór wahadłowy i pompę na ekranie wyświetlacza, aby rozpocząć ewakuację wahadłowca.</li>
		<li>Gdy na ekranie dotykowym pojawi się komunikat Wahadłowiec gotowy do odłączenia, naciśnij dźwignię pod wózkiem i ostrożnie podnieś go za pomocą uchwytu u góry.</li>
		<li>Przenieś wahadłowiec do śluzy powietrznej na stacji końcowej odkurzacza w pozycji pionowej.</li>
		<li>Przymocuj wahadłowiec do śluzy powietrznej na stacji końcowej odkurzacza. 
		UWAGA: Po bezpiecznym zamocowaniu ekran dotykowy na stacji końcowej potwierdzi stan wózka i blokady.</li>
		<li>Wybierz pustą pozycję bloku w zbiorniku, naciskając odpowiedni przycisk na ekranie dotykowym i przesuwając sample hotel do właściwej pozycji załadunku.</li>
		<li>Gdy przykładowy hotel znajdzie się na swoim miejscu, przycisk Otwórz stanie się aktywny. Naciśnij ten przycisk, aby zainicjować sekwencję blokady podciśnienia. 
		UWAGA: Pompa uruchomi się, a postęp zostanie wyświetlony na monitorze. Może to potrwać do dwóch minut.</li>
		<li>Po zakończeniu sekwencji status zmieni się na Śluza powietrzna otwarta, transfer w toku. Przekręć uchwyt o 90° zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby odblokować pręt, i delikatnie wepchnij pręt do naczynia, aby prowadzona prowadnica ponownie wymusiła prawidłową ścieżkę podróży w kierunku sample pozycja hotelu. Korzystając z sygnału wideo wyświetlanego na ekranie w celu uzyskania wskazówek, powoli włóż klocek do hotelu, upewniając się, że lampka pozycyjna bloku na wyświetlaczu dotykowym jest włączona. Po aktywacji obróć uchwyt o 180° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zwolnić blok i wyciągnij pręt z naczynia. Po całkowitym schowaniu obróć uchwyt o 90° w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zablokować pręt.</li>
		<li>Gdy pręt zostanie zablokowany, przycisk Zamknij stanie się aktywny. Naciśnij to, aby zamknąć zawór podciśnieniowy stacji końcowej i odpowietrzyć przestrzeń między wahadłowcem a naczyniem do ciśnienia atmosferycznego, czekając do 20 s na zakończenie.</li>
		<li>Poczekaj, aż wyświetlacz pokaże stan w porządku, aby usunąć czółenko po zakończeniu sekwencji. W tym momencie usuń czółenko i wróć do CTS, aby powtórzyć proces dla następnego bloku.</li>
		<li>Aby przygotować następny blok do przeniesienia, obróć krążek blokowy w wannie. Wciśnij wbudowany klucz obrotowy na górze akrylowej pokrywy w dół do zamka pośrodku krążka blokowego. Przytrzymując go, przekręć kluczyk, aby ustawić żądany blok w pozycji podbieracza.</li>
		<li>Po przeniesieniu wszystkich bloków upewnij się, że zawór wahadłowy jest otwarty, gdy jest zamontowany na CTS. Naciśnij przycisk pieczenia na ekranie dotykowym i wybierz zarówno kąpiel, jak i wahadło, a następnie naciśnij bake. 
		UWAGA: Powoduje to rozgrzanie zarówno czółenka, jak i wanny w celu zagotowania ciekłego azotu, a następnie odparowania nagromadzonego lodu/kondensatu przed następnym użyciem. Po rozpoczęciu pieczenia można wyłączyć dopływ gazu i powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Green, D. W., Ingram, V. M., Perutz, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+haemoglobin+-+IV.+Sign+determination+by+the+isomorphous+replacement+method%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+A.+Mathematical+and+Physical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The structure of haemoglobin - IV. Sign determination by the isomorphous replacement method.</a> Proceedings of the Royal Society of London. Series A. Mathematical and Physical Sciences. 225 (1162), 287(1954).</li>
<li>Hendrickson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+diffraction+in+crystallographic+phase+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Anomalous diffraction in crystallographic phase evaluation.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 47 (1), 49-93 (2014).</li>
<li>Pike, A. C., Garman, E. F., Krojer, T., von Delft, F., Carpenter, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+heavy-atom+derivatization+of+protein+crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 303-318 (2016).</li>
<li>Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selenomethionyl+proteins+produced+for+analysis+by+multiwavelength+anomalous+diffraction+%28MAD%29%3A+A+vehicle+for+direct+determination+of+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure.</a> The EMBO Journal. 9 (5), 1665-1672 (1990).</li>
<li>Liu, Q., Hendrickson, W. A. Contemporary use of anomalous diffraction in biomolecular structure analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+Q+%22Protein+Crystallography.+Methods+in+Molecular+Biology%22">Protein Crystallography. Methods in Molecular Biology</a>. Wlodawer, A., Dauter, Z., Jaskolski, M. 1607, Humana Press. New York, NY. 377-399 (2017).</li>
<li>Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+SAD+is+maturing%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Native SAD is maturing.</a> IUCrJ. 2 (4), 431-440 (2015).</li>
<li>Rozov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+potassium+ions+for+ribosome+structure+and+function+revealed+by+long-wavelength+X-ray+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Importance of potassium ions for ribosome structure and function revealed by long-wavelength X-ray diffraction.</a> Nature Communications. 10 (1), 2519(2019).</li>
<li>Rocchio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+dynamic%2C+partially+occupied+residues+using+anomalous+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Identifying dynamic, partially occupied residues using anomalous scattering.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (12), 1084-1095 (2019).</li>
<li>Langan, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anomalous+X-ray+diffraction+studies+of+ion+transport+in+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Anomalous X-ray diffraction studies of ion transport in K+ channels.</a> Nature Communications. 9 (1), 4540(2018).</li>
<li>Lolicato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((K2p+channel+C-type+gating+involves+asymmetric+selectivity+filter+order-disorder+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">K2p channel C-type gating involves asymmetric selectivity filter order-disorder transitions.</a> Science Advances. 6 (44), (2020).</li>
<li>Thorn, A., Sheldrick, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ANODE%3A+anomalous+and+heavy-atom+density+calculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">ANODE: anomalous and heavy-atom density calculation.</a> Journal of Applied Crystallography. 44 (6), 1285-1287 (2011).</li>
<li>Handing, K. B., Niedzialkowska, E., Shabalin, I. G., Kuhn, M. L., Zheng, H., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+metal-binding+sites+in+proteins+with+X-ray+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Characterizing metal-binding sites in proteins with X-ray crystallography.</a> Nature Protocols. 13 (5), 1062-1090 (2018).</li>
<li>Jungnickel, K. E. J., Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+amino+acid+transport+by+the+CAT+family+of+SLC7+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis for amino acid transport by the CAT family of SLC7 transporters.</a> Nature Communications. 9 (1), 550(2018).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Henderson, K., Mykhaylyk, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vacuum+long-wavelength+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">In-vacuum long-wavelength macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 72 (3), 430-439 (2016).</li>
<li>Wernecke, J., Gollwitzer, C., Müller, P., Krumrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+in-vacuum+PILATUS+1M+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Synchrotron+Radiation%22%5BJournal%5D)">Characterization of an in-vacuum PILATUS 1M detector.</a> Journal of Synchrotron Radiation. 21 (3), 529-536 (2014).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Biological+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (2), 125-132 (2010).</li>
<li>Winter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DIALS%3A+Implementation+and+evaluation+of+a+new+integration+package%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (2), 85-97 (2018).</li>
<li>Brockhauser, S., Di Michiel, M., Mcgeehan, J. E., Mccarthy, A. A., Ravelli, R. B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-ray+tomographic+reconstruction+of+macromolecular+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">X-ray tomographic reconstruction of macromolecular samples.</a> Journal of Applied Crystallography. 41 (6), 1057-1066 (2008).</li>
<li>Kitano, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+membrane+protein+crystal+using+ultraviolet+laser+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Processing of membrane protein crystal using ultraviolet laser irradiation.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 100 (1), 50-53 (2005).</li>
<li>Mykhaylyk, V., Wagner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+long-wavelength+protein+crystallography%3A+Keeping+a+protein+crystal+frozen+in+vacuum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physics%3A+Conference+Series%22%5BJournal%5D)">Towards long-wavelength protein crystallography: Keeping a protein crystal frozen in vacuum.</a> Journal of Physics: Conference Series. 425 (1), 012010(2013).</li>
<li>Snell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+sample+mounting+and+alignment+system+for+biological+crystallography+at+a+synchrotron+source%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Automated sample mounting and alignment system for biological crystallography at a synchrotron source.</a> Structure. 12 (4), 537-545 (2004).</li>
<li>The universal container project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/">https://smb.slac.stanford.edu/robosync/Universal_Puck/</a> (2020).</li>
<li>Teng, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mounting+of+crystals+for+macromolecular+crystallography+in+a+freestanding+thin-film%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">Mounting of crystals for macromolecular crystallography in a freestanding thin-film.</a> Journal of Applied Crystallography. 23, 387-391 (1990).</li>
<li>Esposito, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+glycosyltransferase+activity+of+the+salmonella+effector+SseK3%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the glycosyltransferase activity of the salmonella effector SseK3.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (14), 5064-5078 (2018).</li>
<li>O'Donnell, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+EMC+reveals+a+path+for+membrane+protein+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The architecture of EMC reveals a path for membrane protein insertion.</a> eLife. 9, 57887(2020).</li>
<li>Mishra, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+characterization+of+crimean-congo+hemorrhagic+fever+virus+GP38%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and characterization of crimean-congo hemorrhagic fever virus GP38.</a> Journal of Virology. 94 (8), 02005-02019 (2020).</li>
<li>Rudolf, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+inhibits+its+receptor+patched+by+a+pincer+grasp+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog inhibits its receptor patched by a pincer grasp mechanism.</a> Nature Chemical Biology. 15 (10), 975-982 (2019).</li>
<li>El Omari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pushing+the+limits+of+sulfur+sad+phasing%3A+De+novo+structure+solution+of+the+n-terminal+domain+of+the+ectodomain+of+hcv+e1%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Pushing the limits of sulfur sad phasing: De novo structure solution of the n-terminal domain of the ectodomain of hcv e1.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 70 (8), 2197-2203 (2014).</li>
<li>Winter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XIA2%3A+an+expert+system+for+macromolecular+crystallography+data+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Crystallography%22%5BJournal%5D)">XIA2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction.</a> Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).</li>
<li>Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Buccaneer+software+for+automated+model+building.+1.+Tracing+protein+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+D%3A+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">The Buccaneer software for automated model building. 1. Tracing protein chains.</a> Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 62 (9), 1002-1011 (2006).</li>
<li>Skubak, P., Pannu, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+protein+structure+solution+from+weak+X-ray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Automatic protein structure solution from weak X-ray data.</a> Nature Communications. 4 (1), 2777(2013).</li>
</ol>

Obecny protokół został opracowany w celu spełnienia wymagań dotyczących przygotowania próbek do eksperymentów MX na długich falach w próżni na linii badawczej I23. Jest on wykorzystywany na linii badawczej od roku i przyczynił się do pomyślnego zakończenia wielu projektów. Jak wskazują przedstawione tu wyniki, protokół umożliwia bezpieczny i niezawodny transfer próbek do próżniowej stacji końcowej przy zachowaniu ich jakości dyfrakcyjnej. Jest to ważny aspekt dla funkcjonowania linii badawczej i będzie mu towarzyszyć osobiste szkolenie użytkowników prowadzone przez personel linii. Warto podkreślić niektóre z etapów jako kluczowe dla pomyślnego i bezpiecznego zakończenia procedury: przenoszenie próbek z baz kombipuckowych do bloków próbek wymaga dokładności i uwagi, aby uniknąć uszkodzenia próbek (zob. krok 2.1.4); monitorowanie poziomu ciekłego azotu na wszystkich etapach jest ważne, aby zapobiec wystawieniu próbek na działanie powietrza lub bliskiemu kontaktowi z częściami, które nie są odpowiednio chłodzone (2.1.3 i 2.2.2); odczekanie, aż sekwencja zamykania (2.2.14) zostanie całkowicie zakończona, przed wyjęciem czółenka ze stacji końcowej (2.2.15), aby uniknąć degradacji podciśnienia w stacji końcowej.
Koncepcja protokołu została zainicjowana wraz z pracami inżynieryjnymi mającymi na celu opracowanie specjalnie skonstruowanego sprzętu do przenoszenia kryształów białek do środowiska próżniowego. Końcowymi produktami tego projektu były CTS i związane z nim narzędzia do obsługi próbek opisane powyżej. CTS jest znaczącym ulepszeniem w stosunku do swojego poprzednika, Leica EMVCT100 14, i usuwa wiele ograniczeń, takich jak brak osłony próbki i środowiska próżniowego podczas transferu, gromadzenie się lodu wewnątrz kąpieli ciekłego azotu oraz brak intuicyjnego interfejsu użytkownika i funkcji bezpieczeństwa. Dodatkowe funkcje CTS, które poprawiają komfort użytkowania, to monitorowanie temperatury i poziomu ciekłego azotu wewnątrz wózka i stacji pobierania próbek, wanna o większej pojemności, mieszcząca jednocześnie cztery bloki, a nie jeden, oraz samosterujący mechanizm do obsługi wózka. CTS jest w pełni zintegrowany z systemem sterowania linią badawczą z przyjaznym dla użytkownika interfejsem ekranu dotykowego oraz zwiększonym podciśnieniem i bezpieczeństwem mechanicznym podczas łączenia ze stacją końcową.
Beamline I23 jest pierwszym tego rodzaju instrumentem synchrotronowym MX pracującym na długich falach, w związku z czym wprowadzenie kryształów białka do środowiska wysokiej próżni i przechowywanie ich w temperaturach kriogenicznych wymagało znacznych wysiłków. Trwają prace nad ulepszeniami narzędzi i protokołu przygotowywania próbek, a także wysiłki na rzecz usprawnienia procesów. W ramach wsparcia dla użytkowników, pracownicy linii badawczej są zawsze dostępni, aby pomóc w rozwiązywaniu problemów. Przykładem jednego z takich scenariuszy mogą być problemy, które zagrażają integralności systemu próżniowego, prowadząc do trudności w podłączaniu lub zdejmowaniu wahadłowca do/z CTS lub śluzy końcowej stacji. Różne poziomy testów są wykonywane co tydzień i codziennie, a szkolenie użytkowników obejmuje dodatkowe kontrole w celu uniknięcia potencjalnych awarii, takie jak kontrola wzrokowa O-ringów na interfejsach, do których przymocowany jest wózek. Podczas gdy środowisko próżniowe otwiera możliwość przeprowadzania eksperymentów dyfrakcyjnych w zakresie długości fal niedostępnym na innych liniach badawczych, dodatkowy etap transferu zmniejsza ogólną przepustowość próbki.
Ręczny transfer z tylko czterema próbkami na blok transferowy i do pięciu bloków wewnątrz naczynia próżniowego ogranicza całkowitą pojemność do 20 próbek. W związku z tym, w przypadku projektów z dużą zmiennością między próbkami, próbki powinny być wstępnie przesiewane na liniach badawczych Diamond o wysokiej przepustowości, a następnie tylko najbardziej obiecujące próbki powinny być przenoszone do późniejszego zoptymalizowanego eksperymentu na długich falach. Podczas gdy uchwyty na próbki i bloki transferowe pozostały niezmienione od czasu ich pierwszego wprowadzenia kilka lat temu, prezentowane tutaj narzędzia do obsługi są całkowicie nowymi rozwiązaniami. Dedykowane uchwyty na próbki I23 są niezmienne ze względu na ich rolę w koncepcji chłodzenia linii badawczej. W związku z tym projekt narzędzi do obsługi próbek miał na celu stworzenie powiązania między tym nowym typem uchwytu a standardowymi dostępnymi na rynku narzędziami, które społeczność użytkowników MX przyjmowała od dawna, takimi jak kombajny, różdżki do zbierania kryształów i system transportu suchych nadawców. Ich projekt wymagał intensywnych konsultacji ze społecznością użytkowników i wymagał kilku iteracji do ukończenia. Prezentowany tutaj sprzęt, narzędzia i protokół reprezentują prosty i solidny system do transferu próbek użytkownika do eksperymentów na linii badawczej I23 w Diamond Light Source. Ten instrument do krystalografii makromolekularnej na długich falach w próżni otwiera nowe możliwości dla biologii strukturalnej.

Dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego o długich falach jest używana do wykorzystania anomalnych właściwości rozpraszania specyficznych atomów światła natywnie obecnych w makrocząsteczkach. Pomaga to rozwiązać problem fazy krystalograficznej i jednoznacznie potwierdzić tożsamość i lokalizację takich pierwiastków w makrocząsteczkach. Podczas gdy we wczesnych dniach krystalografii makromolekularnej struktury de novo były rozwiązywane przez wielokrotną izomorficzną zamianę1, wraz z pojawieniem się przestrajalnych linii promieniowania rentgenowskiego w synchrotronach, eksperymentalne fazy oparte na technikach dyfrakcji anomalnej o wielu długościach fali i pojedynczej długości fali (SAD) stały się dominującymi metodami2. Obie metody historycznie opierały się na izomorficznym lub anomalnym sygnale metali ciężkich, które musiały być sztucznie wprowadzone do kryształów przez kokrystalizację lub nasączanie kryształami3. Podejście oparte na próbach i błędach oraz nieprzewidywalny wynik mogą sprawić, że eksperymenty te będą frustrująco czasochłonne. Włączenie selenometioniny podczas ekspresji białek4 jest bardzo eleganckim sposobem na przezwyciężenie tych ograniczeń i wykorzystanie anomalnej dyfrakcji na krótkich falach, chociaż może to być bardzo trudne w systemach ekspresji białek eukariotycznych.
Długofalowy MX jest niezwykle atrakcyjny do określania struktury za pomocą natywnych eksperymentów SAD5,6 ze względu na wygodę korzystania z kryształów bezpośrednio z udanej próby krystalizacji bez dalszego leczenia. Dodatkowo dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o dużym znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor, otwiera możliwość bezpośredniej identyfikacji pozycji tych pierwiastków w makrocząsteczkach7,8,9,10. Przy średniej i niskiej rozdzielczości przypisanie pierwiastków na podstawie gęstości elektronów 2Fo-F c i środowiska chemicznego może być trudne, szczególnie w przypadku pierwiastków o podobnej liczbie elektronów lub słabo związanych jonów z częściowym zajęciem. Niejasności te można rozwiązać, zbierając dane poniżej i powyżej krawędzi absorpcji elementu będącego przedmiotem zainteresowania i interpretując wynikową różnicę anomalną w fazie modelowania Mapy Fouriera11,12. Lokalizowanie pozycji atomów siarki na tych mapach może również pomóc w budowaniu modeli map gęstości elektronów o niskiej rozdzielczości13. Krawędzie absorpcyjne tych lekkich pierwiastków są obserwowane na długościach fal od λ = 3 do 6 A (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1, góra). Ten zakres długości fal znacznie wykracza poza możliwości jakiejkolwiek synchrotronowej linii badawczej MX, a efektywna praca w tym zakresie wymaga pokonania kilku wyzwań technicznych, które zostały opisane poniżej.
Linia badawcza I23 w Diamond Light Source, Wielka Brytania, jest unikalnym instrumentem, specjalnie zaprojektowanym do ułatwiania eksperymentów MX na długich falach, przestrajalnym w zakresie długości fal od λ = 1,13 do 5,9 A (zakres energii między E = 2,1 a 11 keV). Pracując w środowisku wysokiej próżni14, absorpcja i rozpraszanie powietrza są eliminowane, co w konsekwencji zwiększa wydajność eksperymentów dyfrakcyjnych i stosunek sygnału do szumu. Duża próżniowa stacja końcowa zawiera wszystkie elementy środowiska próbki, w tym półcylindryczny detektor Pilatus 12M, goniometr wieloosiowy, systemy podglądu i kolimacji on-line, a także specjalnie zaprojektowane urządzenia do przenoszenia i przechowywania próbek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Każdy element wyposażenia został zoptymalizowany, aby zapewnić możliwość zbierania danych o długich falach najwyższej jakości. Zakrzywiony detektor Pilatus 12M może zbierać dane do kątów dyfrakcji 2θ = ±100°, co skutkuje wystarczająco wysoką rozdzielczością danych dyfrakcyjnych nawet przy najdłuższych długościach fal (<silna klasa="xfig">Rysunek 1, na dole). 120 modułów detektora zostało specjalnie dobranych pod kątem kompatybilności niskoenergetycznej i zapewniono kalibracje dla dodatkowego trybu ultra-wysokiego wzmocnienia.
Najniższy możliwy próg detektora to 1,8 keV, co prowadzi do zwiększonych efektów narożnika i krawędzi dla energii niższych niż 3,6 keV i pogorszenia jakości danych na najdłuższych długościach fal, szczególnie dla kryształów o niskiej mozaikowości. Efekt ten w połączeniu ze spadkiem wydajności kwantowej detektora15 należy wziąć pod uwagę przy planowaniu eksperymentu. Wieloosiowy goniometr umożliwia reorientację kryształów, aby umożliwić strategie gromadzenia danych, które maksymalizują jakość i siłę anomalnego sygnału, a także kompletność zebranych anomalnych danych. Absorpcja próbki jest czynnikiem ograniczającym dla eksperymentów, szczególnie przy najdłuższych długościach fal. Korekcje absorpcji, zaimplementowane w powszechnie używanych pakietach oprogramowania do przetwarzania MX16,17, działają dobrze dla długości fal około 3 A. Dłuższe fale będą wymagały analitycznych poprawek absorpcyjnych opartych na rekonstrukcjach tomograficznych18 lub ablacji laserowej w celu usunięcia materiału niedyfrakcyjnego i pocięcia kryształów w dobrze zdefiniowane kształty19. To ostatnie pomoże również w zmniejszeniu rozmiaru większych kryształów, ponieważ eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej na dłuższych falach są bardziej wydajne dla mniejszych kryształów14. Wyzwaniem związanym z utrzymaniem próbek w temperaturach kriogenicznych podczas zbierania danych jest chłodzenie przewodzące, ponieważ korzystanie z urządzeń do strumienia zimnego gazu o otwartym przepływie nie jest kompatybilne ze środowiskiem próżniowym. W związku z tym materiały przewodzące ciepło, takie jak miedź, są potrzebne do podłączenia próbki do chłodnicy kriogenicznej z rurką impulsową. Standardowe kołki SPINE ze stali nierdzewnej stosowane w MX, a także wszelkie inne dostępne na rynku mocowania próbek, nie nadają się do MX o dużej długości fali w próżni ze względu na ich słabą przewodność cieplną.
Uchwyty na próbki (SHs) dla MX w próżni muszą być istotną częścią ścieżki termicznej odprowadzania ciepła (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A). W związku z tym składają się z przewodzącego ciepło miedzianego korpusu i trzpienia oraz mają dwie ważne cechy: mocną podstawę magnesu, która zapewnia odpowiednie połączenie termiczne z zimną głowicą goniometru, oraz mocowanie próbki, wykonane z poliimidu, w celu zminimalizowania absorpcji i rozpraszania promieniowania rentgenowskiego20. Dołożono starań, aby zapewnić, że doświadczenie użytkownika związane z pozyskiwaniem kryształów i chłodzeniem błyskawicznym jest prawie identyczne z tym, które wiąże się ze standardowymi praktykami MX. Ponieważ dedykowane I23 SH nie są bezpośrednio kompatybilne z innymi liniami synchrotronowymi, adapter ze stali nierdzewnej jest używany w celu zapewnienia kompatybilności z różdżkami magnetycznymi do zbierania kryształów i istniejącymi interfejsami goniometru na innych liniach badawczych MX (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B). Adapter jest również ważny do wykorzystania urządzeń automatyzacji na innych liniach badawczych Diamond MX, które są oparte na głowicach chwytaków robotów typu ALS21 i układach bazowych w stylu unipuck22, jeśli zmienność próbki wymaga szybkiego wstępnego przesiewania w celu wyboru najlepszych kryształów dyfrakcyjnych. Protokół przygotowania i załadunku próbki można podzielić na dwa etapy:
Etap 1: Zbieranie kryształów i błyskawiczne zamrażanie wykonywane przez użytkowników w ich własnych laboratoriach
Po ocenie przydatności projektu do zbierania danych I23, uchwyty na próbki z pętlami pasującymi do rozmiarów kryształów (wstępnie zmontowane z adapterami) są wysyłane do laboratoriów użytkowników w celu pobrania kryształów. Aby zapobiec uszkodzeniom, SH i adaptery nie powinny być rozdzielane i powinny być używane jako jedna jednostka do łowienia kryształów z pętlami o odpowiedniej wielkości przy użyciu standardowych różdżek magnetycznych do zbierania kryształów. Jak to zwykle bywa w MX, zadanie to jest wykonywane ręcznie pod mikroskopem, a kryształy są natychmiast chłodzone w piance dewara z ciekłym azotem23. Ze względu na niedopasowanie sił magnetycznych, SH nie są obecnie kompatybilne z unipuckami. Magazynowanie i wysyłka odbywa się za pomocą kombajnów (patrz Tabela Materiałów), które są dostępne dla użytkowników na życzenie, wraz z kompatybilnymi wkładkami do transportu suchego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C). Krążki te mają tę samą płytę bazową co powszechnie stosowane krążki i umożliwiają szybkie wstępne badanie próbek na innych liniach badawczych Diamond MX. Wypożyczenie tego sprzętu użytkownikom jest obecnie najlepszym rozwiązaniem, dopóki niestandardowe uchwyty na próbki nie będą dostępne na rynku. Transport na linię badawczą wymaga standardowych załadowców suchych używanych w społeczności MX.
Etap 2: Transfer próbek chłodzonych kriogenicznie do próżniowej stacji końcowej
Gdy próbki dotrą na linię badawczą, są przygotowywane do transferu do próżniowej stacji końcowej. Polega to na usunięciu SH z kombajnów i oddzieleniu ich od adapterów. Wprowadzanie próbek biologicznych do próżni jest rutynowo wykonywane w dziedzinie mikroskopii krioelektronowej. Niektóre z dobrze ugruntowanych koncepcji zostały zaadaptowane do transferu próbek I23. Krótko mówiąc, SH są przenoszone pod ciekłym azotem na bloki transferowe (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3D). Bloki te mają doskonałą przewodność cieplną i znaczną masę termiczną, co zapobiega osiąganiu przez kryształy temperatury zeszklenia w próżni. Do czterech bloków, o pojemności czterech próbek każdy, jest ładowanych pod ciekłym azotem do krążka blokowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 3H), który jest używany albo do przenoszenia próbek do kriogenicznego systemu transferu (CTS), albo do przechowywania w ciekłym azocie dewarów między eksperymentami.  
System Kriogenicznego Transferu opracowany w Diamond Light Source składa się z dwóch podzespołów, Stacji Próbkowania i Wahadłowca (<silna klasa="xfig">Rysunek 4A). Stacja próbkowania składa się z kąpieli w ciekłym azocie do tymczasowego przechowywania kryształów białka i posiada specyficzne cechy zapewniające bezpieczeństwo i umożliwiające przyjazne dla użytkownika doświadczenie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5). CTS jest sterowany za pomocą programowalnego sterownika logicznego za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu ekranu dotykowego. Stacja pobierania próbek ma wbudowane diody elektroluminescencyjne dla lepszej wizualizacji oraz zestaw grzałek sterowanych w zamkniętej pętli, aby zautomatyzować suszenie kąpieli ciekłego azotu po przeniesieniu próbek. Posiada również różnorodne czujniki zapewniające bezpieczeństwo i sprawne funkcjonowanie systemu. Stacja pobierania próbek jest wyposażona w specjalny sprzęt, który zapewnia niezawodny interfejs elektryczny do interakcji z wahadłowcem w przypadku operacji, takich jak pompowanie do niskiej próżni w celu przeniesienia próbki, a także monitorowanie poziomu ciekłego azotu i temperatury wewnątrz wahadłowca.
Wahadłowiec (<silna klasa="xfig">Rysunek 6) to przenośne urządzenie służące do pobierania bloku transferowego z kąpieli ciekłego azotu w stacji pobierania próbek i przenoszenia go w środowisku kriogenicznym i próżniowym do stacji końcowej. Zawiera dewara z ciekłym azotem, który utrzymuje próbki w niskiej temperaturze podczas przenoszenia, monitorowanie poziomu cieczy w dewarze oraz różnorodne czujniki zapewniające działanie i bezpieczeństwo użytkownika. Ramię transferowe jest wyposażone w napęd magnetyczny i zawiera obrobione rowki, które prowadzą użytkowników przez bezpieczny załadunek i rozładunek bloków transferowych do stacji końcowej. Transfer z wahadłowca do zbiornika próżniowego odbywa się przez śluzę powietrzną. Śluza powietrzna jest interfejsem dla wahadłowca na stacji końcowej, służącym do ewakuacji przestrzeni między wahadłowcem a stacją końcową, przed otwarciem zaworów podciśnieniowych wahadłowca i stacji końcowej. Sekwencje pompowania i odpowietrzania są w pełni zautomatyzowane i mogą być obsługiwane za pomocą dużego ekranu dotykowego z przyjaznym dla użytkownika interfejsem (<silna klasa="xfig">Rysunek 4C). Obecny protokół służy do przesyłania kryształu taumatyny do próżniowej stacji końcowej w celu zebrania danych.

<table><tbody><tr><td>Detektor 12M</td><td>Dectris, Szwajcaria</td><td></td><td>Detektor promieniowania rentgenowskiego zliczający pojedyncze fotony</td></tr><tr><td>CombiPuck</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-P1</td><td>Kriopuki używane do kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów i próbek I23</td></tr><tr><td>Różdżka magnetyczna do zbierania kryształów</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD7-411</td><td>Służy do zbierania kryształów</td></tr><tr><td>Dry Shipper (CX100)</td><td>Wymiary molekularne</td><td>MD7-21</td><td>Służy do kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów na próbki I23 i próbek</td></tr><tr><td>Sucha wkładka transportowa (CombiPuck Transport Cane)</td><td>MiTeGen</td><td>SKU: M-CBP-PTC1Służy</td> <td>do kriogenicznego przechowywania i transportu uchwytów na próbki I23 i próbek</td></tr><tr><td>Poliimid</td><td></td><td></td> <td>kaptonowyuchwyt na próbkę wykonany z poliimidu Kapton</td></tr><tr><td>Akrylowa pokrywka</td><td></td><td></td> Perpsex <td>z wbudowanym kluczem obrotowym</td></tr><tr><td>Proszek taumatyny</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>T7638</td><td>Stosowany do wytwarzania kryształów taumatyny metodą dyfuzji parowej</td></tr></tbody></table>

protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej i23 przy diamentowym źródle światła

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Krystalografia makromolekularna o długich falach (MX) wykorzystuje anomalne właściwości rozpraszania pierwiastków, takich jak siarka, fosfor, potas, chlor czy wapń, które często są naturalnie obecne w makrocząsteczkach. Umożliwia to bezpośrednie rozwiązanie struktury białek i kwasów nukleinowych poprzez fazowanie eksperymentalne bez konieczności dodatkowego znakowania. Aby wyeliminować znaczną absorpcję promieni rentgenowskich przez powietrze w tym reżimie długości fali, eksperymenty te przeprowadza się w środowisku próżniowym. Beamline I23 w Diamond Light Source w Wielkiej Brytanii jest pierwszym tego typu instrumentem synchrotronowym, zaprojektowanym i zoptymalizowanym do eksperymentów MX w długim zakresie długości fal do 5 A. 
Aby to umożliwić, duże naczynie próżniowe otacza wszystkie elementy końcowe środowiska próbki. Konieczność utrzymywania próbek w temperaturach kriogenicznych podczas przechowywania i zbierania danych w próżni wymaga zastosowania uchwytów na próbki przewodzących ciepło. Ułatwia to skuteczne odprowadzanie ciepła, zapewniając chłodzenie próbki do około 50 K. Obecny protokół opisuje procedury stosowane do przygotowania próbek i transferu próbek do próżni na linii badawczej I23. Zapewniając jednolitość praktyk i metod już ugruntowanych w społeczności krystalografii makromolekularnej, chłodzenie próbki do temperatury ciekłego azotu można przeprowadzić w dowolnym środowisku laboratoryjnym wyposażonym w standardowe narzędzia MX. 
Kriogeniczne przechowywanie i transport próbek wymagają tylko standardowego, dostępnego na rynku sprzętu. Do przenoszenia kriogenicznie chłodzonych kryształów z ciekłego azotu do próżniowej stacji końcowej wymagany jest specjalistyczny sprzęt. Opracowane zostały specjalnie opracowane narzędzia do obsługi próbek oraz dedykowany system transferu kriogenicznego (CTS). Dane dyfrakcyjne zebrane na próbkach przygotowanych przy użyciu tego protokołu wykazują doskonałe statystyki łączenia, co wskazuje, że jakość próbek pozostaje niezmieniona podczas procedury. Otwiera to unikalne możliwości dla MX w próżni w zakresie długości fal wykraczającym poza standardowe synchrotronowe linie badawcze.

Kryształ taumatyny wprowadzono do stacji próżniowej zgodnie z opisanym powyżej protokołem. Dane dyfrakcyjne zebrano przy długości fali 2,7552 Å (E = 4500 eV) w postaci 3600 obrazów z przyrostem obrotu 0,1° i czasem ekspozycji 0,1 s na obraz. Rozmiar wiązki ustawiono na 150 µm x 150 µm i zredukowano transmisję do 10%, przy odpowiadającym temu pomiarze strumienia wynoszącym 7,1 x 109 fotonów/s. Wybór λ = 2,7552 Å wynika z kompromisu między wzrostem sygnału anomalnego a efektami absorpcji próbki, a także spadkiem rozdzielczości przy dłuższych długościach fal. Mimo że wartość ta nie jest bliska teoretycznej krawędzi absorpcyjnej siarki (λ= 5,0095 Å), przy tej długości fali urojona część czynnika rozpraszania siarki f" wynosi 1,57 e-, co jest wartością o 1,6-2,1 raza większą w porównaniu do długości fal między 1,7 a 2 Å. Powstałe w ten sposób silniejsze sygnały anomalne umożliwiają skuteczne wyznaczenie faz metodą S-SAD w przypadku bardziej wymagających projektów.
Na linii wiązki I23 przeprowadzono już szereg trudnych eksperymentów związanych z wyznaczaniem faz.24,25,26,27z danymi zebranymi przy tej długości fali. Choć fazowanie metodą S-SAD jest możliwe przy użyciu znacznie krótszych długości fal, często wymaga ono wzmocnienia sygnału anomalnego poprzez scalanie danych z wielu izomorficznych kryształów w celu osiągnięcia wartości multiplicity przekraczających 10028Ze względu na wzmocniony sygnał anomalny przy dłuższych długościach fal, większość projektów wyznaczania faz rozwiązanych na linii I23 wymagała danych zaledwie z jednego kryształu. Reprezentatywny obraz dyfrakcyjny przedstawiono na Rysunek 7, po lewej. Przetwarzanie danych przy użyciu programu Xia2-3dii29 uzyskano doskonałe statystyki scalania, zgodnie z opisem w Tabela 1. Rysunek 7po prawej stronie przedstawiono fragment reprezentatywnego obrazu dyfrakcyjnego z zestawu danych dla taumatyny, co ilustruje niskie tło otaczające refleksy Bragga; przyczynia się to do wysokich wartości I/σ(I) zazwyczaj obserwowanych w układzie próżniowym, zapewniając, że do detektora docierają jedynie promienie X rozproszone przez próbkę.
Maksymalna osiągalna rozdzielczość 1.8 Å wynika z geometrii detektora oraz wybranej długości fali promieniowania rentgenowskiego. Zbiór danych dostarczył bardzo silnego sygnału anomalnego, co odzwierciedla wartość parametru średniego nachylenia prawdopodobieństwa normalnego dla sygnału anomalnego wynosząca 2,677, co ułatwiło rozwiązanie struktury za pomocą automatycznego potoku fazowania CRANK2. Wysoka jakość wynikłej mapy gęstości elektronowej umożliwiła pomyślne automatyczne budowanie modelu przez moduł Buccaneer30 w ramach CRANK231, z poprawnym rozmieszczeniem 100% sekwencji aminokwasowej taumatyny. Fazowana mapa różnicowa Fouriera dla sygnału anomalnego, obliczona za pomocą ANODE11, ujawnia 16 bardzo dobrze uporządkowanych atomów siarki oraz jeden atom siarki z Cys159 w dwóch alternatywnych konformacjach, co potwierdzają 18 znaczących wysokości pików w pozycjach rozpraszaczy anomalnych w Tabeli 2. 16 reszt cysteiny w taumatynie tworzy 8 mostków disiarczkowych, które są wszystkie wyraźnie widoczne na mapie 2Fo-Fc (Rycina 8).
<img alt="Wykres absorpcji i rozdzielczości promieni rentgenowskich z poziomami energii; analiza widmowa dla pierwiastków Ca, K, Cl, S, P." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Dane dyfrakcyjne o wysokiej rozdzielczości z eksperymentów MX z długimi falami. (A) Wykres wartości f" w funkcji energii, wskazujący krawędzie absorpcyjne lekkich pierwiastków dostępne na linii wiązki I23. (B) Maksymalna rozdzielczość osiągalna na narożnikach detektora P12M w funkcji energii. Skrót: MX = krystalografia makromolekularna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat ustawienia tomografii rentgenowskiej z goniometrem, detektorem i pozycją próbki; szczegóły procesu obrazowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Przekrój poziomy przez komorę próżniową ze wszystkimi komponentami stacji końcowej. Skrót: OAV = system obserwacji w osi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Komponenty sprzętu do spektrometrii mas, pozłacane sondy; układ eksperymentalny, pomiar precyzyjny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Narzędzia do obsługi próbek. (A) Uchwyt na próbkę I23. (B) Standardowy pin MX spine (lewo) obok uchwytu na próbkę I23 z adapterem (prawo). (C) Pokrywa i podstawa Combipuck z uchwytami na próbki I23 (niebieskie). Pokrywa i podstawa Block puck z dwoma blokami transferowymi (złote). W tle widoczna jest rurka do suchego transportu (dry shipper cane), kompatybilna zarówno z Combipuckami, jak i Block puckami. (D) Blok transferowy z czterema uchwytami na próbki I23. (E) Narzędzie kluczowe służące do obracania podstawy Block puck. (F) Pręt separatora. (G) Narzędzie separatora Puck z dwiema strzałkami wskazującymi ustawienia wysokie i niskie. (H) Podstawa Block puck z czterema pustymi blokami Cu. (I) Pokrywa do Block puck. (J) Pojemnik piankowy ze wszystkimi niezbędnymi narzędziami do przenoszenia uchwytów na próbki z podstaw Combipuck do bloków miedzianych. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig03large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Konfiguracja systemu kriogenicznego z panelem sterowania; sprzęt do analizy eksperymentalnej i widok wnętrza komory." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: System transferu kriogenicznego. (A) Stacja próbek CTS z podłączonym wahadłem oraz lejkami używanymi do napełniania. (B) Bloczek z dwoma blokami transferowymi umieszczony wewnątrz CTS. (C) Ekran dotykowy oprogramowania sterującego CTS. Skrót: CTS = Cryogenic Transfer System. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat kriostacji z ekranem dotykowym, rotacją uchwytów oraz czujnikiem LN2, służącej do przygotowania próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5: Stacja próbek kriogenicznego systemu transferowego. Skróty: LEDs = diody emitujące światło; LN2 = ciekły azot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig05large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat systemu przenoszenia ciekłego azotu; opisane komponenty; naczynie Dewara, uchwyt; zastosowanie kriogeniczne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Wahadło systemu przenoszenia kriogenicznego. Skróty: LEDs = diody emitujące światło; LN2 = ciekły azot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mapa ciepła wydajności transfekcji, wynik eksperymentu edycji genów, analiza danych z kodowaniem kolorystycznym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7Obrazy dyfrakcyjne. Po lewej, obraz dyfrakcyjny z zestawu danych zebranych dla kryształu taumatyny. Prawda, refleks dyfrakcyjny otoczony pikselami tła o niskiej liczbie zliczeń. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig07large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić większą wersję tej figury, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Analiza struktury białka; krystalografia; schemat; mapa gęstości elektronowej; konformacja cząsteczkowa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62364/62364fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8: Rozwiązanie struktury taumatyny za pomocą automatycznego rurociągu CRANK2 (ustawienia domyślne, bez późniejszego udoskonalenia). (A) Przegląd taumatyny z mapą 2Fo-Fc przy 1,6σ (niebieska) oraz zfazowaną mapą różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ obliczoną w programie ANODE (zielona). (B) Przegląd taumatyny przedstawiający wyłącznie zfazowaną mapę różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ. (C) Powiększony widok mostka dwusiarczkowego obecnego w taumatynie z mapą 2Fo-Fc przy 1,6σ (niebieska) oraz zfazowaną mapą różnicową Fouriera dla sygnałów anomalnych przy 5σ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62364/62364fig08large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Taumatyna</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Długość fali gromadzenia danych (Å) (energia (eV))</td>
			<td>2.7552 (4500)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liczba obrazów x rozmiar klina (°)</td>
			<td>3600 x 0,1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Grupa przestrzenna</td>
			<td>P 41212</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametry komórki elementarnej</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(a = b, c) (Å)</td>
			<td>57.8, 150.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(α = β = γ) (°)</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rozdzielczość (Å)</td>
			<td>150.22–1.80 (1.84–1.80)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kompletność</td>
			<td>96.3 (81.1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISa</td>
			<td>36.48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpomiary</td>
			<td>0.042 (0.118)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rpim</td>
			<td>0.01 (0.049)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CC1/2</td>
			<td>1 (0.989)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>I/σ(I)</td>
			<td>57.9 (14.7)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krotność</td>
			<td>15.0 (5.4)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Środkowy odcinek stoku</td>
			<td>2.677</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Statystyki gromadzenia i przetwarzania danych dla taumatyny przy długości fali 2,755 Å na linii wiązki I23, DLS. Dla rozdzielczości, kompletności, Rmerge, Rmeas, Rpim, CC1/2, I/σ(I) oraz wielokrotności, powłoki wysokiej rozdzielczości podano w nawiasach. Skrót: DLS = Diamond Light Source.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody >
		<tr >
			<td >Najbliższy atom</td>
			<td >Wysokość piku (sigma)</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS9</td >
			<td >25.83</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS56</td >
			<td >25.03</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >MET112</td >
			<td >24.54</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS149</td >
			<td >24.37</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS126</td >
			<td >24.21</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS145</td >
			<td >24.2</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS134</td >
			<td >23.6</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS177</td >
			<td >23.48</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS204</td >
			<td >23.43</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS66</td >
			<td >23.17</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS164</td >
			<td >22.54</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS193</td >
			<td >22.15</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS158</td >
			<td >21.51</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS77</td >
			<td >21.21</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS121</td >
			<td >20.8</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS71</td >
			<td >19.17</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS159_1</td >
			<td >12.27</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >CYS159_2</td >
			<td >8.34</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabela 2: Wysokości pików na mapie różnic Fouriera dla rozproszenia anomalnego, obliczone przez program ANODE przy użyciu zfazowanego i automatycznie zbudowanego modelu z programu CRANK2.

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Krystalografia makromolekularna o długich falach wykorzystuje anomalny sygnał z atomów światła natywnie obecnych w białkach i kwasach nukleinowych. Technika ta służy do eksperymentalnego rozwiązania problemu czoła krystalograficznego oraz do określenia tożsamości i lokalizacji tych elementów. Beamline I23 w Diamond Light Source to unikalny instrument synchrotronowy zoptymalizowany do eksperymentów na długich falach do pięciu angstremów.Umożliwia dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o wysokim znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor. Ze względu na znaczną absorpcję promieni rentgenowskich przez powietrze w reżimie długich fal, eksperymenty te są wykonywane w środowisku próżniowym. Aby utrzymać próbki w temperaturach kriogenicznych w środowisku próżniowym, kryształy są montowane na dedykowanych, przewodzących ciepło uchwytach na próbki.Przenoszenie próbki kriogenicznej z ciekłego azotu do próżniowej stacji końcowej jest bardzo podobne do technik stosowanych w mikroskopii krioelektronowej. Protokół ten przedstawia procedurę przenoszenia kryształów do środowiska próżniowego przy użyciu narzędzi i sprzętu opracowanego w Diamond Light Source. Rozpocząć od oddzielenia wieczka od podstawy urządzenia CombiPuck w taki sposób, aby uchwyty na próbki pozostały przymocowane do podstawy, a fiolki pozostały w pokrywie.Zanurz pokrywkę z fiolkami w ciekłym azocie, a następnie przymocuj uchwyt na próbkę i adapter do różdżki magnetycznej i zbierz kryształy. Schłodzić każdą próbkę bezpośrednio w CombiPuck, zwracając uwagę na położenie próbki. Aby zamknąć krążek, użyj różdżki krążka, aby przymocować podstawę do pokrywy.Przenieś CombiPuck z ciekłego azotu do suchego transportera lub magazynu. Umieść podstawę krążka blokowego już wypełnionego pustymi blokami transferowymi na jego podstawie nośnej w pojemniku piankowym, a następnie napełnij ciekłym azotem. Następnie umieść CombiPuck w pojemniku piankowym wypełnionym ciekłym azotem, upewniając się, że podstawa krążka jest przymocowana do uchwytu magnetycznego wewnątrz pojemnika na piankę.Wstępnie schłodzić wszystkie niezbędne narzędzia w ciekłym azocie. Następnie oddziel pokrywę od podstawy za pomocą separatora krążków na wysokim ustawieniu, tak aby podstawa pozostała przymocowana do uchwytu magnetycznego, odsłaniając uchwyty na próbki wewnątrz ciekłego azotu. Umieść różdżkę separatora nad uchwytem próbki i adapterem tak głęboko, jak to możliwe, upewniając się, że różdżka jest pionowa.Przesuń kciukiem małą dźwignię na różdżce separatora w dół, aż usłyszysz kliknięcie, aby zamocować uchwyt próbki w środku, a następnie wyciągnij uchwyt na próbkę z adaptera. Opuść separator nad żądaną pozycję bloku transferowego, upewniając się, że jeden z trzech bolców pasuje do środkowego otworu bloku transferowego. Zwolnij uchwyt próbki, przesuwając dźwignię z powrotem do góry.Aby załadować próbki do następnego bloku transferu, użyj narzędzia klucza karuzeli, aby obrócić pusty blok transferu do pozycji poziomej. Po przeniesieniu wszystkich uchwytów na próbki zamknij krążek blokowy, umieszczając pokrywkę w ciekłym azocie. Poczekaj, aż temperatura się wyrówna, a następnie załóż pokrywkę na podstawę i delikatnie podnieś, aby uwolnić z karuzeli.Podłącz wahadłowiec do stacji. Otwórz zawory azotu i powietrza i upewnij się, że gazy przepływają. Następnie włącz CTS.Zarówno wannę, jak i czółenko schłodzić ciekłym azotem. Umieść dostarczony lejek w porcie napełniania na wahadłowcu i powoli wlewaj ciekły azot do lejka, monitorując poziom na ekranie. Zatrzymaj się, gdy wskaźnik zmieni kolor z czerwonego na niebieski.Napełnij wannę ciekłym azotem za pomocą lejka. Przenieś krążek blokowy z ciekłego azotu do kąpieli CTS za pomocą dołączonego narzędzia do separatora krążków. Zdejmij pokrywę krążka blokowego i zamknij pokrywę wanny CTS.Aby wprowadzić blok transferowy do wózka, odblokuj uchwyt wahadłowy, obracając go o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przesuń go w kierunku wanny, tak aby prowadnica na uchwycie wymuszała prawidłowy tor jazdy. Po schłodzeniu pokrywy bloku przesuń uchwyt, aby wprowadzić blok do czółenka. Aby zablokować blok transferowy na czółenku, obróć uchwyt o 180 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara.Cofnij uchwyt do pierwotnej tylnej pozycji i zablokuj go na miejscu, obracając o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Naciśnij przycisk Zamknij pompę zaworu wahadłowego na ekranie wyświetlacza, aby rozpocząć ewakuację wahadłowca. Gdy na ekranie dotykowym pojawią się komunikaty Wahadłowiec gotowy do ruchu i Nie przesuwaj pręta, zawór zamknięty, naciśnij dźwignię pod wahadłowcem i ostrożnie podnieś ją za pomocą uchwytu u góry.Przenieś wahadłowiec do śluzy powietrznej na próżniowej stacji końcowej w pozycji pionowej i zamocuj go. Wybierz pustą pozycję bloku w zbiorniku, naciskając odpowiedni przycisk na ekranie dotykowym i przesuwając sample hotel do właściwej pozycji załadunku. Gdy sample hotel znajdzie się na swoim miejscu, naciśnij przycisk Otwórz, aby zainicjować sekwencję blokady podciśnienia.Po zakończeniu sekwencji i zmianie statusu na Śluza powietrzna otwarta, zablokuj wahadłowiec, przekręć uchwyt o 90 stopni zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby odblokować pręt. Delikatnie wepchnij pręt do naczynia tak, aby prowadzony tor wymuszał prawidłowy tor podróży w kierunku hotelu próbki. Powoli włóż blok transferowy do hotelu, korzystając z sygnału wideo wyświetlanego na ekranie w celu uzyskania wskazówek, upewniając się, że ikona pozycji bloku na wyświetlaczu dotykowym jest aktywna.Po aktywacji obróć uchwyt o 180 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zwolnić blok transferowy i wyciągnąć pręt z naczynia. Po całkowitym schowaniu obróć uchwyt o 90 stopni w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby zablokować pręt. Naciśnij przycisk Zamknij, aby zamknąć zawór podciśnieniowy stacji końcowej i odpowietrzyć przestrzeń między wahadłowcem a naczyniem do ciśnienia atmosferycznego.Wyjmij wahadłowiec, gdy na wyświetlaczu śluzy powietrznej pojawi się stan OK do odłączenia. Zwróć czółenko do kąpieli CTS i naciśnij przycisk Otwórz zawór wahadłowy, aby ewakuować czółenko przed załadowaniem następnego bloku próbki. Gdy sygnalizacja świetlna zmieni kolor na zielony i pojawi się komunikat OK, aby przesunąć pręt, do wahadłowca można wprowadzić następny blok transferowy.Aby przygotować następny blok transferowy, obróć krążek blokowy wewnątrz wanny. Wciśnij wbudowany klucz obrotowy na górze akrylowej pokrywy w dół do zamka pośrodku krążka blokowego. Przytrzymując go, przekręć kluczyk, aby ustawić żądany blok transferowy w pozycji podbieracza.Po przeniesieniu wszystkich bloków upewnij się, że zawór wahadłowy jest otwarty, naciśnij przycisk pieczenia na ekranie dotykowym, wybierz zarówno Bath, jak i Shuttle, a następnie naciśnij Rozpocznij pieczenie. Linia badawcza krystalografii makromolekularnej I23 o dużej długości fali w diamentowym źródle światła może uzyskać dostęp do krawędzi absorpcyjnych pierwiastków o dużym znaczeniu biologicznym, takich jak wapń, potas, chlor, siarka i fosfor, dając wzmocniony sygnał anomalny, który można wykorzystać do fazowania lub lokalizowania tych pierwiastków w makrocząsteczkach. Dane dyfrakcyjne zebrano z pojedynczego kryształu taumatyny o długości fali 2,75 angstrema, wybranego jako kompromis między zwiększonym sygnałem anomalnym a efektami absorpcji próbki na dłuższych falach.Konfiguracja próżniowa zapewnia, że do detektora docierają tylko promienie rentgenowskie rozproszone przez próbkę, zapewniając niskie tło wokół odbić Bragga. Zestaw danych dostarczył bardzo silny sygnał anomalny, ułatwiając rozwiązanie struktury przez automatyczny rurociąg fazowy CRANK2. Wysoka jakość uzyskanej mapy gęstości elektronów umożliwiła pomyślne zbudowanie automatycznego modelu, z prawidłowym rozmieszczeniem 100% sekwencji aminokwasowej taumatyny.16 reszt cysteiny w taumatynie tworzy osiem mostków dwusiarczkowych, które są wyraźnie widoczne na mapie gęstości elektronów. Ponieważ krystalografia białek o długich falach w próżni jest nową dziedziną, opracowaliśmy nowe narzędzia i sprzęt do obsługi próbek. Protokół ten prowadzi użytkowników do bezpiecznego przesyłania próbek do próżniowej stacji końcowej na linii badawczej I23 w Diamond Light Source.Środowisko próżniowe otwiera unikalne możliwości wykonywania eksperymentów dyfrakcyjnych w zakresie długości fal niedostępnym na innych liniach badawczych. Krystalografia rentgenowska o dużej długości fali umożliwia eksperymentalne fazowanie makrocząsteczek bezpośrednio z natywnych kryształów. Pozwala również na jednoznaczną identyfikację jonów związanych z cząsteczkami.

sample-preparation-transfer-protocol-for-vacuum-long-wavelength

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Opisujemy procedury przygotowania i dostarczania mikrokryształów białek błonowych w lipidowej fazie sześciennej do krystalografii szeregowej w laserach rentgenowskich na swobodnych elektronach i źródłach synchrotronowych. Protokoły te mogą być również stosowane do wprowadzania i dostarczania rozpuszczalnych mikrokryształów białek, co prowadzi do znacznego zmniejszenia zużycia próbki w porównaniu z wstrzykiwaniem cieczy.

Otrzymywanie i dostarczanie mikrokryształów białkowych w lipidowej fazie sześciennej do seryjnej krystalografii femtosekundowej

Poznaj protokół przygotowania i transferu próbek do krystalografii długofalowej w próżni na linii I23 przy Diamond Light Source. Metoda umożliwia zachowanie integralności kryształów białkowych w warunkach kriogenicznych.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła (Wideo) | JoVE Journal

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Przeglądaj więcej filmów