Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek
22 maja 2021
W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.
Protokół opisany w tym filmie określi procedury eksperymentalne wymagane do obrazowania naturalnej wielkości komórek rozprzestrzeniających się oraz wykorzystania narzędzia obliczeniowego, które określa ilościowo dynamikę rozprzestrzeniania się komórek w sposób bezstronny i zautomatyzowany. Zasób rozprzestrzeniania komórek pozwala na ciągłe śledzenie ruchu krawędzi komórki i zmian morfologicznych podczas rozprzestrzeniania się komórek, co jest cechą, której brakuje w większości istniejących testów rozprzestrzeniania się komórek. Protokół ten wykorzystuje również zautomatyzowane przetwarzanie i analizę komputerową, dostarczając informacji na temat cykliczności komórek, obszaru i cykli retrakcji wypukłości komórek rozprzestrzeniających się.
Takie zautomatyzowane przetwarzanie zmniejsza tendencyjność w analizie danych i zapewnia solidną metodę analizy dynamiki rozprzestrzeniania się komórek dla dużej liczby komórek. W połączeniu z terapiami farmakologicznymi lub nauką i technikami genetycznymi, protokół ten jest podatny na wielkoskalowe prędkości graczy molekularnych regulujących wypukłości komórek. Dla podanego protokołu wykorzystywane są mysie fibroblasty embrionalne, które genetycznie kodują PH-Akt-GFP, co pozwala na fluorescencyjne znakowanie błony plazmatycznej.
Przed rozpoczęciem testu rozprzestrzeniania się komórek należy wyhodować naczynie z komórkami do 90% zbieżności. Gdy komórki osiągną właściwą konfluencję, spal szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i umieść je w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 35 milimetrów. Pokryj szkiełko nakrywkowe fibronektyną, która została rozcieńczona w PBS do stężenia 2,5 mikrograma na mililitr.
Umieść naczynie z szkiełkiem nakrywkowym w inkubatorze o temperaturze 37 stopni na godzinę. Po godzinie odessać fibronektynę, uważając, aby nie dotknąć szkiełka nakrywkowego końcówką pipety. Umyj naczynie za pomocą PBS, delikatnie pipetując wokół szkiełka nakrywkowego dwa do trzech razy.
W przypadku wysiewu komórek zacznij od zasysania pożywki do hodowli komórkowych z naczynia komórkowego. Następnie umyj naczynie ciepłym PBS. Dodaj 650 mikrolitrów trypsyny EDTA do naczynia i przechyl naczynie, aby równomiernie rozprowadzić enzym.
Umieść naczynie z trypsyną w inkubatorze na jedną minutę. Po inkubacji należy najpierw dodać 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej. Następnie szybko dodaj kolejne 10 mililitrów pożywki do naczynia, aby ugasić trypsynę.
Aby rozcieńczyć komórki, które zostaną wysiane na szkiełko nakrywkowe, należy odpipetować jeden mililitr zawartości naczynia do probówki wirówkowej. Z probówki odpipetować około 500 do 1 000 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do naczynia z szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe ma 10% konfluencję lub 50 000 komórek na mililitr i dostosuj objętość rozcieńczonych komórek w razie potrzeby.
Celem tych komórek jest ustalenie płaszczyzny ostrości podczas akwizycji obrazu. Z pozostałymi komórkami w naczyniu, przejdź jedną piątą komórek do jednego małego naczynia na zabieg. Będą to komórki, które zostaną przeanalizowane pod kątem dynamiki rozprzestrzeniania się.
Umieść naczynia przejściowe i naczynie nakrywkowe w inkubatorze na osiem do 24 godzin. Aby przetestować znaczenie Arp2/3 dla rozprzestrzeniania się komórek, najpierw dodaj pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej kontrolnej i leczniczej. Następnie dodaj 20 mililitrów DMEM, w którym brakuje czerwieni fenolowej, do każdej z dwóch większych probówek wirówkowych.
Do małych i dużych probówek należy odpipetować lek CK-666, który jest inhibitorem kompleksu Arp2/3 lub kontrolowane leczenie, takie jak DMSO. Aby rozpocząć leczenie farmakologiczne komórek, należy usunąć szalki pasażowe, które inkubowały przez noc. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze wszystkich naczyń i umyć naczynia ciepłym PBS.
Wziąć małe probówki zawierające CK-666 lub kontrolną pożywkę uzupełnioną i dodać zawartość odpowiedniej probówki do każdej z naczyń przejściowych. Oznacz każdą z naczyń odpowiednim lekiem, a następnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze na dodatkową godzinę Po godzinnej inkubacji odessaj pożywkę uzupełnioną lekiem z każdej z szalek. Następnie dodaj ciepły PBS do wszystkich naczyń, aby dokładnie usunąć wszystkie pozostałe podłoża z czerwieni fenolowej.
Dodaj 230 mikrolitrów trypsyny EDTA i umieść naczynia w inkubatorze na jedną minutę. Wyjmij trypsynizowane szalki z inkubatora i przystąp do dodawania pięciu mililitrów dmem uzupełnionego lekiem, w którym brakuje czerwieni fenolowej, do probówki oznaczonej jako probówka B. Następnie dodaj kolejne pięć mililitrów tej samej pożywki do odpowiedniego naczynia, aby ugasić trypsynę. Kilkakrotnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć wszystkie komórki od naczynia.
Przenieść całą zawartość naczynia do innej probówki, która została już oznaczona jako probówka, A.In celu przygotowania rozcieńczenia komórek odpowiedniego do obrazowania, przenieść jeden mililitr komórek z probówki A do probówki B. Powtórzyć wszystkie etapy rozcieńczania dla każdego zabiegu. Umieść wszystkie probówki w inkubatorze na 45 minut, aby komórki mogły zregenerować się po trypsynizacji. Upewnij się, że wszystkie części komory magnetycznej ogniwa, które mogą pomieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry, zostały dokładnie wyczyszczone przed użyciem.
Wyjmij naczynie z szkiełkiem nakrywkowym z inkubatora. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i umyć szkiełko nakrywkowe ciepłym PBS. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na dolnej płycie komory magnetycznej.
Następnie podnieś silikonową uszczelkę i umieść ją na szkiełku nakrywkowym. Przymocuj główny korpus komory magnetycznej do dolnej płyty. Dodać jeden mililitr dmemu pozbawionego czerwieni fenolowej odpowiadającego odpowiedniej obróbce do komory magnetycznej.
Weź niestrzępiącą się chusteczkę i ostrożnie przetrzyj obudowę między korpusem a dolną płytą, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Aby uzupełnić komorę magnetyczną, opuść przezroczystą pokrywę na korpus główny. Na koniec przetrzyj spód szkiełka nakrywkowego chusteczką spryskaną wodą, a drugą chusteczką spryskaną 70% etanolem.
Rozgrzej górny inkubator stopnia mikroskopu konfokalnego do 37 stopni. Umieść komorę magnetyczną na górze obiektywu. Przed uzyskaniem dynamiki rozprzestrzeniania się należy skupić się na już spolaryzowanych komórkach w zielonym kanale fluorescencyjnym.
Gwarantuje to, że komórki rozprowadzające będą ostre po przymocowaniu do szkiełka nakrywkowego. Zdjąć przezroczystą pokrywę komory magnetycznej i odpipetować 500 mikrolitrów z probówki B, która została wyjęta z inkubatora. Umieść przezroczystą pokrywę z powrotem na górze.
Aby zidentyfikować komórki idealne do analizy rozprzestrzeniania się komórek, należy poszukać zielonych aureoli, które reprezentują komórki, które nie zostały jeszcze przymocowane do szkiełka nakrywkowego lub są w najwcześniejszym stadium przyczepienia. Zdobądź obrazy i zapisz pliki. Po zakończeniu pozyskiwania obrazu rozprzestrzeniania się komórek zacznij od uruchomienia kompatybilnego środowiska IDE języka Python, takiego jak Spyder.
Aby przeprowadzić analizę obliczeniową dynamiki rozprzestrzeniania się komórek, zlokalizuj i otwórz plik GUI rozprzestrzeniania komórek dostarczony w odpowiednich pakietach skryptów. Naciśnij przycisk uruchom, który otworzy panel GUI analizy w tle. Graficzny interfejs użytkownika zawiera wszystkie ustawienia potrzebne do analizy.
Aby przeanalizować obszar komórki i okrągłość, wprowadź plik akwizycji i niezbędne ustawienia w zakładce obszar rozprzestrzeniania się komórek. Korekty będą musiały zostać dokonane w zależności od typu komórki i parametrów akwizycji obrazu. Po naciśnięciu przycisku uruchom skrypt utworzy wykres kołowości komórki i obszaru w funkcji czasu dla wszystkich komórek rozprzestrzeniających się.
W przypadku danych kimografu naciśnij kartę generatora kimografu i analizy. Ta analiza wymaga, aby pliki wejściowe były przyciętymi stosami obrazów z pojedynczą komórką. Po wstawieniu wszystkich ustawień i naciśnięciu uruchom, skrypt utworzy wiele kimografów dla danej komórki.
Po lewej stronie znajdują się reprezentatywne komórki z zabiegów DMSO i CK-666, automatycznie segmentowane za pomocą dostarczonego skryptu. W przeciwieństwie do izotropowej i wysoce kolistej morfologii wykazywanej przez komórki kontrolne, komórki hamowane Arp2/3 wykazują zmniejszoną okrągłość. Dodatkowo, automatycznie generowane kimografy zapewniają rozdzielczość czasową, która ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki wypukłości.
Komórki kontrolne wystają uporczywie z niewielkimi lub żadnymi retrakcjami. W przeciwieństwie do tego, hamowanie Arp2/3 zaburza stabilność wypukłości, na co wskazuje wzrost liczby zdarzeń retrakcyjnych podczas rozprzestrzeniania się. Te filmy powinny dostarczyć Ci zrozumienia, jak prawidłowo wysiewać komórki, wykonywać zabiegi farmakologiczne oraz przygotowywać narzędzia obrazowania i obliczeniowe niezbędne do ilościowego określenia dynamiki rozprzestrzeniania się komórek.
Protokół ten można dodatkowo połączyć z obrazowaniem fluorescencyjnym cytoszkieletu i testami migracji w celu zidentyfikowania graczy molekularnych rządzących wypukłościami komórek. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół przeprowadzania i analizy testów rozprzestrzeniania się komórek, skupiając się na dynamicznym procesie, w którym komórki przylegają do podłoża i wysuwają lamellipodia. Procedura obejmuje kroki eksperymentalne dotyczące przygotowania i obrazowania zarodkowych fibroblastów mysich wykazujących ekspresję PH-Akt-GFP, a także wykorzystanie otwartoźródłowego narzędzia obliczeniowego do obiektywnej kwantyfikacji dynamiki brzegów komórek. Protokół ten jest odpowiedni do wielkoskalowego przesiewania molekularnych regulatorów wypustek lamellipodialnych, zwłaszcza w połączeniu z podejściami farmakologicznymi lub metodami wyciszania genów.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Dynamika cytoszkieletu
- Obrazowanie ilościowe
Wstęp
- Rozprzestrzenianie się komórek wiąże się z przejściem z morfologii zaokrąglonej w spłaszczoną po przyczepieniu do podłoża.
- Tworzenie lamellipodiów jest napędzane polimeryzacją aktyny, co ma kluczowe znaczenie dla migracji komórek i endocytozy.
- Istniejące testy rozprzestrzeniania się komórek często nie zapewniają ciągłego śledzenia i bezstronnej analizy dynamiki krawędzi komórkowych.
- Do rzetelnej analizy kinetyki rozprzestrzeniania się niezbędne są podejścia zautomatyzowane i ilościowe.
Cel badania
- Aby zapewnić kompleksowy, krok po kroku opracowany protokół dla analiz rozprzestrzeniania się komórek.
- Aby zaprezentować otwartoźródłowe narzędzie obliczeniowe do zautomatyzowanej analizy dynamiki rozprzestrzeniania się komórek.
- Aby umożliwić wielkoskalowy screening molekularnych czynników zaangażowanych w tworzenie wypustek lamellipodialnych.
Zastosowane metody
- Hodowla embrionalnych fibroblastów mysich wykazujących ekspresję PH-Akt-GFP w celu wizualizacji błony plazmatycznej.
- Przygotowanie szkiełek podstawkowych pokrytych fibronektyną dla adhezji komórek.
- Manipulacja farmakologiczna z użyciem inhibitora Arp2/3 CK-666 oraz traktowania kontrolnego.
- Obrazowanie żywych komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej z inkubatorem na stole mikroskopu.
- Zautomatyzowana analiza komputerowa powierzchni komórek, ich kołowości oraz cykli wysuwania i chowania wypustek z wykorzystaniem interfejsu graficznego (GUI) opartego na języku Python.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia ciągłe śledzenie ruchu krawędzi komórek oraz zmian morfologicznych podczas rozprzestrzeniania się.
- Zautomatyzowana analiza dostarcza ilościowych danych na temat powierzchni komórek, ich kolistości oraz dynamiki wypustek.
- Inhibicja Arp2/3 (leczenie CK-666) prowadzi do zmniejszenia kolistości komórek i zwiększenia liczby zdarzeń retrakcji w porównaniu z kontrolą.
- Analiza kymograficzna zapewnia rozdzielczość czasową zdarzeń protruzji i retrakcji.
Wnioski
- Niniejszy protokół oferuje niezawodną, bezstronną metodę ilościowego pomiaru dynamiki rozprzestrzeniania się komórek.
- Można go dostosować do wysokoprzepustowego przesiewania molekularnych regulatorów wypustek komórkowych.
- Podejście to można połączyć z dodatkowymi analizami, takimi jak obrazowanie cytoszkieletu i badania migracji, w celu szerszego zastosowania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ilościowa analiza dynamiki krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się stanowi solidną podstawę do badania regulacji cytoszkieletu oraz mechanizmów napędzających zmiany morfologii komórek. Niniejszy schemat postępowania umożliwia wysokoprzepustowy, bezstronny pomiar kinetyki protruzji lamellipodiów, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i ograniczaniu ryzyka w badaniu szlaków sygnałowych. Podejście to jest bezpośrednio przydatne dla zespołów zajmujących się wczesnym etapem odkryć, poszukujących skalowalnych i powtarzalnych testów do selekcji molekularnych regulatorów ruchliwości komórek i dynamiki cytoszkieletu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia systematyczną analizę szlaków regulacji aktyny oraz ich wpływu na rozprzestrzenianie się komórek.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów molekularnych wpływających na dynamikę lamellipodiów.
- Ułatwia analizę mechanistyczną poprzez kwantyfikację cykli protruzji i retrakcji w warunkach perturbacji genetycznych lub farmakologicznych.
- Zapewnia wyniki ilościowe pozwalające na priorytetyzację potencjalnych regulatorów w biologii cytoszkieletu.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowaną, zautomatyzowaną analizę powierzchni komórek, ich kolistości oraz dynamiki krawędzi w celu standaryzacji testów.
- Ogranicza błędy operatora i zwiększa powtarzalność w wielkoskalowych badaniach przesiewowych związków chemicznych lub wyciszania genów.
- Generuje ilościowe, rozdzielone w czasie odczyty, odpowiednie dla platform wysokoprzepustowych badań przesiewowych.
- Umożliwia wiarygodne porównanie wpływu związków na morfologię i ruchliwość komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla chorób, w których zaangażowana jest migracja komórek i przebudowa cytoszkieletu.
- Wspiera ciągłość procesu od etapu odkryć po przedkliniczną walidację celów cytoszkieletowych.
- Zapewnia wgląd w mechanizmy, który pozwala na dostosowanie ryzyka przy opracowywaniu cząsteczek kandydackich.
- Ułatwia integrację z dodatkowymi testami fenotypowymi lub markerami biologicznymi w celu uzyskania istotności translacyjnej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten ilościowy test rozprzestrzeniania się komórek łączy wczesną fazę odkrywania z badaniami przedklinicznymi, umożliwiając weryfikację hipotez dotyczących regulatorów cytoszkieletu oraz wspierając podejmowanie decyzji w procesie identyfikacji wiodących kandydatów na leki.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych oraz wyjaśnianie szlaków w dynamice komórkowej zależnej od aktyny.
- Przesiewy: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wyniki dla przesiewów związków chemicznych lub zaburzeń genetycznych.
- Analityka: Dostarcza zautomatyzowane pomiary powierzchni komórki, okrągłości oraz cykli wysuwania i chowania wypustek w celu przeprowadzenia solidnych porównań statystycznych.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z zachowaniami komórkowymi istotnymi dla chorób oraz potencjalnymi biomarkerami.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną platformę open-source, którą można dostosować do różnych typów komórek i warunków eksperymentalnych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną walidacji celów i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad cytoszkieletem.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje pozyskiwanie i analizę danych, umożliwiając powtarzalność i skalowalność w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz efektywność kapitałową poprzez dostarczanie wiarygodnych, ilościowych danych fenotypowych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów i związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o metryki funkcjonalnego zachowania komórek.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu żywych komórek oraz analizie obliczeniowej w celu optymalnego zastosowania.
- Wymaga dostępu do mikroskopii konfokalnej i kompatybilnej infrastruktury analitycznej opartej na języku Python.
- Wymaga standaryzacji parametrów obrazowania i schematów przetwarzania danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych typów komórek i strategii perturbacji przy odpowiedniej kalibracji.
- Zależność od jakości obrazu i dokładności segmentacji w celu uzyskania wiarygodnych wyników ilościowych.
