Name: Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Poznaj metodę ilościowej analizy dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się z wykorzystaniem zautomatyzowanego narzędzia obliczeniowego. Protokół umożliwia śledzenie fibroblastów mysich wyrażających PH-Akt-GFP.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Connaught Fund New Investigator Award dla S.P., Canada Foundation for Innovation, NSERC Discovery Grant Program (granty RGPIN-2015-05114 i RGPIN-2020-05881), University of Manchester i University of Toronto Joint Research Fund, oraz University of Toronto XSeed Program.

<ol><li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+Arp2%2F3+complex+with+actin%3A+Nucleation%2C+high+affinity+pointed+end+capping%2C+and+formation+of+branching+networks+of+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interaction of Arp2/3 complex with actin: Nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (11), 6181-6186 (1998).</li>
<li>Yang, C., Czech, L., Gerboth, S., Kojima, S., Scita, G., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Roles+of+Formin+mDia2+in+Lamellipodia+and+Filopodia+Formation+in+Motile+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel Roles of Formin mDia2 in Lamellipodia and Filopodia Formation in Motile Cells.</a> PLoS Biology. 5 (11), 317(2007).</li>
<li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+driven+by+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell motility driven by actin polymerization.</a> Biophysical Journal. 71 (6), 3030-3045 (1996).</li>
<li>Mogilner, A., Oster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Generation+by+Actin+Polymerization+II%3A+The+Elastic+Ratchet+and+Tethered+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Force Generation by Actin Polymerization II: The Elastic Ratchet and Tethered Filaments.</a> Biophysical Journal. 84 (3), 1591-1605 (2003).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+is+critical+for+lamellipodia+and+response+to+extracellular+matrix+cues+but+is+dispensable+for+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 is critical for lamellipodia and response to extracellular matrix cues but is dispensable for chemotaxis.</a> Cell. 148 (5), 973-987 (2012).</li>
<li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> Journal of cell science. 126, Pt 20 4572-4588 (2013).</li>
<li>Gupton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration+without+a+lamellipodium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell migration without a lamellipodium.</a> The Journal of Cell Biology. 168 (4), 619-631 (2005).</li>
<li>Dimchev, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Arp2%2F3+Complex+Depletion+Increases+FMNL2%2F3+Formin+Expression+and+Filopodia+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced Arp2/3 Complex Depletion Increases FMNL2/3 Formin Expression and Filopodia Formation.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 634708(2021).</li>
<li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature cell biology. 18 (11), 1253-1259 (2016).</li>
<li>Giannone, G., Dubin-Thaler, B. J., Döbereiner, H. -G., Kieffer, N., Bresnick, A. R., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+Lamellipodial+Contractions+Correlate+with+Rearward+Actin+Waves%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Periodic Lamellipodial Contractions Correlate with Rearward Actin Waves.</a> Cell. 116 (3), 431-443 (2004).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Cell+Edge+Velocities+and+Traction+Forces+Reveals+Distinct+Motility+Modules+during+Cell+Spreading%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Quantification of Cell Edge Velocities and Traction Forces Reveals Distinct Motility Modules during Cell Spreading.</a> PLoS ONE. 3 (11), 3735(2008).</li>
<li>Suraneni, P., Rubinstein, B., Unruh, J. R., Durnin, M., Hanein, D., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arp2%2F3+complex+is+required+for+lamellipodia+extension+and+directional+fibroblast+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">The Arp2/3 complex is required for lamellipodia extension and directional fibroblast cell migration.</a> The Journal of cell biology. 197 (2), 239-251 (2012).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconvolution+of+subcellular+protrusion+heterogeneity+and+the+underlying+actin+regulator+dynamics+from+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deconvolution of subcellular protrusion heterogeneity and the underlying actin regulator dynamics from live cell imaging.</a> Nature Communications. 9 (1), 1688(2018).</li>
<li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lamellipodin+tunes+cell+migration+by+stabilizing+protrusions+and+promoting+adhesion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Lamellipodin tunes cell migration by stabilizing protrusions and promoting adhesion formation.</a> Journal of cell science. 133 (7), 239020(2020).</li>
<li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nature cell biology. 13 (4), 371-381 (2011).</li>
<li>Yamada, K. M., Kennedy, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dualistic+nature+of+adhesive+protein+function%3A+fibronectin+and+its+biologically+active+peptide+fragments+can+autoinhibit+fibronectin+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dualistic nature of adhesive protein function: fibronectin and its biologically active peptide fragments can autoinhibit fibronectin function.</a> The Journal of Cell Biology. 99 (1), 29-36 (1984).</li>
<li>Cai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonmuscle+Myosin+IIA-Dependent+Force+Inhibits+Cell+Spreading+and+Drives+F-Actin+Flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonmuscle Myosin IIA-Dependent Force Inhibits Cell Spreading and Drives F-Actin Flow.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3907-3920 (2006).</li>
<li>Humphries, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion assays.</a> Molecular Biotechnology. 18 (1), 57-61 (2001).</li>
<li>Cavalcanti-Adam, E. A., Volberg, T., Micoulet, A., Kessler, H., Geiger, B., Spatz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Spreading+and+Focal+Adhesion+Dynamics+Are+Regulated+by+Spacing+of+Integrin+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell Spreading and Focal Adhesion Dynamics Are Regulated by Spacing of Integrin Ligands.</a> Biophysical Journal. 92 (8), 2964-2974 (2007).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. -G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+Analysis+of+Cell+Spreading+on+Matrix-Coated+Surfaces+Reveals+Two+Distinct+Cell+States+and+STEPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanometer Analysis of Cell Spreading on Matrix-Coated Surfaces Reveals Two Distinct Cell States and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li>
<li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li>
<li>Wolfenson, H., Iskratsch, T., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Events+in+Cell+Spreading+as+a+Model+for+Quantitative+Analysis+of+Biomechanical+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Early Events in Cell Spreading as a Model for Quantitative Analysis of Biomechanical Events.</a> Biophysical Journal. 107 (11), 2508-2514 (2014).</li>
<li>Guan, J. -L., Berrier, A. L., LaFlamme, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration%2C+Developmental+Methods+and+Protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Cell Migration, Developmental Methods and Protocols.</a> Methods in molecular biology. 294, Clifton, N.J. 55-68 (2004).</li>
<li>Raucher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol+4%2C5-Bisphosphate+Functions+as+a+Second+Messenger+that+Regulates+Cytoskeleton-Plasma+Membrane+Adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate Functions as a Second Messenger that Regulates Cytoskeleton-Plasma Membrane Adhesion.</a> Cell. 100 (2), 221-228 (2000).</li>
<li>Machacek, M., Danuser, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphodynamic+Profiling+of+Protrusion+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Morphodynamic Profiling of Protrusion Phenotypes.</a> Biophysical Journal. 90 (4), 1439-1452 (2006).</li>
<li>Zack, G. W., Rogers, W. E., Latt, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+measurement+of+sister+chromatid+exchange+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+histochemistry+and+cytochemistry+official+journal+of+the+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Automatic measurement of sister chromatid exchange frequency.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry official journal of the Histochemistry Society. 25 (7), 741-753 (1977).</li>
<li>Bardsley, W. G., Aplin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+cell+spreading.+I.+Theory+and+modelling+of+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of cell spreading. I. Theory and modelling of curves.</a> Journal of cell science. 61, 365-373 (1983).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany test rozprzestrzeniania się komórek pozwala na ciągłe śledzenie zmian morfologicznych (np. wielkości i kształtu komórki) oraz ruchów krawędzi komórek (tj. prędkości wypukłości i częstotliwości retrakcji), które są cechami, których brakuje w większości protokołów rozprzestrzeniania komórek19,24. Podczas gdy powszechnie stosowane testy rozprzestrzeniania się komórek w punkcie końcowym pozwalają na określenie szybkości rozprzestrzeniania si...

Występy blaszkowate to wyraźne struktury cytoszkieletu utworzone na początku migrującej komórki. W lamellipodiach polimeryzacja aktyny za pomocą kompleksu Arp2/3 i formin tworzy szybko rosnącą rozgałęzioną siatkę aktyny, która napiera na błonę plazmatyczną1,2. Siła pchająca generowana przez siatkę aktynową fizycznie popycha komórkę do przodu1,3,4,5. Zubożenie kompleksu Arp2/3 lub zakłócenie szlaków sygnałowych niezbędnych dla wypukłości lamelipodialnych często upośledza migrację komórek6, 7. Chociaż odnotowano również migrację komórek z niedoborem blaszek i blaszek8,9, znaczenie lamellipodiów w migracji komórek jest oczywiste, ponieważ zubożenie tej wystającej struktury zaburza zdolność komórki do poruszania się w złożonych mikrośrodowiskach biologicznych6,10.
Główną przeszkodą w zrozumieniu regulacji lamellipodiów w migrujących komórkach jest naturalna zmienność kinetyki, rozmiaru i kształtu wystających blaszek blaszkowatych11,12,13,14. Co więcej, ostatnie badania wykazały, że lamellipodia wykazują złożone zachowania wystające, w tym zmienne, okresowe i przyspieszające wypukłości14,15. W porównaniu z bardzo zmiennymi lamellipodiami migrujących komórek6,16, lamellipodia powstające podczas rozprzestrzeniania się komórek są bardziej jednolite12. Ponieważ aktywność wystająca rozprzestrzeniających się i migrujących komórek jest napędzana przez identyczne zespoły makromolekularne, które obejmują rozgałęzioną sieć aktyny, kurczliwe wiązki aktomiozyny i adhezje macierzy komórkowej oparte na integrynie17,18, rozprzestrzenianie się komórek jest szeroko stosowane jako model do badania regulacji dynamiki lamellipodiów.
Rozprzestrzenianie się komórek to dynamiczny proces mechanochemiczny, w którym komórka w zawiesinie najpierw przylega do substratu poprzez adhezje oparte na integrynie17,19,20, a następnie rozprzestrzenia się poprzez rozszerzanie wypukłości na bazie aktyny21,22,23. Podczas fazy rozprzestrzeniania się lamellipodia emanujące z ciała komórki wystają izotropowo i uporczywie, z niewielkim lub żadnym wycofaniem lub zatrzymaniem12. Najczęściej stosowanymi protokołami rozsiewania komórek są testy końcowe, w których komórki rozprzestrzeniające się są utrwalane w różnych momentach po posianiu19,24. Testy te, choć szybkie i proste, mają ograniczoną moc diagnostyczną do wykrywania zmian w dynamicznych cechach lamellipodiów. Aby określić mechanizmy molekularne, które kontrolują dynamikę lamellipodiów, grupa Sheetz była pionierem w zastosowaniu analizy ilościowej żywych komórek rozprzestrzeniających się i odkryła wiele podstawowych właściwości wypukłości krawędzi komórek11,12,22. Badania te wykazały, że test rozprzestrzeniania się żywych komórek jest solidną i potężną techniką w zestawie narzędzi laboratorium biologii komórki. Mimo to szczegółowy protokół i narzędzie obliczeniowe typu open source do badania rozprzestrzeniania się żywych komórek są obecnie niedostępne dla społeczności zajmującej się biologią komórki. W tym celu nasz protokół określa procedury obrazowania żywych komórek rozprzestrzeniających się i zapewnia narzędzie do automatycznej analizy obrazu. Aby zwalidować tę metodę, zastosowaliśmy hamowanie Arp2 / 3 jako leczenie eksperymentalne i wykazaliśmy, że hamowanie funkcji kompleksu Arp2 / 3 nie zatrzymało rozprzestrzeniania się komórek, ale spowodowało znaczne zmniejszenie prędkości wysunięcia komórek, a także stabilność wystających krawędzi komórek, powodując postrzępione krawędzie komórek. Dane te pokazują, że połączenie obrazowania żywych komórek i automatycznej analizy obrazu jest użytecznym narzędziem do analizy dynamiki krawędzi komórki i identyfikacji składników molekularnych regulujących blaszkowatość.

<table><tbody><tr><td>0,05% trypsyna (0,05%), 0,53 mM EDTA</td><td>Bisent Bioproducts</td><td>325-042-CL</td><td></td></tr><tr><td>10,0 cm szalka Petriego, polistyren, poddana działaniu TC, wentylowana</td><td>Starstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Probówka wirówkowa PP o wysokiej przejrzystości, stożkowe dno, z nakrętką z uszczelką kopułkową, sterylna</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1-dołkowa Chamlide CMS do szkiełek nakrywkowych 22 mm x 22 mm</td><td>Quorum Technologies</td><td>CM-S22-1</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynie do hodowli komórkowych Easy-Grip Style z powłoką TC</td><td></td><td></td> Probówka wirówkowa Falcon 353001 <td></td></tr><tr><td>50 ml, przezroczysta, gniazdo z uszczelką zatyczkową</td><td></td><td>602002</td><td></td></tr><tr><td>6,0 cm Naczynia do hodowli komórkowych poddane obróbce w celu zwiększenia przyczepu komórek, sterylny</td> inhibitor kompleksu <td>VWR</td><td>10861-658</td><td></td></tr><tr><td>Arp2/3 I, kamera CK-666</td><td>Millipore Sigma</td><td>182515</td><td></td></tr><tr><td>, Prime 95B-25MM</td><td>Fotometria</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek, Sterylny</td><td>BioShop</td><td>DMS666</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 1x, 4,5 g/L Glukoza, z L-Glutaminą, Pirogronianem Sodu i Fenolem Czerwone</td><td>Bioprodukty Żubrów</td><td>319-005 CL</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, Bez Czerwieni Fenolowej</td><td>Gibco</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS, 1X</td><td>Bioprodukty z żubra</td><td>311-425 CL</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Bioprodukty żubra</td><td>080-110</td><td></td></tr><tr><td>Fidżi Software</td><td>ImageJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Oczyszczone białko fibronektyny z ludzkiego osocza 1 mg</td><td>Millipore Sigma</td><td>FC010</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Cargille</td><td>16241</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór L-glutaminy (200 mM)</td><td>Bioprodukty</td> <td>żubra609-065-EL</td><td></td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Okulary Micro Cover Glasses, kwadratowe, nr 11/2 22 x 22 mm</td> Korpus mikroskopu <td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr>, obiektyw <td>Nikon</td><td></td><td></td><td>Eclipse Ti2-E</td></tr><tr><td>, olej CFI Plan Apo Lambda 60X</td><td>Nikon</td><td>MRD01605</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Wirujący dysk, światło grzebienia V2</td><td>CrestOptics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>Anakonda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator górny</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Statistics Software,</td> pęseta <td>Prism GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Styl 2</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>78326-42</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Quantitative Analysis of Cell Edge Dynamics during Cell Spreading

Rozprzestrzenianie się komórek to dynamiczny proces, w którym komórka zawieszona w podłożu przyczepia się do podłoża i spłaszcza się z zaokrąglonego kształtu do cienkiego i rozłożystego. Po przyczepieniu się komórka-substrat, komórka tworzy cienki arkusz lamellipodiów emanujący z ciała komórki. W blaszkach monomery globularne aktyny (G-aktyny) polimeryzują w gęstą nitkowatą siatkę aktyny (F-aktyna), która naciska na błonę plazmatyczną, zapewniając w ten sposób siły mechaniczne wymagane do rozprzestrzeniania się komórki. Warto zauważyć, że gracze molekularni, którzy kontrolują polimeryzację aktyny w lamellipodiach, są niezbędne dla wielu innych procesów komórkowych, takich jak migracja komórek i endocytoza. 
Ponieważ rozprzestrzeniające się komórki tworzą ciągłe lamellipodia, które rozciągają się na całe obrzeża komórek i stale rozszerzają się na zewnątrz, testy rozprzestrzeniania się komórek stały się skutecznym narzędziem do oceny kinetyki wypukłości blaszkowatych. Chociaż opracowano kilka technicznych implementacji testu rozprzestrzeniania się komórek, obecnie brakuje szczegółowego opisu przepływu pracy, który obejmowałby zarówno protokół krok po kroku, jak i narzędzia obliczeniowe do analizy danych. W tym miejscu opisujemy procedury eksperymentalne testu rozprzestrzeniania się komórek i przedstawiamy narzędzie typu open source do ilościowej i bezstronnej analizy dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się. W połączeniu z manipulacjami farmakologicznymi i/lub technikami wyciszania genów, protokół ten jest podatny na badanie przesiewowe na dużą skalę graczy molekularnych regulujących wypukłości blaszkowate.

Powyższy protokół opisuje procedury doświadczalne dotyczące obrazowania żywych komórek podczas ich rozprzestrzeniania się oraz narzędzie obliczeniowe do ilościowej analizy dynamiki rozprzestrzeniania się komórek. Narzędzie obliczeniowe może być wykorzystywane w formacie niskoprzepustowym lub wysokoprzepustowym w celu zidentyfikowania cząsteczek regulujących mechanizm polimeryzacji aktyny na krawędzi prowadzącej komórki.
Schematyczne przedstawienie procedur doświadczalnych ukazano na <strong cl...

W tym protokole prezentujemy eksperymentalne procedury testu rozprzestrzeniania się komórek, który opiera się na mikroskopii żywych komórek. Dostarczamy narzędzie obliczeniowe typu open source do bezstronnej segmentacji komórek znakowanych fluorescencyjnie i ilościowej analizy dynamiki lamellipodiów podczas rozprzestrzeniania się komórek.

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Cell spreading is a dynamic process in which a cell suspended in media attaches to a substrate and flattens itself from a rounded to a thin and spread-out ...

Protokół opisany w tym filmie określi procedury eksperymentalne wymagane do obrazowania naturalnej wielkości komórek rozprzestrzeniających się oraz wykorzystania narzędzia obliczeniowego, które określa ilościowo dynamikę rozprzestrzeniania się komórek w sposób bezstronny i zautomatyzowany. Zasób rozprzestrzeniania komórek pozwala na ciągłe śledzenie ruchu krawędzi komórki i zmian morfologicznych podczas rozprzestrzeniania się komórek, co jest cechą, której brakuje w większości istniejących testów rozprzestrzeniania się komórek. Protokół ten wykorzystuje również zautomatyzowane przetwarzanie i analizę komputerową, dostarczając informacji na temat cykliczności komórek, obszaru i cykli retrakcji wypukłości komórek rozprzestrzeniających się.Takie zautomatyzowane przetwarzanie zmniejsza tendencyjność w analizie danych i zapewnia solidną metodę analizy dynamiki rozprzestrzeniania się komórek dla dużej liczby komórek. W połączeniu z terapiami farmakologicznymi lub nauką i technikami genetycznymi, protokół ten jest podatny na wielkoskalowe prędkości graczy molekularnych regulujących wypukłości komórek. Dla podanego protokołu wykorzystywane są mysie fibroblasty embrionalne, które genetycznie kodują PH-Akt-GFP, co pozwala na fluorescencyjne znakowanie błony plazmatycznej.Przed rozpoczęciem testu rozprzestrzeniania się komórek należy wyhodować naczynie z komórkami do 90% zbieżności. Gdy komórki osiągną właściwą konfluencję, spal szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry i umieść je w naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy 35 milimetrów. Pokryj szkiełko nakrywkowe fibronektyną, która została rozcieńczona w PBS do stężenia 2,5 mikrograma na mililitr.Umieść naczynie z szkiełkiem nakrywkowym w inkubatorze o temperaturze 37 stopni na godzinę. Po godzinie odessać fibronektynę, uważając, aby nie dotknąć szkiełka nakrywkowego końcówką pipety. Umyj naczynie za pomocą PBS, delikatnie pipetując wokół szkiełka nakrywkowego dwa do trzech razy.W przypadku wysiewu komórek zacznij od zasysania pożywki do hodowli komórkowych z naczynia komórkowego. Następnie umyj naczynie ciepłym PBS. Dodaj 650 mikrolitrów trypsyny EDTA do naczynia i przechyl naczynie, aby równomiernie rozprowadzić enzym.Umieść naczynie z trypsyną w inkubatorze na jedną minutę. Po inkubacji należy najpierw dodać 10 mililitrów pożywki do hodowli komórkowej do probówki wirówkowej. Następnie szybko dodaj kolejne 10 mililitrów pożywki do naczynia, aby ugasić trypsynę.Aby rozcieńczyć komórki, które zostaną wysiane na szkiełko nakrywkowe, należy odpipetować jeden mililitr zawartości naczynia do probówki wirówkowej. Z probówki odpipetować około 500 do 1 000 mikrolitrów rozcieńczonych komórek do naczynia z szkiełkiem nakrywkowym. Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe ma 10% konfluencję lub 50 000 komórek na mililitr i dostosuj objętość rozcieńczonych komórek w razie potrzeby.Celem tych komórek jest ustalenie płaszczyzny ostrości podczas akwizycji obrazu. Z pozostałymi komórkami w naczyniu, przejdź jedną piątą komórek do jednego małego naczynia na zabieg. Będą to komórki, które zostaną przeanalizowane pod kątem dynamiki rozprzestrzeniania się.Umieść naczynia przejściowe i naczynie nakrywkowe w inkubatorze na osiem do 24 godzin. Aby przetestować znaczenie Arp2/3 dla rozprzestrzeniania się komórek, najpierw dodaj pięć mililitrów pożywki do hodowli komórkowych do probówki wirówkowej kontrolnej i leczniczej. Następnie dodaj 20 mililitrów DMEM, w którym brakuje czerwieni fenolowej, do każdej z dwóch większych probówek wirówkowych.Do małych i dużych probówek należy odpipetować lek CK-666, który jest inhibitorem kompleksu Arp2/3 lub kontrolowane leczenie, takie jak DMSO. Aby rozpocząć leczenie farmakologiczne komórek, należy usunąć szalki pasażowe, które inkubowały przez noc. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych ze wszystkich naczyń i umyć naczynia ciepłym PBS.Wziąć małe probówki zawierające CK-666 lub kontrolną pożywkę uzupełnioną i dodać zawartość odpowiedniej probówki do każdej z naczyń przejściowych. Oznacz każdą z naczyń odpowiednim lekiem, a następnie umieść szalki z powrotem w inkubatorze na dodatkową godzinę Po godzinnej inkubacji odessaj pożywkę uzupełnioną lekiem z każdej z szalek. Następnie dodaj ciepły PBS do wszystkich naczyń, aby dokładnie usunąć wszystkie pozostałe podłoża z czerwieni fenolowej.Dodaj 230 mikrolitrów trypsyny EDTA i umieść naczynia w inkubatorze na jedną minutę. Wyjmij trypsynizowane szalki z inkubatora i przystąp do dodawania pięciu mililitrów dmem uzupełnionego lekiem, w którym brakuje czerwieni fenolowej, do probówki oznaczonej jako probówka B. Następnie dodaj kolejne pięć mililitrów tej samej pożywki do odpowiedniego naczynia, aby ugasić trypsynę. Kilkakrotnie pipetować pożywkę w górę i w dół, aby odłączyć wszystkie komórki od naczynia.Przenieść całą zawartość naczynia do innej probówki, która została już oznaczona jako probówka, A.In celu przygotowania rozcieńczenia komórek odpowiedniego do obrazowania, przenieść jeden mililitr komórek z probówki A do probówki B. Powtórzyć wszystkie etapy rozcieńczania dla każdego zabiegu. Umieść wszystkie probówki w inkubatorze na 45 minut, aby komórki mogły zregenerować się po trypsynizacji. Upewnij się, że wszystkie części komory magnetycznej ogniwa, które mogą pomieścić szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 22 milimetry, zostały dokładnie wyczyszczone przed użyciem.Wyjmij naczynie z szkiełkiem nakrywkowym z inkubatora. Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i umyć szkiełko nakrywkowe ciepłym PBS. Usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszków i delikatnie połóż szkiełko nakrywkowe na dolnej płycie komory magnetycznej.Następnie podnieś silikonową uszczelkę i umieść ją na szkiełku nakrywkowym. Przymocuj główny korpus komory magnetycznej do dolnej płyty. Dodać jeden mililitr dmemu pozbawionego czerwieni fenolowej odpowiadającego odpowiedniej obróbce do komory magnetycznej.Weź niestrzępiącą się chusteczkę i ostrożnie przetrzyj obudowę między korpusem a dolną płytą, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków. Aby uzupełnić komorę magnetyczną, opuść przezroczystą pokrywę na korpus główny. Na koniec przetrzyj spód szkiełka nakrywkowego chusteczką spryskaną wodą, a drugą chusteczką spryskaną 70% etanolem.Rozgrzej górny inkubator stopnia mikroskopu konfokalnego do 37 stopni. Umieść komorę magnetyczną na górze obiektywu. Przed uzyskaniem dynamiki rozprzestrzeniania się należy skupić się na już spolaryzowanych komórkach w zielonym kanale fluorescencyjnym.Gwarantuje to, że komórki rozprowadzające będą ostre po przymocowaniu do szkiełka nakrywkowego. Zdjąć przezroczystą pokrywę komory magnetycznej i odpipetować 500 mikrolitrów z probówki B, która została wyjęta z inkubatora. Umieść przezroczystą pokrywę z powrotem na górze.Aby zidentyfikować komórki idealne do analizy rozprzestrzeniania się komórek, należy poszukać zielonych aureoli, które reprezentują komórki, które nie zostały jeszcze przymocowane do szkiełka nakrywkowego lub są w najwcześniejszym stadium przyczepienia. Zdobądź obrazy i zapisz pliki. Po zakończeniu pozyskiwania obrazu rozprzestrzeniania się komórek zacznij od uruchomienia kompatybilnego środowiska IDE języka Python, takiego jak Spyder.Aby przeprowadzić analizę obliczeniową dynamiki rozprzestrzeniania się komórek, zlokalizuj i otwórz plik GUI rozprzestrzeniania komórek dostarczony w odpowiednich pakietach skryptów. Naciśnij przycisk uruchom, który otworzy panel GUI analizy w tle. Graficzny interfejs użytkownika zawiera wszystkie ustawienia potrzebne do analizy.Aby przeanalizować obszar komórki i okrągłość, wprowadź plik akwizycji i niezbędne ustawienia w zakładce obszar rozprzestrzeniania się komórek. Korekty będą musiały zostać dokonane w zależności od typu komórki i parametrów akwizycji obrazu. Po naciśnięciu przycisku uruchom skrypt utworzy wykres kołowości komórki i obszaru w funkcji czasu dla wszystkich komórek rozprzestrzeniających się.W przypadku danych kimografu naciśnij kartę generatora kimografu i analizy. Ta analiza wymaga, aby pliki wejściowe były przyciętymi stosami obrazów z pojedynczą komórką. Po wstawieniu wszystkich ustawień i naciśnięciu uruchom, skrypt utworzy wiele kimografów dla danej komórki.Po lewej stronie znajdują się reprezentatywne komórki z zabiegów DMSO i CK-666, automatycznie segmentowane za pomocą dostarczonego skryptu. W przeciwieństwie do izotropowej i wysoce kolistej morfologii wykazywanej przez komórki kontrolne, komórki hamowane Arp2/3 wykazują zmniejszoną okrągłość. Dodatkowo, automatycznie generowane kimografy zapewniają rozdzielczość czasową, która ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia dynamiki wypukłości.Komórki kontrolne wystają uporczywie z niewielkimi lub żadnymi retrakcjami. W przeciwieństwie do tego, hamowanie Arp2/3 zaburza stabilność wypukłości, na co wskazuje wzrost liczby zdarzeń retrakcyjnych podczas rozprzestrzeniania się. Te filmy powinny dostarczyć Ci zrozumienia, jak prawidłowo wysiewać komórki, wykonywać zabiegi farmakologiczne oraz przygotowywać narzędzia obrazowania i obliczeniowe niezbędne do ilościowego określenia dynamiki rozprzestrzeniania się komórek.Protokół ten można dodatkowo połączyć z obrazowaniem fluorescencyjnym cytoszkieletu i testami migracji w celu zidentyfikowania graczy molekularnych rządzących wypukłościami komórek. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.

quantitative-analysis-of-cell-edge-dynamics-during-cell-spreading

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisujemy protokół obserwacji i analizy trajektorii toczenia się komórek na podłożach z asymetrycznym wzorem receptorów. Uzyskane dane są przydatne przy projektowaniu podłoży z wzorem receptorów do bezznakowej separacji i analizy komórek.

Badanie trajektorii toczenia się komórek na asymetrycznych wzorach receptorów

Obrazowanie mikroskopowe żywych komórek śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-actin pozwala na charakterystykę dynamicznych zmian w strukturach cytoszkieletu. W przeciwieństwie do technik wykorzystujących utrwalone preparaty, metoda ta umożliwia szczegółową ocenę zmian czasowych w cytoszkielecie aktynowym w tych samych komórkach przed, w trakcie i po różnych bodźcach fizycznych, farmakologicznych lub zapalnych.

Badanie cytoszkieletu aktynowego w żywych komórkach śródbłonka wykazujących ekspresję GFP-aktyny

Właściwości mechaniczne i mikrostruktura macierzy zewnątrzkomórkowej silnie wpływają na migrację komórek w 3D. Opisano metodę in vitro do badania czasoprzestrzennego zachowania migracji komórek w zmiennych biofizycznie środowiskach, zarówno na poziomie populacji, jak i poszczególnych komórek.

Koncentryczny system żelowy do badania biofizycznej roli mikrośrodowiska macierzy w migracji komórek 3D

Wiele komórek ssaków preferencyjnie migruje w kierunku bardziej sztywnej matrycy lub substratu poprzez durotaksję. Celem tego protokołu jest dostarczenie prostego systemu in vitro, który może być używany do badania i manipulowania zachowaniami durotaksji komórek poprzez włączenie substratów polidimetylosiloksanu (PDMS) o określonej sztywności, łączących się ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi.

Uproszczony system do oceny mechanodetekcji komórek i durotaksji in vitro

Migracja komórek jest niezbędna do rozwoju, utrzymania i naprawy tkanek oraz nowotworzenia, a także jest regulowana przez czynniki wzrostu, chemokiny i cytokiny. Protokół ten opisuje test punktowy, dwuwymiarowy, nieograniczony test migracji w celu oceny fenotypu migracyjnego dołączonych, spójnych arkuszy komórkowych w odpowiedzi na sygnały mikrośrodowiskowe.

Wykorzystanie testu punktowego do analizy migracji arkuszy komórek

Ta metoda jest przydatna do ilościowego określania wczesnej dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek zależnych od zakotwiczenia na fibronektynie. Ponadto test ten może być wykorzystany do zbadania wpływu zmienionej homeostazy redoks na rozprzestrzenianie się komórek i/lub wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe związane z adhezją komórek.

Badanie dynamiki adhezji komórkowej i rozprzestrzeniania się komórek nabłonka na fibronektynie podczas stresu oksydacyjnego

Obrazowanie na żywo lizosomalnej egzocytozy na mikrowzorcach komórek pozwala na przestrzenną kwantyfikację tego procesu. Normalizacja morfologii za pomocą mikrowzorców jest znakomitym narzędziem do odkrywania ogólnych zasad dotyczących przestrzennego rozkładu procesów komórkowych.

Kwantyfikacja parametrów czasoprzestrzennych egzocytozy komórkowej w komórkach z mikrowzorami

Artykuł opisuje ilościowe określenie 1) wielkości i liczby zrostów ogniskowych oraz 2) wskaźnika kształtu komórki i jego rozkładu na podstawie obrazów konfokalnych zlewających się monowarstw komórek MCF7.

Kwantyfikacja obszaru adhezji komórka-substrat i rozkładu kształtu komórki w monowarstwach komórek MCF7

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół krokowy, jak wykorzystać zintegrowany wielofunkcyjny i programowalny przez użytkownika system, który umożliwia automatyczne obrazowanie wielokanałowe i analizę mechanobiologiczną w celu wyjaśnienia mechano-wrażliwości białka związanego z Tak (YAP).

W pełni optyczne badanie mechanobiologiczne białka związanego z Tak w ludzkim raku i normalnych komórkach przy użyciu wielofunkcyjnego systemu

Ten protokół ma na celu zmierzenie parametrów dynamicznych (wypukłości, retrakcje, falbany) wypukłości na krawędzi komórek rozsiewających.

Pomiar dynamiki wypukłości krawędzi komórki podczas rozprzestrzeniania się za pomocą mikroskopii żywych komórek

Aby się rozwijać, stożki wzrostu muszą wywierać siłę napędową na środowisko zewnętrzne. Wytwarzanie sił uciągu zależy od dynamiki aktyny i sprzężenia sprzęgła. W niniejszej pracy opisano metody analizy dynamiki aktyny, sprzęgu sprzęgła i sił trakcyjnych dla wyprzedzenia stożka wzrostu.

Analizy dynamiki aktyny, sprzęgła sprzęgła i siły uciągu dla wyprzedzenia stożka wzrostu

Poznaj metodę ilościowej analizy dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się z wykorzystaniem zautomatyzowanego narzędzia obliczeniowego. Protokół umożliwia śledzenie fibroblastów mysich wyrażających PH-Akt-GFP.

Analiza ilościowa dynamiki krawędzi komórek podczas rozprzestrzeniania się komórek

Przeglądaj więcej filmów