Wypreparowanie worka endolimfatycznego od myszy

Worek endolimfatyczny jest niezbędny do prawidłowego rozwoju ucha wewnętrznego. Ponieważ jest niedostępny in situ do badań strukturalnych, fizjologicznych i molekularnych, niezbędne jest jego rozwarstwienie z modeli zwierzęcych, zwłaszcza mysich. Rozwarstwienie i przygotowanie worka endolimfatycznego jest niezwykle trudne ze względu na jego cienką, delikatną strukturę nabłonka oraz bliskość i przyleganie do sąsiednich tkanek.

Nasze podejście ułatwia wizualizację i identyfikację worka oraz jego oddzielenie od sąsiednich tkanek. Choroby i zaburzenia wpływające na prawidłowe funkcjonowanie worka endolimfatycznego mogą prowadzić do utraty słuchu i równowagi. Nasza technika jest niezbędna do wyjaśnienia procesów komórkowych, molekularnych i fizjologicznych leżących u podstaw funkcji worka endolimfatycznego.

Procedurę zademonstruje Hyun Jae Lee, doktor habilitowany z mojego laboratorium. Zacznij od ułożenia preparatu ucha wewnętrznego w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym PBS z korzeniem ósmego nerwu czaszkowego skierowanym do góry. Za pomocą kleszczy nr 4 przytrzymaj tkankę przy ślimaku i zidentyfikuj akwedukt przedsionkowy, przedni i tylny kanał półkolisty, wspólny crus i zatokę esicy.

Następnie użyj igły o rozmiarze 27 zamontowanej na strzykawce o pojemności jednego mililitra, aby naciąć oponę twardą i akwedukt przedsionkowy, a także leżące poniżej tkanki łączne otaczające worek endolimfatyczny. Po wykonaniu nacięcia w tkance łącznej bocznej do worka endolimfatycznego, użyj kleszczy, aby przytrzymać tkankę łączną i oderwij ją, odciągając ją od kości skroniowej. Ostrożnie usuń wszelkie pozostałe zanieczyszczenia i oddziel nabłonek worka endolimfatycznego od otaczających tkanek.

W celu wypreparowania otwartego worka endolimfatycznego należy przytrzymać część trzpienia preparatu, aby obserwować przekrój poprzeczny światła. Następnie włóż igłę o rozmiarze 27 do światła i przesuń ją, aby przeciąć worek endolimfatyczny na dwa arkusze. Przytrzymaj krawędź każdej chusteczki przypominającej prześcieradło kleszczami i oddziel je od siebie.

W reprezentatywnej analizie środkowy strzałkowy odcinek czaszki tych myszy przed i po usunięciu połowy mózgu uwidoczniono za pomocą fluorescencji tdTomato. Worek endolimfatyczny był dobrze widoczny nawet bez sekcji. Wyizolowano uszy wewnętrzne myszy w 16,6. dniu embrionalnym, a także w 5. i 30. dniu po urodzeniu.

Worki endolimfatyczne obserwowano w większym powiększeniu. W przypadku myszy P30 przewód endolimfatyczny jest trudny do wyizolowania ze względu na jego zamknięcie w kości. Badano immunohistochemię nienaruszonych worków endolimfatycznych z E16.5 i P5 za pomocą przeciwciał anty-SLC26A4 i znakowania falloidyną.

Faloidynę stosowano w celu podkreślenia worka endolimfatycznego i otaczającej go tkanki spojówkowej. Obrazy w dużym powiększeniu otwartego nabłonka worka endolimfatycznego w P5 pokazują, że SLC26A4 oznaczone na zielono jest zlokalizowane w obszarze wierzchołkowym podzbioru komórek. Najważniejszą rzeczą, o której należy pamiętać podczas wykonywania tego zabiegu, jest bycie bardzo delikatnym, aby uniknąć uszkodzenia worka endolimftycznego.

Utrwalona tkanka worka endolimfatycznego wyizolowana w ten sposób może być wykorzystana do hybrydyzacji in situ, zakresu RNA i immunohistochemii. Żywa tkanka może być wykorzystana do przygotowania RNA do analizy transkryptomu i do fizjologii. Podejście to zostało wykorzystane do zbadania transkryptomu worka endolimfatycznego, zarówno jako całości, jak i w analizie sekwencyjnej RNA pojedynczej komórki, aby przyczynić się do scharakteryzowania jego różnych typów komórek.