Name: gP2S, system zarządzania informacjami dla eksperymentów krioelektromagnetycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: Poznaj system gP2S do zarządzania eksperymentami krioelektronowymi w biologii strukturalnej. Ta metoda umożliwia śledzenie próbek, sesji mikroskopowych i modeli atomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują wszystkim pozostałym członkom zespołu deweloperskiego gP2S, którzy pracowali nad projektem od samego początku: Rafał Udziela, Cezary Krzyżanowski, Przemysław Stankowski, Jacek Ziemski, Piotr Suchcicki, Karolina Pająk, Ewout Vanden Eyden, Damian Mierzwiński, Michał Wojtkowski, Piotr Pikusa, Anna Surdacka, Kamil Łuczak, oraz Artur Kusak. Dziękujemy również Raymondowi Ha i Claudio Ciferriemu za pomoc w zebraniu zespołu i ukształtowaniu projektu.

1. Konfiguracja gP2S do pracy
<ol>
	<li>Zaloguj się do gP2S. Po pomyślnym zalogowaniu pojawi się ekran główny. 
	UWAGA: W prawym górnym rogu wyświetlana jest nazwa użytkownika - kliknij na nią, aby się wylogować. Pasek nawigacyjny po lewej stronie składa się z selektora projektu (u góry), zestawu elementów nawigacyjnych z listą typów jednostek eksperymentalnych, które definiują przepływ pracy cryoEM (próbki, siatki, sesje mikroskopowe, sesje przetwarzania, mapy i modele) oraz łącza do sekcji Ustawienia aplikacji.</li>
	<li>Zanim jakiekolwiek eksperymenty będą mogły zostać zarejestrowane, wypełnij sekcję Ustawienia informacjami o projektach, sprzęcie, materiałach eksploatacyjnych, oprogramowaniu i protokołach, które są używane w obiekcie krioEM. Ustawienia można aktualizować w dowolnym momencie, dodając nowe narzędzia i projekty oraz edytując istniejące wpisy; jednak, podobnie jak wszystkie encje w gP2S, encji Ustawienia nie można usunąć po ich utworzeniu.</li>
</ol>
2. Skonfiguruj przynajmniej jeden projekt
<ol>
	<li>Przejdź do pozycji Ustawienia > Projekty.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy projekt.</li>
	<li>Wpisz etykietę projektu.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
3. Skonfiguruj co najmniej jedną maszynę do obróbki powierzchni.
UWAGA: Maszyny do obróbki powierzchni są używane do modyfikowania właściwości powierzchni siatek EM - najczęściej są to wyładowania żarowe lub oczyszczarki plazmowe.
<ol>
	<li>Z sekcji Sprzęt wybierz Maszyna do obróbki powierzchni.</li>
	<li>Kliknij przycisk Create New Machine (Utwórz nową maszynę).</li>
	<li>Wprowadź etykietę, która posłuży do późniejszej identyfikacji maszyny.</li>
	<li>Podaj jego producenta, model i lokalizację.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
4. Zarejestruj co najmniej jeden typ siatki.
UWAGA: Typy siatek mają na celu identyfikację modeli siatek (np. "2-μm dziurawa folia węglowa na siatkach miedzianych o oczkach 300"), a nie konkretnych partii lub wielu siatek.
<ol>
	<li>W sekcji Materiały eksploatacyjne wybierz opcję Grid Type (Typ siatki).</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy typ siatki.</li>
	<li>Wprowadź etykietę typu siatki, producenta i opis.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
5. Zarejestruj co najmniej jedną maszynę do witryfikacji
<ol>
	<li>W sekcji Sprzęt wybierz Maszyna do witryfikacji.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nową maszynę.</li>
	<li>Podaj jego producenta, model i lokalizację.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
6. Zarejestruj przynajmniej jedną bibułę
<ol>
	<li>W sekcji Materiały eksploatacyjne wybierz opcję Bibuła.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nową bibułę.</li>
	<li>Wpisz etykietę bibuły, producenta i model.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
7. Zarejestruj co najmniej jedno urządzenie pamięci masowej Cryo
<ol>
	<li>W sekcji Sprzęt wybierz Cryo Storage Device.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowe urządzenie pamięci masowej.</li>
	<li>Wprowadź producenta, model i lokalizację urządzenia.</li>
	<li>Ustaw przełączniki, aby określić, czy dodawane urządzenie pamięci masowej zawiera cylindry, rurki i/lub skrzynki. 
	UWAGA: Jeśli tak się stanie, gP2S pozwoli użytkownikom określić odpowiednie identyfikatory butli, rur i/lub skrzynek później, gdy użytkownicy będą rejestrować lokalizacje magazynowania dla poszczególnych sieci. Po skonfigurowaniu powyższych elementów wyposażenia i materiałów eksploatacyjnych możliwe jest stworzenie trzech rodzajów protokołów - obróbki powierzchni, barwienia ujemnego i witryfikacji.</li>
</ol>
8. Zarejestruj co najmniej jeden Protokół Obróbki Powierzchniowej
<ol>
	<li>W sekcji Protokoły wybierz opcję Obróbka powierzchniowa. </li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy protokół.</li>
	<li>Wprowadź etykietę identyfikującą protokół.</li>
	<li>Wybierz jedną z maszyn do obróbki powierzchni.</li>
	<li>Określ ustawienia używane podczas tego protokołu: czas trwania, prąd i polaryzacja wyładowania oraz ciśnienie, a także wszelkie dodatki w atmosferze.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
9. Utwórz co najmniej jeden protokół negatywnej plamy
<ol>
	<li>W sekcji Protokoły wybierz opcję Plama ujemna. </li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy protokół.</li>
	<li>Wprowadź etykietę protokołu.</li>
	<li>Opisz plamę, podając wartości jej nazwy, pH i stężenia soli metali ciężkich.</li>
	<li>Określ czas inkubacji barwnika przed osuszeniem.</li>
	<li>Wprowadź opis protokołu w postaci tekstu dowolnego.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
10. Zarejestruj co najmniej jeden protokół zamrażania sieci
<ol>
	<li>W sekcji Protokoły wybierz opcję Witryfikacja.</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy protokół.</li>
	<li>Wprowadź etykietę protokołu.</li>
	<li>Wybierz odpowiednią maszynę do witryfikacji z listy rozwijanej.</li>
	<li>Wybierz bibułę używaną w tym protokole.</li>
	<li>Następnie podaj pozostałe informacje eksperymentalne: wilgotność względną, temperaturę, siłę kleksa, liczbę plam, czas blot, czas oczekiwania, czas drenażu, liczbę aplikacji próbki.</li>
	<li>Wprowadź opis tekstowy.</li>
	<li>Kliknij Save. 
	UWAGA: Po skonfigurowaniu protokołów możliwe jest tworzenie zarówno siatek kriogenicznych, jak i siatek barwienia ujemnego. Aby użyć gP2S do rejestrowania kolejnych kroków w przepływie pracy, począwszy od sesji mikroskopowych, konieczne jest skonfigurowanie mikroskopu, detektora elektronów i uchwytu próbki.</li>
</ol>
11. Zarejestruj co najmniej jeden mikroskop
<ol>
	<li>W sekcji Equipment (Sprzęt) wybierz opcję Mikroskop.</li>
	<li>Kliknij przycisk Create New Microscope (Utwórz nowy mikroskop).</li>
	<li>Wpisz etykietę mikroskopu.</li>
	<li>Podaj jego producenta, model i lokalizację.</li>
	<li>Wybierz, które napięcia przyspieszenia są skonfigurowane i mogą być używane w tym mikroskopie, z listy ustawień 80, 120, 200 i 300 kV.</li>
	<li>Określ listę zainstalowanych kondensatorów ("C2") i apertur obiektywu. UWAGA: dla każdego typu można skonfigurować do 4 szczelin przysłony, z których jedna jest wyznaczona jako domyślna przysłona dla tego mikroskopu. W przypadku otworów obiektywu należy wskazać, że jedna lub więcej szczelin jest zajętych przez płytkę fazową, w którym to przypadku parametr średnicy jest wyłączony.</li>
	<li>Należy wskazać, czy mikroskop jest wyposażony w automatyczną ładowarkę, czy też wymaga uchwytu z bocznym wejściem.</li>
	<li>Wskazać, czy mikroskop jest wyposażony w filtr energetyczny.</li>
	<li>Podaj domyślne wartości napięcia ekstrakcji, ustawienia soczewki pistoletu, rozmiaru plamki i szerokości szczeliny filtra energetycznego (jeśli dotyczy). Podane wartości będą używane podczas tworzenia przez użytkowników sesji mikroskopowych.</li>
</ol>
12. Zarejestruj co najmniej jeden detektor elektronów
<ol>
	<li>W sekcji Equipment (Sprzęt) wybierz opcję Electron Detector (Detektor elektronów).</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowy detektor elektronów.</li>
	<li>Wprowadź etykietę, producenta i model.</li>
	<li>Wybierz z listy rozwijanej mikroskop, na którym ten detektor jest zamontowany.</li>
	<li>Dodaj co najmniej jedno powiększenie skalibrowane dla tej kombinacji mikroskopu i detektora:
	<ol>
		<li>W obszarze Powiększenia wybierz pozycję Dodaj nowy.</li>
		<li>Podaj zarówno nominalne, jak i skalibrowane wartości powiększenia.</li>
		<li>Powtórz te kroki dla wszystkich oczekiwanych ustawień powiększenia. Te ustawienia powiększenia będą później dostępne w rozwijanym selektorze dla użytkowników rejestrujących sesje mikroskopowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyj pól wyboru, aby określić, czy detektor jest zdolny do zliczania elektronów, frakcjonowania dawki i super rozdzielczości.</li>
	<li>Na koniec podaj dodatkowe specyfikacje detektora: współczynnik liczby elektronów (średnia liczba zliczeń zarejestrowanych przez elektron padający), wymiar liniowy każdego piksela (w μm) oraz liczbę rzędów i kolumn pikseli.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
13. Jeśli istnieje jeden lub więcej mikroskopów, które wymagają uchwytów na próbki z bocznym wejściem, zarejestruj dostępne uchwyty na próbki w gP2S.
<ol>
	<li>W sekcji Equipment (Sprzęt) wybierz opcję Sample Holder (Uchwyt próbki).</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowego posiadacza.</li>
	<li>Wprowadź etykietę, producenta, model i lokalizację.</li>
	<li>Określić maksymalne nachylenie (w stopniach) uchwytu próbki.</li>
	<li>Użyj pól wyboru, aby określić, czy jest w stanie utrzymać kriogeniczne siatki EM i czy jest w stanie przechylać się w dwóch osiach.</li>
	<li>Z listy rozwijanej wybierz wszystkie mikroskopy, z którymi można używać tego uchwytu. 
	UWAGA: zapewni to, że tylko odpowiedni posiadacze zostaną wymienieni, gdy użytkownicy zarejestrują sesje mikroskopowe za pomocą mikroskopów z bocznym wejściem.</li>
	<li>Kliknij Zapisz.</li>
</ol>
14. Określ wzorzec, który gP2S będzie stosować przy ustawianiu nazwy katalogu powiązanego z każdą sesją Microcopy.
UWAGA: Może być bardzo użyteczne, aby gP2S automatycznie generowało nazwę katalogu do przechowywania danych obrazu zarejestrowanych podczas sesji mikroskopowej. Zapewnia to systematyczne, bogate w informacje nazewnictwo katalogów pamięci masowej. Określ wzorzec, który gP2S będzie przestrzegał przy ustawianiu nazwy katalogu powiązanej z każdą sesją mikroskopową.
<ol>
	<li>W sekcji Administracja wybierz pozycję Ustawienia.</li>
	<li>Edytuj wzorzec nazwy katalogu string. 
	UWAGA: ten ciąg może zawierać następujące zmienne: etykieta projektu, identyfikator siatki, etykieta siatki, etykieta sesji mikroskopowej, identyfikator sesji mikroskopowej, data rozpoczęcia sesji mikroskopowej, godzina rozpoczęcia sesji mikroskopowej i etykieta mikroskopu, rozdzielona znakiem ${}. Poza tymi zmiennymi wzorce nazw katalogów mogą zawierać większość znaków. Domyślny wzorzec nazwy katalogu, na przykład, to ${GridLabel}_${MicroscopyStartDate}_${ProjectLabel}_${MicroscopeLabel}_grid_${GridID}_session_${MicroscopySessionID}. Teraz skonfigurowano wystarczające ustawienia, aby umożliwić rejestrację jednostek eksperymentalnych do sesji mikroskopowych włącznie.</li>
</ol>
15. Zarejestruj oprogramowanie do przetwarzania obrazów dostępne dla użytkowników.
UWAGA: Umożliwi to rejestrację Sesji Przetwarzania oraz późniejszych typów encji (Mapy i Modele).
<ol>
	<li>Wybierz opcję Image Processing (Przetwarzanie obrazu).</li>
	<li>Kliknij Utwórz nowe oprogramowanie do przetwarzania obrazu.</li>
	<li>Wpisz nazwę oprogramowania</li>
	<li>Lista wszystkich wersji dostępnych dla użytkowników:
	<ol>
		<li>W obszarze Wersje oprogramowania wybierz pozycję Dodaj nowy.</li>
		<li>Wprowadź wersję oprogramowania. 
		UWAGA: Umożliwi to użytkownikom dokładne określenie, której wersji oprogramowania używali do uzyskania wyników podczas rejestrowania sesji przetwarzania obrazu. Na tym kończy się niezbędna konfiguracja gP2S. Użytkownicy powinni teraz być w stanie dokładnie uchwycić kluczowe metadane opisujące ich eksperymenty z mikroskopią elektronową, zgodnie z opisem w poniższej sekcji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>High-End Cryo-EMs Worldwide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.google.com/maps/d/u/0/viewer?mid=1eQ1r8BiDYfaK7D1S9EeFJEgkLggMyoaT">https://www.google.com/maps/d/u/0/viewer?mid=1eQ1r8BiDYfaK7D1S9EeFJEgkLggMyoaT</a> (2021).</li>
<li>Renaud, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
<li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199 (3), 225-236 (2017).</li>
<li>Rees, I., Langley, E., Chiu, W., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMEN2%3A+An+Object+Oriented+Database+and+Electronic+Lab+Notebook%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">EMEN2: An Object Oriented Database and Electronic Lab Notebook.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Delagenière, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>dela Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>EMPIAR deposition manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ebi.ac.u/pdbe/emdb/empiar/depostion/manual/#manScipion">https://www.ebi.ac.u/pdbe/emdb/empiar/depostion/manual/#manScipion</a> (2021).</li>
<li>Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPIAR%3A+a+public+archive+for+raw+electron+microscopy+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data.</a> Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).</li>
<li>Vue.js. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://vuejs.org">https://vuejs.org</a> (2021).</li>
<li>Spring Boot. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://spring.io/projects/spring-boot">https://spring.io/projects/spring-boot</a> (2021).</li>
<li>Lightweight Directory Access Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ldap.com">https://ldap.com</a> (2021).</li>
<li>Vue CLI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cli.vuejs.org">https://cli.vuejs.org</a> (2021).</li>
<li>Element, A Desktop UI Library. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://element.eleme.io">https://element.eleme.io</a> (2021).</li>
<li>Sass. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sass-lang.com/">https://sass-lang.com/</a> (2021).</li>
<li>Karma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://karma-runner.github.io/">http://karma-runner.github.io/</a> (2021).</li>
<li>Node.js. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nodejs.org/">https://nodejs.org/</a> (2021).</li>
<li>Java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.java.com/">https://www.java.com/</a> (2021).</li>
<li>Apache Tomcat. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tomcat.apache.org/">http://tomcat.apache.org/</a> (2021).</li>
<li>Hibernate. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hibernate.org">https://hibernate.org</a> (2021).</li>
<li>Swagger UI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://swagger.io/tools/swagger-ui/">https://swagger.io/tools/swagger-ui/</a> (2021).</li>
<li>JUnit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://junit.org/junit4/">https://junit.org/junit4/</a> (2020).</li>
<li>Apache Maven Project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://maven.apache.org/">https://maven.apache.org/</a> (2020).</li>
<li>MySQL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mysql.com/">https://www.mysql.com/</a> (2020).</li>
<li>mongoDB. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mongodb.com/">https://www.mongodb.com/</a> (2020).</li>
<li>Apache license, version 2.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apache.org/licenses/license-2.0">https://www.apache.org/licenses/license-2.0</a> (2004).</li>
<li>mysql Docker Official Image. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/_/mysql">https://hub.docker.com/_/mysql</a> (2021).</li>
<li>mongo Docker Official Image. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/_/mongo">https://hub.docker.com/_/mongo</a> (2021).</li>
<li>openmicroscopy apacheds. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/r/openmicroscopy/apacheds">https://hub.docker.com/r/openmicroscopy/apacheds</a> (2021).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są wykonawcami lub pracownikami firmy Roche lub jej spółki zależnej Genentech.

Przy prawidłowym i konsekwentnym stosowaniu, gP2S pomaga osiągnąć prawidłowe prowadzenie dokumentacji metadanych wysokiej jakości poprzez egzekwowanie rejestrowania krytycznych metadanych eksperymentalnych przy użyciu ustrukturyzowanych modeli danych i zdefiniowanego słownictwa, ale wartość dodana z tego tytułu jest w pełni realizowana tylko wtedy, gdy w laboratorium zostanie osiągnięty wysoki poziom zgodności. Powyższy protokół nie wyjaśnia, w jaki sposób można to osiągnąć. Ustaliliśmy, że skuteczną techniką egzekwowania prawa była odmowa przez operatorów mikroskopów gromadzenia danych o sieciach niezarejestrowanych w gP2S. To bardzo szybko przyczyniło się do wzrostu zgodności i położyło podwaliny pod pojawienie się w ciągu następnych miesięcy dużej ilości szczegółowych i dokładnych szczegółów eksperymentalnych oraz pamięci korporacyjnej. Po kilku miesiącach użytkowania wartość korpusu metadanych przechowywanych w gP2S stała się tak oczywista dla większości użytkowników, że zgodność pozostała wysoka bez wyraźnej interwencji.
Pełne wykorzystanie tej pamięci zbiorowej wymaga, aby metadane przechowywane w gP2S były dostępne dla systemów zewnętrznych i łatwo powiązane z danymi eksperymentalnymi (mikrofotografie) i wynikami (mapy i modele). Powyższy protokół nie opisuje, w jaki sposób zintegrować gP2S z innymi systemami informatycznymi i przetwarzającymi dane. Najprostsze są potencjalne integracje za pośrednictwem backendowego interfejsu API REST gP2S, które nie wymagają żadnej modyfikacji gP2S. Na przykład, każdy komputer sterujący naszymi detektorami zbierającymi dane uruchamia skrypt, który okresowo wysyła zapytanie do punktu końcowego gP2S "getItemByMicroscope" pod kontrolerem REST zarządzania sesjami mikroskopii, aby sprawdzić, czy na jego mikroskopie trwa sesja mikroskopowa. Jeśli tak, skrypt pobiera z gP2S odpowiednią nazwę katalogu przechowywania danych (zgodnie z konfiguracją na stronie Ustawienia, patrz wyżej) i tworzy katalog na lokalnym urządzeniu do przechowywania danych przy użyciu tej nazwy. Zapewnia to systematyczne nazywanie katalogów przechowywania danych i zmniejsza ryzyko błędu z powodu literówek.
Chociaż zostały one skomentowane w źródle publicznej wersji gP2S, możliwe są również dalsze integracje polegające na korzystaniu przez gP2S z danych systemów zewnętrznych. W naszym laboratorium wdrożenie gP2S integruje się z (i) systemem zarządzania projektami, dzięki czemu każdy projekt skonfigurowany w gP2S może być powiązany z projektem portfela obejmującym całą firmę, a metadane z portfela mogą być wyświetlane w gP2S; (ii) system rejestracji białek, tak aby każde białko dodawane do gP2S było połączone, za pomocą identyfikatora przechowywanego lokalnie, z pełnym zestawem zapisów szczegółowo określających pochodzenie białka, w tym szczegółami dotyczącymi odpowiedniej biologii molekularnej, systemu ekspresji i oczyszczania; (iii) system zarządzania związkami małocząsteczkowymi, umożliwiający gP2S wyświetlanie kluczowych informacji o każdym ligandzie, takich jak jego struktura chemiczna. Modyfikacje kodu niezbędne do umożliwienia tych integracji są opisane w sekcji "Integracja" dokumentu README-BUILD.md dostępnego w repozytorium gP2S (https://github.com/arohou/gP2S).
Obecna wersja gP2S ma ograniczenia, z których pierwszym jest zbyt uproszczony model danych i frontend do depozycji struktury (Modelu). Zostało to celowo pozostawione w stanie "podstawowym" w wydanej wersji gP2S, ponieważ obecnie opracowywana jest pełnoprawna funkcja osadzania i walidacji struktury wraz ze wsparciem dla krystalografii rentgenowskiej. Kolejną decyzją projektową było nieimplementowanie żadnego systemu uprawnień ani przywilejów: wszyscy użytkownicy w gP2S mają równy dostęp do jego funkcji i danych. Może to sprawić, że będzie to zły wybór dla obiektów, które obsługują grupy użytkowników o konkurencyjnych interesach i wymaganiach dotyczących poufności, ale nie było to problemem dla naszego obiektu.
Rozwój naszej wewnętrznej wersji gP2S jest w toku i mamy nadzieję, że opisana tutaj wersja open-source będzie przydatna dla innych grup cryoEM, a niektóre z nich mogą wnieść sugestie lub ulepszenia kodu w przyszłości. Przyszłe osiągnięcia o wysokiej wartości mogłyby na przykład koncentrować się na integracji ze sprzętem laboratoryjnym (roboty do witryfikacji, mikroskopy elektronowe), oprogramowaniem (np. do zbierania metadanych przetwarzania obrazu) i zewnętrznymi repozytoriami publicznymi (np. w celu ułatwienia osadzania struktur).
Systematyczne gromadzenie wysokiej jakości metadanych, które jest możliwe dzięki rutynowemu stosowaniu gP2S w laboratorium i kriozaplecie, może mieć znaczący, pozytywny wpływ na zdolność do równoległego prowadzenia wielu projektów na przestrzeni lat. Przewidujemy, że wraz z powstawaniem coraz większej liczby współdzielonych i scentralizowanych grup i obiektów krioEM, zapotrzebowanie na systemy zarządzania informacjami, takie jak gP2S, będzie nadal rosło.

Zarządzanie informacjami w obiektach krioelektromagnetycznych 
Począwszy od około 2014 roku, liczba obiektów kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryoEM)1 gwałtownie wzrosła, z co najmniej 300 wysokiej klasy systemami zainstalowanymi na całym świecie2, w tym w wielu firmach farmaceutycznych, co odzwierciedla rosnącą rolę cryoEM w odkrywaniu leków3. Misje tych obiektów i ich wymagania dotyczące śledzenia danych i zarządzania nimi różnią się4. Niektóre, na przykład krajowe centra krioelektromagnetyczne, są odpowiedzialne za odbieranie siatek EM, gromadzenie zestawów danych i zwracanie danych do użytkowników w celu określenia struktury, być może po zautomatyzowanym przetwarzaniu obrazu. W takich obiektach śledzenie pochodzenia siatki, jej powiązania z propozycją użytkownika lub grantem oraz rodowodem od siatki do zbioru danych ma kluczowe znaczenie, ale inne czynniki, takie jak metoda oczyszczania próbki białka lub ostateczny proces określania struktury, są mniej istotne lub nie mają go wcale. W innych obiektach, takich jak lokalne placówki akademickie, każdy użytkownik końcowy jest odpowiedzialny za przygotowanie własnych próbek i siatek, przeprowadzenie mikroskopii, zarządzanie surowymi danymi i ich przetwarzanie oraz publikowanie wyników. Nie ma rygorystycznej potrzeby śledzenia metadanych ze strony takiej placówki, ponieważ rolę tę pełni użytkownik końcowy lub jego główny badacz.
W naszym ośrodku krioelektromagnetycznym, obsługa i optymalizacja próbek, siatek, protokołów zbierania i przetwarzania danych oraz wyników (map, modeli) jest scentralizowana w wielu projektach dla małej grupy praktyków. Stanowi to wyzwanie w zarządzaniu eksperymentalnymi (meta)danymi. Eksperymentalne pochodzenie struktur, od modelu atomowego aż do dokładnej tożsamości białek i ligandów, poprzez parametry przygotowania siatki i protokoły gromadzenia danych, musi być dokładnie uchwycone i zachowane. Metadane te muszą zostać udostępnione pewnej liczbie podmiotów gospodarczych. Na przykład osoba zajmująca się przetwarzaniem obrazu może potrzebować wiedzieć, jaki konstrukt białka został użyty i jakie były parametry obrazowania, nawet jeśli ani nie oczyściła białka, ani sama nie zebrała danych krioEM; Systemy informatyczne, takie jak demony zautomatyzowanego zarządzania daemonem, muszą zidentyfikować projekt, dla którego mikroskop aktualnie zbiera dane, aby prawidłowo i systematycznie przypisywać nazwy katalogów.
Dostępnych jest kilka systemów zarządzania informacjami do obsługi urządzeń krioEM. Być może najbardziej kompletnym z nich jest EMEN25, który łączy w sobie cechy elektronicznego notatnika laboratoryjnego, systemu zarządzania informacjami i niektórych elementów narzędzia do zarządzania procesami biznesowymi. Używany w wielu synchrotronach, ISPyB6, pierwotnie zbudowany do obsługi linii rentgenowskich do krystalografii, teraz obsługuje również zbieranie danych krioEM. Scipion7 to bogaty i potężny pakiet do przetwarzania obrazów, który pozwala użytkownikom rejestrować przepływy pracy związane z przetwarzaniem obrazów i udostępniać je, na przykład za pośrednictwem publicznego repozytorium EMPIAR8,9, a także jest zintegrowany z ISPyB, aby umożliwić przetwarzanie danych cryoEM w locie.
Tutaj opisujemy gP2S (od Genentech Protein to Structure), nowoczesny i lekki system zarządzania informacjami krioEM, zbudowany w celu wspierania przepływu pracy od oczyszczonego białka i liganda małocząsteczkowego do końcowego modelu atomowego.
Przegląd gP2S 
gP2S to przyjazny dla użytkownika internetowy system zarządzania informacjami krioelektromagnetycznymi, który ułatwia dokładne prowadzenie dokumentacji w laboratoriach krioelektromagnetycznych oraz obiektach z wieloma użytkownikami i wieloma projektami. Śledzone są następujące jednostki, ich relacje i powiązane metadane: projekty, sprzęt, materiały eksploatacyjne, protokoły, próbki, siatki, sesje mikroskopowe, sesje przetwarzania obrazów, mapy i modele atomowe. Użytkownicy mogą również dodawać komentarze tekstowe, opcjonalnie dołączając załączniki, co pozwala na bogate dodawanie adnotacji do dowolnego podmiotu zarejestrowanego w gP2S. Interfejs został zaprojektowany tak, aby ułatwić korzystanie z urządzeń z ekranem dotykowym i został szeroko przetestowany na 12,9-calowych iPadach Pro, umożliwiając korzystanie z gP2S na stanowisku laboratoryjnym podczas przygotowywania próbek i siatek (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1), a także przy komputerze podczas obsługi mikroskopu, przetwarzania obrazów lub deponowania modeli. Każda strona w interfejsie użytkownika ma na celu ograniczenie ręcznego wprowadzania danych poprzez wstępne ustawienie parametrów na rozsądne wartości domyślne, jeśli to możliwe.
Backend gP2S posiada szereg punktów końcowych REST API (REpresentational State Transfer Application Programming Interface), co umożliwia integrację gP2S z istniejącymi przepływami pracy i skryptami. Model danych został zaprojektowany tak, aby umożliwić dokładne uchwycenie procesów pracy związanych z barwieniem ujemnym i krioelektromagnetycznym, w tym rozgałęzianie, na przykład z jedną próbką używaną na kilku siatkach, dane z kilku sesji mikroskopowych łączone w jedną sesję przetwarzania danych lub jedną sesję przetwarzania danych dającą kilka map.
Architektura systemu 
gP2S to klasyczna aplikacja trójwarstwowa (Rysunek 2). W tej modułowej architekturze system jest podzielony na trzy oddzielne warstwy, z których każda odpowiada za wykonywanie odrębnych obowiązków, a każda z nich może być wymieniana lub modyfikowana niezależnie od pozostałych. (1) Warstwa prezentacji (lub frontend) zapewnia użytkownikowi dostęp przez przeglądarkę internetową (szeroko przetestowaną z przeglądarkami Chrome i Safari), umożliwia tworzenie i modyfikowanie elementów przepływu pracy (w tym walidację danych) oraz wyświetlanie danych eksperymentalnych w postaci pojedynczych jednostek, list opartych na projektach i pełnych raportów przepływu pracy. (2) Warstwa usług (lub backend) służy jako warstwa pośrednicząca między interfejsem użytkownika a systemem pamięci masowej - zawiera podstawową logikę biznesową, udostępnia API usługi używane przez frontend, integruje się z magazynem danych i systemem LDAP (Lightweight Directory Access Protocol) do uwierzytelniania użytkowników oraz stanowi podstawę do dodatkowej integracji z systemami zewnętrznymi. (3) Warstwa trwałości (dostęp do danych) jest odpowiedzialna za przechowywanie danych eksperymentalnych, komentarzy użytkowników i załączników plików.
Kluczowe technologie i frameworki 
Aby ułatwić rozwój, budowę i utrzymanie aplikacji gP2S, w projekcie wykorzystano kilka technologii i frameworków. Najważniejsze z nich to: Vue.js 2.4.210 dla frontendu oraz SpringBoot 1.311 z wbudowanym serwerem Tomcat 8 dla backendu. Aplikacja korzysta z baz danych MySQL 5.7 i MongoDB 4.0.6 do przechowywania oraz LDAP12 do uwierzytelniania. Domyślnie wszystkie te części składowe są dostarczane i wdrażane jako jedna aplikacja.
W sumie aplikacja korzysta z setek różnych bibliotek, bezpośrednio lub pośrednio. Najbardziej znane z nich wymieniono w tabeli 1.
Model danych 
W modelu danych gP2S można wyróżnić trzy typy jednostek (<silna klasa="xfig">Rysunek 3): jednostki przepływu pracy związane z danymi zebranymi podczas eksperymentów (np. próbki lub sesje mikroskopowe); sprzęt i jednostki protokołu, które opisują dane, które są wspólne dla wszystkich projektów (np. mikroskopy lub protokoły witryfikacji); inne podmioty, które odgrywają rolę pomocniczą lub techniczną w systemie (np. komentarze lub wartości domyślne).
Korzeniem drzewa danych przepływu pracy jest encja Projektu. Każdy projekt składa się z pewnej liczby białek i/lub ligandów, które są elementami budulcowymi do tworzenia jednostek próbki. Każda próbka może być użyta do stworzenia wielu siatek, które z kolei są używane w sesjach mikroskopowych (jedna siatka na sesję mikroskopową). Te ostatnie są przypisywane do sesji przetwarzania, które mogą dać jedną lub więcej map. Ostatnim elementem w drzewie jest model atomowy, utworzony przy użyciu jednej lub wielu map. W związku z tym każda jednostka związana z przepływem pracy, od białka do modelu, jest zawsze związana z konkretnym projektem poprzez swoich przodków. Taki projekt tworzy agregacje danych, które są łatwe do przetworzenia zarówno przez moduł frontendowy, jak i przez zewnętrzne systemy wykorzystujące API.
Oprócz danych dotyczących przepływu pracy istnieją jednostki opisujące sprzęt używany w eksperymentach lub protokoły, które były przestrzegane podczas przygotowywania siatek. Zdefiniowanie tych jednostek jest warunkiem wstępnym do tworzenia eksperymentalnych jednostek przepływu pracy, takich jak siatki, mikroskopia i sesje przetwarzania.
Ostatni typ jednostki danych, zbiorczo nazwany jako "Inne", jest używany do celów technicznych (np. załączniki do plików lub wartości domyślne). Ta kategoria zawiera encje komentarzy, które można połączyć z dowolnymi encjami przepływu pracy lub sprzętu/protokołu.
Dostępność oprogramowania 
Wersja gP2S o otwartym kodzie źródłowym jest dostępna na licencji Apache w wersji 2.026, od https://github.com/arohou/gP2S. Obraz platformy Docker do uruchamiania usługi gP2S jest dostępny w https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s. Gałąź gP2S o zamkniętym kodzie źródłowym jest nadal rozwijana w Roche & Genentech.
Uruchamianie aplikacji gP2S 
Istnieją dwa sposoby uruchamiania gP2S: jako kontener platformy Docker lub jako autonomiczna aplikacja Java. Optymalny wybór będzie zależał od docelowego środowiska wdrożenia. Na przykład, jeśli pożądana jest możliwość dostosowania lub ulepszenia kodu do konkretnych potrzeb użytkowników, najpierw należy ponownie skompilować całą aplikację. W takim przypadku może być zalecane uruchomienie gP2S jako samodzielnej aplikacji.
Kontener platformy Docker 
Najprostszym sposobem na rozpoczęcie pracy z aplikacją gP2S jest uruchomienie jej jako usługi Docker. W tym celu został przygotowany dedykowany obraz Dockera, który został opublikowany w repozytorium Docker Hub ("https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s"). Uruchomienie obrazu gP2S jest uzależnione od dostępu do baz danych MySQL i MongoDB oraz do serwera LDAP. W przypadku środowiska nieprodukcyjnego zaleca się uruchamianie wszystkich tych zależności jako wielokontenerowych aplikacji Docker wraz z aplikacją gP2S. Aby wszystko przebiegło bezproblemowo, w repozytorium gP2S GitHub (https://github.com/arohou/gP2S) został przygotowany plik docker-compose (https://github.com/arohou/gP2S/blob/master/docker-compose.yml), który zawiera wszystkie potrzebne konfiguracje środowiska końcowego. Następujące obrazy dockera są zależnościami: mysql27, mongodb28, apacheds29.
W domyślnej konfiguracji wszystkie przechowywane dane, zarówno jednostki, jak i załączniki zostaną usunięte po usunięciu kontenerów docker. W celu przechowywania danych należy albo korzystać z woluminów docker, albo aplikacja gP2S powinna być podłączona do dedykowanych instancji bazodanowych (MySQL i MongoDB). Kontener serwera LDAP ApacheDS jest dostarczany ze wstępnie skonfigurowanym użytkownikiem administracyjnym (hasło: tajne). Te poświadczenia powinny być używane do logowania się do aplikacji gP2S, gdy jest ona uruchamiana jako usługa Docker. W przypadku środowisk produkcyjnych ten sam plik docker-compose może być używany do wdrażania gP2S (i innych kontenerów w razie potrzeby) jako usług dla platformy orkiestracji kontenerów Docker Swarm.
Pełny proces uruchamiania gP2S jako kontenera Dockera, w tym wszystkie szczegóły dotyczące poprawnej konfiguracji, jest opisany w repozytorium GitHub gP2S i obejmuje następujące tematy:
• Uruchamianie aplikacji gP2S z dockerized ze wszystkimi zależnościami. 
• Dostęp do aplikacji gP2S, bazy danych i LDAP. 
• Aktualizacja usługi gP2S do nowej wersji. 
• Usuwanie gP2S application. 
• Konfigurowanie trwałości danych. 
• Podłączenie dockerowanej aplikacji gP2S do dedykowanych baz danych lub serwera LDAP. 
• Szczegóły konfiguracji
Samodzielna aplikacja Java 
Inną opcją uruchomienia aplikacji gP2S jest zbudowanie samodzielnego pakietu Java. Takie podejście należy zastosować, jeśli uruchamianie kontenerów Docker nie jest możliwe. Kompilowanie aplikacji gP2S wymaga zainstalowania zestawu Java Development Kit w wersji 8 lub nowszej. Cały proces budowania jest zarządzany przez narzędzie Maven, które jest dostępne w bazie kodu w repozytorium GitHub. Konfiguracja kompilacji jest przygotowywana tak, aby najpierw zbudować część frontendową, następnie skopiować ją do źródeł backendowych, a następnie zbudować jako ostateczną aplikację. W ten sposób nie ma potrzeby instalowania żadnych innych narzędzi czy bibliotek w celu przygotowania w pełni funkcjonalnego pakietu gP2S. Domyślnie wynikiem kompilacji jest pakiet JAR (przechowywany lokalnie) i obraz platformy Docker (wypchnięty do repozytorium skonfigurowanego w pliku Maven pom.xml). Należy pamiętać, że informacje wymagane do połączenia z systemami zewnętrznymi (bazami danych i serwerem LDAP) muszą być podane w odpowiednim pliku konfiguracyjnym przed zbudowaniem pakietu.
Po utworzeniu pakietu JAR gP2S, zawiera on wszystkie zależności i informacje konfiguracyjne potrzebne do uruchomienia aplikacji, w tym serwer aplikacji Tomcat, na którym znajduje się system. Jeśli pakiet został zbudowany z wieloma plikami konfiguracyjnymi, może być uruchamiany w różnych trybach bez ponownego kompilowania.
Repozytorium gP2S GitHub zawiera pełny opis procesu budowania i uruchamiania gP2S jako samodzielnej aplikacji i obejmuje następujące tematy:
• Budowanie gP2S za pomocą narzędzia Maven 
• Budowanie i uruchamianie z wbudowanymi bazami danych 
• Kompilowanie i uruchamianie z zależnościami wdrożonymi jako kontenery platformy Docker 
• Budowanie i uruchamianie z dedykowanymi bazami danych 
• Konfiguracja uwierzytelniania

gp2s, system zarządzania informacjami dla eksperymentów krioelektromagnetycznych

gP2S, an Information Management System for CryoEM Experiments

Kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryoEM) stała się integralną częścią wielu projektów związanych z odkrywaniem leków, ponieważ krystalografia docelowego białka nie zawsze jest osiągalna, a cryoEM stanowi alternatywny sposób wspierania projektowania ligandów opartych na strukturze. W przypadku dużej liczby odrębnych projektów, a w ramach każdego projektu potencjalnie dużej liczby współstruktur ligand-białko, dokładne prowadzenie dokumentacji szybko staje się wyzwaniem. Wiele parametrów eksperymentalnych jest dostrajanych dla każdego celu, w tym na etapie przygotowania próbki, przygotowania siatki i mikroskopii. W związku z tym dokładne prowadzenie dokumentacji może mieć kluczowe znaczenie dla zapewnienia długoterminowej odtwarzalności i ułatwienia efektywnej pracy zespołowej, zwłaszcza gdy etapy przepływu pracy cryoEM są wykonywane przez różnych operatorów. Aby pomóc w sprostaniu temu wyzwaniu, opracowaliśmy internetowy system zarządzania informacjami dla cryoEM, nazwany gP2S. 
Aplikacja śledzi każdy eksperyment, od próbki do końcowego modelu atomowego, w kontekście projektów, których lista jest przechowywana w aplikacji lub zewnętrznie w oddzielnym systemie. Zdefiniowane przez użytkownika, kontrolowane słownictwo materiałów eksploatacyjnych, sprzętu, protokołów i oprogramowania pomaga opisać każdy etap przepływu pracy cryoEM w uporządkowany sposób. gP2S jest szeroko konfigurowalny i, w zależności od potrzeb zespołu, może istnieć jako samodzielny produkt lub być częścią szerszego ekosystemu aplikacji naukowych, integrując się za pośrednictwem REST API z narzędziami do zarządzania projektami, aplikacjami śledzącymi produkcję białek lub ligandów drobnocząsteczkowych lub aplikacjami automatyzującymi gromadzenie i przechowywanie danych. Użytkownicy mogą rejestrować szczegóły każdej sesji siatki i mikroskopii, w tym kluczowe metadane eksperymentalne i wartości parametrów, a także rejestrowane jest pochodzenie każdego artefaktu eksperymentalnego (próbki, siatki, sesji mikroskopowej, mapy itp.). gP2S służy jako eksperymentalny organizator przepływu pracy cryoEM, który umożliwia dokładne prowadzenie dokumentacji przez zespoły i jest dostępny na licencji open source.

gP2S to aplikacja internetowa do śledzenia eksperymentów krioelektromagnetycznych. Opisano jego główne funkcje, a także kroki wymagane do zainstalowania i skonfigurowania aplikacji. Po skonfigurowaniu aplikacja pozwala na dokładne rejestrowanie metadanych związanych z eksperymentami z barwieniem ujemnym i krioEM.

gP2S, system zarządzania informacjami dla eksperymentów krioelektromagnetycznych

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has become an integral part of many drug-discovery projects because crystallography of the protein target is not ...

Aby zalogować się do gP2S, wpisz swoją nazwę użytkownika i hasło. Po lewej stronie znajduje się pasek nawigacyjny, który składa się z selektora projektu i zestawu elementów nawigacyjnych, który zawiera listę typów jednostek eksperymentalnych przepływu pracy CryoEMEM, próbki składające się z białek lub ligandów lub kombinacji tych dwóch, siatki, sesje mikroskopowe, sesje przetwarzania, mapy i modele. Ostatnim elementem na pasku nawigacyjnym jest link do sekcji ustawień aplikacji.W tym miejscu będziesz mógł dodać szereg encji, które pozwolą Ci nagrywać eksperymenty w gP2S. Wypełnienie go dostarczy informacji dla różnych list rozwijanych do użycia w całym systemie. Towarzyszący manuskrypt zawiera szczegółowe informacje o tym, jak zainstalować i skonfigurować gP2S, aby można go było używać do rejestrowania eksperymentów.W tym filmie ilustrujemy tylko jeden z kroków konfiguracji, jak zarejestrować uchwyt na próbki kriogeniczne, a następnie bardziej szczegółowo, w jaki sposób użytkownicy mogą rejestrować eksperymenty w gP2S. Uchwyty na próbki można skonfigurować po zarejestrowaniu mikroskopów, przechodząc do sekcji uchwytów na próbki. Podczas rejestracji nowego uchwytu na próbkę należy określić, z którym ze skonfigurowanych mikroskopów może on być używany i czy może być używany do kriogenicznych próbek.Aplikacja gP2S jest zorientowana na projekty. Oznacza to, że encja przepływu pracy może zostać utworzona tylko w kontekście projektu. Odpowiedni projekt musi zostać wybrany z listy rozwijanej.Po wybraniu projektu liczba encji każdego typu, które są skojarzone z tym projektem, jest wyświetlana w sekcji przepływu pracy. Widać, że w tym konkretnym przypadku zarejestrowano 89 próbek, 203 siatki, 80 sesji mikroskopowych, pięć sesji przetwarzania, siedem map i dwa modele. Po kliknięciu dowolnego typu jednostki przepływu pracy, na przykład sesji mikroskopowych, zostanie wyświetlona lista tych jednostek.Ta lista składa się z etykiety. Może być również flaga, jak w tym przypadku, aby pokazać, czy była to sesja mikroskopii kriogenicznej, czy mikroskopii barwień ujemnych, oraz do sześciu kluczowych pól metadanych. W przypadku sesji mikroskopowej można zobaczyć, jaka siatka została zobrazowana, liczba zebranych obrazów, daty rozpoczęcia i zakończenia sesji oraz jaki mikroskop i detektor zostały użyte.Wybranie jednego z wymienionych podmiotów otwiera stronę szczegółów, która zawiera listę wszystkich dostępnych informacji dla tego elementu, co w przypadku sesji mikroskopowych jest bardzo dużo. Pod szczegółami mikroskopii znajduje się lista podsumowująca wszystkie jednostki przodków, takie jak siatki i próbki. Pozwala to na bardzo szybką nawigację po pochodzeniu wyświetlanej jednostki.Przejdźmy do modeli, aby lepiej to zobrazować. Na koniec każdy element w gP2S można skomentować, wybierając komentarze. Jak widać w przypadku tego konkretnego modelu, jeden komentarz już istnieje.Kliknięcie na nią pokazuje, kto i kiedy ją stworzył. Możesz dodać kolejny komentarz, wprowadzając dowolny tekst i opcjonalnie dołączając jeden lub więcej plików. Teraz, gdy zwiedziliśmy już główną część aplikacji, pokażemy, jak rejestrować jednostki eksperymentalne podczas eksperymentu CryoEM.W pierwszym kroku przepływu pracy zostaniesz poproszony o opisanie swojej próbki. Aby to zrobić, musisz najpierw zdefiniować co najmniej jeden składnik, białko lub ligand. Dodanie nowego białka wymaga jedynie etykiety białka, ale aby pomóc w lepszym opisie białka, można również dodać identyfikator oczyszczania.Pole to może zawierać numer partii lub służyć jako miejsce na etykietę z kodem kreskowym. Jeśli gP2S został dostosowany do integracji z systemem rejestracji białek, identyfikator PUR może zostać automatycznie zweryfikowany i wykorzystany do pobrania i wyświetlenia szczegółowych informacji o tej partii białka. W przypadku ligandów etykieta i stężenie w stadzie są obowiązkowe, a dwa inne pola są nieobowiązkowe: pojęcie i identyfikator partii.Próbka jest definiowana przez dowolną kombinację białek i ligandów oraz ich końcowe stężenia. W naszym przypadku stworzymy próbkę, która zawiera jedno białko, które zostało wcześniej zarejestrowane w gP2S. Komponenty są łatwe do znalezienia dzięki rozwijanej liście rozwijanej z możliwością wyszukiwania.Jeśli nie znajdziesz swojego komponentu, możesz utworzyć go od podstaw na tym etapie. Opcjonalnie można również określić inne szczegóły eksperymentalne próbki, takie jak czas i temperatura inkubacji, bufor oraz opis protokołu w postaci dowolnego tekstu. Gdy próbka jest gotowa i tworzysz siatki, przejdź do siatek i utwórz nową kriowanż.Wybierz typ siatki i zastosowany protokół obróbki powierzchni, na przykład protokół wyładowań jarzeniowych. Następnie wskaż, czy przygotowujesz kriografię, czy siatkę do barwienia ujemnego i wybierz jeden ze wstępnie skonfigurowanych protokołów witryfikacji z listy rozwijanej. Następnie wybierz z listy rozwijanej próbkę, którą zastosowałeś do siatki.Jeśli zdecydujesz się rozcieńczyć lub zagęścić wybraną próbkę, użyj przełącznika i określ odpowiedni współczynnik rozcieńczenia lub stężenia. Należy również określić objętość zastosowaną do siatki i opcjonalnie zarejestrować czas inkubacji. Na koniec musisz zdefiniować lokalizację magazynowania w sieci.Jeśli chcesz, zmień domyślną etykietę i zapisz siatkę. Po zarejestrowaniu siatek będzie można zarejestrować eksperymenty związane z gromadzeniem danych, tworząc sesję mikroskopową. Formularz składa się z czterech sekcji: podstawowe informacje, ustawienia mikroskopu, ustawienia ekspozycji i sterowanie mikroskopem.Pierwsza sekcja zawiera podstawowe informacje, etykietę, zmień wartość domyślną, jeśli chcesz. Zwróć uwagę, że system automatycznie wypełnia datę i godzinę rozpoczęcia. Data i godzina zakończenia są opcjonalne, ponieważ prawdopodobnie będziesz rejestrować sesję mikroskopową, gdy eksperyment jest nadal w toku.Jeśli znasz datę i godzinę zakończenia, możesz wpisać ją ręcznie lub użyć przycisku teraz, aby wprowadzić bieżącą. Następnie wybierz, jaka siatka została zobrazowana i jaki mikroskop został użyty. Domyślnie wstępnie wybrany jest mikroskop ostatnio używany w bieżącym projekcie.Wybierz detektor i opcjonalnie, ile obrazów zostało zebranych. Trzecia część sesji mikroskopowej zawiera informacje o ustawieniach ekspozycji. W tej sekcji rejestrowane są następujące metadane: powiększenie, rozmiar plamki, średnica oświetlanego obszaru, szybkość ekspozycji, czas trwania ekspozycji i liczba klatek.Należy wskazać, czy zastosowano nanosondę, tryb zliczania, frakcjonowanie dawki i super rozdzielczość. Są one włączone tylko wtedy, gdy wybrany mikroskop i detektor mają te funkcje. Po wprowadzeniu współczynnika kategoryzacji pikseli, jeśli taki istnieje, na bieżąco obliczana jest i wyświetlana liczba parametrów ważnych eksperymentalnie.Praca związana z przetwarzaniem obrazu jest rejestrowana w sesji przetwarzania. Każda sesja przetwarzania jest powiązana z co najmniej jedną sesją mikroskopową, którą można wybrać z listy rozwijanej. Możesz dodać więcej sesji mikroskopowych, jeśli podczas przetwarzania scalisz dane z kilku sesji.Należy również wskazać, które pakiety oprogramowania były używane, wybierając etykietę oprogramowania i jego wersję. Jest też miejsce na kilka powiązanych notatek. Musisz podać liczbę mikrofotografii i pobranych cząstek.Możesz również zapisać nazwę katalogu lub pełną ścieżkę, w której wykonałeś przetwarzanie. Po uzyskaniu jednej lub więcej rekonstrukcji trójwymiarowych mapy można zdeponować w gP2S. Każda mapa jest skojarzona z sesją przetwarzania i składa się z rzeczywistego pliku mapy.gP2S pozwala na dowolny typ pliku. Wprowadź kluczowe metadane, takie jak rozmiar piksela, zalecany poziom konturu dla renderowania powierzchni, zastosowana symetria, liczba obrazów użytych do utworzenia mapy oraz szacowana rozdzielczość w jej najlepszych częściach, średnia rozdzielczość globalna i rozdzielczość w najgorszych częściach. Podobnie jak w tym przypadku, w wielu częściach gP2S reguły walidacji sprawdzają dane wejściowe pod kątem oczywistych błędów.Mapy mogą być ze sobą powiązane przy użyciu różnych typów relacji. Rejestrując takie stowarzyszenie, należy wybrać rodzaj relacji i powiązaną mapę. Po uzyskaniu modelu atomowego można go zdeponować w gP2S.Dodaj plik modelu, rozdzielczość i mapę lub listę map, na podstawie których powstał model. Dodatkowo możliwe jest wskazanie, że model jest udoskonaloną wersją wcześniej zdeponowanego modelu. Zmień etykietę i zapisz rekord.W przypadku współpracy z innymi badaczami, którzy nie mają dostępu do aplikacji, może być konieczne wygenerowanie dokumentów podsumowujących, które można następnie udostępnić. W tym celu gP2S udostępnia funkcjonalność raportu. Spowoduje to wygenerowanie pliku PDF do wydrukowania, który zawiera wszystkie metadane opisujące jednostkę i każdą z jej encji nadrzędnych, w tym wszystkie komentarze.Cecha ta jest szczególnie cenna po osadzaniu modelu, ponieważ wszystkie dane i metadane śledzące rodowód końcowego modelu atomowego aż do określonych partii ligandów białek i małych cząsteczek za pomocą sesji mikroskopowych i siatek są dostępne w jednolitym dokumencie. Plik PDF można jednak wygenerować z dowolnej strony widoku szczegółów. Jak widać, gP2S umożliwia śledzenie różnych encji, które są dobrze ustrukturyzowane i łatwe w nawigacji.Jak pokazano wcześniej, walidacja danych podczas rejestrowania określonych encji przyczynia się do wyższej jakości metadanych niż może to być osiągalne w przypadku klasycznych arkuszy kalkulacyjnych lub notatników. Dziękuję za oglądanie. Mamy nadzieję, że ten film zachęci Cię do wypróbowania gP2S jako systemu zarządzania informacjami laboratoryjnymi w Twoim laboratorium CryoEM.

gp2s-an-information-management-system-for-cryoem-experiments

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek wymaga odpowiedniego pakietu oprogramowania i przyjaznego dla użytkownika potoku do wysokowydajnej automatycznej akwizycji danych. W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie w pełni zautomatyzowanego pakietu oprogramowania do akwizycji obrazu, Latitude-S, oraz praktycznego potoku do gromadzenia danych o zeszklonych biomolekułach w warunkach niskich dawek.

Przyjazne dla użytkownika, wysokowydajne i w pełni zautomatyzowane oprogramowanie do akwizycji danych do mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

S1P wywiera swoje różnorodne efekty fizjologiczne poprzez podrodzinę receptorów S1P (S1PRs). W tym miejscu opisano potok w celu wyjaśnienia struktur i funkcji S1PR.

Rurociąg do badania struktur i szlaków sygnałowych receptorów sfingozyno-fosforanowych

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Badanie przesiewowe z użyciem wielu siatek w mikroskopii krioelektronowej (cryoEM) jest często żmudnym procesem, który wymaga wielu godzin uwagi. Ten protokół pokazuje, jak skonfigurować standardową kolekcję Leginon i Smart Leginon Autoscreen, aby zautomatyzować ten proces. Protokół ten można zastosować do większości dziurawych siatek foliowych cryoEM.

Automatyzacja badań przesiewowych pod mikroskopią krioelektronową w wielu sieciach przy użyciu Smart Leginon

Poznaj system gP2S do zarządzania eksperymentami krioelektronowymi w biologii strukturalnej. Ta metoda umożliwia śledzenie próbek, sesji mikroskopowych i modeli atomowych.

gP2S, system zarządzania informacjami dla eksperymentów krioelektromagnetycznych

Przeglądaj więcej filmów