Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Protokół ten umożliwia każdemu przeprowadzanie eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET w celu zmierzenia dokładnych odległości bezwzględnych w biomolekułach za pomocą smfBox, który jest tanim, solidnym instrumentem o otwartym kodzie źródłowym. smFRET pozwala spojrzeć na jedną cząsteczkę na raz, a nie średnio na wiele miliardów cząsteczek, dzięki czemu można scharakteryzować różne konformacje, które przyjmują. Piękno tej metody polega na tym, że można ją wykorzystać do rzucenia światła na strukturę i dynamikę wielu układów biomolekularnych.

Na przykład fałdowanie białek, interakcje białkowe DNA i allosteria DNA. Przed rozpoczęciem analizy uruchom centrum sterowania laserem i upewnij się, że wybrano tryb prądu przemiennego o stałym prądzie ciągłym fali. Włącz oba lasery.

Uruchom oprogramowanie do akwizycji smOTTER i potwierdź, że każdy instrument jest poprawnie skonfigurowany. Aby wyrównać ścieżkę emisji, umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie i ostrożnie umieść czystą szklankę nakrywkową na soczewce obiektywu, opuszczając ją pod kątem do oleju, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza między szkłem nakrywkowym a obiektywem. Następnie dodaj 10 mikrolitrów 100 nanomolowego barwnika Cy3B na środek szkła nakrywkowego.

W panelu cykli pracy lasera ustaw laser dawczy na wyzerowanie, 45 włączone i 55 wyłączone. Ustaw laser akceptorowy na 50 wyłączone, 45 włączone i pięć wyłączone. Ustaw naprzemienne wzbudzenie lasera lub okres ALEX na 100 mikrosekund.

Otwórz kartę Z fokus. W panelu akwizycji przełącz lasery na żywo i uruchom kamerę. Dostosuj ekspozycję tak, aby jasny punkt był widoczny centralnie otoczony czarnym tłem.

Zaczynając od niskiej pozycji Z, zwiększaj wysokość, aż jasny punkt osiągnie swój minimalny rozmiar. Następnie podnieś wysokość do dodatkowych 20 mikrometrów, aby skupić laser w próbce nad olejem i szkłem nakrywkowym. Gdy próbka znajdzie ostrość, zatrzymaj aparat.

W centrum sterowania omikronem zmniejsz moc zielonego lasera, jednocześnie monitorując skalę osi y w zakładce wyrównania smOTTER, aż do momentu zaobserwowania odczytu z obu detektorów, zmieniając skalę w razie potrzeby. Następnie odkręć cztery z przodu smfBoxa, aby zdjąć panel przedni. Aby wyrównać otworek, przekręć pokrętło X na pozycjonerze otworkowym, obserwując sygnał na zaczepie wyrównującym, aby zwiększyć sygnał na zielono i czerwono.

Obróć pokrętło Y, aby wyrównać otwór w przeciwnym kierunku, a następnie wróć do pokrętła X, aby sprawdzić, czy sygnał nie uległ dalszemu wzrostowi. Aby wyrównać soczewkę otworkową, obróć pokrętło X obiektywu w jednym kierunku, aby zmniejszyć sygnał, a następnie obróć pokrętło X w tym samym kierunku, aby przywrócić sygnał do pierwotnego poziomu. Jeśli nowy maksymalny sygnał jest wyższy niż wcześniej, kontynuuj iteracyjne przesuwanie zarówno pokręteł otworkowych, jak i obiektywu w tym kierunku.

Jeśli sygnał jest niższy niż wcześniej, iteracyjnie przesuń pokrętła w przeciwnym kierunku, a następnie powtórz wyrównanie za pomocą pokręteł Y otworka i soczewki. Aby wyrównać soczewkę fotodiody lawinowej, zaczynając od zielonej fotodiody lawinowej, przesuwaj pokrętło X, aż zielony sygnał osiągnie maksimum. Powtórz modyfikację sygnału dla pokrętła Y.

Wróć do pokrętła X, poruszając się w przód iw tył, aby znaleźć punkty progowe, w których sygnał zaczyna spadać. Pozostaw sygnał w pozycji w połowie odległości między tymi dwoma punktami. Znajdź połowę położenia pokrętła Y i powtórz wyrównanie dla czerwonej fotodiody lawinowej.

Przed analizą pierwszej próbki wyczyść stolik chusteczką do czyszczenia soczewek nasączoną metanolem, delikatnie przecierając obiektyw od jednego końca do drugiego i nałóż trzy do czterech kropli olejku immersyjnego na środek obiektywu. Dodaj 10 mikrolitrów ultraczystej wody typu pierwszego do środka czystej szklanki nakrywkowej i monitoruj ślad wody, aby upewnić się, że nie obserwuje się żadnych sygnałów fluorescencyjnych. Następnie użyj pęsety z gumową końcówką, aby ostrożnie zdjąć szkło nakrywkowe i w razie potrzeby uzupełnić olejek immersyjny.

Aby zapewnić uzyskanie danych dotyczących pojedynczej cząsteczki, po rozcieńczeniu próbki należy wybrać stężenie, przy którym obserwuje się od jednego do pięciu impulsów na sekundę w panelu śledzenia na żywo. Po ustaleniu odpowiedniego stężenia wciśnij izolatory silikonowe o średnicy od ośmiu do dziewięciu milimetrów na środek nowego szkła nakrywkowego i ostrożnie dodaj 10 mikrolitrów próbki do środka, unikając kontaktu z silikonem. Mocno umieść drugą szklankę nakrywkową na izolatorach, aż utworzy się uszczelka.

Sprawdź histogram stechiometrii na żywo w funkcji wydajności FRET, aby zaobserwować, czy próbka zachowuje się zgodnie z oczekiwaniami. W panelu zapisywania ustawień wprowadź informacje dotyczące nazwy i szczegółów próbki, etykiet dawcy i akceptora, długości fal wzbudzenia bufora, dawcy i akceptora, długości fal wykrywania i mocy lasera, użytkownika końcowego i przynależności użytkownika. W panelu akwizycji wprowadź długość eksperymentu w minutach i wybierz odpowiedni interwał zapisu, aby zminimalizować potencjalną utratę danych w przypadku błędu.

W razie potrzeby wybierz opcję oszczędzaj moc lasera, a następnie kliknij przycisk Start, aby rozpocząć pobieranie danych. W wyniku pozytywnym uzyska się od pięciu do jednej serii na sekundę. W wyniku ujemnym zaobserwuje się zbyt wiele lub zbyt mało wybuchów w tym samym przedziale czasowym.

Po zebraniu i przeanalizowaniu, wykres alternatywny powinien być zgodny z okresem ALEX konfiguracji eksperymentalnej. Ślad czasowy służy do jakościowej oceny, czy stężenie próbki jest rozsądne. Wykres tła pokazuje rozkład okresów opóźnienia między fotonami z liniowym dopasowaniem do dłuższych czasów w celu oszacowania szybkości tła.

Ślad tła może być wykorzystany do określenia, czy w próbce zaszły zmiany w czasie trwania eksperymentu. Generowane są histogramy stechiometrii w funkcji wydajności FRET, wybierane dla wszystkich gatunków i gatunków podwójnie oznakowanych. Generowany jest histogram wydajności 1D FRET z dopasowaniem gaussowskim danych.

Tak więc stężenie próbki jest tutaj kluczowe. Jeśli jest zbyt wysoka, nie przeprowadzasz już eksperymentu z pojedynczą cząsteczką, a jeśli jest zbyt niska, uzyskanie danych zajmie zbyt dużo czasu. Umożliwiło to określenie struktur dynamicznych biomolekuł, których nie można było określić innymi metodami, takimi jak NMR czy krystalografia.