Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych
9 kwietnia 2021
Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.
Badanie to przedstawia nowatorski przepływ pracy do wykrywania SARS-CoV-2 na powierzchniach, które rzadko są czyszczone w środowisku miejskim, takich jak uchwyty pomp gazowych, place zabaw i bankomaty. W czasie pandemii zapasy są ograniczone. Korzystamy z łatwo dostępnych materiałów i odczynników oraz sprzętu dostępnego w podstawowych warunkach laboratoryjnych.
Stosujemy metodę ekstrakcji, która zachowuje RNA bez łańcucha chłodniczego oraz metodę detekcji odporną na inhibitory. Protokół ten leży w interesie zdrowia publicznego. Stanowi ona ramy oceny środowiskowych rezerwuarów wirusów dla obecnej pandemii COVID-19 i innych czynników zakaźnych podczas przyszłych globalnych epidemii.
Rekrutuj naukowców-amatorów za pomocą bezpośredniego i jasnego wezwania do działania opublikowanego za pośrednictwem mediów lokalnych i społecznościowych. Utwórz uchwyt do mediów społecznościowych, aby połączyć temat z treściami w mediach społecznościowych. Należy utworzyć link do SMP, udostępniając wielojęzyczną wtyczkę umożliwiającą nawigację w wielu językach osobom fizycznym ubiegającym się o udział w pobieraniu próbek środowiskowych poprzez udzielanie odpowiedzi na pytania związane z bezpieczeństwem biologicznym określone w formularzu online.
Dołącz do sekcji dotyczącej próbkowania protokoły graficzne i audiowizualne w języku angielskim i hiszpańskim. Wizualizacja danych geoprzestrzennych za pomocą interfejsu programowania aplikacji geoprzestrzennych obsługiwanego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przechowuj dane przesłane do LIMS za pośrednictwem SMP, aby ułatwić scentralizowane przechowywanie, śledzenie przepływów pracy przetwarzania i zarządzanie logistyką.
Wstępnie załaduj informacje, takie jak identyfikator zestawu próbek, identyfikator próbki, data, godzina i współrzędne globalnego systemu pozycjonowania, aby zapewnić zgodność z typami danych i zminimalizować błąd. Dołącz link do prośby o odbiór próbki dla uczestników, z którego mogą skorzystać po zebraniu wszystkich próbek. Zbuduj zestaw, który zawiera wszystkie materiały do pobierania próbek, w tym niezbędne środki ochrony osobistej, takie jak maska i rękawiczki, protokół pobierania próbek oraz informacje dotyczące bezpieczeństwa biologicznego.
Wymaz rzadko dezynfekowane powierzchnie w gospodarstwach domowych i środowisku miejskim, zwilżając wacik chłonny z poliestru o powierzchni jednego centymetra kwadratowego detergentem i przecierając powierzchnię o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych. Wspomagany wykałaczką, zanurz każdy wymazówkę próbki we wstępnie oznakowanej probówce zawierającej 200 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny. Nosić dostarczoną maskę i nową parę rękawiczek do pobierania każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
Po zakończeniu pobierania próbek użyj dołączonego środka do dezynfekcji rąk. Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich transportu do laboratorium. Gdy próbki dotrą do laboratorium, przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Aby zwiększyć szybkość przesiewania, próbki należy przetwarzać w kałużach. Jeśli pula jest dodatnia, wyekstrahuj RNA z każdej próbki niezależnie. Połącz próbki z każdego zestawu do pobierania próbek w dwie pule, łącząc 50 mikrolitrów każdej z ośmiu próbek w probówce mikrowirówkowej i zapisując pozostałe próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Dodaj 80 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund. Następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 13 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.
Przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj pozostały interfejs i różowy płyn w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Frakcje te zawierają DNA i białka.
Ekstrahować RNA z odzyskanej warstwy wodnej przy użyciu surowego protokołu ekstrakcji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny. Przygotować mieszaninę reakcyjną RT-LAMP w temperaturze pokojowej z 10% nadmiarem objętości, aby uwzględnić straty w pipetowaniu. Dodaj pięć mikrolitrów RNA do reakcji próbki i pięć mikrolitrów RNA plus 2,5 mikrolitrów syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do reakcji wzbogaconej.
Dodaj 2,5 mikrolitra syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do kontroli pozytywnej i pięć mikrolitrów wody do kontroli ujemnej. Dobrze wymieszaj i odkręć reakcje. W przypadku obserwacji kolorymetrycznej wynik ujemny jest oznaczony kolorem różowym, a wynik pozytywny jest oznaczony kolorem żółtym.
Po RT-LAMP należy wykonać elektroforezę żelową. Rozmieszczenie miejsc pobierania próbek przedstawiono tutaj. Większość zestawów była kompletna, a odpowiednie dane zostały przesłane do systemu LIMS.
Granica wykrywalności przy częstotliwości 100% wynosiła 500 kopii na 25 mikrolitrów reakcji. W kolorymetrycznej lampie RT-LAMP dodatnie próbki zmieniły kolor z różowego na żółty z powodu zmiany pH z ośmiu do 5,5. Przy niskiej liczbie kopii próbki badano na żelu agarozowym, aby potwierdzić wyniki dodatnie z uzyskanym wzorem przypominającym drabinę.
Metody RT QPCR przetestowano na próbkach środowiskowych. Wszystkie mieszaniny wzorcowe były wrażliwe na inhibitory przy niskich stężeniach liczby kopii kontroli pozytywnej. Przy niskich stężeniach matrycy tradycyjne metody RT PCR wykazywały wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne.
Wreszcie, technika zwana amplifikacją toczącego się koła wykryła niewielkie ilości sekwencji docelowej. Wykazał jednak amplifikację sondy przy braku matrycy RNA. Konieczne jest wystosowanie wezwania do działania, które dotrze do wszystkich sektorów społeczności, tak aby pobieranie próbek rzeczywiście odzwierciedlało ryzyko narażenia wszystkich członków tej społeczności.
Platforma ta wykrywa materiał genetyczny SARS-CoV-2. Kolejnym krokiem są badania mające na celu sprawdzenie żywotności wirusa.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia oparty na nauce obywatelskiej schemat postępowania w celu wykrywania SARS-CoV-2 na rzadko czyszczonych powierzchniach miejskich podczas pandemii COVID-19. Protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały i odczynniki, co umożliwia prowadzenie wielkoskalowego pobierania próbek środowiskowych oraz czułą detekcję viralnego RNA, nawet w warunkach ograniczeń w łańcuchach dostaw. Podejście to zostało zaprojektowane tak, aby było odporne na inhibitory powszechnie występujące w próbkach środowiskowych i możliwe do zaadaptowania w przyszłym nadzorze zdrowia publicznego nad innymi wirusami.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Wirusologia środowiskowa
- Nadzór zdrowia publicznego
- Diagnostyka molekularna
Wstęp
- Transmisja SARS-CoV-2 przez powierzchnie stanowiła istotny problem podczas pandemii COVID-19.
- Większość działań nadzoru środowiskowego koncentrowała się na miejscach o wysokiej prewalencji, takich jak szpitale i transport publiczny.
- Powierzchnie miejskie, które są rzadko czyszczone, mogą służyć jako rezerwuary wirusa.
- Niedobory materiałów podczas pandemii wymusiły zastosowanie alternatywnych strategii pobierania próbek i detekcji.
Cel badania
- Opracowanie i walidacja schematu postępowania w celu wykrywania SARS-CoV-2 na rzadko dezynfekowanych powierzchniach miejskich.
- Włączenie naukowców-obywateli do prowadzenia wielkoskalowego pobierania próbek środowiskowych.
- Stworzenie protokołu odpornego na niedobory materiałów oraz obecność inhibitorów środowiskowych.
Zastosowane metody
- Rekrutacja 350 obywatelskich naukowców za pośrednictwem lokalnych mediów i mediów społecznościowych, z zapewnieniem wielojęzycznego wsparcia.
- Dystrybucja zestawów do pobierania próbek zawierających ŚOI, wymazy oraz protokoły.
- Pobieranie wymazów z powierzchni o wielkości 10 cm2 przy użyciu poliestrowych wymazów zwilżonych detergentem.
- Konserwacja próbek w tiocyjanie guanidynium bez konieczności zachowania łańcucha chłodniczego.
- Łączenie próbek w pule do wstępnego przesiewu, a następnie indywidualna ekstrakcja RNA w przypadku uzyskania wyników dodatnich dla danej puli.
- Ekstrakcja RNA przy użyciu protokołu opartego na tiocyjanie guanidynium.
- Detekcja za pomocą kolorymetrycznego RT-LAMP, potwierdzona elektroforezą żelową.
- Porównanie z metodami RT-qPCR oraz amplifikacji z wykorzystaniem kółtującego kręgu (RCA).
- Scentralizowane zarządzanie danymi przy użyciu systemu zarządzania informacją laboratoryjną (LIMS) oraz narzędzi do wizualizacji geospatialnej.
Główne wyniki
- Zebrano ponad 4 000 próbek z różnych powierzchni miejskich.
- Test RT-LAMP wykazał granicę wykrywalności na poziomie 500 kopii na 25 µL reakcji z wyraźnym odczytem kolorymetrycznym.
- Łączenie próbek zwiększyło efektywność przesiewania; grupy pozytywne poddano dekonwolucji w celu przeprowadzenia analizy indywidualnej.
- Metoda RT-qPCR była podatna na działanie inhibitorów przy niskiej liczbie kopii, co prowadziło do wyników fałszywie dodatnich/ujemnych.
- Metoda amplifikacji przez toczącą się obręcz (RCA) wykazała niespecyficzną amplifikację w przypadku braku matrycy RNA.
- Opracowany schemat postępowania skutecznie zaangażował społeczność i umożliwił kompleksowy nadzór środowiskowy.
Wnioski
- Opisany protokół umożliwia czułe wykrywanie RNA SARS-CoV-2 na powierzchniach miejskich z wykorzystaniem dostępnych materiałów i udziału obywateli.
- Przepływ pracy jest odporny na inhibitory środowiskowe i może zostać dostosowany do przyszłych ognisk innych wirusów.
- Konieczne są dalsze badania w celu oceny żywotności wirusów na wykrytych powierzchniach.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Nadzór środowiskowy nad obecnością wirusowego RNA na powierzchniach miejskich zapewnia skalowalne ramy dla wczesnego wykrywania ryzyka transmisji w społeczności oraz rezerwuarów środowiskowych. Ten schemat pracy umożliwia szybkie, rozproszone pobieranie próbek i niezawodną detekcję nawet w warunkach ograniczeń łańcucha dostaw, co wspiera pewność prognostyczną w obszarze zdrowia publicznego oraz badań i rozwoju w sektorze biofarmaceutycznym. Podejście to jest adaptowalne do przyszłego monitorowania patogenów, co pozwala na opracowanie ocen ryzyka i strategii interwencyjnych w całym kontinuum od odkrycia po nadzór.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia ocenę rezerwuarów wirusów w środowisku w oparciu o postawione hipotezy, w odniesieniu do dynamiki transmisji.
- Wspiera biologiczną minimalizację ryzyka poprzez wyjaśnienie obecności i rozkładu RNA wirusa na różnych powierzchniach.
- Ułatwia uzyskanie wiarygodności prognostycznej w modelach ekspozycji środowiskowej na czynniki zakaźne.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane protokoły dla wysokoczułego wykrywania wirusowego RNA w złożonych matrycach środowiskowych.
- Standaryzuje pobieranie i przetwarzanie próbek w celu uzyskania powtarzalnych, ilościowych wyników w dużych kohortach.
- Wykazuje odporność testu na inhibitory, co umożliwia wiarygodny screening w warunkach rzeczywistych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje dane nadzoru środowiskowego ze strategiami biomarkerów zdrowia publicznego w celu przygotowania się na wystąpienie ognisk chorób.
- Zapewnia ciągłość procesu od detekcji środowiskowej po przedkliniczne modelowanie ryzyka i planowanie interwencji.
- Wspiera dostosowane do ryzyka wdrażanie narzędzi nadzoru nad patogenami wyłaniającymi się.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten schemat postępowania łączy pobieranie próbek środowiskowych, detekcję molekularną i scentralizowane zarządzanie danymi, obejmując cały proces od wczesnego etapu odkrywania po nadzór translacyjny.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących transmisji środowiskowej i mapowania rezerwuarów.
- Screening: Zapewnia powtarzalną, ilościową detekcję viralnego RNA z próbek zbiórkowych i indywidualnych.
- Analityka: Integruje dane geoprzestrzenne oraz dane z systemu LIMS w celu przeprowadzenia analiz porównawczych i zapewnienia zgodności.
- Badania translacyjne: Dostarcza informacji niezbędnych do dopasowania biomarkerów zdrowia publicznego i strategii reagowania na ogniska chorób.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy skalowalną, adaptacyjną platformę dla przyszłych inicjatyw nadzoru nad patogenami.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w ocenie ryzyka środowiskowego i walidacji celów.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, skalowalne pobieranie próbek i detekcję w warunkach ograniczonych zasobów.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji o wdrożeniu nadzoru oraz priorytetyzacji interwencji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację rozwoju narzędzi nadzorczych i diagnostycznych w oparciu o dostosowanie do ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie diagnostyki molekularnej i protokołów pobierania próbek środowiskowych.
- Wymaga dostępu do podstawowej infrastruktury laboratoryjnej oraz systemu LIMS do zarządzania danymi.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w zakresie pobierania próbek, ich przetwarzania oraz raportowania danych.
- Możliwość adaptacji do różnych środowisk miejskich i społeczności przy minimalnych wymaganiach dotyczących zapasów.
- Wykrywanie ograniczone do RNA wirusa; badania żywotności są niezbędnym kolejnym krokiem.
