Name: Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: Poznaj metodę wykrywania SARS-CoV-2 na miejskich powierzchniach rzadko czyszczonych przy użyciu próbek środowiskowych i testu RT-LAMP. Protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały oraz udział obywateli naukowców.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy badaczom z Instytutu Informacji Wirusowej (VII), dr Ance M. Segall, Willow Segall, Patricii L. Rohwer, Gary'emu Rohwerowi, Cary'emu L. Rohwerowi, Magdzie Silvii Pinetta, Elizabeth Cruz Cano, dr Gregory'emu Petersowi, dr Stuartowi A. Sandinowi i dr Jennifer Smith za poświęcenie czasu na zebranie licznych próbek. Dziękujemy również dr Robowi Knightowi, dr Jackowi Gilbertowi, dr Pedro Balda-Ferre i dr Sarah Allard z wydziału pediatrii w School of Medicine University of San Diego California (UCSD) za ułatwienie kontroli pozytywnych i przydatne informacje zwrotne. Dziękujemy Stacey Carota (SDSU College of Sciences) i Ginie Spidel (SDSU) za wsparcie logistyczne oraz Juanowi Rodríguezowi za grafikę i projekt graficzny protokołu pobierania próbek. Dziękujemy wszystkim uczestnikom za zaangażowanie i poświęcenie dla tego projektu w bardzo trudnych czasach. Prace te zostały wsparte hojną darowizną od dr Jo Ann Lane (SDSU College of Sciences) oraz grantu National Science Foundation RAPID: Environmental Reservoirs of SARS-CoV-2 (numer nagrody: 2030479).

Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółową listę odczynników i materiałów eksploatacyjnych, w tym numery katalogowe, producenta i odpowiednie koszty.
1. Pobieranie próbek środowiska miejskiego
<ol>
	<li>Działania popularyzatorskie dla naukowców obywatelskich
	<ol>
		<li>Rekrutuj naukowców-amatorów za pomocą bezpośredniego i jasnego wezwania do działania opublikowanego za pośrednictwem mediów lokalnych i społecznościowych. Utwórz uchwyt mediów społecznościowych (np. #swab4corona), aby połączyć temat z treściami w mediach społecznościowych.</li>
		<li>Utwórz konto e-mail do bezpośredniej komunikacji między zespołem laboratoryjnym a każdym naukowcem-obywatelem, zarządzane przez osobę biegle posługującą się głównymi językami regionu zainteresowania (np. hiszpańskim i angielskim dla hrabstwa San Diego).</li>
		<li>Zbuduj bezpieczną internetową platformę zarządzania próbkami (SMP), która będzie służyć jako baza danych, system zarządzania informacjami laboratoryjnymi (LIMS) i komunikować się z naukowcami-obywatelami. 
		UWAGA: SMP zapewnia scentralizowaną lokalizację, w której użytkownicy proszą o zestaw, uzyskują dostęp do protokołów pobierania próbek, przesyłają metadane próbek i żądają odbioru kompletnych zestawów próbek.</li>
		<li>Utwórz link do SMP (np. https://demo.covidsample.org/) (<silna klasa="xfig">Rysunek 1) dla osób, które mogą ubiegać się o udział w próbach pobierania próbek środowiskowych, odpowiadając na pytania związane z bezpieczeństwem biologicznym określone w formularzu online.</li>
		<li>Bezpieczny dostęp do SMP za pomocą interfejsu programowania aplikacji uwierzytelniającej (Authentication Application Programming Interface) udostępnianego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przyznawanie zatwierdzonym użytkownikom dostępu do pliku SMP. 
		UWAGA: Zapoznaj się z literaturą, aby zapoznać się z opisem protokołu OAuth 2.031 w celu uwierzytelniania i autoryzacji. Zapewnia bezproblemowy proces logowania dla ochotników-naukowców-amatorów. Umożliwia także użytkownikom logowanie się przy użyciu istniejącego konta, eliminując potrzebę tworzenia niestandardowego rozwiązania do logowania i zarządzania poświadczeniami użytkownika, co oszczędza znaczną ilość czasu i zachęca do uczestnictwa. Według ostatnich doniesień, bezpłatna usługa poczty e-mail dostępna dla wybranego dostawcy usług komputerowych w chmurze ma około 1,5 miliarda aktywnych użytkowników poczty e-mail miesięcznie; Wymaganie posiadania konta e-mail od tego usługodawcy w celu uczestnictwa nie jest uważane za czynnik zniechęcający.</li>
		<li>Wyjaśnij cel badania i kwestie bezpieczeństwa biologicznego naukowcom z SMP, zanim poproszą o swój pierwszy zestaw. Udostępnij wielojęzyczną wtyczkę, aby umożliwić nawigację w dowolnym języku dostępnym w wielojęzycznej usłudze neuronowego tłumaczenia maszynowego udostępnianej przez dostawcę usług komputerowych w chmurze.</li>
		<li>Dołącz do sekcji dotyczącej próbkowania protokoły graficzne i audiowizualne w języku angielskim i hiszpańskim.</li>
		<li>Przypisz unikalny identyfikator do każdego zestawu i zaprojektuj interfejs użytkownika tak, aby wykorzystywał przyciski powiązane z identyfikatorem próbki w celu usprawnienia procesu wprowadzania danych (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1A).</li>
		<li>Korzystaj z oprogramowania do planowania tras dostaw z aplikacją na urządzenia mobilne, które mogą być używane przez kierowców do optymalizacji tras dostaw/odbioru i powiadamiania naukowców amatorów o dokładnym szacowanym czasie przybycia.</li>
		<li>Zbuduj platformę LIMS na stosie usług internetowych PHP i hostuj ją na komercyjnej platformie hostingowej (sugerowany system operacyjny, oprogramowanie serwera WWW i oprogramowanie bazy danych są określone w tabeli materiałów).</li>
		<li>Zapewnij bezpieczny interfejs aplikacji internetowej, aby umożliwić personelowi laboratoryjnemu szybkie i łatwe zarządzanie danymi w systemie LIMS. Zapewnij wizualizację danych przy użyciu interfejsu programowania aplikacji do tworzenia wykresów danych udostępnianego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze.</li>
		<li>Wizualizacja danych geoprzestrzennych za pomocą interfejsu programowania aplikacji geoprzestrzennych obsługiwanego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przechowywanie danych przesyłanych do systemu LIMS za pośrednictwem SMP w celu ułatwienia (1) scentralizowanego przechowywania danych projektowych; (2) śledzenie przepływów pracy związanych z próbkowaniem/przetwarzaniem danych; oraz (3) zarządzanie logistyką dystrybucji zestawów próbek do naukowców-amatorów.</li>
		<li>Zabezpiecz przesłane metadane przy użyciu najlepszych praktyk (np. https://demo.covidsample.org/). </li>
		<li>Wstępnie załaduj informacje, takie jak identyfikator zestawu próbki, identyfikator próbki, data, godzina i współrzędne globalnego systemu pozycjonowania (GPS) (automatycznie zbierane ze zdjęcia miejsca), aby umożliwić zgodność z typami danych i zminimalizować przesyłanie błędnych lub brakujących danych przez użytkownika (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 1B). Uwzględnij następujące pola, które mają być wypełnione ręcznie i szybko (<1 min) przez naukowca-amatora: data i godzina pobrania, krótki opis miejsca pobierania próbek oraz zdjęcie miejsca pobierania próbek.</li>
		<li>Oczyść wszystkie przekazane dane i zweryfikuj typ danych. Na przykład zweryfikuj dane obrazów przekazane przez użytkowników, aby wybrać .jpg pliki, zmień ich nazwy na Sample ID w celu szybkiego skojarzenia z próbką i przechowuj przekazane obrazy w oddzielnej bezpiecznej lokalizacji niedostępnej dla użytkowników.</li>
		<li>Aktywuj opcję, aby zamówić dostawę i odbiór zestawu, gdy wszystkie próbki (16) zostaną skompletowane. Dodatkowo aktywuj opcję zamówienia nowego zestawu, który zostanie dostarczony po odbiorze poprzedniego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A). 
		UWAGA: Dla wolontariuszy, którzy preferują platformę nieinternetową oraz dla tych, którzy obawiają się ujawnienia swojej lokalizacji GPS (np. członkowie społeczności zaniepokojeni swoim statusem migracyjnym), zestawy mogą zostać dostarczone w uzgodnionym miejscu spotkania, a wolontariusze mogą zostać poproszeni o nagranie pisemnej wersji zbierania danych. Do komunikacji między laboratorium a każdym naukowcem-obywatelem należy zapewnić dwujęzycznego członka projektu, który będzie dostępny do rozmów telefonicznych i wysyłania wiadomości tekstowych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wacik do korony
	<ol>
		<li>Określić epidemiologicznie istotny przedział czasowy dla pobierania próbek.</li>
		<li>Zbuduj zestaw, który zawiera wszystkie materiały do pobierania próbek, w tym niezbędne środki ochrony osobistej (np. maskę, rękawiczki), protokół pobierania próbek i informacje dotyczące bezpieczeństwa biologicznego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Wstępnie oznacz każdą probówkę przypisanym unikalnym identyfikatorem (identyfikatorem próbki).</li>
		<li>Wymaz rzadko dezynfekuje powierzchnie, które są narażone na działanie aerozoli w gospodarstwach domowych i środowisku miejskim.
		<ol>
			<li>Noś dołączoną maskę w miejscach publicznych i nową parę rękawiczek do pobierania każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego. Po zakończeniu pobierania próbek użyj dołączonego środka do dezynfekcji rąk.</li>
			<li>Zwilż wacik absorpcyjny o grubości 1 cm2 (np. nakładki do mopa) detergentem (np. 0,5% dodecylosiarczanem sodu (SDS)) w celu dezaktywacji wirusa poprzez przerwanie jego otoczki i ustabilizowania nagiego RNA poprzez wywołanie rozwijania RNaz32.</li>
			<li>Przetrzyj powierzchnię 10 cm2. Wspomagany wykałaczką, całkowicie zanurz każdy wacik z próbką w odpowiedniej, wstępnie oznakowanej probówce zawierającej 200 μl roztworu tiocyjanianu guanidyny (GITC). Probówki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu ich transportu do laboratorium. Po dostarczeniu próbek do laboratorium należy je przechowywać w temperaturze -80 °C. 
			UWAGA: GITC jest toksycznym środkiem drażniącym; Unikać kontaktu ze skórą. Roztwór GITC jest prosty do przygotowania z popularnych chemikaliów laboratoryjnych, dla przepisu zobacz33,34. Dezaktywuje wirusa, stabilizuje RNA poprzez denaturację RNaz34,35,36 i stabilizuje próbki w temperaturze pokojowej. Zestaw zawiera jednak wkłady z lodu, które utrzymują próbki w niskiej temperaturze bez konieczności używania domowych lodówek do przechowywania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wykrywanie SARS-CoV-2
<ol>
	<li>Całkowita izolacja RNA
	<ol>
		<li>Zdezynfekować powierzchnie, sprzęt i pipetory roztworem 2 mM siarczanu miedzi i 3% nadtlenku wodoru, a następnie roztworem 10% wybielacza, 90 mM wodorowęglanu sodu, 5% SDS i 2,5% NaOH. Dokładnie przetrzyj wodą destylowaną, a następnie 75% etanolem. 
		UWAGA: Rozwiązania te stanowią alternatywę dla rozwiązań dostępnych na rynku.</li>
		<li>Rozmrozić próbki na lodzie. Wirować próbki przez 2 minuty ze średnią prędkością.</li>
		<li>Aby zwiększyć szybkość przesiewania, próbki należy przetwarzać w kałużach. Jeśli pula jest dodatnia, należy niezależnie ekstrahować RNA z każdej próbki, aby znaleźć dodatnią próbkę. Połączyć próbki z każdego zestawu do pobierania próbek (w sumie 16 próbek) w 2 pule po 8 próbek. 
		UWAGA: Posiadanie 8 próbek w puli oznacza, że w jednym zestawie muszą być przetwarzane tylko 2 próbki. Jeśli pula jest dodatnia, poszczególne próbki są ponownie przetwarzane do indywidualnej analizy RT-LAMP. Skraca to czas, koszty i zmniejsza ilość odczynników.</li>
		<li>Zebrać 50 μl każdej z 8 próbek do probówki mikrowirówkowej (całkowita objętość 400 μl); zachować pozostałą próbkę w temperaturze -80 °C. Dodać 0,2 objętości (80 μl) chloroformu, wirować przez 15 s, a następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Wirować przy 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przenieść warstwę wody (klarownej cieczy) do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj pozostały interfejs i różowy płyn w zamrażarce o temperaturze -80 °C; te frakcje zawierają DNA i białka33,36.</li>
		<li>Dodaj równą objętość izopropanolu (~200 μL) i 2,6 μL glikogenu koprecypitantu (15 mg mL-1)37. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu wytrącenia RNA. 
		UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, inkubując próbki w temperaturze -20 °C przez noc zamiast przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant bez naruszania osadu. Zawiesić osad w 50 μl wody uzdatnionej dietylowęglanem (DEPC) i dodać równą objętość (50 μl) wolnego od RNaz octanu 5 M amonu i 2,5 objętości (250 μl) 100% etanolu7,38. 
		nuta: Jony amonowe hamują kinazę polinukleotydową, jeśli są używane w procesie końcowym38. Mieszanina wytrąca RNA, pozostawiając trifosforany deoksynukleozydowe i oligosacharydy w roztworze38.</li>
		<li>Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -20 °C przez co najmniej 1 godzinę, a następnie w temperaturze 4 °C przez 10 minut w celu wytrącenia RNA. 
		UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, inkubując próbki w temperaturze -20 °C przez noc zamiast przez 1 godzinę.</li>
		<li>Wirować w temperaturze 13 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Umyć granulki 1 ml zimnego (-20 °C), świeżo przygotowanego 75% etanolu. Wirować przy 8 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety P10, aby uniknąć naruszenia osadu.</li>
		<li>Suszyć pelety na powietrzu przez 10-15 minut, aż nie pozostanie etanol. Zawiesić osad w 50 μl wody uzdatnionej DEPC, dodać 5 μl 10x buforu DNazy + 1 μl DNazy (2 jednostki μL-1) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.</li>
		<li>Dodać 0,1 objętości (5,6 μl) odczynnika do inaktywacji DNazy, inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut i delikatnie mieszać co minutę. Odwirować przy 13 000 × g przez 2 minuty i przenieść supernatant do nowej probówki (~50 μL). Umieść probówkę na lodzie natychmiast podczas przygotowywania reakcji RT-qPCR lub RT-LAMP lub przechowuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Wykonaj izolację RNA w pomieszczeniu wolnym od amplikonów, aby uniknąć przeniesienia zanieczyszczenia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Multipleksowa amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)
	<ol>
		<li>Przygotować 20-krotny roztwór mieszający starter (Tabela 1) dla każdego zestawu podkładów (Tabela 2). Przygotować mieszaninę reakcyjną RT-LAMP (Tabela 3) w temperaturze pokojowej z 10% nadmiarem objętości, aby uwzględnić straty pipetowania. 
		UWAGA: Kolorymetryczna mieszanka główna LAMP 2X z antarktyczną termolabilną glikozylazą uracylo-DNA (UDG) zapobiega amplifikacji zanieczyszczenia DNA z poprzednich reakcji20,28.</li>
		<li>Zwiruj i odkręć mieszaninę. Dozować 20 μl mieszaniny do każdej probówki reakcyjnej: próbki, wzbogaconej, kontroli pozytywnej i kontroli ujemnej. Inkubować reakcje w probówkach w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić UDG działanie na potencjalne zanieczyszczenie przeniesione.</li>
		<li>Dodać 5 μL RNA do reakcji próbki, 5 μL RNA + 2,5 μL (450 kopii) syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do reakcji wzbogaconej, 2,5 μL (450 kopii) syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do pozytywnej reakcji kontroli i 5 μLH2Odo reakcji kontroli negatywnej. Dobrze wymieszaj i odkręć reakcje; rozmrozić całe RNA na lodzie.</li>
		<li>Podczas gdy termocykler lub łaźnia wodna jest podgrzewana do 65 °C, pozwól, aby wszystkie reakcje pozostały w temperaturze pokojowej. UDG zostanie dezaktywowany w temperaturze >50 °C. Umieścić reakcje w termocyklerze (użyć pokrywy grzewczej), inkubować w temperaturze 65 °C przez 40 minut i pozwolić reakcjom osiągnąć temperaturę pokojową (~22 °C przez 5 minut) lub schłodzić na lodzie przez 1 minutę. Analizuj wyniki za pomocą funkcji kolorymetrycznej (prosta obserwacja) lub uruchamiając produkty w żelu agarozowym. 
		UWAGA: Chociaż granica wykrywalności (LOD) wynosi 10 kopii na reakcję, częstotliwość wykrywania wzrasta, gdy liczba kopii zbliża się do 500 kopii na reakcję (<silna klasa = "xfig">Rysunek 3A). W przypadku obserwacji kolorymetrycznej należy zauważyć, że wynik ujemny jest oznaczony kolorem różowym (pH = 8,8), podczas gdy wynik dodatni jest oznaczony kolorem żółtym (pH = 5) (<klasa silna = "xfig">Rysunek 3B). Opcja kolorymetryczna pozwala uniknąć otwierania lamp RT-LAMP po amplifikacji, co zmniejszy objętość produktów RT-LAMP w środowisku pracy i przenoszenie zanieczyszczeń. Do elektroforezy żelowej należy przygotować 1,5% żel agarozowy z 1X barwnikiem żelowym DNA w 0,5% buforze Tris/Boran/EDTA (TBE). Załadować 25 μL reakcji + 5 μL 6-krotnie obciążającego barwnika do każdej studzienki. Uruchom żel pod napięciem 100 V przez 60 minut. Marker molekularny nie jest potrzebny, ponieważ dodatnie próbki wykazują wzór drabinkowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3C).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie istnieją sprzeczne interesy.

Zaangażowanie naukowców obywatelskich. Naukowcy-amatorzy zostali zrekrutowani do pobrania wymazów z powierzchni w całym hrabstwie San Diego w celu pobrania próbek i wykrycia obecności SARS-CoV-2 w środowisku miejskim. Większość dostarczonych zestawów do pobierania próbek (70%) została zwrócona do laboratorium, a spośród nich prawie wszystkie próbki były kompletne (91%) (ryc. 3A, B i tabela 4). Ochotnicy mogli łatwo poprosić o dostarczenie/odbiór zestawu za pośrednictwem platformy internetowej, a oprogramowanie do planowania tras dostaw informowało naukowców-amatorów o szacowanym czasie przybycia, co prawdopodobnie miało istotny wpływ na zaobserwowany sukces. Średni czas od momentu dostarczenia zestawu do naukowca amatora do momentu jego zwrotu do laboratorium wynosił 8 dni, przy medianie 3 dni i zakresie od 1 do 64 dni (Rysunek 3A i Tabela 4). Częstsze przypomnienia dla ochotników prawdopodobnie skróciłyby ten czas opóźnienia.
Platforma do zbierania danych była z powodzeniem wykorzystywana przez zdecydowaną większość użytkowników (73%) (tab. 4). Chociaż wysiłki naukowców-amatorów nie były mierzone, testy terenowe wykazały, że platforma gromadzenia danych znacznie zmniejszyła wysiłek i czas potrzebny do prawidłowego zakończenia pobierania próbek. W ten sposób zmniejszenie ilości księgowości zachęciło naukowców obywatelskich do zaangażowania. Platforma internetowa miała na celu przezwyciężenie ograniczeń demograficznych poprzez zapewnienie wielojęzycznej usługi neuronowego tłumaczenia maszynowego oraz dostarczenie protokołów graficznych i audiowizualnych w języku angielskim i hiszpańskim. Udało się to tylko częściowo, ponieważ pobrano mniej próbek zarówno z South Bay, jak i North County, gdzie mieszka większość populacji latynoskiej/latynoskiej w hrabstwie(45). Obszary te zawierały również 63% (1 700 przypadków na 100 000) wszystkich przypadków COVID-19 w hrabstwie San Diego z najwyższą częstością występowania choroby46 i wskaźnikiem hospitalizacji (62%)47,48. Chociaż większość próbek pochodziła z hrabstwa Central, reprezentatywna liczba została pobrana z okręgów najbardziej dotkniętych COVID-19 i tylko niewielka część próbek była pozytywna, co sugeruje, że powierzchniowe rezerwuary SARS-CoV-2 w środowisku miejskim są stosunkowo rzadkie.
Przetwarzanie próbek. Wymazy z próbek zwilżono SDS, który inaktywował wirusa poprzez rozerwanie jego otoczki i ustabilizował nagie RNA poprzez rozwinięcie RNaz32. Dogodnie podczas pobierania detergent w waciku oczyścił pobraną powierzchnię. Próbki środowiskowe często zawierają bardzo małe ilości RNA. Aby zmaksymalizować regenerację, izolację RNA przeprowadzono przy użyciu opartej na GITC, bezkolumnowej, surowej metody ekstrakcji. GITC, silny środek chaotropowy, rozbija wiązania wodorowe, które utrzymują fałdowanie białek (tj. efekt hydrofobowy). Działanie to powoduje inaktywację cząstek wirusa, a RNA pozostaje stabilne dzięki hamowaniu RNAz 34,35,36. Rozwiązanie opracowane w ramach projektu GITC pozwoliło utrzymać stabilność próbek RNA bez ścisłych względów związanych z łańcuchem chłodniczym, co pozwoliło obywatelom na utrzymanie próbek w temperaturze pokojowej, jeśli zamrażarka na dostarczone wkłady z lodem nie była dostępna. Aby zmniejszyć potencjalne zagrożenie, jakie stwarza ten odczynnik w przypadku bezpośredniego kontaktu ze skórą lub błoną śluzową, obywatele zostali poinformowani o tych zagrożeniach poprzez dołączenie karty charakterystyki substancji niebezpiecznej dostarczonej do zestawu oraz umieszczenie plomby ostrzegawczej w pudełku zawierającym probówki.
Surowa metoda ekstrakcji chloroformem GITC pomogła w odzyskaniu śladów RNA z wymazów, a jak wykazano w amplifikacji próbek wzbogaconych, inhibitory rzadko utrzymywały się w próbkach po ekstrakcji. Próbki, które były ujemne dla SARS-CoV-2 i nie wykazywały hamowania RT-LAMP, reprezentowały prawdziwie ujemne lub miały niższą liczbę kopii niż LOD przy 100% częstości. I odwrotnie, wykrycie wirusowego RNA na powierzchni nie oznacza bezpośrednio ryzyka przeniesienia przez kontakt, ponieważ zakaźność wirusa z próbek dodatnich musi zostać przetestowana. Szybkie badania przesiewowe środowiska, nieograniczone dostępnością zaawansowanych materiałów eksploatacyjnych lub wysoko wykwalifikowanego personelu, mają kluczowe znaczenie dla oceny, czy powierzchnie stanowią rezerwuar wirusa, oraz dla lepszego kierowania działaniami zapobiegawczymi i powstrzymującymi rozprzestrzenianie się wirusa.
RT-LAMP została wybrana jako najlepsza metoda odpowiednia dla proponowanego rurociągu detekcji. Okazało się, że jest to szybka i niedroga metoda, która była wysoce odporna na większość pozostałych inhibitorów oraz tak samo czuła i specyficzna jak inne metody RT-qPCR. Ze względu na ich zastosowanie w warunkach klinicznych podczas pandemii SARS-CoV-2, na dostępność zestawów RT-qPCR wpłynęło globalne zapotrzebowanie. Co więcej, techniki RT-qPCR – nawet te opracowane w celu odporności na inhibitory – były wrażliwe na substancje zawarte w próbkach środowiskowych pobranych przez pilotażową kohortę naukowców amatorskich, nawet po zastosowaniu innych powszechnych strategii w celu zmniejszenia konkurencji inhibitorów o wiązanie enzymów49. Wyniki te zostały potwierdzone w niedawnym badaniu, w którym porównano obie metody wykrywania SARS-CoV-2 na próbkach wymazów z cukierków obsługiwanych przez pacjentów z COVID-19 i stwierdzono ponad 83% zgodność wyników, z 25% niższą inhibicją, w próbkach analizowanych przez RT-LAMP15. Co więcej, ekstrakcja surowego chloroformu GITC, w połączeniu z RT-LAMP, obniżyła koszty odczynników i materiałów eksploatacyjnych o 42% w porównaniu z ekstrakcją zestawu RNA i RT-qPCR (Tabela Materiałów).
Metoda ta pozwoliła na wysokoprzepustową analizę tysięcy próbek wymazów powierzchniowych. Do 80 pul, reprezentujących 640 próbek, zostało przetworzonych w ciągu 2 dni od ekstrakcji RNA do wykrycia SARS-CoV-2 przez RT-LAMP. Proponowany protokół jest półilościowy, ogranicza się do wykrywania wirusowego RNA i nie wskazuje na obecność zakaźnych cząstek wirusa. Konieczna jest dalsza analiza w celu oceny ryzyka przeniesienia SARS-CoV-2 z zakażonych komórek obecnych na pobranych powierzchniach.
W badaniu tym przedstawiono protokół szybkiego opracowania strategii testowania, która obejmuje skuteczny przepływ pracy w obliczu zagrożenia zdrowia związanego z chorobą zakaźną. Proponowany protokół pobierania próbek jest prosty i wykorzystuje materiały powszechnie spotykane w gospodarstwach domowych, a metoda wykrywania wirusa jest przeprowadzana na sprzęcie dostępnym w podstawowych warunkach laboratoryjnych, takich jak łaźnia wodna zamiast termocyklera. Koszty odczynników RT-LAMP są znacznie niższe niż te potrzebne do RT-qPCR i mniej podatne na scenariusze wysokiego globalnego popytu. Badanie to służy jako ramy do oceny środowiskowych rezerwuarów wirusa w przyszłych epidemiach i globalnych pandemiach.

SARS-CoV-2 jest uważany za przenoszony głównie przez wdychanie skażonych aerozoli i kropelek pochodzących z bezpośredniego kontaktu z zakażonymi osobami1,2,3,4. Jednak w początkowych fazach globalnej pandemii COVID-19 wysiłki mające na celu kontrolę transmisji SARS-CoV-2 koncentrowały się silnie na dezynfekcji powierzchni, myciu rąk i odkażaniu się. Do końca 2020 r. wytyczne Światowej Organizacji Zdrowia (WHO)5 oraz amerykańskie Centra Kontroli i Prewencji Chorób (CDC)6 uznały, że przenoszenie drogą powietrzną stanowi zagrożenie głównie w bliskim kontakcie (<2 m) z osobą zakażoną lub w obecności procedur medycznych generujących aerozol. Samozaszczepienie po kontakcie ze skażonymi powierzchniami lub wdychanie fomitów w aerozolu nie zostało jeszcze wykluczone jako droga przenoszenia SARS-CoV-2.
Przypadki COVID-19 zostały zgłoszone, w przypadku których transmisja drogą powietrzną wydaje się mało prawdopodobna7,8. Wiriony SARS-CoV-2 pozostają zakaźne na miedzi do 8 godzin, na kartonie i stali nierdzewnej do 24 godzin, a na plastiku do 48 godzin9. W kabinach statków wycieczkowych RNA SARS-CoV-2 wykryto 17 dni po odlocie pasażerów7. Próbki powietrza i powierzchni ze szpitali i systemów transportu zbiorowego dały wynik pozytywny na obecność SARS-CoV-2 i innych koronawirusów8,10,11,12,13,14. Badanie przeprowadzone na zewnętrznym opakowaniu cukierków na Halloween obsługiwanych przez bezobjawowych i umiarkowanych/łagodnie objawowych pacjentów z COVID-19 wykazało, że połączenie mycia rąk przez opiekuna i mycia cukierków mydłem do rąk zmniejszyło RNA SARS-CoV-2 poniżej poziomów progowych15.
Opublikowano kilka metod diagnostyki SARS-CoV-2 opartych na reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym (RT-qPCR)16,17, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP)11,18,19,20,21 oraz technologie CRISPR-Cas18,19,22,23. Większość z nich wymaga zestawów do ekstrakcji RNA, których często brakuje w okresach znacznego globalnego popytu, a bardzo niewiele z nich zostało wykorzystanych do badań przesiewowych wirusa w środowisku 24. Wykazano, że wykrywanie RNA SARS-CoV-2 za pomocą RT-LAMP jest w ponad 83% zgodne z użyciem RT-qPCR. Co więcej, RT-LAMP spowodował zmniejszenie o 25% liczby niejednoznacznych wyników w porównaniu z RT-qPCR15.
RT-LAMP to prosta technika, która wykorzystuje odwrotną transkryptazę do syntezy cDNA z matrycy RNA25, a następnie polimerazy DNA o silnej aktywności przemieszczenia nici, która syntetyzuje DNA w stałej temperaturze (tj. amplifikacji izotermicznej)26. Większą specyficzność wykrywania genomu wirusa uzyskuje się dzięki zastosowaniu czterech lub sześciu starterów, które rozpoznają sześć lub osiem regionów docelowego DNA. Amplifikacja jest inicjowana z wewnętrznego startera i daje półdwuniciową strukturę DNA. Pasmo wiodące jest następnie wzmacniane przez zewnętrzny starter. Wzmocnienia te są powtarzane dla starterów odwrotnych. Wewnętrzne i zewnętrzne startery na obu końcach mają wewnętrzne odwrócone samokomplementarne miejsce, które tworzy pętlę w produkcie amplifikacji26,27. W izotermicznym przemieszczeniu nici asynchroniczna synteza DNA generuje duże ilości amplifikowanego produktu, gdzie ciągła polimeryzacja wzmacnia sygnał zaledwie 10 kopii na reakcję11,20,28. Kolorymetryczna mieszanka RT-LAMP jest słabo buforowana i wykorzystuje czerwień fenolową jako wskaźnik pH. Gdy polimeraza zawiera nukleotyd, uwalnia proton, a wystarczająca ilość protonów zmieni pH roztworu, a także jego kolor z różowego na żółty11,20,28,29.
RT-LAMP został opracowany do wykrywania chorób przenoszonych przez komary w peryferyjnych placówkach opieki zdrowotnej, które nie mają w pełni wyposażonych laboratoriów25 oraz do szybkiego wykrywania innych wirusów RNA, takich jak ludzki wirus niedoboru odporności30. Populacje najbardziej narażone na wybuchy epidemii – zgodnie z definicją WHO – często nie mają wystarczających zasobów ekonomicznych i odpowiedniego sprzętu do przeprowadzenia wykrywania (Globalna Agenda Zdrowia Publicznego ONZ). W obecnej pandemii SARS-CoV-2 materiały takie jak wymazy klasy medycznej i odczynniki do zestawów do ekstrakcji RNA nie były w stanie zaspokoić globalnego popytu, zwłaszcza w krajach nieprodukcyjnych. W proponowanym protokole wykorzystano ekstrakcję surowego RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny (GITC), która skutecznie zachowała RNA w sposób niezależny od łańcucha chłodniczego i znacznie zmniejszyła trwałość inhibitorów z próbki. Co więcej, protokół ekstrakcji chloroformem GITC opiera się na oddzieleniu RNA od DNA i białek, a następnie odpowiednim wytrąceniu, co pozwala na odzyskanie większości materiału genetycznego. Korzyści te przeważają nad potencjalnymi zagrożeniami związanymi z naukowcami-amatorami mającymi do czynienia z substancją chemiczną, jeśli zostaną podjęte środki w celu odpowiedniego poinformowania ich o ryzyku.
Proponowany przepływ pracy wykorzystuje materiały i odczynniki, które są powszechnie używane. Wymaga to sprzętu, który jest dostępny w podstawowych, często wiejskich warunkach laboratoryjnych. Metody te są niedrogie, wysoce odporne na inhibitory często znajdujące się w próbkach środowiskowych lub próbkach, których nie można przetworzyć za pomocą zestawów do ekstrakcji, i eliminują potrzebę stosowania precyzyjnego termocyklera. W pracy przedstawiono proces pobierania próbek i wykrywania wirusa SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych na powszechnie dotykanych i rzadko dezynfekowanych powierzchniach gospodarstw domowych i środowiska miejskiego.

<table><tbody><tr><td>SMP, LIMS i działania społecznościowe:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Uwierzytelnianie Interfejs programowania aplikacji</td><td>Google</td><td>Google Logowanie</td><td></td></tr> Google <tr><td>Komercyjna platforma hostingowa</td><td>GoDaddy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Charting Interfejs programowania aplikacji</td><td></td> Google <td>Google Charts</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MySQL&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do planowania tras dostaw&nbsp;</td><td></td><td>Circuit Circuit dla drużyn Bezpłatna</td><td></td></tr><tr><td>usługa poczty e-mail</td><td>Google</td><td>Google Email</td><td></td></tr><tr><td>Interfejs programowania aplikacji geoprzestrzennych</td><td>Google</td><td>Google Maps API</td><td></td></tr><tr><td>Wielojęzyczna neuronowa usługa tłumaczenia maszynowego</td><td>Google</td><td>Translate</td><td></td></tr><tr><td>Online Formularz</td><td>Google</td><td></td> System operacyjny Google Form <td></td></tr><tr><td></td><td>Tworzenie</td> stron internetowych i baz danych w systemie Linux<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Big Rose Web Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie serwera WWW</td><td>Apache&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do pobierania próbek:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coolers</td><td>Coleman (Amazon)</td><td>B00363X3F2</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 70</td></tr><tr><td>galonów Worki Ziploc</td><td>Solimo (Amazon)</td><td>B07BJ495GL</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 18</td></tr><tr><td>Glicerol (środek do dezynfekcji rąk)</td><td>FischerScientific</td><td>G33-4</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 9</td></tr><tr><td>Okłady z lodu</td><td>Ice-Brix (Amazon)</td><td>B075GLD3X1</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 110</td></tr><tr><td>Izopropanol (płyn do dezynfekcji rąk)</td><td>FischerScientific</td><td>AA36644K7</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 43</td></tr><tr><td>Maski KN95</td><td>Echo-Sigma</td><td>Echo-Sigma</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 400</td></tr><tr><td>Papier do protokołów i karty bezpieczeństwa Trizol Office</td><td>Depot</td><td>348037</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 36</td></tr><tr><td>Butelki z rozpylaczem 30 ml (SDS i środek do dezynfekcji rąk)</td><td>Anyumocz (Amazon)</td><td>B07T64FHXR</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 80</td></tr><tr><td>RNazy, DNazy, DNA i Wolne od inhibitorów PCR Probówki do mikrowirówek</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-281</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 83</td></tr><tr><td>Identyfikator próbki etykiety odporne na rozpuszczalniki</td><td>LABTAG</td><td>XST-10C1-1WH</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 68</td></tr><tr><td>Podkładki Swiffer WetJet (waciki)</td><td>Swiffer (Amazon)</td><td>B001F0RBT2</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 8</td></tr><tr><td>Wykałaczki</td><td>Niezbędnik kuchenny (Amazon)</td><td>B00PBK4NG6</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 8</td></tr><tr><td>Odczynnik Trizol (roztwór izotiocyjanianu guanidyny - GITC), nie LS</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 40</td></tr><tr><td>Pudełka tubowe</td><td>Genesee Scientific</td><td>21-119</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 180</td></tr><tr><td>Małe torebki Ziploc</td><td>Ziploc (Amazon)</td><td>B01LRKEI9K</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 8</td></tr><tr><td>Biurkowa drukarka termotransferowa Zebra&nbsp;</td><td>Zebra</td><td>GK420t</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Całkowity koszt zestawu do pobierania próbek (US$) za 100 rxns: 1,160</td></tr><tr><td>Ekstrakcja RNA Trizol: </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen</td><td>AM9070G</td> octanu <td>amonu bez RNaz</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 2</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>FisherScientific</td><td>C298-500</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 2</td></tr><tr><td>GlycoBlue (glikogen 15 mg / ml)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9515</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 80</td></tr><tr><td>Absolutny molekularny (200 proof) Etanol</td><td>FisherScientific</td><td>BP2818500</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 30</td></tr><tr><td>Isopropanol klasy molekularnej</td><td>FisherScientific</td><td>BP2618500</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 3</td></tr><tr><td>Zestaw TURBO bez DNA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>AM1907</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 110</td></tr><tr><td>Multiplexed kolorymetryczny RT-LAMP:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>guanidyna chlorowodorek</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ6548522</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 1</td></tr><tr><td>RT-LAMP E1-Primers</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 7</td></tr><tr><td>RT-LAMP N2-Primers</td><td>IDT</td><td>n/a</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 7</td></tr><tr><td>Syntetyczny SARS-CoV-2 RNA</td><td>ATCC</td><td>VR-3276SD</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 14</td></tr><tr><td>Lampa kolorymetryczna WarmStart 2X Master Mix z UDG</td><td>NEB</td><td>M1800S</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 210</td></tr><tr><td>Eppendorf Mastercycler Pro Thermal Cycler</td><td>Eppendorf</td><td>950030010</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Całkowita ekstrakcja RNA Trizol + LAMP Koszt (US$) za 100 rxns: 470</td></tr><tr><td>Kit do ekstrakcji RNA:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAamp DSP Viral RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>61904</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 570</td></tr><tr><td>RT-qPCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synthetic SARS-CoV-2</td><td>RNA ATCC</td><td>VR-3276SD</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 14</td></tr><tr><td>TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4444432</td><td>Koszt (US$) za 100 rxns: 180</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) N1,N2 Startery i sondy</td><td>IDT</td><td></td><td>10006713 Koszt (US$) za 100 rxns: 20</td></tr><tr><td>qScript XLT 1-Step RT-qPCR ToughMix</td><td>Quantabio</td><td>95132-100</td><td></td></tr><tr><td>Patogen QuantiNova&nbsp;</td><td>Sonda Qiagen</td><td>208652</td><td></td></tr><tr><td>QuantiNova</td><td>Qiagen</td><td>208352</td><td></td></tr><tr><td>UltraPlex 1-Step ToughMix&nbsp;</td><td>Quantabio</td><td>95166-100</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dotykowy system wykrywania PCR w czasie rzeczywistym</td><td>BioRad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Zestaw do ekstrakcji RNA + RT-qPCR Koszt (US$) za 100 rxns: 790&nbsp;</td></tr><tr><td>RT-PCR:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript IV One-Step RT-PCR&nbsp;</td><td>Czyszczenie</td><td>12594025</td><td></td></tr><tr><td>Lab:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNAZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9890</td><td></td></tr><tr><td>RNAZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania sars-cov-2 ze zbiorników środowiskowych

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Aby kontrolować przenoszenie koronawirusa zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2) podczas globalnej pandemii w 2020 roku, większość krajów wdrożyła strategie oparte na bezpośrednich testach na ludziach, zakrywaniu twarzy i dezynfekcji powierzchni. Przy założeniu, że główną drogą transmisji są aerozole i kropelki oddechowe, wysiłki mające na celu wykrycie SARS-CoV-2 w ogniskach skoncentrowały się na miejscach podejrzanych o wysoką częstość występowania (np. oddziały szpitalne, statki wycieczkowe i systemy transportu masowego). Aby zbadać obecność SARS-CoV-2 na powierzchniach w środowisku miejskim, które rzadko są czyszczone i rzadko dezynfekowane, zwerbowano 350 obywateli z aglomeracji hrabstwa San Diego. W sumie ci naukowcy-amatorzy zebrali 4080 próbek. Stworzono platformę internetową do monitorowania dostarczania i odbierania zestawów do pobierania próbek, a także do gromadzenia danych dotyczących próbek. Zestawy do pobierania próbek zostały w większości zbudowane z zapasów dostępnych w sklepach dotkniętych pandemią. Próbki były przetwarzane przy użyciu odczynników, które były łatwo dostępne pomimo powtarzających się braków w dostawach. Zastosowane metody były bardzo czułe i odporne na inhibitory, które są powszechnie obecne w próbkach środowiskowych. Zaproponowane metody projektowania i przetwarzania eksperymentów z powodzeniem zaangażowały wielu naukowców-amatorów, którzy skutecznie zebrali próbki z różnych obszarów powierzchniowych. Opisany tutaj przepływ pracy i metody są istotne dla badania środowiska miejskiego pod kątem innych wirusów, które stanowią zagrożenie dla zdrowia publicznego i stanowią zagrożenie dla przyszłych pandemii.

Obywatelski projekt naukowy miał na celu rekrutację mieszkańców San Diego do pobierania próbek środowiskowych na obecność SARS-CoV-2. Stworzono wielojęzyczną platformę internetową do przesyłania danych za pomocą przyjaznego dla użytkownika interfejsu urządzenia mobilnego. System zarządzania informacjami laboratoryjnymi ułatwił gromadzenie tysięcy próbek zróżnicowanych geograficznie dzięki śledzeniu wyników w czasie rzeczywistym.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

Badanie to przedstawia nowatorski przepływ pracy do wykrywania SARS-CoV-2 na powierzchniach, które rzadko są czyszczone w środowisku miejskim, takich jak uchwyty pomp gazowych, place zabaw i bankomaty. W czasie pandemii zapasy są ograniczone. Korzystamy z łatwo dostępnych materiałów i odczynników oraz sprzętu dostępnego w podstawowych warunkach laboratoryjnych.Stosujemy metodę ekstrakcji, która zachowuje RNA bez łańcucha chłodniczego oraz metodę detekcji odporną na inhibitory. Protokół ten leży w interesie zdrowia publicznego. Stanowi ona ramy oceny środowiskowych rezerwuarów wirusów dla obecnej pandemii COVID-19 i innych czynników zakaźnych podczas przyszłych globalnych epidemii.Rekrutuj naukowców-amatorów za pomocą bezpośredniego i jasnego wezwania do działania opublikowanego za pośrednictwem mediów lokalnych i społecznościowych. Utwórz uchwyt do mediów społecznościowych, aby połączyć temat z treściami w mediach społecznościowych. Należy utworzyć link do SMP, udostępniając wielojęzyczną wtyczkę umożliwiającą nawigację w wielu językach osobom fizycznym ubiegającym się o udział w pobieraniu próbek środowiskowych poprzez udzielanie odpowiedzi na pytania związane z bezpieczeństwem biologicznym określone w formularzu online.Dołącz do sekcji dotyczącej próbkowania protokoły graficzne i audiowizualne w języku angielskim i hiszpańskim. Wizualizacja danych geoprzestrzennych za pomocą interfejsu programowania aplikacji geoprzestrzennych obsługiwanego przez dostawcę usług komputerowych w chmurze. Przechowuj dane przesłane do LIMS za pośrednictwem SMP, aby ułatwić scentralizowane przechowywanie, śledzenie przepływów pracy przetwarzania i zarządzanie logistyką.Wstępnie załaduj informacje, takie jak identyfikator zestawu próbek, identyfikator próbki, data, godzina i współrzędne globalnego systemu pozycjonowania, aby zapewnić zgodność z typami danych i zminimalizować błąd. Dołącz link do prośby o odbiór próbki dla uczestników, z którego mogą skorzystać po zebraniu wszystkich próbek. Zbuduj zestaw, który zawiera wszystkie materiały do pobierania próbek, w tym niezbędne środki ochrony osobistej, takie jak maska i rękawiczki, protokół pobierania próbek oraz informacje dotyczące bezpieczeństwa biologicznego.Wymaz rzadko dezynfekowane powierzchnie w gospodarstwach domowych i środowisku miejskim, zwilżając wacik chłonny z poliestru o powierzchni jednego centymetra kwadratowego detergentem i przecierając powierzchnię o powierzchni 10 centymetrów kwadratowych. Wspomagany wykałaczką, zanurz każdy wymazówkę próbki we wstępnie oznakowanej probówce zawierającej 200 mikrolitrów tiocyjanianu guanidyny. Nosić dostarczoną maskę i nową parę rękawiczek do pobierania każdej próbki, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.Po zakończeniu pobierania próbek użyj dołączonego środka do dezynfekcji rąk. Przechowuj probówki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu ich transportu do laboratorium. Gdy próbki dotrą do laboratorium, przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Aby zwiększyć szybkość przesiewania, próbki należy przetwarzać w kałużach. Jeśli pula jest dodatnia, wyekstrahuj RNA z każdej próbki niezależnie. Połącz próbki z każdego zestawu do pobierania próbek w dwie pule, łącząc 50 mikrolitrów każdej z ośmiu próbek w probówce mikrowirówkowej i zapisując pozostałe próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.Dodaj 80 mikrolitrów chloroformu i wiruj przez 15 sekund. Następnie inkubować przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wirować w temperaturze 13 000 razy G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś warstwę wodną do nowej probówki do mikrowirówki. Przechowuj pozostały interfejs i różowy płyn w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Frakcje te zawierają DNA i białka.Ekstrahować RNA z odzyskanej warstwy wodnej przy użyciu surowego protokołu ekstrakcji RNA na bazie tiocyjanianu guanidyny. Przygotować mieszaninę reakcyjną RT-LAMP w temperaturze pokojowej z 10% nadmiarem objętości, aby uwzględnić straty w pipetowaniu. Dodaj pięć mikrolitrów RNA do reakcji próbki i pięć mikrolitrów RNA plus 2,5 mikrolitrów syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do reakcji wzbogaconej.Dodaj 2,5 mikrolitra syntetycznego RNA SARS-CoV-2 do kontroli pozytywnej i pięć mikrolitrów wody do kontroli ujemnej. Dobrze wymieszaj i odkręć reakcje. W przypadku obserwacji kolorymetrycznej wynik ujemny jest oznaczony kolorem różowym, a wynik pozytywny jest oznaczony kolorem żółtym.Po RT-LAMP należy wykonać elektroforezę żelową. Rozmieszczenie miejsc pobierania próbek przedstawiono tutaj. Większość zestawów była kompletna, a odpowiednie dane zostały przesłane do systemu LIMS.Granica wykrywalności przy częstotliwości 100% wynosiła 500 kopii na 25 mikrolitrów reakcji. W kolorymetrycznej lampie RT-LAMP dodatnie próbki zmieniły kolor z różowego na żółty z powodu zmiany pH z ośmiu do 5,5. Przy niskiej liczbie kopii próbki badano na żelu agarozowym, aby potwierdzić wyniki dodatnie z uzyskanym wzorem przypominającym drabinę.Metody RT QPCR przetestowano na próbkach środowiskowych. Wszystkie mieszaniny wzorcowe były wrażliwe na inhibitory przy niskich stężeniach liczby kopii kontroli pozytywnej. Przy niskich stężeniach matrycy tradycyjne metody RT PCR wykazywały wyniki fałszywie dodatnie i fałszywie ujemne.Wreszcie, technika zwana amplifikacją toczącego się koła wykryła niewielkie ilości sekwencji docelowej. Wykazał jednak amplifikację sondy przy braku matrycy RNA. Konieczne jest wystosowanie wezwania do działania, które dotrze do wszystkich sektorów społeczności, tak aby pobieranie próbek rzeczywiście odzwierciedlało ryzyko narażenia wszystkich członków tej społeczności.Platforma ta wykrywa materiał genetyczny SARS-CoV-2. Kolejnym krokiem są badania mające na celu sprawdzenie żywotności wirusa.

swabbing-urban-environment-pipeline-for-sampling-detection-sars-cov-2

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wysokoprzepustowe testowanie patogenów opartych na DNA i RNA za pomocą nanoskalowego PCR jest opisane za pomocą syndromicznego panelu PCR na psach i koniach.

Wysokoprzepustowe wykrywanie patogenów układu oddechowego w próbkach zwierzęcych metodą nanoscale PCR

Metodologia pobierania próbek oparta na makropianie została opracowana i oceniona pod kątem wykrywania i kwantyfikacji norowirusa na twardych powierzchniach środowiskowych.

Metoda pobierania wymazów w celu wykrycia ludzkiego norowirusa na powierzchniach

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Ta praca podsumowuje kroki nad opracowaniem różnych testów do wykrywania SARS-CoV-2 przy użyciu dwukolorowego systemu ddPCR. Kroki są skomplikowane i dołączono uwagi dotyczące tego, jak poprawić wyniki testów i eksperymentów. Testy te mogą być stosowane w wielu zastosowaniach SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Dwuetapowe cyfrowe protokoły PCR z kroplami odwrotnej transkrypcji do wykrywania i kwantyfikacji SARS-CoV-2

Protokół opisuje metodę diagnostyczną SARS-CoV-2, która wykorzystuje automatyzację open-source do przeprowadzania testów molekularnych RT-qPCR próbek śliny. To skalowalne podejście może być stosowane w klinicznym nadzorze nad zdrowiem publicznym, a także w celu zwiększenia wydajności mniejszych laboratoriów uniwersyteckich.

Skuteczna ilościowa strategia diagnostyki śliny metodą PCR z odwrotną transkryptazą SARS-CoV-2 z wykorzystaniem robotów do pipetowania typu open source

Ten protokół ma na celu ilościowe określenie RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza, które mają być wykorzystane do badań epidemiologicznych opartych na ściekach oraz ocenę ryzyka narażenia na SARS-CoV-2 w aerozolach wewnątrz i na zewnątrz. Protokół ten opisuje również podejście do sekwencjonowania długiego szablonu amplikonu w celu charakterystyki całego genomu SARS-CoV-2.

Kwantyfikacja i charakterystyka całego genomu RNA SARS-CoV-2 w próbkach ścieków i powietrza

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

Tutaj udostępniamy kompletny protokół do standaryzacji i implementacji metody wykrywania wirusa SARS-CoV-2 w próbkach ludzkich za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji (RT-LAMP). Ta metoda, wykonana w ciągu 60 minut, może być dostosowana do każdego laboratorium lub punktu opieki nad pacjentem przy niskich kosztach i przy użyciu niedrogiego sprzętu.

Wykrywanie wirusa SARS-CoV-2 za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli odwrotnej transkrypcji

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Mikromacierze tkankowe stanowią efektywną metodę jednoczesnego pozyskiwania informacji z wielu tkanek. Reprezentatywne fragmenty tkanek są łączone w jednym bloku parafiny. Przekroje z bloku wykorzystuje się do immunohistochemii oraz analizy wzorców ekspresji białek. Skanowanie cyfrowe pozwala na wygenerowanie odpowiadających im obrazów w celu dystrybucji danych.

Produkcja macierzy mikrotkankowych, barwienie immunohistochemiczne i digitalizacja w ramach projektu Human Protein Atlas

Poznaj metodę wykrywania SARS-CoV-2 na miejskich powierzchniach rzadko czyszczonych przy użyciu próbek środowiskowych i testu RT-LAMP. Protokół wykorzystuje łatwo dostępne materiały oraz udział obywateli naukowców.

Wymazy ze środowiska miejskiego - rurociąg do pobierania próbek i wykrywania SARS-CoV-2 ze zbiorników środowiskowych

Przeglądaj więcej filmów