Name: Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Poznaj metody ekstrakcji, oczyszczania i profilowania gangliozydów z tkanki nerwowej. Techniki te maksymalizują wydajność izolacji i umożliwiają analizę jakościową oraz półilościową tych kluczowych lipidów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health (NIH) Common Fund for Glycoscience U01CA241953. MJP był wspierany przez Chemistry-Biology Interface Program na Uniwersytecie Johnsa Hopkinsa (T32GM080189).

Pobieranie tkanek przeprowadzono zgodnie z warunkami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Johns Hopkins.
1. Małoskalowa ekstrakcja i częściowe oczyszczanie gangliozydów
OSTROŻNIE: Podczas pracy z lotnymi i toksycznymi rozpuszczalnikami należy zapewnić odpowiednią wentylację. Należy unikać stosowania tworzyw sztucznych; rozpuszczalniki mogą wyekstrahować z wielu plastików składniki chemiczne, które zakłócają późniejsze analizy. Wyjątkiem jest politetrafluoroetylen (PTFE); do zamykania szklanych fiolek do przechowywania należy używać zakrętek wyłożonych PTFE.
<ol>
	<li>Ekstrakcja
	<ol>
		<li>Zważyć pojedynczy świeży lub rozmrożony mózg mysi (lub połowę mózgu w przekroju strzałkowym, ~ 0,2-0,5 g) i umieścić w homogenizatorze Pottera-Elvehjema schłodzonym w naczyniu z lodem. 
		UWAGA: Wcześniej zamrożone mózgi można wykorzystać po rozmrożeniu w temperaturze 0-4 °C.</li>
		<li>Dodać 4,1 mL wody na 1 g masy mokrej tkanki i homogenizować za pomocą 10 pociągnięć. 
		UWAGA: Precyzyjne proporcje rozpuszczalników są kluczowe dla optymalnej ekstrakcji i rozdziału; celem jest uzyskanie stosunku chloroform-metanol-woda (4:8:3), zakładając, że tkanka mózgowa składa się w 80% z wody.</li>
		<li>Dodać 13 mL metanolu na 1 g masy mokrej tkanki, pozostawić do osiągnięcia temperatury otoczenia (22 °C) i wymieszać. 
		&#8203;UWAGA: Roztwór stanie się mętny. Dodanie metanolu na tym etapie, bez chloroformu, optymalizuje wytrącanie białek. Wszystkie kolejne kroki wykonuje się w temperaturze otoczenia (22 °C).</li>
		<li>Przenieść do grubościennej szklanej probówki z nakrętką z wkładką PTFE w temperaturze otoczenia (22 °C) i dokładnie wymieszać. Dodać 6,5 mL chloroformu na 1 g masy mokrej tkanki, zakręcić i dokładnie wymieszać. Wirować przy 450 x g przez 15 min. Przenieść klarowny supernatant do nowej probówki z nakrętką i zmierzyć jego objętość, tzw. „objętość odzyskanego ekstraktu”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdział
	<ol>
		<li>Dodać do klarownego supernatantu wodę w ilości 0,173x „objętości odzyskanego ekstraktu”, zakręcić, energicznie wymieszać w wortexie i wirować zgodnie z opisem w punkcie 1.1.4. 
		UWAGA: Celem jest uzyskanie stosunku chloroform-metanol-woda 4:8:5,6. Mieszanina będzie mętna i rozdzieli się na dwie fazy: górną fazę bogatą w wodę oraz dolną fazę bogatą w chloroform w stosunku ok. 4:1. Odczekać 60 min lub wirować przy 450 x g przez 15 min do całkowitego rozdzielenia faz.</li>
		<li>Przenieść górną fazę, zawierającą gangliozydy, do nowej szklanej probówki z nakrętką z wkładką PTFE.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia na kolumnach przeciwprądowych (odwrócona faza)
	<ol>
		<li>Używając szklanej strzykawki o objętości 5 mL, przemyć wkład SPE tC18 (400 mg) 3 mL metanolu, a następnie 3 mL mieszaniny chloroform-metanol-woda (2:43:55). Nanieść górną fazę z punktu 1.2.2 na wkład tC18 za pomocą&#160;tej samej szklanej strzykawki, zebrać effluent i nanieść go ponownie na kolumnę w celu optymalizacji adsorpcji.</li>
		<li>Używając szklanej strzykawki, przemyć wkład 3 mL mieszaniny chloroform-metanol-woda (2:43:55), a następnie 3 mL mieszaniny metanol-woda (1:1).</li>
		<li>Eluować gangliozydy 3 mL metanolu do nowej probówki z nakrętką. Odparować do sucha pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze ≤ 45 °C. Rozpuścić w metanolu w ilości 1 mL na 1 g pierwotnej masy mokrej tkanki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Wielkoskalowa ekstrakcja i oczyszczanie gangliozydów
UWAGA: Podczas pracy z lotnymi rozpuszczalnikami należy używać blenderów w wykonaniu przeciwwybuchowym. Nie należy stosować tworzyw sztucznych z wyjątkiem PTFE. Tetrahydrofuran, chloroform i eter etylowy są toksycznymi lotnymi związkami organicznymi. Pracować w dygestorium, stosując rękawice ochronne i okulary ochronne.
<ol>
	<li>Ekstrakcja
	<ol>
		<li>Rozmrozić zamrożony mózg bydlęcy w temperaturze 4 °C przez kilka godzin. Oddzielić szarą istotę od opon mózgowych i białej istoty. 
		UWAGA: Poniższa procedura jest opisana dla 100 ± 20 g wyizolowanej szarej istoty mózgu i jest skalowalna.</li>
		<li>Umieścić 100 g szarej istoty mózgu w blenderze i dodać 1 mL na g mokrej masy mózgu schłodzonego 10 mM buforu fosforanowego potasu o pH 6,8. Homogenizować na niskich obrotach przez 20 s. Dodać 8 mL tetrahydrofuranu na g mokrej masy mózgu i homogenizować na niskich obrotach przez 10 s. Przelać do szklanych butelek do wirowania i wirować przy 5 000 x g przez 15 min w temperaturze pokojowej (22 °C).</li>
		<li>Zebrać nadfiltr, zmierzyć jego objętość i przenieść do szklanego rozdzielacza. Dodać 0,3 mL eteru etylowego na 1 mL nadfiltru. Wstrząsnąć energicznie, a następnie pozostawić w spokoju na 30 min, aż oddzielą się dwie fazy: górna faza eterowa i dolna faza wodna. Zebrać dolną fazę, zawierającą gangliozydy, do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE.</li>
		<li>Do górnej (eterowej) fazy pozostałej w rozdzielaczu dodać 0,1 mL wody na 1 mL pierwotnego nadfiltru (krok 2.1.3). Wstrząsnąć energicznie, pozwolić fazom się rozdzielić, zebrać dolną (wodną) fazę i połączyć z poprzednią dolną fazą. Odparować połączone fazy dolne do postaci suchego proszku i zważyć.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Saponifikacja
	<ol>
		<li>Do szczelnej probówki dodać 10 mL 100 mM wodnego NaOH na g proszku. Wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 h. Pozostawić do ostygnięcia i doprowadzić do pH 4,5 poprzez kroplowe dodawanie 100 mM wodnego HCl. Zmierzyć objętość i przenieść do szklanego rozdzielacza. 
		UWAGA: Kwasy sialowe są labilne w środowisku kwasowym; należy unikać zakwaszania poniżej pH 4,5.</li>
		<li>W zależności od objętości wodnej dodać 2,67 objętości metanolu, delikatnie wymieszać, a następnie dodać 1,33 objętości chloroformu, aby utworzyć jednofazowy roztwór chloroform-metanol-woda (4:8:3). Dobrze wymieszać.</li>
		<li>W zależności od pierwotnej objętości wodnej dodać 2,6 objętości wody, aby doprowadzić mieszaninę chloroform-metanol-woda do stosunku 4:8:5,6. Wstrząsnąć energicznie, a następnie pozostawić w spokoju, aby oddzieliły się dwie fazy: polarna faza górna zawierająca gangliozydy i niepolarna faza dolna. Zebrać fazę górną do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE. 
		UWAGA: Lipidy niesjalilowane nie będą widoczne na płytkach do chromatografii cieczowej (TLC) barwionych rezorcynolem, ale pojawią się przy użyciu barwienia p-anisaldehydem. Celem tej saponifikacji jest usunięcie związków O-acetylowanych, takich jak fosfolipidy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Chromatografia w odwróconej fazie
	<ol>
		<li>Wstępnie przemyć w dużej skali (10 g) wkład z ekstrakcji do fazy stałej tC18, przepuszczając przez kolumnę 50 mL każdego z trzech następujących rozpuszczalników za pomocą próżni lub ciśnienia (&#60; 1 min na każde przemycie): metanol, metanol-woda (1:1), a następnie chloroform-metanol-woda (2:43:55). Nanieść fazę górną z kroku 2.2.3 na kolumnę za pomocą próżni lub ciśnienia, zebrać przepłuczynę, nanieść ponownie i zebrać przepłuczynę.</li>
		<li>Przemyć kolumnę 30 mL roztworu chloroform-metanol-woda (2:43:55), a następnie 30 mL metanol-woda (1:1), po czym eluować gangliozydy 50 mL metanolu, a następnie ponownie 10 mL metanolu, zbierając każde przemycie i każdą elucję oddzielnie. Za pomocą TLC (poniżej) potwierdzić, że gangliozydy nie występują w przepłuczynie i przemyciach, lecz są eluowane w pierwszej elucji (50 mL metanolu). Odparować eluowane gangliozydy do postaci suchego proszku i zważyć. 
		UWAGA: Celem chromatografii tC18 jest oddzielenie gangliozydów od zanieczyszczeń mniej i bardziej polarnych. Wydajność mieszanych gangliozydów mózgu po saponifikacji wynosi ~ 120 mg na g suchego ekstraktu z mózgu (krok 2.1.4). Pojawienie się gangliozydów w przepłuczynie lub przemyciach w analizie TLC wskazuje na nasycenie kolumny do ekstrakcji w fazie stałej. Po elucji metanolem kolumnę można dalej eluować chloroformem i metanolem (1:1), aby wychwycić lipidy mniej polarne.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oczyszczanie poszczególnych gangliozydów metodą HPLC
	<ol>
		<li>Przygotować rozpuszczalnik HPLC A: acetonitryl-5 mM wodny bufor fosforan sodu pH 5,6 (83:17) oraz rozpuszczalnik B: acetonitryl-20 mM bufor fosforan sodu, pH 5,6 (1:1). Odgazować oba rozpuszczalniki przez 5 min.</li>
		<li>Wstępnie wyrównać kolumnę HPLC (kolumna 20 x 250 mm wypełniona sferami krzemionkowymi z wiązaniami aminowymi (NH2), średnica 5 µm, rozmiar porów 100 Å) 100% rozpuszczalnika A przez 20 min przy przepływie 5 mL/min. Ustawić detektor UV effluentu kolumny HPLC na 215 nm.</li>
		<li>Rozpuścić proszek gangliozydowy z eluatu z fazy odwróconej w wodzie w stężeniu 5 mg/mL. Wstrzyknąć 0,5 mL mieszaniny gangliozydów do HPLC i przeprowadzić gradient rozpuszczalnika (Tabela 1) przy 5 mL/min, zbierając frakcje. Gangliozydy pojawią się jako piki A215 z czasami retencji (główne gangliozydy mózgu) od 25 do 70 min: GM1 ≈ 28 min; GD1a ≈ 38 min; GD1b ≈ 46 min; GT1b ≈ 65 min. Po każdym przebiegu ponownie wyrównać kolumnę przez 20 min rozpuszczalnikiem A. Analizować frakcje za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Czas (min)</td>
			<td>%A</td>
			<td>%B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12</td>
			<td>63</td>
			<td>37</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82</td>
			<td>54</td>
			<td>46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>82.01</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>92</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Gradient rozpuszczalnika dla HPLC.
3. Analiza gangliozydów za pomocą cienkowarstwowej chromatografii (TLC)
OSTRZEŻENIE: Chloroform jest toksycznym, lotnym związkiem organicznym. Pracuj pod wyciągiem laboratoryjnym, używając rękawic ochronnych i okularów ochronnych.
<ol>
	<li>Przygotowanie układu rozwijającego i płytek TLC
	<ol>
		<li>Przygotować układ rozwijający składający się z chloroformu, metanolu i 0,25% KCl w wodzie (60:35:8 obj.). Wlać go do szklanej komory TLC o wymiarach 10 cm x 10 cm z pokrywą ze stali nierdzewnej tak, aby głębokość rozpuszczalnika wynosiła ~ 0,5 cm. Przykryć i pozostawić do wyrównania w miejscu wolnym od przeciągów przez &#62;10 min. 
		UWAGA: Aby odizolować komorę TLC od przeciągów, można zbudować lub kupić akrylowe pudełko zamknięte z pięciu stron&#160; (Rysunek 2). Wewnątrz komory nie należy stosować nasyconego rozpuszczalnikiem papieru filtracyjnego.</li>
		<li>Umieścić wysokowydajną płytkę TLC z żelem krzemionkowym na szklanym podłożu o wymiarach 10 cm x 10 cm lub 5 cm x 10 cm w suszarce w temperaturze 125 °C na 10 min. Pozostawić do ostygnięcia. Za pomocą tępego ołówka nr 2 narysować linie nakładania próbek o długości 5 mm z odstępami 2 mm wzdłuż linii znajdującej się 1 cm nad dolną krawędzią płytki i co najmniej 1 cm od każdej z krawędzi bocznych (Rysunek 3). Podczas zaznaczania należy unikać uszkadzania warstwy krzemionki.</li>
		<li>Przygotować standardową mieszaninę czystych gangliozydów w metanolu zawierającą 100 µM GM1, po 50 µM GD1a i GD1b oraz 33 µM GT1b. 
		UWAGA: Mieszanina ta zawiera po 100 pmol kwasu sialowego gangliozydów na µL dla każdego z czterech gangliozydów, co zapewnia silny sygnał kolorymetryczny podczas barwienia rezorcynolem, które jest zależne od obecności kwasu sialowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozdzielanie gangliozydów
	<ol>
		<li>Przepłukać strzykawkę Hamiltona o pojemności 10 µL z ściętą igłą metanolem. Nabrać 1 µL metanolu do szklanej strzykawki, aby wypełnić martwą przestrzeń igły, a następnie 1 µL próbki lub standardu. Równomiernie nanieść próbkę na wcześniej zaznaczone linie 5-mm, aż w strzykawce pozostanie &#60;1 µL rozpuszczalnika (metanolu). Po naniesieniu wszystkich próbek pozostawić płytkę do wyschnięcia w temperaturze otoczenia (22 °C). 
		UWAGA: Między nakładaniem poszczególnych próbek należy przepłukać strzykawkę metanolem. Do przyspieszenia suszenia można użyć niepodgrzewanego nawiewu powietrza ustawionego na niską moc.</li>
		<li>Umieścić naniesioną i wysuszoną płytkę w uprzednio wyrównanej komorze TLC tak, aby dolna krawędź była zanurzona w układzie rozwijającym; następnie przykryć i chronić przed przeciągami (Rysunek 2). Pozostawić rozpuszczalnik do przesunięcia się w górę płytki drogą kapilarną, aż czoło rozpuszczalnika dotrze na odległość 1 cm od górnej krawędzi płytki. Wyjąć płytkę i zaznaczyć ołówkiem linię czoła rozpuszczalnika na krawędzi. Pozostawić rozpuszczalniki do całkowitego odparowania, bez ingerencji lub pod wpływem łagodnego strumienia powietrza.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Wyposażenie i konfiguracja TLC gangliozydów. Komora z podwójną korytkiem jest wypełniona rozpuszczalnikiem ruchomym do poziomu ≈ 0.5 cm po obu stronach. Płytkę umieszcza się przy jednej ściance, tak aby koniec z linią startową był zanurzony w buforze ruchomym. Komora jest przykryta akrylowym pudełkiem, aby uniknąć prądów powietrza. Panel A, widok z boku przed włożeniem płytki. Poziom rozpuszczalnika jest widoczny kilka mm nad dnem komory; Panel B, widok z przodu podczas rozwijania. Front rozpuszczalnika jest widoczny na wysokości około 40% płytki. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="3">
	<li>Barwienie gangliozydów 
	UWAGA: Odczynniki barwiące są toksyczne. Kwas solny jest żrący i toksyczny. Przygotowywanie i rozpylanie odczynników należy przeprowadzać w dygestorium, stosując rękawice ochronne i gogle bezpieczeństwa. 
	UWAGA: Płytkę można poddać obrazowaniu do jakościowej analizy obrazu lub przechowywać, zdejmując zaciski i mocując płytkę przykrywkową za pomocą przezroczystej taśmy. Analizę ilościową można przeprowadzić, mierząc densytometrię wzorców gangliozydów naniesionych w sąsiednich ścieżkach.
	<ol>
		<li>Przygotować odczynnik do rozpylania z rezorcynolem do detekcji gangliozydów na podstawie ich kwasów sialowych. Rozpuścić 6 g rezorcynolu w 100 mL wody, aby uzyskać 6% roztwór stokowy rezorcynolu. Rozpuścić 1 g CuSO4 w 100 mL wody, aby przygotować 1% roztwór stokowy. Do 64,7 mL wody dodać 5 mL 6% roztworu stokowego rezorcynolu, 0,31 mL 1% roztworu stokowego CuSO4, następnie powoli dodać 30 mL stężonego HCl i delikatnie wymieszać. Roztwór może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez miesiąc.</li>
		<li>W dygestorium chemicznym umieścić płytkę TLC z rozdzielonymi gangliozydami (końcem startowym do góry) w wyciętym pudełku tekturowym, aby chronić ściany dygestorium przed rozpylonym kwasem. Odczynnik z rezorcynolem przelać do szklanego rozpylacza do TLC, podłączyć do źródła sprężonego azotu i lekko rozpylić na płytkę po przekątnej w kierunkach pionowym i poziomnym. Powierzchnię sorbentu TLC należy rozpylać równomiernie, lecz delikatnie.</li>
		<li>Płytkę natychmiast przykryć czystą, suchą szklaną płytką przykrywkową o tych samych wymiarach i zamocować ją za pomocą zacisków biurowych (Rycina 3). Przykrytą płytkę ogrzewać w temperaturze 125 °C przez 20 min. Gangliozydy pojawią się w ciemnofioletowym kolorze na białym tle. 
		UWAGA: Po zakończeniu rozpylania płytka nie powinna wyglądać na mokrą. Płytki przykrywkowe można wykonać, zdrapując sorbent z wcześniej używanych płytek TLC za pomocą jednokrawędziowej żyletki. 
		UWAGA: Pył krzemionkowy jest toksyczny dla płuc. Należy używać maski i utylizować krzemionkę w szczelnym pojemniku.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Płytka TLC z rozdziałem mieszanych gangliozydów. Płytka TLC z rozdziałem standardów mieszanych gangliozydów (lewy pas) oraz oczyszczonych mieszanych gangliozydów z szarej substancji mózgowej bydlęcej (prawy pas) po barwieniu rezorcynolem i podgrzewaniu z przypiętą szklaną płytką przykryciową. Standardowe gangliozydy (od góry do dołu) to GM3, GM2, GM1, GD3, GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b. Po ostygnięciu płytkę można sfotografować i/lub przymocować płytkę przykryciową taśmą w celu przechowywania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<ol start="4">
	<li>Ogólne barwienie lipidów w celu wykrycia gangliozydów i fosfolipidów. 
	&#8203;OSTROŻNIE: Kwas siarkowy jest toksyczny i żrący. Dodawanie stężonego kwasu do etanolu jest procesem egzotermicznym i musi być przeprowadzane powoli. Odczynnik barwiący należy przygotowywać w dygestorium, stosując rękawice ochronne i gogle bezpieczeństwa.
	<ol>
		<li>Przygotuj pbarwienie p-anisaldehydem poprzez powolne dodanie 15 ml stężonego kwasu siarkowego do 500 ml etanolu. Mieszać przez 30 min, aby roztwór ostygł przed kontynuacją. Dodać 15 ml p-anizaldehyd i delikatnie wymieszać. Można przechowywać w temperaturze pokojowej (22 &#176;C) do sześciu miesięcy.</li>
		<li>W dygestorium zanurzyć płytkę TLC z rozdzielonymi gangliozydami, zaczynając od linii startu&#160;w dół, do zlewki zawierającej pbarwienie p-anisaldehydem. Zanurzyć czoło przemieszczenia na ≥ 2 s. Wyjąć płytkę TLC z barwnika i pozwolić jej odcieknąć. Podgrzać płytkę TLC na płycie grzejnej w niskiej temperaturze w celu wywołania barwienia. 
		UWAGA: Lipidy będą widoczne jako ciemne obszary na fioletowym tle. Roztwór barwiący można odzyskać do ponownego użycia.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Gangliosides%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Carbohydrate+Chemistry+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Biology of Gangliosides.</a> Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry. 76, 113-148 (2019).</li>
<li>DeMarco, M. L., Woods, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic-resolution+conformational+analysis+of+the+GM3+ganglioside+in+a+lipid+bilayer+and+its+implications+for+ganglioside-protein+recognition+at+membrane+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Atomic-resolution conformational analysis of the GM3 ganglioside in a lipid bilayer and its implications for ganglioside-protein recognition at membrane surfaces.</a> Glycobiology. 19 (4), 344-355 (2009).</li>
<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides+of+the+vertebrate+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Gangliosides of the vertebrate nervous system.</a> Journal of Molecular Biology. 428, 3325-3336 (2016).</li>
<li>Klenk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+die+Ganglioside%2C+eine+neue+Gruppe+von+zuckerhaltigen+Gehirnlipoiden+%5BAbout+gangliosides%2C+a+new+group+of+sugar-containing+brain+lipids%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Hoppe-Seyler%27s+Zeitschrift+f%C3%BCr+Physiologische+Chemie%22%5BJournal%5D)">Über die Ganglioside, eine neue Gruppe von zuckerhaltigen Gehirnlipoiden [About gangliosides, a new group of sugar-containing brain lipids].</a> Hoppe-Seyler's Zeitschrift für Physiologische Chemie. 273, 76-86 (1942).</li>
<li>Uemura, S., Go, S., Shishido, F., Inokuchi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+machinery+of+GM4%3A+the+excess+amounts+of+GM3%2FGM4S+synthase+%28ST3GAL5%29+are+necessary+for+GM4+synthesis+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">Expression machinery of GM4: the excess amounts of GM3/GM4S synthase (ST3GAL5) are necessary for GM4 synthesis in mammalian cells.</a> Glycoconjugate Journal. 31 (2), 101-108 (2014).</li>
<li>Nimrichter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-selectin+receptors+on+human+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">E-selectin receptors on human leukocytes.</a> Blood. 112 (9), 3744-3752 (2008).</li>
<li>Saito, M., Kitamura, H., Sugiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+heptasialosyl+c-series+ganglioside+in+embryonic+chicken+brain%3A+its+structure+and+stage-specific+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A novel heptasialosyl c-series ganglioside in embryonic chicken brain: its structure and stage-specific expression.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1571 (1), 18-26 (2002).</li>
<li>Todeschini, A. R., Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+glycosphingolipids+and+gangliosides+in+control+of+cell+adhesion%2C+motility%2C+and+growth%2C+through+glycosynaptic+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Functional role of glycosphingolipids and gangliosides in control of cell adhesion, motility, and growth, through glycosynaptic microdomains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1780 (3), 421-433 (2008).</li>
<li>Sturgill, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+the+major+brain+gangliosides+GD1a+and+GT1b%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of the major brain gangliosides GD1a and GT1b.</a> Glycobiology. 22, 1289-1301 (2012).</li>
<li>Cavdarli, S., Delannoy, P., Groux-Degroote, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((O-Acetylated+gangliosides+as+targets+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">O-Acetylated gangliosides as targets for cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), (2020).</li>
<li>Varki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symbol+nomenclature+for+graphical+representations+of+glycans%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Symbol nomenclature for graphical representations of glycans.</a> Glycobiology. 25 (12), 1323-1324 (2015).</li>
<li>Schnaar, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 348-370 (1994).</li>
<li>Svennerholm, L., Fredman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+procedure+for+the+quantitative+isolation+of+brain+gangliosides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A procedure for the quantitative isolation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 617, 97-109 (1980).</li>
<li>Tettamanti, G., Bonali, F., Marchesini, S., Zambotti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+procedure+for+the+extraction%2C+purification+and+fractionation+of+brain+gangliosides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">A new procedure for the extraction, purification and fractionation of brain gangliosides.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 296, 160-170 (1973).</li>
<li>Gazzotti, G., Sonnino, S., Ghidoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal-phase+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+non-derivatized+ganglioside+mixtures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Normal-phase high-performance liquid chromatographic separation of non-derivatized ganglioside mixtures.</a> Journal of Chromatography. 348, 371-378 (1985).</li>
<li>Schnaar, R. L., Needham, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thin-layer+chromatography+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Thin-layer chromatography of glycosphingolipids.</a> Methods in Enzymology. 230, 371-389 (1994).</li>
<li>Ledeen, R. W., Yu, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gangliosides%3A+structure%2C+isolation%2C+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Gangliosides: structure, isolation, and analysis.</a> Methods in Enzymology. 83, 139-191 (1982).</li>
<li>Lopez, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+lacking+sialyltransferase+ST3Gal-II+develop+late-onset+obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Mice lacking sialyltransferase ST3Gal-II develop late-onset obesity and insulin resistance.</a> Glycobiology. 27 (2), 129-139 (2017).</li>
</ol>

Autorzy twierdzą, że nie ma sprzecznych interesów.

Opisane tutaj metody ekstrakcji i izolacji gangliozydów na małą i dużą skalę nie są unikalne - istnieje wiele różnych podejść do ekstrakcji i oczyszczania rozpuszczalnikiem, które zapewniają doskonałe wyniki12. Opisane tutaj metody oczyszczania mózgu na małą skalę, opracowane przez Fredmana i Svennerholma13, wykazały, że optymalizują regenerację i okazały się solidne i proste przez wiele lat w naszym laboratorium. Izolację i oczyszczanie odpowiednie dla TLC i SM można łatwo...

Gangliozydy definiuje się jako glikosfingolipidy posiadające jedną lub więcej reszt kwasu sialowego1. Są one eksprymowane głównie na powierzchni komórki, przy czym ich hydrofobowa część lipidowa w postaci ceramidu jest osadzona w zewnętrznej warstwie błony plazmatycznej, a ich hydrofilowe glikany rozciągają się w przestrzeń zewnątrzkomórkową2. Choć występują powszechnie w komórkach i tkankach kręgowców, są szczególnie obficie reprezentowane w mózgu kręgowców3, gdzie zostały po raz pierwszy odkryte i nazwane4.
Struktury glikanów gangliozydów są zróżnicowane i stanowią podstawę ich nomenklatury (Rysunek 1). Glikany gangliozydów składają się z neutralnego rdzenia cukrowego, który posiada różną liczbę i rozmieszczenie kwasów sjalowych. Najmniejszy gangliozyd, GM4, posiada tylko dwa cukry (kwas sjalowy związany z galaktozą)5. Większe, naturalnie występujące gangliozydy mogą zawierać łącznie ponad tuzin cukrów6 lub do siedmiu kwasów sjalowych na jednym neutralnym rdzeniu7. Ich lipidowe części ceramidowe również są zróżnicowane, wykazując różną długość sfingozyny oraz różnorodność amidów kwasów tłuszczowych. W mózgu kręgowców przeważają cztery rodzaje gangliozydów: GM1, GD1a, GD1b i GT1b. Ekspresja gangliozydów jest regulowana rozwojowo, specyficzna dla tkanki oraz specyficzna dla typu komórek.
<img alt="Rysunek 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62385/62385fig01.jpg" /> 
Rysunek 1: Główne gangliozydy mózgowe i ich prekursory biosyntetyczne. Struktury przedstawiono zgodnie z systemem Symbol Nomenclature for Glycans11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62385/62385fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Gangliozydy działają na poziomie molekularnym poprzez angażowanie i modulowanie białek w obrębie własnych błon (regulacja cis) lub poprzez angażowanie białek wiążących glikany w środowisku zewnątrzkomórkowym, w tym toksyn bakteryjnych oraz lektyn na innych komórkach (rozpoznawanie trans)3. Specyficzne wiązanie gangliozydów z białkami regulatorowymi i/lub samoorganizacja z innymi cząsteczkami w tratwy lipidowe prowadzi do zmian w zachowaniu komórek, które wpływają na strukturę i funkcję układu nerwowego, progresję nowotworów, metabolizm, stan zapalny, proteinopatie neuronalne oraz choroby zakaźne8. Ze względu na ich zróżnicowane role komórkowe, metody ich izolacji i analizy mogą dostarczyć pogłębionej wiedzy na temat regulacji procesów fizjologicznych i patologicznych. W niniejszym materiale przedstawiono zwalidowane metody szybkiej ekstrakcji i analizy w małej skali oraz izolację gangliozydów z mózgu w skali preparatywnej. Omówiono możliwości i wyzwania związane z zastosowaniem tych metod w odniesieniu do innych tkanek.

<table><tbody><tr><td>Mózg bydlęcy, pozbawiony</td><td>PelFreez</td><td>57105-1</td><td></td></tr><tr><td>Wzorce gangliozydowe</td><td>Matreya</td><td>GM1, 1061; GD1a, 1062; GD1b, 1501; GT1b, 1063</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka z nakrętką wyłożoną PTFE</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-911-739</td><td></td></tr><tr><td>Szklana butelka wirówkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-586B</td><td></td></tr><tr><td>Szklane probówki hodowlane, 16 x 125 mm</td><td>VWR</td><td>60825-430</td><td>do zbierania frakcji HPLC</td></tr><tr><td>Szklany lejek separacyjny (2 L)</td><td>Pyrex</td><td>6400-2L</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka iniekcyjna - Hamilton 1750 gazoszczelne 500 i mikro; l</td><td>Hamilton</td><td>81265</td><td></td></tr><tr><td>p-Aldehyd anusowy, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&nbsp; A88107</td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator Potter-Elvhjem</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td>Wybierz odpowiednią opcję objętości</td></tr><tr><td>Reprosil 100 NH2 10&micro; m Kolumny ochronne 5x4mm</td><td>Analytics-Shop</td><td>AAVRS1N-100540-5</td><td></td></tr><tr><td>Reprospher 100 NH2, 5 &mu; m, 250 mm x 20 mm Kolumna HPLC</td><td>Analytics-Shop</td><td>pakowane na zamówienie</td><td>dostępne inne rozmiary</td></tr><tr><td>Rezorcinol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30752-1</td><td></td></tr><tr><td>Parownik obrotowy</td><td>Buchi</td><td>R-300</td><td></td></tr><tr><td>Pętla próbki do wtryskiwacza model 7725 (5 ml)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57632</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 Cartidges Vac 35 cc (10 g)</td><td>Wody</td><td>WAT043350</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 Plus Krótki wkład, 400 mg</td><td>wody</td><td>WAT036810</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka do plam - Hamilton 701N 10 &micro; l</td><td>Hamilton</td><td>80300</td><td></td></tr><tr><td>Grubościenne probówki o średnicy 13 mm z nakrętkami wyłożonymi PFTE</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-933A</td><td></td></tr><tr><td>Gwintowane fiolki 2 ml z nakrętkami wyłożonymi PFTE</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-323</td><td>Do przechowywania gangliozydów</td></tr><tr><td>Płytki TLC, HPTLC Żel krzemionkowy 60 F254 Multiformat</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1056350001</td><td>Impregnacja fluorescencyjna (F254) stabilizuje sorbent powierzchniowy</td></tr><tr><td>odczynnik TLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-723-26A</td><td></td></tr><tr><td>Komora jezdna TLC do płytek 10 x 10 cm</td><td>Camag</td><td>22.5155</td><td></td></tr><tr><td>Waring 1-litrowy blender przeciwwybuchowy ze stali nierdzewnej</td><td>Waring</td><td>E8520</td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Ganglioside Extraction, Purification and Profiling

Gangliozydy to glikosfingolipidy, które zawierają jedną lub więcej reszt kwasu sjalowego. Znajdują się one we wszystkich komórkach i tkankach kręgowców, ale szczególnie obfite występują w mózgu. Ulegające ekspresji głównie na zewnętrznej ulotce błon plazmatycznych komórek, modulują aktywność białek powierzchniowych komórek poprzez asocjację boczną, działają jako receptory w interakcjach komórka-komórka i są celem dla patogenów i toksyn. Genetyczna dysregulacja biosyntezy gangliozydów u ludzi prowadzi do poważnych wrodzonych zaburzeń układu nerwowego. Ze względu na ich amfipatyczny charakter, ekstrakcja, oczyszczanie i analiza gangliozydów wymagają technik, które zostały zoptymalizowane przez wielu badaczy w ciągu 80 lat od ich odkrycia. W tym miejscu opisujemy laboratoryjne metody ekstrakcji, oczyszczania oraz wstępnych analiz jakościowych i ilościowych głównych gangliozydów z tkanek i komórek, które można wykonać w ciągu kilku godzin. Opisujemy również metody izolacji i oczyszczania głównych gatunków gangliozydów z mózgu na większą skalę. Łącznie metody te zapewniają analityczny i preparatywny dostęp do tej klasy cząsteczek bioaktywnych.

Metody opisane w sekcji 1 (skala mikro) pozwalają na otrzymanie gangliozydów w ilości i czystości wystarczającej do jakościowego i ilościowego oznaczenia głównych gangliozydów mózgowych. Odzysk z mózgu mysiego wynosi ~ 1 µmol gangliozydu na g mokrej masy mózgu (1 nmol/µL), gdy są one przygotowane zgodnie z opisem. Rozdzielczość TLC dla 1 µL (1 nmol) z zastosowaniem sekcji 3 dostarcza wystarczającej ilości materiału do detekcji rezorcynolem i rozdziela wszystkie główne gangliozydy mózgowe, co pokazano dla myszy typu dziki...

Gangliozydy to glikosfingolipidy zawierające kwas sjalowy, których szczególnie dużo występuje w mózgu. Ich amfipatyczny charakter wymaga technik ekstrakcji i oczyszczania organicznego/wodnego, aby zapewnić optymalny odzysk i dokładne analizy. Ten artykuł zawiera omówienie ekstrakcji gangliozydów w skali analitycznej i preparatywnej, oczyszczania i analizy chromatografii cienkowarstwowej.

Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Gangliosides are glycosphingolipids that contain one or more sialic acid residues. They are found on all vertebrate cells and tissues but are especially ...

Gangliozydy ulegają ekspresji na wszystkich powierzchniach komórek kręgowców i są szczególnie obfite na komórkach nerwowych. Regulują sygnalizację komórkową i rozpoznawanie komórek. Protokół ten wprowadza izolację i analizę gangliozydów.Techniki zostały wybrane tak, aby zmaksymalizować wydajność gangliozydów w dużej i małej skali, jednocześnie usprawniając oczyszczanie. Opisano również metody stosunkowo szybkiego wykonywania jakościowych i półilościowych analiz gangliozydów. Badania nad lipidami, zwłaszcza lipidami polarnymi, takimi jak gangliozydy, wymagają innych narzędzi i technik niż praca z białkami lub kwasami nukleinowymi.Ten film zapozna Cię z tym, jak pracować z tymi cząsteczkami. Ponieważ rozpuszczalniki, takie jak chloroform i tetrahydrofuran, rozpuszczają popularne tworzywa sztuczne, podczas tych procedur używamy szklanych butelek i fiolek z nakrętkami wyłożonymi teflonem, szklanych pipet, szklanych mikrostrzykawek ze stali nierdzewnej i homogenizatorów ze szkła teflonowego. Niezastosowanie się do tego powoduje, że w produktach znajdują się polimery z tworzyw sztucznych, które mogą zakłócać analizy.Na początek dodaj 4,1 mililitra wody na gram mokrej masy tkanki i homogenizuj ją za pomocą 10 pociągnięć. Dodaj 13 mililitrów metanolu na gram tkanki. Przenieś go do temperatury otoczenia 22 stopni Celsjusza i wymieszaj.Przenieś chusteczkę do grubościennej, szklanej, zakręcanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE i dokładnie wymieszaj. Dodaj 6,5 mililitra chloroformu na gram tkanki, zakryj i dokładnie wymieszaj. Wirować 450 razy g przez 15 minut.Następnie przenieś klarowny supernatant do świeżej, zakręcanej probówki i zmierz objętość jako odzyskaną objętość ekstraktu. W celu podziału dodać 0,173 razy objętość odzyskanego ekstraktu wody do klarownego supernatantu. Następnie przykręć go.Wiruj energicznie. Wirować 450 razy g przez 15 minut. Przenieś górną fazę, która zawiera gangliozydy, do świeżej, szklanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE.Aby przeprowadzić chromatografię z odwróconymi fazami, użyj pięciomililitrowej szklanej strzykawki do przemycia wkładu ekstrakcyjnego tC18 do fazy stałej trzema mililitrami metanolu. Następnie dodaj trzy mililitry chloroformu-metanolu-wody w stosunku dwa do 43 do 55. Załaduj górną fazę z poprzedniego kroku na wkład tC18 przez tę samą szklaną strzykawkę.Zbierz przepływ i załaduj go ponownie do kolumny, aby zoptymalizować adsorpcję. Umyj wkład trzema mililitrami chloroformu-metanolu-wody, a następnie trzema mililitrami metanolu-wody. Rozpuść gangliozydy za pomocą trzech mililitrów metanolu do świeżej, zakręcanej probówki.Odparować do sucha pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze mniejszej lub równej 45 stopni Celsjusza. Rozpuścić w metanolu w ilości jednego mililitra na gram pierwotnej mokrej masy tkanki. Umieść 100 gramów istoty szarej mózgu w blenderze i dodaj jeden mililitr na gram mokrej masy mózgu schłodzonego, 10-milimolowego buforu fosforanu potasu o pH 6,8.Następnie homogenizować na małym ogniu przez 20 sekund. Dodaj osiem mililitrów tetrahydrofuranu na gram mokrej masy mózgu i homogenizuj na małym ogniu przez 10 sekund. Przelać do szklanych butelek wirówkowych i odwirować pod ciśnieniem 5 000 g przez 15 minut.Zebrać supernatant, zmierzyć jego objętość, a następnie przenieść go do szklanego lejka separacyjnego. Dodać 0,3 mililitra eteru etylowego na mililitr supernatantu. Wstrząśnij energicznie.Następnie pozostaw go w spokoju przez 30 minut, podczas których rozdzielają się dwie fazy, górna faza eterowa i dolna faza wodna. Zbierz dolną fazę, która zawiera gangliozydy, do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE. Do górnej fazy eterowej pozostałej w lejku separatora dodać 0,1 mililitra wody na mililitr oryginalnego supernatantu z poprzedniego etapu.Wstrząśnij energicznie. Poczekaj, aż fazy się rozdzielą. Następnie zbierz dolną fazę wodną i połącz ją z wcześniej zebraną dolną fazą.Odparować połączone dolne fazy na suchy proszek i zważyć go. Aby przeprowadzić chromatografię z odwróconymi fazami, należy wstępnie przepłukać duży wkład ekstrakcyjny tC18 do fazy stałej, przepuszczając 50 mililitrów rozpuszczalników przez kolumnę za pomocą próżni lub ciśnienia przez mniej niż jedną minutę na mycie. Załadować górną fazę z separacji faz po zmydleniu do kolumny za pomocą podciśnienia lub ciśnienia.Następnie zbierz przepływ, załaduj go ponownie i ponownie zbierz przepływ do późniejszej analizy. Przemyć kolumnę po 30 mililitrami chloroformu, metanolu i wody, a następnie metanolem i wodą. Następnie eluuj gangliozydy za pomocą 50 mililitrów metanolu, a następnie ponownie za pomocą 10 mililitrów metanolu.Zebrać każde przepłukanie i elucję oddzielnie. Zastosować chromatografię cienkowarstwową lub TLC, aby potwierdzić, że gangliozydy są nieobecne w przepływie i płukaniu oraz eluowane w pierwszej elucji metanolu. Odparować eluowane gangliozydy na suchy proszek i zważyć je.Aby wykonać TLC, wlej bieżący rozpuszczalnik do szklanej komory TLC o wymiarach 10 na 10 centymetrów z pokrywą ze stali nierdzewnej tak, aby głębokość rozpuszczalnika wynosiła 0,5 centymetra. Przykryj komorę i pozwól jej się wyrównać przez około 10 minut. Umyj 10-mikrolitrową strzykawkę Hamiltona skośną igłą przy użyciu metanolu.Pobrać jeden mikrolitr metanolu do szklanej strzykawki, aby wypełnić martwą objętość igły, a następnie jeden mikrolitr próbki lub wzorca. Umieść próbkę równomiernie na pięciomilimetrowych, wstępnie zaznaczonych liniach, aż w strzykawce pozostanie mniej niż jeden mikrolitr rozpuszczalnika metanolowego. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze 22 stopni Celsjusza po wykryciu wszystkich próbek.Umieścić nakrapianą i wysuszoną płytkę na wstępnie zrównoważonej komorze TLC z dolną krawędzią zanurzoną w działającym rozpuszczalniku. Pozwól, aby płynący rozpuszczalnik przesuwał się w górę płytki poprzez działanie kapilarne, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się w odległości jednego centymetra od górnej części płytki. Usunąć ołówkiem czoło rozpuszczalnika na krawędzi płytki i oznaczyć go wodą.Pozwól, aby rozpuszczalniki całkowicie odparowały, bez zakłóceń lub pod łagodnym przepływem powietrza. W okapie oparowym umieść płytkę TLC z rozwiązanym końcem pochodzenia gangliozydów do góry nogami w wyciętym kartonowym pudełku, aby chronić ścianki okapu przed rozpryskami kwasu. Umieść odczynnik rezorcyny w sprayu w szklanym rozpylacza TLC.Przymocuj go do źródła azotu pod ciśnieniem i lekko spryskaj płytkę po przekątnej w kierunku pionowym i poziomym. Natychmiast przykryj płytkę czystą, suchą, szklaną pokrywą o tych samych wymiarach i zabezpiecz pokrywę za pomocą spinaczy do segregatorów. Podgrzej przykrytą płytę w temperaturze 125 stopni Celsjusza przez 20 minut.Gangliozydy będą ciemnofioletowe na białym tle. Aby przeprowadzić barwienie lipidów, zanurz płytkę TLC rozwiązaną stroną początkową gangliozydów do dołu w zlewce zawierającej barwienie aldehydem anyżowym. Zanurz się w biegnącym czole na nieco ponad dwie sekundy.Następnie pozwól mu spłynąć. Podgrzej płytkę TLC na płycie grzejnej w niskiej temperaturze, aby się rozwinęła. Protokół ten zapewnia gangliozydy w wystarczającej ilości i czystości do oznaczania jakościowego i ilościowego.Rozdzielczość TLC wynosząca jeden mikrolitr zapewnia wystarczającą ilość materiału do wykrywania rezorcyny i rozwiązuje wszystkie główne gangliozydy mózgowe u myszy typu dzikiego i zmodyfikowanego genetycznie. Chociaż przygotowane mieszane gangliozydy nie są wolne od innych głównych lipidów, mają wystarczającą czystość do oznaczania metodą spektrometrii mas jako natywne oczyszczone gangliozydy w trybie ujemnym lub po wstępnej metylacji w trybie dodatnim. Oczyszczanie na dużą skalę obejmuje ekstrakcję, zmydlanie i rozdzielczość HPLC w celu uzyskania oczyszczonych głównych gangliozydów mózgowych odpowiednich do eksperymentów biologicznych oraz do dalszych modyfikacji chemicznych i enzymatycznych.Przedstawiono przykładowy profil HPLC i późniejszą analizę TLC. Leczenie alkaliami lub zmydlanie jest konieczne do hydrolizy i usunięcia zanieczyszczających fosfolipidów, ale spowoduje również hydrolizę naturalnych modyfikacji gangliozydów, takich jak O-acetylowane kwasy sjalowe, co może być ważne w niektórych kontekstach. Dokładne proporcje rozpuszczalników do ekstrakcji, podziału rozpuszczalnika i rozdzielczości TLC mają kluczowe znaczenie dla poprawy odzysku, czystości i analiz.Od raka, przez metabolizm, po funkcjonowanie mózgu, gangliozydy są fizjologicznymi modyfikatorami i celami terapeutycznymi. Izolacja, oczyszczanie i analiza gangliozydów są podstawą odkryć biomedycznych i rozwoju terapeutycznego.

ganglioside-extraction-purification-and-profiling

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Opisujemy standardowy protokół barwienia przeciwciał do użycia w mikroskopii w celu określenia ekspresji błonowej i lokalizacji gangliozydów w spoczynku i aktywowanych ludzkich naiwnych limfocytach T CD4+. Opisano również eksperymenty PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem &lt; 40 000 komórek, które nie wymagają dodatkowych zestawów RNA o niskim wkładzie wejściowym.

Przygotowanie limfocytów T CD4 + do analizy ekspresji błony gangliozydowej GD3 i GD2 za pomocą mikroskopii

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Immunoglobulina G (IgG) N-glikan jest scharakteryzowany za pomocą hydrofilowej chromatografii oddziaływań UPLC. Ponadto struktura N-glikanu IgG jest wyraźnie oddzielona. Przedstawiono tutaj wprowadzenie do tej metody eksperymentalnej, tak aby mogła być szeroko stosowana w warunkach badawczych.

Analiza N-glikanu immunoglobuliny G metodą ultrasprawnej chromatografii cieczowej

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

Przedstawiamy szczegółowy protokół uwalniania O-glikanów z mucyn oraz późniejszego odsolania, permetylacji i analizy za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Profilowanie permetylowanych mulynowych O-glikanów za pomocą laserowej desorpcji/jonizacji wspomaganej matrycą w czasie przelotu

Protokół został opracowany do przygotowania oczyszczonych mitochondriów z komórek mikrogleju, izolacji białek mitochondrialnych do uwalniania N-glikanów oraz szybkiego wykrywania subkomórkowych, mitochondrialnych glikanów za pomocą desorpcji laserowej wspomaganej matrycą w podczerwieni, jonizacji elektrorozpylanej w połączeniu z precyzyjnym analizatorem mas o wysokiej rozdzielczości.

Preparat mitochondrialny z mikrogleju do analizy glikanów

Poznaj metody ekstrakcji, oczyszczania i profilowania gangliozydów z tkanki nerwowej. Techniki te maksymalizują wydajność izolacji i umożliwiają analizę jakościową oraz półilościową tych kluczowych lipidów.

Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Przeglądaj więcej filmów