Ekstrakcja, oczyszczanie i profilowanie gangliozydów

Gangliozydy ulegają ekspresji na wszystkich powierzchniach komórek kręgowców i są szczególnie obfite na komórkach nerwowych. Regulują sygnalizację komórkową i rozpoznawanie komórek. Protokół ten wprowadza izolację i analizę gangliozydów.

Techniki zostały wybrane tak, aby zmaksymalizować wydajność gangliozydów w dużej i małej skali, jednocześnie usprawniając oczyszczanie. Opisano również metody stosunkowo szybkiego wykonywania jakościowych i półilościowych analiz gangliozydów. Badania nad lipidami, zwłaszcza lipidami polarnymi, takimi jak gangliozydy, wymagają innych narzędzi i technik niż praca z białkami lub kwasami nukleinowymi.

Ten film zapozna Cię z tym, jak pracować z tymi cząsteczkami. Ponieważ rozpuszczalniki, takie jak chloroform i tetrahydrofuran, rozpuszczają popularne tworzywa sztuczne, podczas tych procedur używamy szklanych butelek i fiolek z nakrętkami wyłożonymi teflonem, szklanych pipet, szklanych mikrostrzykawek ze stali nierdzewnej i homogenizatorów ze szkła teflonowego. Niezastosowanie się do tego powoduje, że w produktach znajdują się polimery z tworzyw sztucznych, które mogą zakłócać analizy.

Na początek dodaj 4,1 mililitra wody na gram mokrej masy tkanki i homogenizuj ją za pomocą 10 pociągnięć. Dodaj 13 mililitrów metanolu na gram tkanki. Przenieś go do temperatury otoczenia 22 stopni Celsjusza i wymieszaj.

Przenieś chusteczkę do grubościennej, szklanej, zakręcanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE i dokładnie wymieszaj. Dodaj 6,5 mililitra chloroformu na gram tkanki, zakryj i dokładnie wymieszaj. Wirować 450 razy g przez 15 minut.

Następnie przenieś klarowny supernatant do świeżej, zakręcanej probówki i zmierz objętość jako odzyskaną objętość ekstraktu. W celu podziału dodać 0,173 razy objętość odzyskanego ekstraktu wody do klarownego supernatantu. Następnie przykręć go.

Wiruj energicznie. Wirować 450 razy g przez 15 minut. Przenieś górną fazę, która zawiera gangliozydy, do świeżej, szklanej rurki z nakrętką wyłożoną PTFE.

Aby przeprowadzić chromatografię z odwróconymi fazami, użyj pięciomililitrowej szklanej strzykawki do przemycia wkładu ekstrakcyjnego tC18 do fazy stałej trzema mililitrami metanolu. Następnie dodaj trzy mililitry chloroformu-metanolu-wody w stosunku dwa do 43 do 55. Załaduj górną fazę z poprzedniego kroku na wkład tC18 przez tę samą szklaną strzykawkę.

Zbierz przepływ i załaduj go ponownie do kolumny, aby zoptymalizować adsorpcję. Umyj wkład trzema mililitrami chloroformu-metanolu-wody, a następnie trzema mililitrami metanolu-wody. Rozpuść gangliozydy za pomocą trzech mililitrów metanolu do świeżej, zakręcanej probówki.

Odparować do sucha pod delikatnym strumieniem azotu w temperaturze mniejszej lub równej 45 stopni Celsjusza. Rozpuścić w metanolu w ilości jednego mililitra na gram pierwotnej mokrej masy tkanki. Umieść 100 gramów istoty szarej mózgu w blenderze i dodaj jeden mililitr na gram mokrej masy mózgu schłodzonego, 10-milimolowego buforu fosforanu potasu o pH 6,8.

Następnie homogenizować na małym ogniu przez 20 sekund. Dodaj osiem mililitrów tetrahydrofuranu na gram mokrej masy mózgu i homogenizuj na małym ogniu przez 10 sekund. Przelać do szklanych butelek wirówkowych i odwirować pod ciśnieniem 5 000 g przez 15 minut.

Zebrać supernatant, zmierzyć jego objętość, a następnie przenieść go do szklanego lejka separacyjnego. Dodać 0,3 mililitra eteru etylowego na mililitr supernatantu. Wstrząśnij energicznie.

Następnie pozostaw go w spokoju przez 30 minut, podczas których rozdzielają się dwie fazy, górna faza eterowa i dolna faza wodna. Zbierz dolną fazę, która zawiera gangliozydy, do szklanej butelki z nakrętką wyłożoną PTFE. Do górnej fazy eterowej pozostałej w lejku separatora dodać 0,1 mililitra wody na mililitr oryginalnego supernatantu z poprzedniego etapu.

Wstrząśnij energicznie. Poczekaj, aż fazy się rozdzielą. Następnie zbierz dolną fazę wodną i połącz ją z wcześniej zebraną dolną fazą.

Odparować połączone dolne fazy na suchy proszek i zważyć go. Aby przeprowadzić chromatografię z odwróconymi fazami, należy wstępnie przepłukać duży wkład ekstrakcyjny tC18 do fazy stałej, przepuszczając 50 mililitrów rozpuszczalników przez kolumnę za pomocą próżni lub ciśnienia przez mniej niż jedną minutę na mycie. Załadować górną fazę z separacji faz po zmydleniu do kolumny za pomocą podciśnienia lub ciśnienia.

Następnie zbierz przepływ, załaduj go ponownie i ponownie zbierz przepływ do późniejszej analizy. Przemyć kolumnę po 30 mililitrami chloroformu, metanolu i wody, a następnie metanolem i wodą. Następnie eluuj gangliozydy za pomocą 50 mililitrów metanolu, a następnie ponownie za pomocą 10 mililitrów metanolu.

Zebrać każde przepłukanie i elucję oddzielnie. Zastosować chromatografię cienkowarstwową lub TLC, aby potwierdzić, że gangliozydy są nieobecne w przepływie i płukaniu oraz eluowane w pierwszej elucji metanolu. Odparować eluowane gangliozydy na suchy proszek i zważyć je.

Aby wykonać TLC, wlej bieżący rozpuszczalnik do szklanej komory TLC o wymiarach 10 na 10 centymetrów z pokrywą ze stali nierdzewnej tak, aby głębokość rozpuszczalnika wynosiła 0,5 centymetra. Przykryj komorę i pozwól jej się wyrównać przez około 10 minut. Umyj 10-mikrolitrową strzykawkę Hamiltona skośną igłą przy użyciu metanolu.

Pobrać jeden mikrolitr metanolu do szklanej strzykawki, aby wypełnić martwą objętość igły, a następnie jeden mikrolitr próbki lub wzorca. Umieść próbkę równomiernie na pięciomilimetrowych, wstępnie zaznaczonych liniach, aż w strzykawce pozostanie mniej niż jeden mikrolitr rozpuszczalnika metanolowego. Pozostaw płytkę do wyschnięcia w temperaturze 22 stopni Celsjusza po wykryciu wszystkich próbek.

Umieścić nakrapianą i wysuszoną płytkę na wstępnie zrównoważonej komorze TLC z dolną krawędzią zanurzoną w działającym rozpuszczalniku. Pozwól, aby płynący rozpuszczalnik przesuwał się w górę płytki poprzez działanie kapilarne, aż czoło rozpuszczalnika znajdzie się w odległości jednego centymetra od górnej części płytki. Usunąć ołówkiem czoło rozpuszczalnika na krawędzi płytki i oznaczyć go wodą.

Pozwól, aby rozpuszczalniki całkowicie odparowały, bez zakłóceń lub pod łagodnym przepływem powietrza. W okapie oparowym umieść płytkę TLC z rozwiązanym końcem pochodzenia gangliozydów do góry nogami w wyciętym kartonowym pudełku, aby chronić ścianki okapu przed rozpryskami kwasu. Umieść odczynnik rezorcyny w sprayu w szklanym rozpylacza TLC.

Przymocuj go do źródła azotu pod ciśnieniem i lekko spryskaj płytkę po przekątnej w kierunku pionowym i poziomym. Natychmiast przykryj płytkę czystą, suchą, szklaną pokrywą o tych samych wymiarach i zabezpiecz pokrywę za pomocą spinaczy do segregatorów. Podgrzej przykrytą płytę w temperaturze 125 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Gangliozydy będą ciemnofioletowe na białym tle. Aby przeprowadzić barwienie lipidów, zanurz płytkę TLC rozwiązaną stroną początkową gangliozydów do dołu w zlewce zawierającej barwienie aldehydem anyżowym. Zanurz się w biegnącym czole na nieco ponad dwie sekundy.

Następnie pozwól mu spłynąć. Podgrzej płytkę TLC na płycie grzejnej w niskiej temperaturze, aby się rozwinęła. Protokół ten zapewnia gangliozydy w wystarczającej ilości i czystości do oznaczania jakościowego i ilościowego.

Rozdzielczość TLC wynosząca jeden mikrolitr zapewnia wystarczającą ilość materiału do wykrywania rezorcyny i rozwiązuje wszystkie główne gangliozydy mózgowe u myszy typu dzikiego i zmodyfikowanego genetycznie. Chociaż przygotowane mieszane gangliozydy nie są wolne od innych głównych lipidów, mają wystarczającą czystość do oznaczania metodą spektrometrii mas jako natywne oczyszczone gangliozydy w trybie ujemnym lub po wstępnej metylacji w trybie dodatnim. Oczyszczanie na dużą skalę obejmuje ekstrakcję, zmydlanie i rozdzielczość HPLC w celu uzyskania oczyszczonych głównych gangliozydów mózgowych odpowiednich do eksperymentów biologicznych oraz do dalszych modyfikacji chemicznych i enzymatycznych.

Przedstawiono przykładowy profil HPLC i późniejszą analizę TLC. Leczenie alkaliami lub zmydlanie jest konieczne do hydrolizy i usunięcia zanieczyszczających fosfolipidów, ale spowoduje również hydrolizę naturalnych modyfikacji gangliozydów, takich jak O-acetylowane kwasy sjalowe, co może być ważne w niektórych kontekstach. Dokładne proporcje rozpuszczalników do ekstrakcji, podziału rozpuszczalnika i rozdzielczości TLC mają kluczowe znaczenie dla poprawy odzysku, czystości i analiz.

Od raka, przez metabolizm, po funkcjonowanie mózgu, gangliozydy są fizjologicznymi modyfikatorami i celami terapeutycznymi. Izolacja, oczyszczanie i analiza gangliozydów są podstawą odkryć biomedycznych i rozwoju terapeutycznego.