Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej
1 lipca 2021
Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.
Ultraszybka spektroskopia siłowo-cęgowa to technika jednocząsteczkowa oparta na pęsetie laserowej, która umożliwia badanie chemomechaniki silników miozyny pod obciążeniem z najwyższą rozdzielczością czasową. Technika ta pozwala na sondowanie bardzo szybkich zdarzeń w wytwarzaniu siły poprzez utrzymywanie stałej siły podczas każdej fazy interakcji motorycznej z pełną kontrolą kierunkowości siły. Dokonując odpowiednich dostosowań, protokół ten można łatwo zastosować do innych rodzajów silników procesowych, w tym kinezyn i dynein, w celu wykrycia regulacji na siłę.
Po zamontowaniu jednego zestawu deflektorów akustyczno-optycznych na translatorze liniowym, weź przysłonę i dostosuj jej przysłonę do rozmiaru tylnej apertury obiektywu. Wymień obiektyw na tęczówkę wyśrodkowaną na gwintowanej obudowie obiektywu. Przesuń translator w kierunku wiązki laserowej, aż część wiązki zablokowana przez kryształ piezoelektryczny będzie widoczna za tęczówką, a następnie obróć translator lekko do tyłu, aż wiązka całkowicie wypełni otwór tęczówki.
Aby przygotować kulki krzemionkowe w octanie pentylu, najpierw rozcieńczyć 20 mikrolitrów 1,2 mikrona 10% stałych kulek krzemionkowych w 1-1,5 mililitra acetonu z wirowaniem i 30 sekundami sonikacji. Po sonikacji zbierz kulki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 1 mililitrze świeżego acetonu do drugiego prania. Po drugim myciu acetonem umyj kulki trzy razy w 1 mililitrze świeżego octanu pentylu na pranie w tych samych warunkach wirowania i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach 1% nitrocelulozy i 900 mikrolitrach octanu pentylu.
Następnie użyj kawałka tkanki laboratoryjnej nasączonej czystym etanolem, aby ostrożnie wytrzeć szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 24 milimetry, a następnie użyj czystej pęsety, aby przepłukać szkło bezpośrednio w etanolu i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia pod delikatnym przepływem azotu. Wirować i sonikować przygotowany bulion krzemionkowy przez 30 sekund i użyć oczyszczonego etanolem szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 60 milimetrów, aby rozsmarować 2 mikrolitry roztworu kulki krzemionkowej na powierzchni mniejszego szkiełka nakrywkowego. Podczas wysychania kulek wyczyść szkiełko o wymiarach 26 x 76 milimetrów, jak pokazano, i umieść dwie linie o grubości 60-100 mikronów o grubości 3 milimetrów dwustronnie przyklejone taśmą na długich krawędziach szkiełka.
Za pomocą czystej pęsety umieść szkiełko nakrywkowe pokryte koralikami na taśmie tak, aby koraliki były skierowane do wnętrza komory szkiełka i wypełnij komorę 15-milimolowym buforem fosforanowym i pływającym roztworem kulek polistyrenowych. Następnie uszczelnij komorę smarem silikonowym. Aby skalibrować stosunek pikseli do nanometrów w kamerze w jasnym polu, uzyskaj pierwszy obraz kulki krzemionki na powierzchni szkiełka nakrywkowego około 5 mikronów od środka pola widzenia.
Przesuń stolik, aby przesunąć koralik o 10 mikronów w kierunku środka pola view i zrób drugi obraz. Oblicz stałą kalibracji kamery, mierząc odległość pikseli między dwiema pozycjami ściegu. Aby skalibrować położenie pułapki, należy uwięzić pojedynczą pływającą cząstkę w jednej pułapce i przesuwać deflektory akustyczno-optyczne w krokach co 0,2 megaherca, uzyskując obraz cząstki i odpowiednią częstotliwość deflektorów dla każdego kroku.
Następnie powtórz kalibrację dla drugiej pułapki w ten sam sposób. Aby skalibrować moc i sztywność pułapki, należy uwięzić pojedynczą cząstkę w każdej pułapce i przemieścić obie pułapki za pomocą deflektorów akustyczno-optycznych w krokach co 0,2 megaherca, rejestrując ruch Browna cząstki w obu pułapkach za pomocą kwadrantowych detektorów fotodiodowych i odpowiednią częstotliwość deflektorów akustyczno-optycznych. Uzyskać stałe kalibracji, dopasowując funkcję Lorentza do widma mocy zarejestrowanego ruchu Browna.
Aby zebrać próbkę do pomiaru, dodaj 1 miligram na mililitr biotynylowanego BSA do nowej komory z kulkami krzemionkowymi na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Po 5 minutach przemyć komorę buforem AB i dodać do komory 1 miligram na mililitr streptawidyny. Po 5 minutach umyć komorę, jak pokazano, i dodać 3 nanomolową biotynylowaną ciężką meromyozynę miozyny-5B w buforze M5B uzupełnionym 2 mikromolową kalmoduliną.
Po 5 minutach przemyć komorę trzykrotnie 1 miligramem na mililitr biotynylowanego BSA uzupełnionego 2 mikromolową kalmoduliną w buforze AB i odczekać 3 minuty po ostatnim płukaniu. Przelej mieszaninę reakcyjną i uszczelnij komorę smarem silikonowym. Aby zmierzyć próbkę, umieść komorę na stoliku mikroskopu i przesuwaj obiektyw, aż pływające kulki alfa-aktyniny znajdą się w ostrości.
Włącz jedną pułapkę i zalewnij jeden koralik. Gdy pierwsza pułapka zostanie zajęta, przesuń translator tak, aby umieścił uwięziony ścieg blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć przytrzaśnięcia wielu koralików, i uwięzić koralik w drugiej pułapce. Przepchnąć próbkę przez translatory dalekiego zasięgu, aby zlokalizować w roztworze włókna aktynowe o długości co najmniej 5 mikronów.
Po zauważeniu filamentu przesuń próbkę, aby uwięziona kulka zbliżyła się do jednego końca filamentu. Po przymocowaniu filamentu dostosuj odległość koralika do przybliżonej długości filamentu i przesuń stolik, aby utworzyć przepływ w kierunku niezwiązanego koralika. Włókno zostanie rozciągnięte przez przepływ i ostatecznie zwiąże się z drugim koralikiem.
Powstały kompleks nazywa się hantlami"Aby nawiązać kontakt aktyna-miozyna, delikatnie oddziel dwie pułapki i ustaw włókno na poziomy naprężenia wstępnego do około 3 pikonewtonów. Aby zbadać sztywność hantli, spraw, aby jedna pułapka oscylowała w fali trójkątnej, zmieniając częstotliwość jednego deflektora akustyczno-optycznego i sprawdzając konsekwentne przenoszenie ruchu na koralik wleczony za pomocą jego sygnału położenia. Przesuń stolik, aby ustawić hantle w pobliżu kulki krzemionki na cokole i wyreguluj wysokość hantli tak, aby włókno aktynowe stykało się z powierzchnią kulki krzemionki.
Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym zapisie pozycji, gdy silnik miozyny nie oddziałuje z włóknem aktyny, uwięzione kulki poruszają się ze stałą prędkością w stosunku do lepkiej siły oporu roztworu. Gdy silnik miozyny zaczyna oddziaływać z włóknem, siła przenoszona przez poruszające się włókno jest bardzo szybko przenoszona na białko, a prędkość systemu spada do zera, przy czym zdarzenia krokowe zachodzą pod stałą siłą aż do końca przebiegu. Siła jest przełączana z kierunku dodatniego na ujemny przez system sprzężenia zwrotnego, który zmienia kierunek siły, gdy koralik osiągnie krawędź zakresu oscylacji ustawionego przez użytkownika.
Kiedy miozyna wiąże się i przemieszcza włókno w kierunku dodatnim, popycha koralik w kierunku górnej krawędzi zakresu oscylacji. Jeśli stanie się to pod wpływem siły wspomagającej, bieg miozyny zostanie przerwany przez odwrócenie kierunku siły na krawędzi oscylacji, ograniczając długość biegu do amplitudy oscylacji hantli. Precyzyjne ustawienie układu optycznego jest niezbędne do uzyskania optymalnej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, natomiast dokładna kalibracja jest niezbędna do precyzyjnego określenia wartości przyłożonych sił.
Technika ta została zaadaptowana do badania ślizgania się i celowanego poszukiwania czynników transkrypcyjnych w DNA, a także dynamicznych interakcji między białkami mechanotransdukcji indukowanymi przez włókna mikrotubul.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ultraszybka spektroskopia z zaciskiem siły (UFFCS) jest techniką jednocząsteczkową wykorzystującą pęsety laserowe do badania chemomechaniki motorów miozynowych pod obciążeniem z wyjątkową rozdzielczością czasową. Niniejszy protokół szczegółowo opisuje konfigurację, kalibrację i przeprowadzenie eksperymentów UFFCS, umożliwiając precyzyjny pomiar oddziaływań miozyna-aktyna oraz ich odpowiedzi na przyłożone siły. Metoda ta jest dostosowalna do badania różnych motorów procesywnych i nieprocesywnych, w tym niekonwencjonalnych miozyn, kinezyn i dynein.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biofizyka pojedynczych cząsteczek
- Mechanika molekularnych motorów
- Techniki pułapkowania optycznego
Wprowadzenie
- Miozyny to motory molekularne, które przekształcają energię chemiczną w pracę mechaniczną.
- Zrozumienie dynamiki oddziaływań miozyna-aktyna zależnych od siły jest kluczowe dla wyjaśnienia funkcji białek motorowych.
- Tradycyjne techniki nie posiadają rozdzielczości czasowej pozwalającej na zarejestrowanie szybkich zdarzeń w procesie generowania siły.
- UFFCS zapewnia stałe przyłożenie siły oraz szybką pętlę sprzężenia zwrotnego, co umożliwia szczegółowe badanie szybkiej dynamiki motorów.
Cel badania
- Dostarczenie szczegółowego protokołu przeprowadzania UFFCS dla procesywnej miozyny-5 oraz innych niekonwencjonalnych miozyn.
- Umożliwienie badania wpływu natężenia i kierunku przyłożonej siły na oddziaływania miozyna-aktyna.
- Ułatwienie adaptacji protokołu dla innych motorów procesywnych, takich jak kinezyny i dyneiny.
Zastosowane metody
- Montaż i wyrównanie pęset optycznych z deflektorami akustyczno-optycznymi.
- Przygotowanie i czyszczenie kulek krzemionkowych oraz szklanych szkiełek podstawowych.
- Montaż komory z pokrytymi kulkami szkiełkami i roztworami buforowymi.
- Kalibracja stosunku pikseli kamery do nanometrów, pozycji pułapki, mocy oraz sztywności przy użyciu analizy ruchu Browna.
- Funkcjonalizacja komór za pomocą biotynilowanej BSA, streptawidyny i biotynilowanej miozyny-5B.
- Tworzenie kompleksów filamentów aktynowych w formie „hantli” do pomiarów w trybie clampy siłowej.
- Akwizycja danych dotyczących oddziaływań miozyna-aktyna w kontrolowanych warunkach siłowych.
Główne wyniki
- UFFCS umożliwia obserwację w czasie rzeczywistym ruchów roboczych oraz zdarzeń krokowych miozyny pod stałą siłą.
- Technika ta pozwala na precyzyjną kontrolę kierunkowości i wielkości siły podczas oddziaływań między motorem a filamentem.
- Interakcje miozyny z aktyną, zarówno procesywne, jak i nieprocesywne, mogą być ilościowo analizowane pod kątem zależności od obciążenia.
- Dokładna kalibracja i wyrównanie są krytyczne dla uzyskania optymalnej rozdzielczości przestrzennej i czasowej.
Wnioski
- UFFCS jest potężnym narzędziem do analizy szybkiej dynamiki chemomechanicznej motorów molekularnych pod obciążeniem.
- Protokół ten jest wszechstronny i może zostać dostosowany do badania szerokiego zakresu białek motorowych poza miozynami.
- Wysokorozdzielcze pomiary za pomocą zacisku siły (force-clamp) dostarczają wglądu w regulację i mechanikę białek motorowych.
Najczęściej Zadawane Pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ultraszybka spektroskopia z zaciskiem siłowym (UFFCS) umożliwia badania w obszarze biofarmaceutyki R&Zespoły D analizują właściwości chemomechaniczne miozyn procesywnych oraz innych motorów molekularnych z rozdzielczością pojedynczych cząsteczek pod kontrolowanym obciążeniem. Możliwość ta zwiększa pewność predykcyjną na wczesnym etapie odkrywania, ujawniając, w jaki sposób kierunek i wartość siły wpływają na funkcję białek motorowych, co dostarcza informacji niezbędnych do walidacji celu i mechanistycznego ograniczania ryzyka. Adaptacyjność systemu UFFCS do różnych klas motorów pozycjonuje go jako wielokrotnego użytku platformę do badania dynamiki białek zależnej od siły w całym portfolio.
Strategiczne zastosowania w badaniach biofarmaceutycznych&D
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji białek motorycznych w warunkach sił istotnych fizjologicznie.
- Wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka poprzez kwantyfikację aktywności i procesywności zależnej od obciążenia.
- Ułatwia walidację funkcjonalną celów w przypadku niekonwencjonalnych miozyn i pokrewnych białek motorycznych.
- Dostarcza danych o wysokiej rozdzielczości służących do opracowywania modeli prognostycznych dynamiki białek.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Przygotowuje zwalidowane układy pojedynczych cząsteczek do dalszego przesiewania modulatorów lub inhibitorów.
- Zapewnia ilościowe, powtarzalne pomiary aktywności motorowej w określonych reżimach sił.
- Umożliwia standaryzację testów w celu porównawczej oceny związków w różnych klasach białek motorowych.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy dla zróżnicowanych celów białkowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Koreluje pomiary zależne od siły in vitro z istotnymi dla przebiegu choroby szlakami mechanotransdukcji.
- Zapewnia ciągłość od mechanizmu molekularnego po walidację w modelach przedklinicznych w przypadkach, gdy zaangażowana jest regulacja siły.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o rozwoju terapeutyków celowanych w motorykę w oparciu o analizę ryzyka.
- Wspiera opracowywanie biomarkerów translacyjnych poprzez powiązanie mechaniki molekularnej z efektami funkcjonalnymi.
Integracja potoku i przepływu pracy
UFFCS integruje się z kontinuum odkrywczym, od wczesnego testowania hipotez, poprzez identyfikację związków wiodących, aż po przedkliniczną walidację mechanistyczną, szczególnie w przypadku celów, w których regulacja siły odgrywa kluczową rolę.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez kwantyfikację zależnych od siły oddziaływań białkowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowe do analizy, powtarzalne układy do oceny wpływu związków na funkcję motoryczną.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty zdarzeń krokowych, skurczów roboczych oraz odpowiedzi na obciążenie w celu przeprowadzenia rzetelnych porównań.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia molekularne z modelami przedklinicznymi, w których mechanotransdukcja ma znaczenie dla przebiegu choroby.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje elastyczną platformę, którą można dostosować do wielu białek motorycznych i pytań dotyczących mechanizmów działania.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne analizy pojedynczych cząsteczek.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez wczesne wyjaśnienie mechanizmów zależnych od siły.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój programów ukierunkowanych na białka motoryczne.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu biofizyki pojedynczych cząsteczek oraz aparatury do pułapkowania optycznego.
- Wymaga precyzyjnej kalibracji i wyrównania systemów optycznych oraz systemów sprzężenia zwrotnego w celu niezawodnego przyłożenia siły.
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja protokołów przygotowania próbek i analizy danych.
- Metoda jest możliwa do zaadaptowania do różnych motorów procesywnych poprzez dostosowanie protokołu do konkretnych klas białek.
- Rozdzielczość przestrzenna i czasowa są ograniczone przez dokładność kalibracji oraz wyrównanie systemu.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Optical Setup
1:22
Silica Beads Preparation
3:24
Trap Position, Power, and Stiffness Calibration
4:53
Sample Assembly
5:54
Sample Measurement and Actin‐Myosin Contact Establishment
7:37
Results: Position Recording and Force Inversion
8:53
Conclusion
