Name: Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Poznaj ultraszybką spektroskopię siłowo-zaciskową do badania chemomechaniki miozyn procesowych z wysoką rozdzielczością czasową. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę interakcji miozyna z aktyną pod obciążeniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez program Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji na podstawie umowy o grant nr 871124 Laserlab-Europe, przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań (FIRB "Futuro in Ricerca" 2013 Grant No. RBFR13V4M2) oraz Ente Cassa di Risparmio di Firenze. A.V. Kashchuk otrzymał wsparcie w ramach stypendium interdyscyplinarnego Human Frontier Science Program LT008/2020-C.

1. Układ optyczny
UWAGA: Układ eksperymentalny składa się z podwójnych pęset optycznych o nanometrycznej stabilności celowania i fluktuacjach intensywności lasera &lt; 1%. W tych warunkach stabilność hantla na poziomie nanometrycznym jest gwarantowana przy typowej sztywności pułapki (0,1 pN/nm) i naprężeniu (1 pN – kilkanaście pN). Rysunek 2 przedstawia szczegółowy schemat układu optycznego.
<ol>
	<li>Projekt i konstrukcja pęsety optycznej 9,10,11.
	<ol>
		<li>Umieść wszystkie elementy układu na stole optycznym zgodnie ze schematem przedstawionym na Rysunku 2. Należy pamiętać, że stół optyczny posiada aktywne izolatory w celu zminimalizowania wibracji mechanicznych. Dodatkowo konstrukcja mikroskopu jest zamontowana na izolatorach elastomerowych, aby pochłaniać hałas akustyczny i rezonanse mechaniczne.</li>
		<li>Wstaw izolator optyczny blisko źródła lasera („OI” na Rysunku 2), aby uniknąć przypadkowych fluktuacji amplitudy spowodowanych sprzężeniem zwrotnym.</li>
		<li>Zamknij całą drogę optyczną w szczelnej skrzynce, aby ograniczyć prądy powietrzne i turbulencje, które mogłyby wpłynąć na stabilność kierunku wiązki lasera.</li>
		<li>Stwórz podwójną pęsetę optyczną, dzieląc główne źródło laserowe (laser Nd:YAG, długość fali 1 064 nm na Rysunku 2) na dwie gałęzie o ortogonalnych polaryzacjach za pomocą polaryzacyjnych dzielników wiązki (PBS). Należy unikać pułapek z podziałem czasu, ponieważ indukują one oscylacje hantla pod napięciem12.</li>
		<li>Użyj dwóch akustyczno-optycznych deflektorów (AOD na Rysunku 2) sterowanych przez cyfrowe syntezatory bezpośrednie (DDS), aby umożliwić precyzyjne i szybkie przemieszczanie dwóch pułapek oraz dokładną regulację napięcia aktyny poprzez bezpośrednie sterowanie DDS za pomocą wyjść cyfrowych z karty FPGA (patrz Rysunek 2). 
		​UWAGA: Całkowity czas odpowiedzi sprzężenia zwrotnego musi wynosić &lt;10 µs, aby szybko korygować i utrzymywać stałą siłę w obu pułapkach podczas pomiarów, w tym w stanie niezwiązanym, podczas oddziaływania z miozyną i ruchu. W tym celu detektory pozycji muszą mieć pasmo &gt;= 100 kHz, a dane muszą być zbierane z częstotliwością próbkowania &gt;= 200 kHz. Dla każdego pozyskanego punktu danych (czas akwizycji 5 µs) FPGA oblicza proporcjonalne korekty dla dwóch pułapek i przesyła je do dwóch DDS sterujących AOD. Czas odpowiedzi AOD musi być krótszy niż 5 µs, aby spełnić wymagany czas odpowiedzi sprzężenia zwrotnego.</li>
		<li>W celu detekcji pozycji uwięzionych kulek z dokładnością do nm, umieść dwa detektory z fotodiodą kwadratową (QPD na Rysunku 2) w tylnej płaszczyźnie ogniskowej kondensora. Precyzyjne wyrównanie QPD w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową kondensora, a także AOD w płaszczyźnie sprzężonej z tylną płaszczyzną ogniskową obiektywu, zapewni, że sygnały QPD będą niezależne od częstotliwości AOD.</li>
		<li>Zamontuj AOD na translatorze liniowym z napędem mikrometrycznym i przemieszczaj go, aż krawędź kryształu znajdzie się blisko wiązki lasera. Następnie zastąp obiektyw przysłoną, wycentrowaną w gwintowanej oprawie obiektywu, i wyreguluj jej otwór tak, aby odpowiadał rozmiarowi tylnej apertury obiektywu.</li>
		<li>Przesuwaj translator w stronę wiązki lasera, aż część wiązki blokowana przez kryształ piezoelektryczny stanie się widoczna za przysłoną; następnie lekko przesuń translator z powrotem, aby wiązka ponownie całkowicie wypełniła otwór przysłony.</li>
		<li>Powtórz kroki 1.1.7-1.1.8 dla drugiego AOD. Sprawdź czas odpowiedzi pętli sprzężenia zwrotnego, mierząc opóźnienie czasowe z QPD podczas szybkiego przemieszczania wiązki na kulce przyklejonej do powierzchni szkiełka podstawowego13. 
		​UWAGA: Powyższe trzy kroki (1.1.7-1.1.9) służą do dokładnego wyrównania kryształów AOD. Kroki te są ważne dla optymalizacji czasu odpowiedzi zarówno odchylenia wiązki, jak i sprzężenia zwrotnego13.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą fotodiody zmierz fluktuacje intensywności lasera pułapkującego na wejściu do mikroskopu, które muszą być poniżej 1%. Należy pamiętać, że pasmo fotodiody musi być większe niż szybkość obrazowania.</li>
	<li>Sprawdź stabilność kierunku obu pułapek.
	<ol>
		<li>Przygotuj kulki krzemionkowe w buforze fosforanowym (PB), rozcieńczając 20 µL kulek krzemionkowych (1,2 µm, 10% ciał stałych) w 1 mL acetonu, sonikuj przez 30 s, krótko wymieszaj w wirówce (vortex) i wiruj przez 2 min przy 19 000 x g.</li>
		<li>Usuń nadfiltr, resuspenduj w 1 mL acetonu i powtórz płukanie. Resuspenduj w 1 mL 50 mM PB, przemyj 2 razy. Na koniec resuspenduj w 100 µL 50 mM PB.</li>
		<li>Przeprowadź kalibrację pęsety optycznej za pomocą kulek krzemionkowych, przyklejając szkiełko podstawowe do płytki mikroskopowej za pomocą dwustronnej taśmy (o grubości ok. 60 µm), aby zbudować komorę przepływową. Wypełnij komorę 1 mg/mL BSA (białko surowicy bydlęcej) i odczekaj 3 min.</li>
		<li>Wprowadź do komory rozcieńczenie 1:1000 kulek krzemionkowych w PB. Użyj strzykawki wypełnionej smarem silikonowym, aby starannie uszczelnić komorę. Uwięź pojedynczą kulkę w każdej pułapce i zastosuj metodę widma mocy14 w celu ich kalibracji.</li>
		<li>Przygotuj kulki krzemionkowe w octanie pentylu (w temperaturze pokojowej), rozpuszczając 20 µL kulek krzemionkowych (średnica 1,2 µm, 10% ciał stałych) w 1-1,5 mL acetonu, wymieszaj w wirówce i sonikuj przez 30 s.</li>
		<li>Wiruj przy 18 500 x g przez 2 min. Odrzuć nadfiltr i resuspenduj w 1 mL acetonu, a następnie powtórz płukanie. Resuspenduj w 1 mL octanu pentylu i powtórz płukanie (wirowanie i resuspensję) w octanie pentylu 2 razy. Resuspenduj osad w 100 µL 1% nitrocelulozy i 900 µL octanu pentylu. Przechowywać w 4 °C przez 2 miesiące.</li>
		<li>Weź szklane szkiełko podstawowe o wymiarach 24 x 24 mm i dokładnie oczyść je papierem nasączonym czystym etanolem. Następnie, trzymając je czystą pęsetą, wypłucz je drugi raz, myjąc bezpośrednio czystym etanolem. Pozostaw do wyschnięcia pod delikatnym strumieniem azotu. W razie potrzeby powtórz tę operację, aby usunąć wszystkie widoczne pozostałości z powierzchni szkła.</li>
		<li>Weź zapas kulek krzemionkowych, wymieszaj w wirówce i krótko sonikuj przez ok. 30 s.</li>
		<li>Po oczyszczeniu drugiego szkiełka (24 x 60 mm), użyj go do naniesienia 2 µL roztworu kulek krzemionkowych na jedną powierzchnię szkiełka i odczekaj do wyschnięcia.</li>
		<li>Dokładnie oczyść płytkę mikroskopową (26 x 76 mm), która posłuży do stworzenia komory przepływowej.</li>
		<li>Odetnij dwa pasy dwustronnej taśmy klejącej (szerokość ok. 3 mm, grubość 60-100 µm) i przytwierdź je po jednej stronie płytki mikroskopowej, jak pokazano na Rysunku 3.</li>
		<li>Używając czystej pęsety, zamknij komorę (końcowa objętość ok. 20 µL), przykładając powlekłe szkiełko (1.3.9) do pasów taśmy klejącej, tak aby warstwa nitrocelulozy i kulek była skierowana do wnętrza komory, jak pokazano na Rysunku 3a. Wypełnij komorę przepływową 50 mM buforem fosforanowym i uszczelnij smarem silikonowym.</li>
		<li>Wykonaj obrazowanie pojedynczej kulki krzemionkowej w mikroskopii w jasnym polu przy powiększeniu &gt;200x, używając kamery CCD (charge-coupled device) lub CMOS (complementary metal-oxide-semiconductor) z rozdzielczością &gt;1,4 megapiksela. Użyj oprogramowania do sprzężenia zwrotnego, aby przesuwać stół piezoelektryczny (z dokładnością nanometryczną lub lepszą) w celu kompensacji dryftów termicznych10.</li>
		<li>Nałóż środek lewej pułapki na środek kulki (poziomy sygnału x-y z QPD powinny odpowiadać tym z kalibracji). Następnie zmierz szum pozycji i odchylenie standardowe sygnałów pozycji dla tej pułapki.</li>
		<li>Powtórz poprzedni krok dla prawej pułapki15.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja pozycji pułapki: MHz na nm
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przytwierdzonymi do powierzchni szkiełka (1.3.5-1.3.12) oraz pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyj kulek koniugowanych z α-aktyniną przygotowanych zgodnie z następną sekcją 2.1).</li>
		<li>Skup kulkę krzemionkową na powierzchni szkiełka, lekko przesuniętą (~5 µm) od środka pola widzenia (FOV) i wykonaj obraz FOV. Przesuń kulkę o 10 µm w stronę centrum FOV za pomocą stołu piezoelektrycznego i wykonaj drugi obraz. Oblicz środek kulki na obu obrazach za pomocą algorytmu centroidu lub podobnego i oblicz odległość w pikselach między dwiema kulkami, aby uzyskać kalibrację nm/piksel kamery w jasnym polu.</li>
		<li>Uwięź pojedynczą pływającą cząstkę w jednej pułapce. Następnie przesuwaj pułapkę za pomocą AOD w małych krokach (0,2 MHz) i wykonaj obraz cząstki oraz zapisz odpowiadającą mu częstotliwość AOD dla każdego kroku. Oblicz pozycję cząstki w FOV, używając algorytmu centroidu jak wcześniej, i przelicz ją na nm, korzystając z kalibracji nm/piksel uzyskanej w poprzednim kroku.</li>
		<li>Wykonaj dopasowanie liniowe do danych częstotliwość-pozycja i oblicz stałą kalibracji w nm/MHz.</li>
		<li>Powtórz kalibrację dla drugiej pułapki</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kalibracja mocy i sztywności pułapki (MHz vs W), QPD (MHz vs pN/nm)
	<ol>
		<li>Przygotuj komorę przepływową z kulkami krzemionkowymi przytwierdzonymi do powierzchni szkiełka (1.3.5-1.3.12) oraz pływającymi kulkami polistyrenowymi (użyj kulek koniugowanych z α-aktyniną przygotowanych zgodnie z następną sekcją 2.1) i uwięź pojedynczą cząstkę w jednej pułapce. Następnie przemieszczaj obie pułapki za pomocą AOD w małych krokach (0,2 MHz) i rejestruj ruchy Browna cząstki w obu pułapkach za pomocą QPD oraz odpowiadającą częstotliwość AOD.</li>
		<li>Oblicz średnią moc na detektorach dla każdej pozycji i wyznacz sztywność pułapki oraz stałą kalibracyjną beta QPD, dopasowując funkcję Lorentza do widma mocy zarejestrowanego ruchu Browna13.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek
<ol>
	<li>Przygotowanie fluorescencyjnych kulek sprzęganych z α-aktyniną
	<ol>
		<li>Przeprowadzenie sprzęgania16: Należy pobrać kulki polistyrenowe z grupami aminowymi (średnica 1 µm, 2,5% substancji stałej), przemyć je dwukrotnie w 500 μL wody destylowanej i resuspender w 500 μL PBS (pH 7,0). Należy dodać 1 mM ligandu estru succynimidylowego HaloTag O2 i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h. Przemyć trzykrotnie 500 μL PBS i resuspender w 100-200 µM HaloTag α-aktyniny. Inkubować przez 1 h w 37 °C i przemyć trzykrotnie w 500 μL PBS (użyć kulek w ciągu 1,5 tygodnia lub zamrozić gwałtownie w ciekłym azocie i przechowywać w −80 °C).</li>
		<li>Znakowanie: Inkubować 200 µL zawiesiny kulek z Rodaminą-BSA przy końcowym stężeniu 5 µg/mL przez 10 min. Przemyć trzykrotnie 50 mM PB i resuspender w 500 µL 50 mM PB. Preparat ten można przechowywać w alikwotach w - 80 °C przez wiele miesięcy).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekspresja i oczyszczanie biotynilowanej miozyny-5B zgodnie z wcześniejszymi opisami4,17.</li>
	<li>Polimeryzacja i znakowanie F-aktyny13:
	<ol>
		<li>Polimeryzacja F-aktyny: Wymieszać 69 µL wody ultrapurej, 10 µL 10x buforu do polimeryzacji aktyny (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglanu guanydyny pH 7,5), 20 µL G-aktyny 10 mg/mL oraz 1 µL 1 M ditiotreitolu (DTT). Pozostawić na lodzie przez ponad 1 h.</li>
		<li>Znakowanie F-aktyny rodaminą (Ex/Em: 546/575 nm): Pobrać 25 µL spolimeryzowanej F-aktyny i dodać 19,5 µL wody ultrapurej, 2,5 µL 10x buforu do polimeryzacji aktyny (100 mM Tris HCl, 20 mM MgCl2, 500 mM KCl, 10 mM ATP, 50 mM węglanu guanydyny pH 7,5), 1 µL 1 M DTT oraz 2 µL 250 µM faloidyny z rodaminą. Pozostawić na lodzie przez noc. Do eksperymentów z pułapkowaniem F-aktynę z rodaminą można przechowywać na lodzie i wykorzystać w ciągu tygodnia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż próbki
	<ol>
		<li>Pobrać komorę przepływową (1.3.5-1.3.12) i inkubować z 1 mg/mL biotynilowanym BSA przez 5 min. Po przemyciu buforem AB (25 mM MOPS ,25 mM KCl, 4mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1 mM DTT, pH 7,2) inkubować z 1 mg/mL streptawidyną przez 5 min i ponownie przemyć buforem AB. Inkubować biotynilowaną ciężką meromiozynę miozyny-5B o stężeniu 3 nM w buforze M5B (10 mM MOPS pH 7,3, 0,5 M NaCl, 0,1 mM EGTA, 3 mM NaN3) z 2 µM kalmoduliną (CaM) przez 5 min. Przemyć trzykrotnie objętością 1 mg/mL biotynilowanego BSA uzupełnionego o 2 µM CaM w buforze AB i inkubować przez 3 min.</li>
		<li>Podczas inkubacji przygotować mieszaninę reakcyjną (RM): 0,005% kulek funkcjonalizowanych α-aktyniną (sekcja 2.1), 1 nM F-aktyny z rodaminą (sekcja 2.3) w buforze obrazowym (IB: bufor AB z 1,2 µM oksydazą glukozową, 0,2 µM katalazą, 17 mM glukozą, 20 mM DTT, 2 µM CaM oraz ATP w stężeniu wymaganym dla danego eksperymentu).</li>
		<li>Przemyć mieszaniną RM i uszczelnić komorę smarem silikonowym. Próbka jest teraz gotowa do obserwacji pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pomiar
<ol>
	<li>Zmontuj „hantel” (dumbbell).
	<ol>
		<li>Znajdź pływające kuleczki α-actinin, przemieszczając próbkę za pomocą translatorów dalekiego zasięgu, włącz jedną pułapkę i uwięź jedną kuleczkę.</li>
		<li>Po zajęciu pierwszej pułapki przesuń translator tak, aby uwięziona kuleczka znajdowała się blisko powierzchni szkiełka nakrywkowe, aby uniknąć uwięzienia wielu kuleczek, a następnie uwięź kolejną kuleczkę w drugiej pułapce.</li>
		<li>Dostrój obie pułapki do równej sztywności, regulując moc fal akustycznych AOD. Sztywność ustawia się zazwyczaj w zakresie od 0,03 do 0,14 pN/nm. Im mniejsza sztywność, tym mniejszy szum siły, szczególnie przy niskich wartościach sił.</li>
		<li>Następnie obróć zmotoryzowane lustro M (Rysunek 2), aby przełączyć na mikroskopię fluorescencyjną, i znajdź włókno aktyny pływające w roztworze, przemieszczając próbkę za pomocą translatorów dalekiego zasięgu13. Wybieraj długie włókna (&gt;5 µm), ponieważ procesywna miozyna będzie je przemieszczać o kilka mikrometrów przed odłączeniem się.</li>
		<li>Przesuń próbkę tak, aby jedna z uwięzionych kuleczek zbliżyła się do jednego z końców włókna, aż do momentu ich połączenia. Następnie dostosuj odległość między kuleczkami do przybliżonej długości włókna i wytwórz przepływ w kierunku niezwiązanej drugiej kuleczki, przesuwając stoлик w jej stronę. Włókno zostanie rozciągnięte przez przepływ i w końcu z nim zwiąże13. Kompleks kuleczka-aktyna-kuleczka nazywany jest „hantlem”.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Nawiąż kontakt aktyna-miozyna.
	<ol>
		<li>Delikatnie rozsuń obie pułapki, aby wstępnie naprężyć włókno do około 3 pN i zbadaj sztywność hantla, wprowadzając jedną pułapkę w oscylacje w postaci fali trójkątnej poprzez zmianę częstotliwości jednego z dwóch AOD oraz weryfikując następczą transmisję ruchu na kuleczkę podążającą za pomocą sygnału jej pozycji.</li>
		<li>Przesuń stoLik, aby umieścić hantel w pobliżu krzemionkowej kuleczki postumentowej i umożliwić kontakt między włóknem a białkiem przytwierdzonym do powierzchni kuleczki, dostosowując wysokość centrów uwięzionych kuleczek nieco poniżej średnicy kuleczki krzemionkowej. Następnie ustaw centrum kuleczki krzemionkowej pomiędzy uwięzionymi kuleczkami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Klemowanie siły (force clamp) i sprzężenie zwrotne stabilizacji nanometrycznej:
	<ol>
		<li>Włącz ultraszybki klem siły z siłą 2-3 pN i oscylacją 200 nm i przeskanuj kuleczkę postumentową w dyskretnych krokach około 20-30 nm w kierunku prostopadłym do włókna aktyny. Odczekaj kilka sekund w każdej pozycji na wystąpienie oddziaływań, a następnie wykonaj kolejny krok, jeśli nie zaobserwowano interakcji. Po ustanowieniu oddziaływania białko-włókno znajdź pozycję, w której interakcje występują najczęściej.</li>
		<li>Upewnij się, że gdy procesywna miozyna porusza się w stronę jednego z końców włókna aktyny (zazwyczaj końca +), uwięziona kuleczka przyczepiona do końca + porusza się w stronę kuleczki krzemionkowej. Przesuń stoLik w stronę końca - włókna tak, aby kuleczka krzemionkowa znajdowała się jak najbliżej uwięzionej kuleczki przyczepionej do końca - włókna w momencie, gdy miozyna nie jest związana, i uruchom sprzężenie zwrotne stabilizacji nanometrycznej. W ten sposób zminimalizowano prawdopodobieństwo zderzenia uwięzionej kuleczki przyczepionej do końca + włókna z kuleczką krzemionkową.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zarejestruj dane.</li>
</ol>
4. Analiza danych4
UWAGA: Opisana metoda analizy pozwala na detekcję i pomiar przebiegów procesywnych oraz szybkich zdarzeń skokowych na podstawie zmian prędkości hantla, wywołanych skokami miozyny. Analiza przebiegów procesywnych jest przeprowadzana w oparciu o metodę analizy danych dla silników nieprocesywnych opisaną w referencjach3,4,13.
<ol>
	<li>Ustal próg zmian prędkości, aby umożliwić detekcję zdarzeń skokowych. Ponieważ w tym przypadku spodziewane są zarówno kroki do przodu, jak i do tyłu, przekroczenie progu jest akceptowane w obu kierunkach.</li>
	<li>Przypisz każdy krok do odpowiadającego mu przebiegu (run): jeśli odstęp czasowy między dwoma kolejnymi krokami jest krótszy niż 3 ms, a amplituda kroków wynosi &lt; 90 nm, kroki są przypisywane do tego samego przebiegu, w przeciwnym razie kroki są przypisywane do różnych przebiegów4.</li>
	<li>Skoryguj długość przebiegu dla sił wspomagających4.
	<ol>
		<li>Skoryguj długości przebiegów pod wpływem sił wspomagających, obliczając rzeczywistą wartość długości przebiegu RL z pomierzonej średniej wartości długości przebiegu &lt;RLm&gt; na podstawie następującego równania, gdzie D to zakres oscylacji: 
		<img alt="Równanie matematyczne ilustrujące gęstość prawdopodobieństwa i obliczanie wartości oczekiwanej." src="/files/ftp_upload/62388/62388eq1v3.jpg" data-altupdatedat="1788282455000" data-alt="Równanie 1"> 
		UWAGA: Szczegóły wyprowadzenia tego równania znajdują się w referencji4.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ashkin, A., Dziedzic, J. M., Bjorkholm, J. E., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+a+single-beam+gradient+force+optical+trap+for+dielectric+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Optical+Angular+Momentum%22%5BJournal%5D)">Observation of a single-beam gradient force optical trap for dielectric particles.</a> Optical Angular Momentum. 11 (5), 196-198 (2016).</li>
<li>Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+biology+with+force%3A+Single+molecule+high-resolution+measurements+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Interrogating biology with force: Single molecule high-resolution measurements with optical tweezers.</a> Biophysical Journal. 105 (6), 1293-1303 (2013).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+force-clamp+spectroscopy+of+single+molecules+reveals+load+dependence+of+myosin+working+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke.</a> Nature Methods. 9 (10), 1013-1019 (2012).</li>
<li>Gardini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+myosin-5B+mechanosensitivity+and+calcium+regulation+at+the+single+molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dissecting myosin-5B mechanosensitivity and calcium regulation at the single molecule level.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Woody, M. S., Winkelmann, D. A., Capitanio, M., Ostap, E. M., Goldman, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+mechanics+resolves+the+earliest+events+in+force+generation+by+cardiac+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single molecule mechanics resolves the earliest events in force generation by cardiac myosin.</a> eLife. 8, 49266(2019).</li>
<li>Clemen, A. E. -M., Vilfan, M., Jaud, J., Zhang, J., Bä, M., Rief, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-dependent+stepping+kinetics+of+myosin-V%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Force-dependent stepping kinetics of myosin-V.</a> Biophysical Journal. 88, 4402-4410 (2005).</li>
<li>Howard, J., Hancock, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+beads+are+better+than+one%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Three beads are better than one.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 1-3 (2020).</li>
<li>Pyrpassopoulos, S., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+kinesin%27s+load-bearing+capacity+by+force+geometry+and+the+microtubule+track%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Modulation of kinesin's load-bearing capacity by force geometry and the microtubule track.</a> Biophysical Journal. 118 (1), 243-253 (2020).</li>
<li>Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIONA+in+the+trap%3A+The+advantages+of+combining+optical+tweezers+and+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Optics+A%3A+Pure+and+Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">FIONA in the trap: The advantages of combining optical tweezers and fluorescence.</a> Journal of Optics A: Pure and Applied Optics. 9 (8), 157(2007).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position+control+and+optical+manipulation+for+nanotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22European+Physical+Journal+B%22%5BJournal%5D)">Position control and optical manipulation for nanotechnology applications.</a> European Physical Journal B. 46 (1), 1-8 (2005).</li>
<li>Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCapitanio%2C+M+%22Optical+Tweezers.+An+introduction+to+Single+Molecule+Biophysics%22">Optical Tweezers. An introduction to Single Molecule Biophysics</a>. , CRC Press. (2017).</li>
<li>Capitanio, M., Cicchi, R., Saverio Pavone, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+and+time-shared+multiple+optical+tweezers+for+the+study+of+single+motor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+and+Lasers+in+Engineering%22%5BJournal%5D)">Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins.</a> Optics and Lasers in Engineering. 45 (4), 450-457 (2007).</li>
<li>Gardini, L., Tempestini, A., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+optical+tweezers+for+the+study+of+single+molecular+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed optical tweezers for the study of single molecular motors.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, (2018).</li>
<li>Capitanio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calibration+of+optical+tweezers+with+differential+interference+contrast+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals.</a> Review of Scientific Instruments. 73 (4), 1687(2002).</li>
<li>Monico, C., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S., Capitanio, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+single-molecule+manipulation+and+imaging+for+the+study+of+protein-DNA+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Combining single-molecule manipulation and imaging for the study of protein-DNA interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. (90), e51446(2014).</li>
<li>Greenberg, M. J., Lin, T., Goldman, Y. E., Shuman, H., Ostap, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+IC+generates+power+over+a+range+of+loads+via+a+new+tension-sensing+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Myosin IC generates power over a range of loads via a new tension-sensing mechanism.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (37), 2433-2440 (2012).</li>
<li>Gardini, L., Arbore, C., Capitanio, M., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+single+molecule+imaging+and+tracking+of+processive+myosin+motors%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A protocol for single molecule imaging and tracking of processive myosin motors.</a> MethodsX. 6, 1854-1862 (2019).</li>
<li>Ramaiya, A., Roy, B., Bugiel, M., Schäffer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+rotates+unidirectionally+and+generates+torque+while+walking+on+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Kinesin rotates unidirectionally and generates torque while walking on microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 10894-10899 (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Chociaż techniki jednocząsteczkowe, takie jak test z trzema kulkami, są technicznie trudne i mają niską przepustowość, UFFCS poprawia wykrywanie interakcji molekularnych dzięki wysokiemu stosunkowi sygnału do szumu w danych. UFFCS pozwala na badanie zależności białek motorycznych od obciążenia, z głównymi zaletami bardzo szybkiego przyłożenia siły po związaniu silnika z włóknem w celu zbadania wczesnych i bardzo szybkich zdarzeń w wytwarzaniu siły i słabych stanach wiązania pod kontrolowaną siłą; Utrzymywanie stałej siły...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.
The title was updated from:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy
to:
Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62388">Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy</a>. The title was updated.

Erratum: Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultra Force-Clamp Spectroscopy

W ostatnich dziesięcioleciach pęsety optyczne były cennym narzędziem do wyjaśnienia mechanochemii oddziaływań białek na poziomie pojedynczej cząsteczki, ze względu na uderzającą możliwość jednoczesnej manipulacji i pomiaru zmian konformacyjnych i kinetyki enzymatycznej 1,2. W szczególności zdolność do przykładania i mierzenia sił w zakresie sił wywieranych przez silniki molekularne w komórce, wraz ze zdolnością do pomiaru subnanometrowych zmian konformacyjnych, sprawiły, że pęseta optyczna stała się unikalnym narzędziem jednocząsteczkowym do odkrywania właściwości chemomechanicznych białek motorycznych i ich mechanicznej regulacji.
Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika spektroskopii sił pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach optycznych, opracowana do badania szybkiej kinetyki silników molekularnych pod obciążeniem w geometrii trzech kulek (Rysunek 1a)3,4. UFFCS skraca opóźnienie czasu przyłożenia siły do białka motorycznego do fizycznego limitu pęsety optycznej, tj. czasu mechanicznego relaksacji systemu, umożliwiając w ten sposób szybkie przyłożenie siły po rozpoczęciu przebiegu miozyny (kilkadziesiąt mikrosekund)<klasa sup = "xref">3. Ta zdolność została wykorzystana do zbadania wczesnych zdarzeń mechanicznych w szybkim układzie kostnym 3 i cardiac5 miozyny mięśniowej, aby ujawnić zależność obciążenia skoku siłowego, stany słabego i silnego wiązania, a także kolejność zdarzeń biochemicznych (Pi) i mechanicznych (udar siłowy).
Geometria trzech koralików jest zwykle stosowana do badania silników nieprocesowych, geometria pojedynczego koralika z zaciskiem siły jest powszechnie używana do badania procesyjnych niekonwencjonalnych miozyn, takich jak miozyna Va6. Istnieje jednak kilka powodów, dla których warto preferować test UFFCS z trzema kulkami również w przypadku miozyn procesowych. Po pierwsze, szybkie przyłożenie obciążenia zaraz po związaniu aktyny-miozyny pozwala na pomiar wczesnych zdarzeń w rozwoju siły, jak w silnikach nieprocesowych. Dodatkowo, w przypadku silników procesowych pozwala to również na dokładny pomiar długości i czasu trwania pracy silnika pod stałą siłą przez cały czas ich progresji (<silna klasa="xfig">Rysunek 1b). Co więcej, ze względu na wysoki współczynnik sprzężenia zwrotnego siły, system może utrzymać stałą siłę podczas szybkich zmian pozycji, takich jak skok roboczy miozyny, gwarantując w ten sposób stałe obciążenie podczas stepowania silnika. Wysoka rozdzielczość czasowa systemu pozwala na wykrycie oddziaływań sub-ms, otwierając możliwość badania słabego wiązania miozyny z aktyną. Wreszcie, geometria testu gwarantuje, że siła jest przyłożona wzdłuż włókna aktynowego, przy znikomych poprzecznych i pionowych składowych siły. Ten punkt jest szczególnie istotny, ponieważ wykazano, że składowa siły pionowej znacząco wpływa na zależność kinetyki silnika od obciążenia7,8. Korzystając z tej techniki, możemy zastosować szereg obciążeń wspomagających i rezystancyjnych do procesowej miozyny-5B i bezpośrednio zmierzyć zależność obciążenia jej procesywności dla szerokiego zakresu sił4.
Jak pokazano w Rysunek 1a, w tym systemie pojedyncze włókno aktynowe jest zawieszone pomiędzy dwoma polistyrenowymi kulkami uwięzionymi w ognisku podwójnej pęsety optycznej ("hantle"). Niezrównoważona siła wypadkowa F= F1-F 2 jest nakładana na żarnik za pośrednictwem systemu szybkiego sprzężenia zwrotnego, który sprawia, że żarnik porusza się ze stałą prędkością w jednym kierunku, aż osiągnie zdefiniowany przez użytkownika punkt odwrócenia, w którym siła wypadkowa jest odwrócona w przeciwnym kierunku. Gdy białko motoryczne nie wchodzi w interakcję z włóknem, hantle mogą swobodnie poruszać się do przodu i do tyłu w kształcie trójkątnej fali (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1b, dolny panel) obejmujący koralik postumentu, do którego przymocowane jest pojedyncze białko motoryczne. Po ustaleniu interakcji siła przenoszona przez hantle jest bardzo szybko przenoszona na białko motoryczne, a silnik zaczyna przemieszczać włókno, przechodząc pod intensywnością siły i kierunkiem, które zostały przyłożone przez system sprzężenia zwrotnego w momencie interakcji, aż miozyna odłączy się od aktyny. Będąc przemieszczeniem wytworzonym przez stopniowanie silnika zależnym od biegunowości uwięzionego włókna aktynowego, w zależności od kierunku przyłożonej siły obciążenie może być albo pomocnicze, tj. pchające w tym samym kierunku, co przemieszczenie silnika (pchanie w <silna klasa="xfig">Rysunek 1b górny panel), albo rezystancyjne, tj. ciągnące w przeciwnym kierunku w stosunku do przemieszczenia silnika (ciągnięcie w <silna klasa="xfig">Rysunek 1b górny panel) umożliwiający badanie chemomechanicznej regulacji procesywności ruchowej zarówno przez intensywność, jak i kierunkowość przyłożonego obciążenia.
W następnych sekcjach wszystkie kroki do pomiaru oddziaływań aktyna-miozyna-5B pod różnymi obciążeniami za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siła-cęgi są w pełni opisane, w tym 1) ustawienie układu optycznego, wyrównanie pułapek optycznych i procedury kalibracji, 2) przygotowanie wszystkich komponentów i ich montaż w komorze próbki, 3) procedura pomiaru, 4) reprezentatywne dane i analiza danych w celu wyodrębnienia ważnych parametrów fizycznych, takich jak długość biegu, rozmiar kroku i prędkość białka motorycznego.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; Koraliki alifatyczne aminowo-lateksowe</td><td>ThermoFisher</td><td>A37362</td><td>1.0-&mu; m średnica, 2% (w/v)</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td></td></tr><tr><td>Bufor polimeryzacyjny aktyny</td><td>Cytoszkielet</td><td>BSA02</td><td>10X</td></tr><tr><td>ADED (deflektory akustyczno-optyczne)</td><td>AA Opto Electronic</td><td>DTS-XY 250</td><td>Deflektory wiązki laserowej</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Biotynylowane-BSA</td><td>ThermoFisher</td><td>29130</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>B4287</td><td></td></tr><tr><td>Kalmodulina z mózgu świni (CaM)</td><td>Merck Millipore</td><td>208783</td><td></td></tr><tr><td>Katalaza z wątroby bydlęcej</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td></td></tr><tr><td>Kondensator</td><td>Olympus</td><td>OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat</td><td>NA 1.4, zanurzenie w oleju</td></tr><tr><td>Tetrahydrat fosforanu kreatyny sól disodowa</td><td>Sigma</td><td>27920</td><td></td></tr><tr><td>Fosfokinaza kreatynowa z mięśnia królika</td><td>Sigma</td><td>C3755</td><td></td></tr><tr><td>DDs</td><td>AA Opto Electronic</td><td>AA. DDS. XX</td><td>Dwukanałowy syntezator cyfrowy</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)/td></td><td>Sigma</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td></td><td>Sigma E4378</td><td></td></tr><tr><td>Cytoszkielet</td><td>białka G-aktyny</td><td>AKL99</td><td></td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Oksydaza glukozowa z Aspergillus niger</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; G7141</td><td></td></tr><tr><td>HaloTag ligand o2 ester sukcynimidylowy</td><td>Promega</td><td>P1691</td><td></td></tr><tr><td>Wysokopróżniowy smar silikonowy ciężki</td><td>Merck Millipore</td><td>107921</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4 / K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P5379 / P8281</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td>wersja 8.1</td><td>Akwizycja danych</td></tr><tr><td>Labview Moduł FPGA</td><td>National Instruments</td><td>wersja 8.1</td><td>Fast Force-Clamp</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>MathWorks</td><td>2016</td><td>Analiza danych</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Fluka</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Obiektyw</td><td>Nikon</td><td>Plan-Apo 60X</td><td>NA 1.2, WD 0.2 mm, woda imm.</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>Sigma</td><td>N8267</td><td>0,45 wielkość porów</td></tr><tr><td>Roztwór octanu pentylu</td><td>Sigma</td><td>46022</td><td></td></tr><tr><td>Czysty etanol</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>QPDs</td><td>UDT</td><td>DLS-20</td><td>D Wykrywanie pozycji</td></tr><tr><td>Rodaminy BSA</td><td>Sondy molekularne</td><td>A23016</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina falloidyna</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki krzemionkowe</td><td>Bangslabs</td><td>SS04N</td><td>1,21 mm, 10% ciał stałych</td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Białko Streptawidyny</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>189730</td><td></td></tr></tbody></table> powiedział:

analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy

Ultraszybka spektroskopia siłowo-zaciskowa (UFFCS) to technika pojedynczej cząsteczki oparta na pęsetach laserowych, która pozwala na badanie chemomechaniki zarówno konwencjonalnych, jak i niekonwencjonalnych miozyn pod obciążeniem z niespotykaną dotąd rozdzielczością czasową. W szczególności możliwość sondowania silników miozyny pod stałą siłą zaraz po utworzeniu wiązania aktyna-miozyna, wraz z wysoką szybkością siłowego sprzężenia zwrotnego (200 kHz), wykazała, że UFFCS jest cennym narzędziem do badania zależności obciążenia od szybkiej dynamiki, takiej jak skok roboczy miozyny. Co więcej, UFFCS umożliwia badanie, w jaki sposób intensywność i kierunek przyłożonej siły wpływają na procesyjne i nieprocesowe interakcje miozyna-aktyna.
Postępując zgodnie z tym protokołem, możliwe będzie przeprowadzanie ultraszybkich eksperymentów z siłą zacisku na procesyjnych silnikach miozyny-5 oraz na różnych niekonwencjonalnych miozynach. Dzięki pewnym modyfikacjom protokół można również łatwo rozszerzyć na badania nad innymi klasami silników procesowych, takimi jak kinezyny i dyneiny. Protokół obejmuje wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, procedury kalibracji, gromadzenie i analizę danych.

Reprezentatywne dane składają się z zapisów pozycji w czasie, co przedstawiono w Rysunek 4W zapisie pozycji widoczne są dwa rodzaje przemieszczenia. Po pierwsze, gdy silnik miozynowy nie oddziałuje z filamentem aktynowym, uwięzione kulki poruszają się ze stałą prędkością przeciwko sile oporu lepkości roztworu, wykazując liniowe przemieszczenie oscylujące w zakresie oscylacji ustawionym przez operatora w postaci fali trójkątnej.3 (niewidoczne w <strong...

Prezentowany tutaj jest obszerny protokół do przeprowadzania ultraszybkich eksperymentów z zaciskiem siły na procesyjnych silnikach miozyny-5, który można łatwo rozszerzyć do badania innych klas silników procesowych. Protokół wyszczególnia wszystkie niezbędne kroki, od ustawienia aparatury doświadczalnej po przygotowanie próbki, gromadzenie danych i analizę.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Ultrafast force-clamp spectroscopy (UFFCS) is a single molecule technique based on laser tweezers that allows the investigation of the chemomechanics of ...

Ultraszybka spektroskopia siłowo-cęgowa to technika jednocząsteczkowa oparta na pęsetie laserowej, która umożliwia badanie chemomechaniki silników miozyny pod obciążeniem z najwyższą rozdzielczością czasową. Technika ta pozwala na sondowanie bardzo szybkich zdarzeń w wytwarzaniu siły poprzez utrzymywanie stałej siły podczas każdej fazy interakcji motorycznej z pełną kontrolą kierunkowości siły. Dokonując odpowiednich dostosowań, protokół ten można łatwo zastosować do innych rodzajów silników procesowych, w tym kinezyn i dynein, w celu wykrycia regulacji na siłę.Po zamontowaniu jednego zestawu deflektorów akustyczno-optycznych na translatorze liniowym, weź przysłonę i dostosuj jej przysłonę do rozmiaru tylnej apertury obiektywu. Wymień obiektyw na tęczówkę wyśrodkowaną na gwintowanej obudowie obiektywu. Przesuń translator w kierunku wiązki laserowej, aż część wiązki zablokowana przez kryształ piezoelektryczny będzie widoczna za tęczówką, a następnie obróć translator lekko do tyłu, aż wiązka całkowicie wypełni otwór tęczówki.Aby przygotować kulki krzemionkowe w octanie pentylu, najpierw rozcieńczyć 20 mikrolitrów 1,2 mikrona 10% stałych kulek krzemionkowych w 1-1,5 mililitra acetonu z wirowaniem i 30 sekundami sonikacji. Po sonikacji zbierz kulki przez odwirowanie i ponownie zawieś granulki w 1 mililitrze świeżego acetonu do drugiego prania. Po drugim myciu acetonem umyj kulki trzy razy w 1 mililitrze świeżego octanu pentylu na pranie w tych samych warunkach wirowania i ponownie zawieś osad w 100 mikrolitrach 1% nitrocelulozy i 900 mikrolitrach octanu pentylu.Następnie użyj kawałka tkanki laboratoryjnej nasączonej czystym etanolem, aby ostrożnie wytrzeć szklane szkiełko nakrywkowe o wymiarach 24 x 24 milimetry, a następnie użyj czystej pęsety, aby przepłukać szkło bezpośrednio w etanolu i pozostawić szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia pod delikatnym przepływem azotu. Wirować i sonikować przygotowany bulion krzemionkowy przez 30 sekund i użyć oczyszczonego etanolem szkiełka nakrywkowego o wymiarach 24 x 60 milimetrów, aby rozsmarować 2 mikrolitry roztworu kulki krzemionkowej na powierzchni mniejszego szkiełka nakrywkowego. Podczas wysychania kulek wyczyść szkiełko o wymiarach 26 x 76 milimetrów, jak pokazano, i umieść dwie linie o grubości 60-100 mikronów o grubości 3 milimetrów dwustronnie przyklejone taśmą na długich krawędziach szkiełka.Za pomocą czystej pęsety umieść szkiełko nakrywkowe pokryte koralikami na taśmie tak, aby koraliki były skierowane do wnętrza komory szkiełka i wypełnij komorę 15-milimolowym buforem fosforanowym i pływającym roztworem kulek polistyrenowych. Następnie uszczelnij komorę smarem silikonowym. Aby skalibrować stosunek pikseli do nanometrów w kamerze w jasnym polu, uzyskaj pierwszy obraz kulki krzemionki na powierzchni szkiełka nakrywkowego około 5 mikronów od środka pola widzenia.Przesuń stolik, aby przesunąć koralik o 10 mikronów w kierunku środka pola view i zrób drugi obraz. Oblicz stałą kalibracji kamery, mierząc odległość pikseli między dwiema pozycjami ściegu. Aby skalibrować położenie pułapki, należy uwięzić pojedynczą pływającą cząstkę w jednej pułapce i przesuwać deflektory akustyczno-optyczne w krokach co 0,2 megaherca, uzyskując obraz cząstki i odpowiednią częstotliwość deflektorów dla każdego kroku.Następnie powtórz kalibrację dla drugiej pułapki w ten sam sposób. Aby skalibrować moc i sztywność pułapki, należy uwięzić pojedynczą cząstkę w każdej pułapce i przemieścić obie pułapki za pomocą deflektorów akustyczno-optycznych w krokach co 0,2 megaherca, rejestrując ruch Browna cząstki w obu pułapkach za pomocą kwadrantowych detektorów fotodiodowych i odpowiednią częstotliwość deflektorów akustyczno-optycznych. Uzyskać stałe kalibracji, dopasowując funkcję Lorentza do widma mocy zarejestrowanego ruchu Browna.Aby zebrać próbkę do pomiaru, dodaj 1 miligram na mililitr biotynylowanego BSA do nowej komory z kulkami krzemionkowymi na powierzchni szkiełka nakrywkowego. Po 5 minutach przemyć komorę buforem AB i dodać do komory 1 miligram na mililitr streptawidyny. Po 5 minutach umyć komorę, jak pokazano, i dodać 3 nanomolową biotynylowaną ciężką meromyozynę miozyny-5B w buforze M5B uzupełnionym 2 mikromolową kalmoduliną.Po 5 minutach przemyć komorę trzykrotnie 1 miligramem na mililitr biotynylowanego BSA uzupełnionego 2 mikromolową kalmoduliną w buforze AB i odczekać 3 minuty po ostatnim płukaniu. Przelej mieszaninę reakcyjną i uszczelnij komorę smarem silikonowym. Aby zmierzyć próbkę, umieść komorę na stoliku mikroskopu i przesuwaj obiektyw, aż pływające kulki alfa-aktyniny znajdą się w ostrości.Włącz jedną pułapkę i zalewnij jeden koralik. Gdy pierwsza pułapka zostanie zajęta, przesuń translator tak, aby umieścił uwięziony ścieg blisko powierzchni szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć przytrzaśnięcia wielu koralików, i uwięzić koralik w drugiej pułapce. Przepchnąć próbkę przez translatory dalekiego zasięgu, aby zlokalizować w roztworze włókna aktynowe o długości co najmniej 5 mikronów.Po zauważeniu filamentu przesuń próbkę, aby uwięziona kulka zbliżyła się do jednego końca filamentu. Po przymocowaniu filamentu dostosuj odległość koralika do przybliżonej długości filamentu i przesuń stolik, aby utworzyć przepływ w kierunku niezwiązanego koralika. Włókno zostanie rozciągnięte przez przepływ i ostatecznie zwiąże się z drugim koralikiem.Powstały kompleks nazywa się hantlami"Aby nawiązać kontakt aktyna-miozyna, delikatnie oddziel dwie pułapki i ustaw włókno na poziomy naprężenia wstępnego do około 3 pikonewtonów. Aby zbadać sztywność hantli, spraw, aby jedna pułapka oscylowała w fali trójkątnej, zmieniając częstotliwość jednego deflektora akustyczno-optycznego i sprawdzając konsekwentne przenoszenie ruchu na koralik wleczony za pomocą jego sygnału położenia. Przesuń stolik, aby ustawić hantle w pobliżu kulki krzemionki na cokole i wyreguluj wysokość hantli tak, aby włókno aktynowe stykało się z powierzchnią kulki krzemionki.Jak zaobserwowano w tym reprezentatywnym zapisie pozycji, gdy silnik miozyny nie oddziałuje z włóknem aktyny, uwięzione kulki poruszają się ze stałą prędkością w stosunku do lepkiej siły oporu roztworu. Gdy silnik miozyny zaczyna oddziaływać z włóknem, siła przenoszona przez poruszające się włókno jest bardzo szybko przenoszona na białko, a prędkość systemu spada do zera, przy czym zdarzenia krokowe zachodzą pod stałą siłą aż do końca przebiegu. Siła jest przełączana z kierunku dodatniego na ujemny przez system sprzężenia zwrotnego, który zmienia kierunek siły, gdy koralik osiągnie krawędź zakresu oscylacji ustawionego przez użytkownika.Kiedy miozyna wiąże się i przemieszcza włókno w kierunku dodatnim, popycha koralik w kierunku górnej krawędzi zakresu oscylacji. Jeśli stanie się to pod wpływem siły wspomagającej, bieg miozyny zostanie przerwany przez odwrócenie kierunku siły na krawędzi oscylacji, ograniczając długość biegu do amplitudy oscylacji hantli. Precyzyjne ustawienie układu optycznego jest niezbędne do uzyskania optymalnej rozdzielczości przestrzennej i czasowej, natomiast dokładna kalibracja jest niezbędna do precyzyjnego określenia wartości przyłożonych sił.Technika ta została zaadaptowana do badania ślizgania się i celowanego poszukiwania czynników transkrypcyjnych w DNA, a także dynamicznych interakcji między białkami mechanotransdukcji indukowanymi przez włókna mikrotubul.

dissecting-mechanoenzymatic-properties-processive-myosins-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niniejszym przedstawiamy przewodnik krok po kroku, prezentujący przeznaczenie, zasadę działania oraz reprezentatywne wyniki uzyskiwane za pomocą nowatorskiego spektrometru siły grawitacyjnej.

Demonstracja zastosowań nowatorskiego spektrometru sił grawitacyjnych do rozciągania i pomiaru białek włóknistych

W niniejszym artykule opisujemy zastosowanie pęset magnetycznych do badania wpływu siły na proteolizę enzymatyczną na poziomie pojedynczej cząsteczki w sposób wysoce równoległy.

Multipleksowe pomiary proteolizy pojedynczych cząsteczek siłowych przy użyciu pęset magnetycznych

Celulosomy to kompleksy wieloenzymatyczne przeznaczone do trawienia celulozy. SMFS oparty na AFM wykorzystano do zbadania właściwości mechanicznych i konfiguracji fałdowania zespołów białkowych związanych z celulozonami. Przedstawiamy kompletny przepływ pracy do immobilizacji białek, pozyskiwania i analizy danych w celu zbadania interakcji poszczególnych kompleksów receptor-ligand zaangażowanych w składanie celulasomów.

Badanie układów receptor-ligand celulosomu za pomocą spektroskopii sił pojedynczych cząsteczek opartej na AFM

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny właściwości kurczliwych miofibryli mięśni prążkowanych z rozdzielczością nano-Newtona. Protokół wykorzystuje konfigurację z opartą na interferometrii sondą siły optycznej. Taka konfiguracja generuje dane o wysokim stosunku sygnału do szumu i umożliwia ocenę kinetyki kurczliwości miofibryli.

Izolowanie miofibryli z biopsji mięśni szkieletowych i określanie funkcji skurczu za pomocą przetwornika siły o rozdzielczości nano-Newtona

Przedstawiono tutaj procedurę ekspresji i oczyszczania miozyny 5a, po której następuje dyskusja na temat jej charakterystyki, przy użyciu testów opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro zarówno zespołowych, jak i pojedynczych, oraz jak te metody mogą być modyfikowane do charakterystyki niemięśniowej miozyny 2b.

Specyficzne dla miozyny adaptacje testów ruchliwości opartych na mikroskopii fluorescencyjnej in vitro

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Zespołowa spektroskopia sił (EFS) to solidna technika mechanicznego rozkładania i wykrywania w czasie rzeczywistym zestawu struktur biomolekularnych w polach biofizycznych i biosensorycznych.

Spektroskopia sił zespołowych za pomocą sił ścinających

Tutaj opisujemy szybki zestaw pęsety magnetycznej, który wykonuje nanomechaniczne pomiary na wrażliwych na siłę biomolekułach z maksymalną szybkością 1,2 kHz. Wprowadzamy jego zastosowanie do spinek do włosów DNA i kompleksów SNARE jako układów modelowych, ale będzie on miał również zastosowanie do innych cząsteczek biorących udział w zdarzeniach mechanobiologicznych.

Pęseta magnetyczna o dużej prędkości do pomiarów nanomechanicznych na elementach wrażliwych na siłę

Ten protokół szczegółowo opisuje procedury rekombinacyjnego wytwarzania ludzkiego holoenzymu miozyny-7a za pomocą systemu MultiBac Baculovirus oraz badania jego ruchliwości za pomocą dostosowanego testu ślizgowego in vitro.

Oczyszczanie oparte na systemie MultiBac i biofizyczna charakterystyka ludzkiej miozyny-7a

Poznaj ultraszybką spektroskopię siłowo-zaciskową do badania chemomechaniki miozyn procesowych z wysoką rozdzielczością czasową. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę interakcji miozyna z aktyną pod obciążeniem.

Analiza właściwości mechanoenzymatycznych miozyn procesowych za pomocą ultraszybkiej spektroskopii siłowo-zaciskowej

Przeglądaj więcej filmów