Name: Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną preparację tkanek do wzbogacenia regionów guzowych w próbkach o niskiej zawartości nowotworu. Ta metoda łączy cyfrową adnotację z automatycznym frezowaniem, zapewniając dokładną izolację materiału do ekstrakcji kwasów nukleinowych i sekwencjonowania egzonów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Carminie Espiritu i Robin E. Taylor za wsparcie w rozwoju zautomatyzowanych sekcji, a także personelowi Genentech Pathology Core Laboratory, który wspierał tę pracę.

Przed rozpoczęciem należy pobrać odpowiednie próbki tkanek zgodnie z protokołami Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB). Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) firmy Genentech, Inc.
1. Przygotowanie tkanek i preparatów
<ol>
	<li>Wybierz FFPE lub świeżo mrożone bloki tkanek i zastosuj odpowiednią metodę przetwarzania poniżej.</li>
	<li>Wytnij skrawki tkanek na dodatnio naładowanych szkiełkach o żądanej grubości. Tkankę FFPE należy podzielić na wstęgi, przy czym pierwszy odcinek referencyjny zostanie przecięty na grubość odpowiednią do barwienia H&E (tj. 4 μm), a następnie 1-4 odcinki o grubości od 4 do 20 μm w zależności od potrzeb i dostępności tkanki. Zbierz skrawki tkanek na dodatnio naładowane szklane szkiełka mikroskopowe. 
	UWAGA: Świeżo zamrożone skrawki tkanek odniesienia należy natychmiast zabarwić hematoksyną i eozyną (H&E) przy użyciu rutynowych protokołów dla zamrożonych skrawków, a niebarwione zamrożone skrawki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będą potrzebne do pobrania.</li>
	<li>Pozostaw wszystkie sekcje FFPE do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc.</li>
	<li>Piecz szkiełka referencyjne FFPE w temperaturze 60 °C przez 30 minut, a następnie zabarwij je H&E zgodnie z rutynowymi protokołami.</li>
	<li>Skanuj poplamione szkiełka H&E na całym imagerze slajdów przy powiększeniu 20x lub większym.</li>
	<li>Dodawaj adnotacje do zeskanowanych obrazów slajdów pod kątem interesujących obszarów nowotworu, korzystając z platformy wyświetlania dostarczonej przez dostawcę lub przeglądarki typu open source. Wyeksportuj te adnotacje jako zrzut ekranu w małym powiększeniu lub zapisz je jako plik metadanych zawierający współrzędne pikseli X-Y odpowiadające wierzchołkom wielokątów. 
	UWAGA: Pierwsza z nich jest mniej trudna technicznie w obsłudze, ale druga oferuje zalety w automatyzacji procesów.</li>
	<li>Utwórz cyfrowe maski obszarów zainteresowania adnotacjami zgodnie z zastosowanym podejściem i wyeksportuj adnotacje ręczne. 
	UWAGA: Jeśli używany jest zrzut ekranu/obraz adnotacji, można użyć prostego oprogramowania do przetwarzania obrazu, aby wybrać region i wypełnić całe zaznaczenie. Użycie współrzędnych X-Y dla każdego ROI wymaga użycia języka programowania do odczytu zarówno danych obrazu, jak i współrzędnych wielokąta w celu utworzenia obrazu o małym powiększeniu z wypełnionymi obszarami zainteresowania. Użytkownik powinien współpracować z dostawcą zautomatyzowanego narzędzia do preparowania w celu ustalenia procesu w oparciu o jego indywidualną dostępność oprogramowania i potrzeby. Jeśli skanowanie, cyfrowe adnotacje do slajdów i/lub tworzenie masek cyfrowych nie są dostępne, można wykonać staranne adnotacje na slajdzie za pomocą markera i użyć ich zamiast maski cyfrowej jako obrazu referencyjnego. Pseudokod do tworzenia maski cyfrowej znajduje się w pliku uzupełniającym 1.</li>
</ol>
2. Zautomatyzowana sekcja tkanek
<ol>
	<li>Umieść niebarwione szkiełka tkankowe próbki na stoliku w pozycjach od pierwszego do czwartego szkiełka w przypadku korzystania z cyfrowego odniesienia do szkiełek. W przypadku korzystania z adnotacji na szkiełku, a nie opcji cyfrowej, umieść niebarwione szkiełka tkankowe próbki na stoliku w pozycjach od drugiego do czwartego szkiełka z szkiełkiem referencyjnym w pierwszej pozycji.</li>
	<li>Utwórz zadanie frezowania za pomocą oprogramowania do automatycznego rozwarstwiania tkanek: Wybór zadania > Utwórz nowe zadanie > identyfikatora przypadku > Nazwij zadanie frezowania; przejdź do Grubość > Grubość przekroju za pomocą zakładki strzałki w górę lub w dół; następnie przejdź do Przygotowanie tkanek > parafinizowanych lub odparafinowanych, Obraz referencyjny > Z pliku > Importuj obraz > Plik, aby zaimportować z listy rozwijanej jako odniesienie cyfrowe, jeśli ma to zastosowanie. Wybierz opcję Ze stołu montażowego, aby uzyskać odniesienie do slajdu na stole montażowym. Po wypełnieniu pól zeskanuj stolik, wybierając przycisk Skanuj etap w prawym dolnym rogu, aby przechwycić każdy szkiełko tkanki próbki w pozycji od pierwszej do czwartej.</li>
	<li>Wybierz obszar tkanki do przechwycenia obrazu.
	<ol>
		<li>Jeśli korzystasz z odniesienia na stole montażowym, przeciągnij ramkę z jednego rogu do drugiego, aby utworzyć prostokątny obszar nad tkanką. Zaznacz okrągły bąbelek pod prostokątnym obszarem, aby przechwycić obraz referencyjny stołu montażowego. Jeśli używasz cyfrowego obrazu referencyjnego, nałóż obraz na wybrany prostokątny obszar. Zmień rozmiar i wyrównaj cyfrowe odniesienie w przybliżeniu kursu, aby jak najlepiej dopasować rozmiar i położenie nad tkanką próbki.</li>
		<li>Skopiuj to prostokątne pole na pozostałe szkiełka tkankowe próbki w pozycjach od drugiego do czwartego slajdu, wybierając opcję kopiowania w prawym górnym rogu obrazu referencyjnego. W razie potrzeby wyrównaj i zmień rozmiar brutto. 
		UWAGA: W przypadku korzystania z obrazu referencyjnego na slajdzie, a nie z maski cyfrowej, wybierz, który slajd na stole montażowym ma być używany jako odniesienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyrównywanie slajdów referencyjnych i przykładowych
	<ol>
		<li>Gdy obraz referencyjny jest rażąco wyrównany na szkiełkach z próbką tkanki we wszystkich pozycjach szkiełka, wybierz przycisk Scan Stage (Etap skanowania) w prawym dolnym rogu ekranu, aby przejść do kroku precyzyjnej regulacji. Wybierz pozycję pierwszego stopnia i ikonę narzędzia Przekształć (trzecia ikona w dół na pasku narzędzi po prawej stronie), aby dokonać precyzyjnych korekt wyrównania i powiększenia odniesienia, aby jak najlepiej pasowało do przykładowej nakładki slajdu. Użyj suwaka Odniesienie do próbki u dołu ekranu, przełączając się między obrazem referencyjnym a przykładowym obrazem wraz z funkcją Powiększ i Pomniejsz, aby dostosować i uzyskać wyrównanie każdej pozycji slajdu. Powtórz ten proces w pozycjach szkiełka próbki od drugiej do czwartej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybierz obszar frezowania w obszarze zainteresowania
	<ol>
		<li>Po uzyskaniu optymalnego nakładania próbki dla każdej z czterech pozycji suwaka, narysuj oznaczenia ścieżek frezowania za pomocą ikony narzędzia Próbnik kolorów (dziesiąta ikona w dół na pasku narzędzi po prawej stronie) na kolorowej części zamaskowanego obrazu referencyjnego. Zaznacz pole Rozszerz do podobnego, jeśli wiele slajdów lub obszarów jest oznaczonych adnotacjami do sekcji, a następnie wybierz przycisk Pobierz adnotacje w prawym dolnym rogu, aby narysować ścieżki frezowania na przykładowych slajdach. </li>
		<li>Wybierz ścieżkę frezowania w pierwszej pozycji suwaka. 
		UWAGA: Po wybraniu ścieżki frezowania w pierwszej pozycji suwaka, zostanie ona skopiowana na pozostałe pozycje suwaka i zostanie obliczone użycie końcówki frezującej. Użycie końcówki frezującej w lewym górnym rogu jest obliczane na podstawie pokrytego obszaru i wybranego rozmiaru końcówki. Jeśli obliczono więcej niż cztery końcówki, można wybrać większy rozmiar końcówki, aby uchwycić zwrot z inwestycji z adnotacjami. Rozmiar końcówki można wybrać lub zmienić po lewej stronie ekranu pod strzałką Końcówka frezująca, a użycie końcówki zostanie ponownie obliczone.</li>
		<li>Po obliczeniu ścieżki frezowania zbierz opisany zwrot z inwestycji z czterema lub mniej końcówkami frezującymi. Wybierz przycisk Setup Stage (Etap konfiguracji) w prawym dolnym rogu ekranu, aby wyświetlić monit o załadowanie końcówek frezujących z umieszczonych probówek zbiorczych w ich odpowiednim oznaczeniu na stoliku.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napełnij zbiornik 3.0 ml buforu do rozwarstwiania najbardziej odpowiedniego dla typu tkanki (FFPE lub świeżo mrożona) i zestawu do ekstrakcji kwasów nukleinowych i wybierz przycisk Analizuj w prawym dolnym rogu ekranu. Użyj oleju mineralnego o jakości molekularnej lub odpowiedniego buforu z dostępnych na rynku zestawów do ekstrakcji kwasów nukleinowych. 
	UWAGA: Następnie rozpoczyna się automatyczna sekcja szkiełek i wybranych obszarów zainteresowania, a próbki są pobierane przez urządzenie. Głowica jednostki podniesie końcówki frezujące z tyłu stolika i napełni płynem preparacyjnym ze zbiornika. Końcówki następnie obracają się wzdłuż ścieżki mielenia, zasysając tkankę próbki ze szkiełek, aż do całkowitego lub pełnego. Pobrana próbka z płynem preparacyjnym jest następnie dozowana do probówek zbiorczych znajdujących się z tyłu stolika.</li>
	<li>Po zakończeniu automatycznej sekcji wyjmij probówki zbiorcze i wypreparowane szkiełka z próbki ze stolika i umieść je odpowiednio w stojaku na probówki i stojaku na szkiełka. 
	UWAGA: Świeżo zamrożone zbiory należy poddać bezpośrednio ekstrakcji kwasów nukleinowych zgodnie z instrukcjami producenta, a świeżo zamrożone sekcje po rozbiorze należy natychmiast wybarwić w H&E przy użyciu rutynowych protokołów dla zamrożonych sekcji.</li>
	<li>Piecz wypreparowane szkiełka tkankowe w temperaturze 60 °C przez 30 minut, a następnie zabarwij je środkiem H&E zgodnie z rutynowymi protokołami.</li>
	<li>Zeskanuj wypreparowane szkiełka poplamione H&E na całym imagerze slajdów w 20-krotnym powiększeniu i/lub archiwum, aby uzyskać odniesienie do tego, jaka tkanka nie została pobrana i pozostaje na szkiełku. 
	UWAGA: Zobacz krok 1.5 powyżej, aby zapoznać się z alternatywnymi opcjami skanowania.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych
<ol>
	<li>Zebrać i ogranulować tkankę. Ekstrakcję kwasów nukleinowych należy przeprowadzić za pomocą dostępnego w handlu zestawu i postępować zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing%3A+a+comprehensive+single+cancer+center%27s+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li>
<li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%3A+An+Official+Journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li>
<li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li>
<li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+in+Barrett%27s+Esophagus%3A+Laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis%3A+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482(2019).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li>
<li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29(2013).</li>
</ol>

Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio i Amy A Lo są pracownikami i akcjonariuszami Genentech i Roche, a Mana Javey i Emmanuel Naouri są pracownikami i akcjonariuszami Roche.

Przedstawiono tutaj protokół zastosowania adnotacji cyfrowej i automatycznej sekcji do preparowania regionów guza z FFPE o niskiej zawartości guza lub świeżo zamrożonych tkanek w celu wzbogacenia guza i wykorzystania w WES. Połączenie cyfrowych adnotacji i tworzenia masek z automatyczną sekcją znacznie skraca wymagany czas pracy i wiedzę specjalistyczną typową dla klasycznych metod wzbogacania guza, w tym ręcznej makrodysekcji i LCM. Protokół demonstruje potencjalnie ważną opcję wzbogacania guza w średnim zakresie, która...

Sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) jest coraz częściej wykorzystywane zarówno w opiece nad pacjentami, jak i w badaniach nad rakiem, pomagając w prowadzeniu terapii i ułatwiając odkrycia naukowe. Tkanka jest często ograniczona i rutynowo stosuje się małe próbki o zmiennej zawartości guza. Adekwatność i integralność guza pozostają zatem przeszkodą w uzyskaniu istotnych danych. Próbki o niższym procencie guza mogą powodować trudności w odróżnieniu prawdziwych wariantów od artefaktów sekwencjonowania i często nie kwalifikują się do NGS1. Wykazano, że wzbogacanie guza w przypadkach o niskiej zawartości guza, poniżej 20%, pomaga uzyskać wystarczającą ilość materiału w celu wygenerowania powtarzalnych danych sekwencjonowania i zapewnienia, że warianty o niskiej częstotliwości nie zostaną pominięte2,3. Limity będą się jednak różnić w zależności od wykorzystywanych platform i planowanego wykorzystania wygenerowanych danych.
Tradycyjnie, wzbogacanie obszarów guza do ekstrakcji odbywa się poprzez manualną makrodysekcję lub mikrodysekcję laserową (LCM) szkiełka z zatopioną parafiną w formalinie (FFPE). Ręczna makrodyssekcja, czyli zeskrobywanie określonych obszarów tkanek ze szkiełek, umożliwia usunięcie obszarów guza do wykorzystania w dalszych testach przy stosunkowo niskich kosztach, ale z niską dokładnością i niską precyzją2,4. Minimalna dokładność techniczna może być bardzo skuteczna w przypadkach o wyższej zawartości guza, w których obecne są duże połacie guza i / lub minimalna utrata tkanki nie wpływa znacząco na wyniki, ale przypadki o niskiej zawartości guza lub przypadki z bardziej rozproszonym guzem wymagają większej precyzji. LCM został zatem wynaleziony w latach 90. i stał się cennym sposobem precyzyjnego usuwania małych, zdefiniowanych, mikroskopijnych obszarów tkanki z szkiełek zatopionych w parafinie w formalinie (FFPE)5,6,7,8. LCM może być wykorzystany do zbierania pojedynczych populacji komórek, gdy istnieje złożona heterogeniczność próbki9, co pozwala na zbieranie wcześniej trudnych do rozdzielenia populacji komórek. Jednak LCM wymaga kosztownych maszyn, które wymagają rozległej wiedzy technicznej i czasu pracy10,11,12,13,14.
Przyrząd używany do automatycznego preparowania tkanek ma precyzję pomiędzy LCM (~10 μm) a makrodyssekcjami (~1 mm)15. Dodatkowo, wykazuje wymagania zarówno dotyczące kosztów, jak i wiedzy technicznej między makrodysekcją a LCM i jest przeznaczony do wykonywania szybkiego wzbogacania tkanek z sekwencyjnych preparatów FFPE w celu złagodzenia wad poprzednich metod15. Zautomatyzowana sekcja w ten sposób wykorzystuje adnotacje cyfrowe lub nakładki obrazów referencyjnych na stole na seryjnie cięte niebarwione szkiełka tkankowe w celu przeanalizowania i wzbogacenia obszarów zainteresowania. Przyrząd wykorzystuje plastikowe końcówki do mielenia z wirującymi ostrzami, probówki zbiorcze o pojemności 1,5 ml i może być używany z wieloma różnymi płynami do preparacji w celu zebrania obszarów zainteresowania do dalszych testów, w tym ekstrakcji nukleinowej i sekwencjonowania. Obracająca się plastikowa końcówka do mielenia wykorzystuje wewnętrzne i zewnętrzne zbiorniki cylindra strzykawki oraz tłok do zbierania buforu, a następnie miele i zbiera tissue16. Zmienna średnica końcówki frezującej (250 μm, 525 μm, 725 μm) pozwala na rozwarstwienie oddzielnych obszarów tkanek w celu porównania, obszarów wieloogniskowych, które można łączyć lub pojedynczych małych obszarów z jednego lub wielu szkiełek FFPE. Grubości sekcji używanych do zbioru można dostosować w oparciu o indywidualne potrzeby eksperymentu, a użytkownicy mogą upewnić się, że obszary zainteresowania nie zostały wyczerpane, wykonując dodatkowe H&E na jednej sekcji szeregowej bezpośrednio po ostatniej sekcji użytej do zbiorów.
Zautomatyzowana sekcja została zidentyfikowana jako sposób na wzbogacenie zawartości guza w przypadkach niskiej zawartości nowotworu, a my przetestowaliśmy i rozszerzyliśmy zamierzoną funkcjonalność automatycznego narzędzia do preparowania tkanek, które jest obecnie sprzedawane do użytku na próbkach klinicznych FFPE o grubości do 10 μm. Prace pokazują, że zautomatyzowana sekcja może być stosowana zarówno do FFPE, jak i świeżo mrożonych skrawków tkanek ludzkich lub zwierzęcych o grubości do 20 μm w celach badawczych. Protokół demonstruje również podejście do cyfrowego opisywania i automatyzacji sekcji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza i/lub przypadkach z zagnieżdżonym, rozproszonym guzem, w których znacząca makrodysekcja jest trudna lub niewykonalna, i wykazuje zarówno jakość, jak i wydajność kwasu nukleinowego wystarczającego dla NGS. Zautomatyzowana sekcja może zatem zapewnić precyzję na średnim poziomie i zwiększoną przepustowość w celu wzbogacenia guza, a także może być stosowana do wzbogacania innych obszarów zainteresowania lub w połączeniu z innymi platformami w celu udzielenia odpowiedzi na pytania badawcze lub kliniczne.

<table><tbody><tr><td>Agilent SureSelectXT</td><td>Agilent</td><td>G9611A</td><td></td></tr><tr><td>Stacja napełniania AVENIO Millisect</td><td>Roche</td><td>8106533001</td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd AVENIO Millisect, Base</td><td>Roche</td><td>8106568001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect Instrument, głowica</td><td>Roche</td><td>8106550001</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki frezujące AVENIO Millisect Mały</td><td>Roche</td><td>8106509001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect PC</td><td>Roche</td><td>8106495001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>22620700</td><td></td></tr><tr><td>Bufor inkubacyjny</td> do mikrowirówek <td>Promega</td><td>D920D</td><td></td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td>Automatyczny barwnik</td></tr><tr><td>Olej mineralny klasy molekularnej</td><td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Promega</td><td>V302B</td><td>Bufor do wytrawiania</td></tr><tr><td>Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus Bufor</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus dodatnio naładowane szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr></tbody></table>

zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

Wzbogacanie guza w tkankach o niskiej zawartości guza, poniżej 20% zawartości guza, w zależności od metody, jest wymagane do generowania powtarzalnych danych jakościowych za pomocą wielu dalszych testów, takich jak sekwencjonowanie nowej generacji. Zautomatyzowana dyssekcja tkanek to nowa metodologia, która automatyzuje i poprawia wzbogacanie guza w tych powszechnych tkankach o niskiej zawartości guza poprzez zmniejszenie zależnej od użytkownika niedokładności tradycyjnej makrosekcji oraz ograniczeń czasowych, kosztowych i specjalistycznych mikrodysekcji wychwytywania laserowego za pomocą cyfrowej nakładki adnotacji obrazu na niebarwione szkiełka. W tym przypadku cyfrowe adnotacje hematoksyliny i eozyny (H&E) są wykorzystywane do celowania w małe obszary guza za pomocą ostrza o średnicy 250μm 2 w niebarwionej parafinie utrwalonej w formalinie (FFPE) lub świeżo zamrożonych skrawkach o grubości do 20 μm w celu automatycznego wzbogacenia guza przed ekstrakcją kwasów nukleinowych i sekwencjonowaniem całego egzomu (WES). Zautomatyzowana sekcja może zbierać oznaczone adnotacjami regiony w tkankach o niskiej zawartości guza z jednej lub wielu sekcji w celu ekstrakcji kwasów nukleinowych. Pozwala również na rejestrowanie obszernych wskaźników przed i po zbiorach przy jednoczesnej poprawie dokładności, odtwarzalności i zwiększeniu przepustowości dzięki wykorzystaniu mniejszej liczby szkiełek. Opisany protokół umożliwia cyfrową adnotację z automatyczną sekcją na zwierzęcych i/lub ludzkich FFPE lub świeżo zamrożonych tkankach o niskiej zawartości guza i może być również wykorzystany do wzbogacania dowolnego regionu zainteresowania w celu zwiększenia adekwatności do dalszych zastosowań sekwencjonowania w przepływach pracy klinicznej lub badawczej.

Wybrano skrawki wątroby mysiej utrwalone w FFPE oraz świeżo zamrożone (FF) zawierające przerzuty raka jelita grubego w ksenoprzeszczepach. Skrawki poddano barwieniu H&amp;E (Rysunek 1A,E,I) i zeskanowano za pomocą skanera całych preparatów przy powiększeniu 20x. Patolog cyfrowo oznaczył obszary nowotworowe zainteresowania, a następnie za pomocą komercyjnego oprogramowania wygenerowano maskę w formacie cyfrowego obrazu referencyjnego png (Rysunek 1B</stro...

Cyfrowa adnotacja z automatyczną sekcją tkanek zapewnia innowacyjne podejście do wzbogacania guza w przypadkach o niskiej zawartości guza i jest dostosowana zarówno do parafiny, jak i mrożonych typów tkanek. Opisany przepływ pracy poprawia dokładność, odtwarzalność i przepustowość i może być stosowany zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.

Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

Izolację lub wzbogacenie małych, rozproszonych obszarów zainteresowania z FFPE lub świeżo zamrożonego materiału można osiągnąć dzięki automatycznej sekcji szybciej i skuteczniej niż przy użyciu tradycyjnych metod. Ekstrakcja materiału genomowego z FFPE, czyli świeżo zamrożonej tkanki, jest wymogiem dla wielu laboratoriów klinicznych i translacyjnych. Zautomatyzowana preparacja wypełnia znaczną lukę między makropreparacją a mikropreparacją laserową.Aby rozpocząć, dodaj adnotacje do zeskanowanych obrazów slajdów dla interesujących nas regionów guza, korzystając z platformy wyświetlania dostarczonej przez dostawcę lub przeglądarki typu open source. Umieść niebarwione szkiełko tkankowe z próbką na stoliku w pozycji od pierwszego do czwartego szkiełka w przypadku korzystania z cyfrowego odniesienia do szkiełka. Utwórz zadanie frezowania za pomocą oprogramowania do automatycznego rozwarstwiania tkanek, otwierając listę zadań, a następnie wybierz opcję Utwórz nowe zadanie i wprowadź identyfikator sprawy i nazwę, aby wprowadzić nazwę zadania.Przejdź do sekcji Grubość i wybierz grubość przekroju za pomocą zakładki strzałki w górę lub w dół. Następnie przejdź do Przygotowanie tkanek i wybier

automated-dissection-protocol-for-tumor-enrichment-low-tumor-content

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Ten protokół opisuje szybką nieenzymatyczną dysocjację świeżych fragmentów tkanek ludzkich do jakościowej i ilościowej oceny komórek CD45+ (limfocytów/leukocytów) obecnych w różnych normalnych i złośliwych tkankach ludzkich. Dodatkowo, supernatant uzyskany z pierwotnego homogenatu tkankowego może być zbierany i przechowywany do dalszej analizy lub eksperymentów.

Prosty i szybki protokół nieenzymatycznej dysocjacji świeżych tkanek ludzkich w celu analizy naciekających limfocytów

Ksenoprzeszczepy ludzkich nowotworów są unaczyniane i infiltrowane przez komórki pochodzenia mysiego podczas fazy wzrostu in vivo. Aby obejść odchylenia spowodowane przez te zanieczyszczające komórki podczas dalszej analizy, opracowaliśmy metodę pozwalającą na kompleksowe zubożenie wszystkich komórek myszy poprzez magnetyczne sortowanie komórek.

Zubożenie komórek myszy z ludzkich ksenoprzeszczepów nowotworowych znacznie poprawia dalszą analizę komórek docelowych

Tutaj opisujemy metodę rozdzielania i wzbogacania składników mikrośrodowiska immunologicznego i nieimmunologicznego guza w ustalonych guzach podskórnych. Technika ta pozwala na oddzielną analizę nacieków immunologicznych guza i nieimmunologicznych frakcji guza, co może pozwolić na kompleksową charakterystykę mikrośrodowiska immunologicznego guza.

Wzbogacenie i charakterystyka mikrośrodowisk immunologicznych i nieimmunologicznych guza w ustalonych podskórnych guzach myszy

W artykule opisano metodę identyfikacji zmian klonalnych i subklonalnych wśród różnych próbek od danego pacjenta. Chociaż opisane tutaj eksperymenty koncentrują się na określonym typie nowotworu, podejście to ma szerokie zastosowanie do innych guzów litych.

Analiza porównawcza zmian chorobowych za pomocą ukierunkowanego podejścia sekwencjonowania

Mikrodysekcja laserowa (LMD) jest czułą i wysoce powtarzalną techniką, która może być wykorzystana do odkrycia ścieżek pośredniczących w heterogeniczności i inwazji glejaka. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowany protokół izolacji dyskretnych obszarów z tkanki glejaka za pomocą laserowego LMD, a następnie analizy transkryptomicznej.

Mikrodysekcja podregionów glejaka do wychwytywania laserowego w celu przestrzennej i molekularnej charakterystyki heterogeniczności wewnątrznowotworowej, onkostrumieni i inwazji

Ten protokół przedstawia metodę zwiększania procentowej zawartości guza w próbkach tkanek zatopionych w parafinie utrwalonych w formalinie.

Zwiększanie zawartości guza poprzez makrodysekcję guza

Ten protokół opisuje wysokoprzepustowy przepływ pracy dla sterowanej przez sztuczną inteligencję segmentacji obszarów zainteresowania potwierdzonych patologicznie na podstawie barwionych, cienkich obrazów skrawków tkanek w celu wzbogacenia populacji komórek z rozdzielczością histologiczną za pomocą mikrodysekcji laserowej. Strategia ta obejmuje nowatorski algorytm umożliwiający przenoszenie znaczników oznaczających interesujące populacje komórek bezpośrednio do mikroskopów laserowych.

Uprzemysłowiona, sterowana sztuczną inteligencją mikrodysekcja laserowa do mikroskalowej analizy proteomicznej mikrośrodowiska guza

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Protokół zapewnia niezawodne i zoptymalizowane podejście do izolacji jąder z próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego przy użyciu platformy 10x Genomics, w tym zalecenia dotyczące warunków dysocjacji tkanek, kriokonserwacji zawiesin pojedynczych komórek i oceny izolowanych jąder.

Zoptymalizowana izolacja jąder ze świeżych i mrożonych próbek guzów litych do sekwencjonowania wieloomowego

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Poznaj zautomatyzowaną preparację tkanek do wzbogacenia regionów guzowych w próbkach o niskiej zawartości nowotworu. Ta metoda łączy cyfrową adnotację z automatycznym frezowaniem, zapewniając dokładną izolację materiału do ekstrakcji kwasów nukleinowych i sekwencjonowania egzonów.

Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza

Przeglądaj więcej filmów