Zautomatyzowany protokół preparacji w celu wzbogacenia guza w tkankach o niskiej zawartości guza
29 marca 2021
Cyfrowa adnotacja z automatyczną sekcją tkanek zapewnia innowacyjne podejście do wzbogacania guza w przypadkach o niskiej zawartości guza i jest dostosowana zarówno do parafiny, jak i mrożonych typów tkanek. Opisany przepływ pracy poprawia dokładność, odtwarzalność i przepustowość i może być stosowany zarówno w warunkach badawczych, jak i klinicznych.
Izolację lub wzbogacenie małych, rozproszonych obszarów zainteresowania z FFPE lub świeżo zamrożonego materiału można osiągnąć dzięki automatycznej sekcji szybciej i skuteczniej niż przy użyciu tradycyjnych metod. Ekstrakcja materiału genomowego z FFPE, czyli świeżo zamrożonej tkanki, jest wymogiem dla wielu laboratoriów klinicznych i translacyjnych. Zautomatyzowana preparacja wypełnia znaczną lukę między makropreparacją a mikropreparacją laserową.
Aby rozpocząć, dodaj adnotacje do zeskanowanych obrazów slajdów dla interesujących nas regionów guza, korzystając z platformy wyświetlania dostarczonej przez dostawcę lub przeglądarki typu open source. Umieść niebarwione szkiełko tkankowe z próbką na stoliku w pozycji od pierwszego do czwartego szkiełka w przypadku korzystania z cyfrowego odniesienia do szkiełka. Utwórz zadanie frezowania za pomocą oprogramowania do automatycznego rozwarstwiania tkanek, otwierając listę zadań, a następnie wybierz opcję Utwórz nowe zadanie i wprowadź identyfikator sprawy i nazwę, aby wprowadzić nazwę zadania.
Przejdź do sekcji Grubość i wybierz grubość przekroju za pomocą zakładki strzałki w górę lub w dół. Następnie przejdź do Przygotowanie tkanek i wybierz Parafinizowane lub Odparafinowane. Wybierz obraz referencyjny "Z pliku i Importuj obraz".
Następnie wybierz plik do zaimportowania z listy rozwijanej jako odniesienie cyfrowe. Zeskanuj stolik, wybierając przycisk Etap skanowania w prawym dolnym rogu, aby przechwycić każdy slajd tkanki próbki w pozycji od pierwszej do czwartej. Aby uzyskać odniesienie na stole montażowym, przeciągnij pole, aby utworzyć prostokątny obszar nad tkanką, a następnie zaznacz okrągły bąbelek pod prostokątnym obszarem, aby przechwycić obraz referencyjny stołu montażowego.
Skopiuj to prostokątne pole na pozostałe szkiełka tkankowe próbki w pozycjach od drugiego do czwartego slajdu, wybierając opcję kopiowania w prawym górnym rogu obrazu referencyjnego. Następnie wyrównaj i zmień rozmiar w razie potrzeby. W przypadku cyfrowego obrazu referencyjnego nałóż obraz na wybrany prostokątny obszar.
Następnie zmień rozmiar i wyrównaj cyfrowe odniesienie rażąco, w trakcie powiększania, aby jak najlepiej dopasować rozmiar i położenie nad tkanką próbki. Skopiuj to prostokątne pole na pozostałe szkiełka tkankowe próbki w pozycjach od drugiego do czwartego slajdu, wybierając opcję kopiowania w prawym górnym rogu obrazu referencyjnego. Następnie wyrównaj i zmień rozmiar w razie potrzeby.
Wybierz etap skanowania" w prawym dolnym rogu, aby przejść do kroku precyzyjnej regulacji. Wybierz pozycję pierwszego etapu i ikonę narzędzia Przekształć na pasku narzędzi po prawej stronie, aby dokonać precyzyjnych korekt wyrównania i powiększenia odniesienia, aby jak najlepiej pasowało do przykładowej nakładki slajdu. Użyj suwaka odwołania do próbki u dołu ekranu, przełączając się między obrazem referencyjnym a przykładowym.
Oraz funkcja powiększania i pomniejszania, aby dostosować i uzyskać wyrównanie każdej pozycji slajdu. Po uzyskaniu optymalnej nakładki próbki narysuj oznaczenia ścieżki frezowania na kolorowej części zamaskowanego obrazu referencyjnego, wybierając ikonę narzędzia próbnika kolorów na pasku narzędzi po prawej stronie. Narysuj ścieżki frezowania na przykładowych slajdach, wybierając przycisk Pobierz adnotacje w prawym dolnym rogu ekranu.
Przechwyć i zbierz opisany obszar zainteresowania za pomocą czterech lub mniej końcówek frezowania podczas obliczania ścieżki frezowania. Użycie końcówki frezarskiej w lewym górnym rogu jest obliczane na podstawie pokrytego obszaru i wybranego rozmiaru końcówki. Rozmiar końcówki można zmienić pod strzałką końcówki frezującej, a użycie końcówki zostanie ponownie obliczone.
Po wybraniu ścieżki frezowania w pierwszej pozycji suwaka, zostanie ona skopiowana na pozostałe pozycje suwaka. Wybierz przycisk "Setup stage" w prawym dolnym rogu ekranu, aby szybko załadować końcówki frezujące z probówek zbiorczych w ich odpowiednim oznaczeniu na stoliku. Napełnij zbiornik trzema mililitrami odpowiedniego buforu do rozwarstwiania dla typu tkanki i do dalszej ekstrakcji kwasów nukleinowych.
Następnie wybierz przycisk Zbadaj w prawym dolnym rogu ekranu. Po automatycznej sekcji należy usunąć probówki zbiorcze i wypreparowane szkiełka z próbką ze stolika. Umieść probówki zbiorcze w stojaku na probówki, a szkiełka w stojaku na przesuwniki.
Formalina barwiona H&E, zatopiona w parafinie i świeżo mrożone skrawki wątroby myszy zawierające przerzutowego raka jelita grubego w ksenoprzeszczepach zostały zeskanowane na całym obrazie slajdów w 20-krotnym powiększeniu i wykorzystane jako szkiełka referencyjne. Szkiełka referencyjne barwione H&E zostały opatrzone adnotacjami i cyfrowo zamaskowane pod kątem obszarów guza do sekcji i ekstrakcji kwasów nukleinowych. Preparaty po wypreparowaniu próbek zostały wybarwione metodą H&E w celu potwierdzenia obszarów sekcji na szkiełkach o grubości 10 mikrometrów i 20 mikrometrów.
Zebrane wskaźniki wykazały sukces zautomatyzowanej sekcji i ekstrakcji kwasów nukleinowych. Próbując zastosować ten protokół, należy pamiętać, że uzyskanie stosunkowo dokładnej adnotacji na niezabarwionych slajdach jest ważne dla wyodrębnienia obszarów zainteresowania.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół zautomatyzowanej dysekcji tkanek w celu wzbogacenia obszarów nowotworowych w tkankach o niskiej zawartości guza, co ułatwia wysokiej jakości ekstrakcję kwasów nukleowych do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie całego egzomu. Metoda ta wykorzystuje cyfrowe nakładki adnotacji na niebarwionych preparatach, co zwiększa dokładność, powtarzalność i przepustowość w porównaniu z tradycyjną makrodysekcją oraz mikrodysekcją sterowaną laserem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Patologia molekularna
- Technologia mikrodysekcji tkanek
- Analiza genomiczna
Wprowadzenie
- Tkanki o niskiej zawartości guza (<20% guza) często dostarczają niewystarczającego materiału do wiarygodnych analiz w dalszych etapach badań.
- Tradycyjna makrodysekcja jest zależna od użytkownika i nieprecyzyjna, natomiast mikrodysekcja laserowa jest czasochłonna i kosztowna.
- Zautomatyzowana dysekcja tkanek stanowi rozwiązanie łączące cyfrową adnotację z precyzyjnym, zautomatyzowanym frezowaniem.
- Dokładne wzbogacanie regionów nowotworowych ma krytyczne znaczenie dla klinicznych i badawczych procesów sekwencjonowania.
Cel badania
- Zaprezentowanie protokołu zautomatyzowanego wzbogacania obszarów nowotworowych w tkankach utrwalonych w FFPE lub świeżo zamrożonych.
- Poprawa wydajności i powtarzalności wycinania tkanek w celu ekstrakcji kwasów nukleowych.
- Umożliwienie generowania wysokiej jakości danych z próbek o niskiej zawartości nowotworu do zastosowań w sekwencjonowaniu.
Zastosowane metody
- Cyfrowa adnotacja obszarów nowotworowych na zeskanowanych preparatach referencyjnych barwionych H&E przy użyciu specjalistycznego oprogramowania lub oprogramowania open-source.
- Nałożenie cyfrowych adnotacji na niebarwione preparaty tkankowe w celu precyzyjnego wyznaczenia celu.
- Zautomatyzowane wycinanie adnotowanych obszarów za pomocą ostrza o średnicy 250 µm2 w sekcjach FFPE lub świeżo zamrożonych o grubości do 20 µm.
- Zbiór wyciętej tkanki do ekstrakcji kwasów nukleinowych i następującego po niej sekwencjonowania całego egzomu.
Główne wyniki
- Zautomatyzowana sekcja pozwala na efektywną izolację niewielkich, rozproszonych obszarów guza z tkanek o niskiej zawartości nowotworu.
- Barwienie H&E po sekcji potwierdza precyzyjne usunięcie zaznaczonych obszarów.
- Metryki pobierania próbek wykazują skuteczne wzbogacenie oraz ekstrakcję kwasów nukleinowych.
- Protokół ten zwiększa przepustowość i zmniejsza zużycie szkiełek w porównaniu z metodami manualnymi.
Wnioski
- Zautomatyzowana dyssekcja tkanek zwiększa dokładność i powtarzalność wzbogacania frakcji nowotworowej w próbkach o niskiej zawartości materiału.
- Metoda ta wypełnia lukę pomiędzy makrodysekcją a mikrodysekcją wspomaganą laserem.
- Jest ona odpowiednia zarówno do zastosowań klinicznych, jak i badawczych, wymagających wysokiej jakości kwasów nukleinowych do sekwencjonowania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowana dyssekcja w celu wzbogacenia guzów w tkankach o niskiej zawartości nowotworu eliminuje krytyczne wąskie gardło w procesie pozyskiwania wysokiej jakości kwasów nukleinowych do późniejszych analiz genomicznych. Dzięki ograniczeniu zmienności zależnej od operatora i zwiększeniu przepustowości, protokół ten podnosi pewność prognostyczną oraz powtarzalność na styku badań podstawowych i translacyjnych. Jego integracja wspiera podejmowanie decyzji z uwzględnieniem ryzyka oraz rozwój portfela projektów w ramach rurociągów badawczo-rozwojowych skoncentrowanych na onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju (B&R) biofarmaceutycznych
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia precyzyjną izolację obszarów guza, wspierając rzetelną walidację celu w heterogenicznych próbkach tkanek.
- Zmniejsza niejednoznaczność biologiczną poprzez poprawę czystości materiału wejściowego do analiz molekularnych.
- Ułatwia pewną weryfikację hipotez dzięki minimalizacji zanieczyszczeń z tkanek pozaguzowych.
Przesiewy i rozwój testów analitycznych
- Przygotowuje wzbogacone próbki odpowiednie do standaryzowanych analiz w dalszych etapach, takich jak sekwencjonowanie następnej generacji.
- Poprawia powtarzalność analizy poprzez automatyzację etapów wyboru i wycinania tkanek.
- Wspiera skalowalne przepływy pracy poprzez zwiększenie przepustowości i zmniejszenie zużycia szkiełek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje przygotowanie próbek do wymagań dotyczących odkrywania i walidacji biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od momentu pobrania tkanki do generowania danych genomowych w modelach przedklinicznych.
- Minimalizuje ryzyko w badaniach translacyjnych poprzez dostarczanie wysokiej jakości wejściowych kwasów nukleinowych wzbogaconych o komórki nowotworowe.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten zautomatyzowany protokół sekcji znajduje zastosowanie pomiędzy etapem pozyskania tkanki a ekstrakcją kwasów nukleinowych, umożliwiając rzetelne przygotowanie próbek do sekwencjonowania i profilowania molekularnego zarówno w badaniach odkrywczych, jak i w procesach translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badania oparte na hipotezach, umożliwiając precyzyjną izolację obszarów zainteresowania z tkanek złożonych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe wzbogacenie odpowiednie dla analiz sekwencjonowania wysokoprzepustowego.
- Analityka: Dostarcza metryki pobierania oraz potwierdzenie po izolacji w celu walidacji jakości próbki i skuteczności wzbogacenia.
- Badania translacyjne: Łączy przetwarzanie próbek przedklinicznych i klinicznych za pomocą standaryzowanych, skalowalnych metod wzbogacania.
- Zastosowania w przedsiębiorstwach: Oferuje niezależną od platformy funkcjonalność, którą można dostosować do różnych typów tkanek i pytań badawczych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w analizach molekularnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje wzbogacanie tkanek, poprawiając powtarzalność i przepustowość.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie bardziej świadomych decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu badań poprzez zapewnienie wysokiej jakości materiału wejściowego dla analiz następczych.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez redukcję zmienności próbek w badaniach genomowych.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagane jest doświadczenie w adnotacji patologii cyfrowej oraz w obsłudze oprogramowania do automatycznej dyssekcji.
- Wymagany jest dostęp do kompatybilnej aparatury obrazującej, adnotacyjnej i frezarskiej.
- Wymagana jest standaryzacja parametrów adnotacji i dyssekcji między zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Metoda jest możliwa do zastosowania zarówno dla tkanek utrwalonych w FFPE, jak i świeżo zamrożonych, pochodzących od zwierząt lub ludzi.
- Optymalne wzbogacenie zależy od dokładnego nałożenia i dopasowania adnotacji cyfrowych.
