Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia
13 maja 2021
Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.
To, co dzisiaj wprowadziliśmy, to uproszczona, zmodyfikowana i chirurgicznie skuteczna metoda leczenia niedokrwienia kończyn tylnych u myszy z ApoE. Ta metoda może być wdrożona w każdym obiekcie dla zwierząt. Główną zaletą metody maziowej jest mała inwazyjność, przy użyciu nacięcia poniżej pięciu milimetrów.
Metoda ma w sobie coś z uczenia się. Dlatego radzimy poćwiczyć na modelach mikrochirurgicznych przed rozpoczęciem pracy na zwierzętach, które zostaną uwzględnione w końcowej analizie. Metodę zademonstruje Kaixuan Yan, doktor medycyny i student z mojego laboratorium.
Zacznij od przygotowania wymaganego sprzętu i narzędzi do zabiegu. Po podaniu znieczulenia myszy, nałóż tę maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie około 37 stopni Celsjusza.
Za pomocą bawełnianego wacika i kremu do depilacji ostrożnie usuń włosy ze skóry kończyn tylnych po prawej stronie. Połóż mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj alkoholu do dezynfekcji skóry i wytrzyj bawełną z dala od roślinnej strony nacięcia.
Za pomocą spiczastych kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie około trzech do czterech milimetrów w środku okolicy pachwinowej. Ostrożnie usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą cienkich spiczastych kleszczy, aby odsłonić proksymalny pęczek nerwowo-naczyniowy kości udowej. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego solą fizjologiczną ostrożnie odsuń tętnicę udową od nerwu udowego i żyły udowej.
Następnie za pomocą końcówki szwu 7,0 ostrożnie przebij błonę pochewki kości udowej. Następnie przejść do 7-0 wchłanialnych szwów przez bliższą tętnicę udową i wykonać podwójne węzły za pomocą nożyczek sprężynowych. Następnie przeciąć tętnicę udową między dwoma wiązaniami.
Przełóż szew wchłanialny 6-0 przez dolną krawędź nacięcia i delikatnie przeciągnij nacięcie do obszaru prawej strony kolana kończyny tylnej, aby odsłonić dystalną tętnicę udową. Ostrożnie odsuń tkankę podskórną na bok, aby odsłonić pęczek nerwowo-naczyniowy. Wyciąć tętnicę udową z żyły udowej i nerwu udowego i użyć bawełny do ochrony nerwu.
Następnie za pomocą końcówki szwu 7,0 przebij błonę pochewki kości udowej. Przełóż dwa wchłanialne szwy 7-0 przez dystalną tętnicę udową i wykonaj podwójne węzły za pomocą nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tętnicę udową między dwoma wiązaniami. Następnie zszyj nacięcie za pomocą wchłanialnych szwów 6-0.
Umieść mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce i kontynuuj monitorowanie jej parametrów życiowych aż do wyzdrowienia. Określ powodzenie podwójnego podwiązania tętnicy udowej lub DLFA następnego dnia za pomocą rezonansu magnetycznego. Przed zabiegiem DLFA waga myszy wahała się od 29,6 do 38,0 gramów.
Siedem dni po operacji DLFA waga wahała się od 26,5 do 34,1 gramów, znacznie niższa niż przed DLFA. Obszary proksymalne i dystalne prawego FA nie wykazywały perfuzji. Wyniki skali Tarlova uległy znacznemu obniżeniu w ciągu jednego dnia po operacji.
Chociaż w kolejnych dniach powoli rosły, do siódmego dnia nadal były niższe niż wartość wyjściowa. Łapy niedokrwionych kończyn tylnych u siedmiu myszy nie były w stanie naturalnie się rozciągnąć w porównaniu ze stroną przeciwległą. Ponadto cztery myszy wykazywały niewielkie przebarwienia łap w porównaniu ze stroną przeciwległą.
Barwienie H&E prawego mięśnia GM ujawniło włókna mięśniowe, które wykazywały nieregularną martwicę niedokrwienną, w której proliferujące komórki satelitarne zastąpiły nekrotyczne włókna mięśniowe i były rozmieszczone w masie lub z regularną dyspersją. Włókna mięśniowe wykazujące naciekanie zapalne przez wielojądrowe makrofagi utraciły swoje normalne cechy morfologiczne, przy czym obecnych było bardzo niewiele zregenerowanych włókien mięśniowych. Przekroje poprzeczne tych zregenerowanych włókien mięśniowych były okrągłe.
Cytoplazma była zabarwiona na czerwono, a w środku znajdowało się jedno małe jądro lub wiele jąder. Jednak tego rodzaju wzorzec zapalny nie został zaobserwowany u lewego GM. Barwienie przeciwciałami CD31 przeprowadzone w celu obserwacji gęstości mikronaczyniowej wykazało, że niedokrwienne kończyny tylne wykazywały znacznie większą gęstość mikronaczyniową niż strona nieniedokrwienna. Najważniejsze jest rozwarstwienie tętnicy udowej.
Operator musi mieć doświadczenie w technikach mikrochirurgicznych, a także być zaznajomiony z anatomią kończyn tylnych myszy. W zasadzie metoda ta może być również stosowana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w nodze. W ten sposób tętnicę można zamknąć za pomocą miękkiego zacisku naczyniowego przed dopuszczeniem do reperfuzji.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia uproszczoną i wydajną technikę chirurgiczną indukcji ostrego niedokrwienia kończyny tylnej u myszy ApoE z wykorzystaniem małoinwazyjnego nacięcia. Metoda została opracowana tak, aby była dostępna dla większości grup badawczych, bez konieczności wprowadzania specjalistycznych usprawnień laboratoryjnych.
Kluczowe elementy badania
Obszar badawczy
- Chirurgia naczyniowa
- Modelowanie niedokrwienia
- Modele mysie w badaniach biomedycznych
Wprowadzenie
- Ostre niedokrwienie jest kluczowym stanem w badaniu problemów naczyniowych.
- Poprzednie metody często wiązały się z większymi nacięciami i wyższą inwazyjnością.
- Niniejsza technika minimalizuje urazy i przyspiesza powrót do zdrowia.
Zastosowane metody
- Chirurgiczna dyssekcja tętnicy udowej
- Myszy ApoE jako model biologiczny
- Zastosowanie nici wchłanialnych do podwiązania
Główne wyniki
- Model wykazuje znaczną utratę masy ciała po operacji oraz upośledzenie funkcji kończyn.
- Analiza histologiczna wykazała martwicę niedokrwienną oraz zmienioną strukturę mięśni.
- Gęstość mikronaczyniowa wzrosła w niedokrwiennych kończynach, co wskazuje na reakcję na wywołany stan.
Wnioski
- Metoda ta skutecznie indukuje niedokrwienie kończyny dolnej, stanowiąc platformę do dalszych badań nad uszkodzeniem reperfuzyjnym.
- Technika ta jest istotna dla badaczy zajmujących się patologią naczyń i mięśni.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten zmodyfikowany model chirurgiczny umożliwia efektywne wywołanie niedokrwienia kończyny tylnej u myszy ApoE-/- przy użyciu małoinwazyjnego nacięcia, co zmniejsza uraz chirurgiczny i ułatwia ocenę powrotu funkcji. Podejście to wspiera przedkliniczną ewaluację patologii naczyniowej oraz mechanizmów niedokrwienia i reperfuzji w istotnym dla choroby modelu miażdżycowym. Stanowi ono skalowalną, powtarzalną platformę do walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego w programach odkrywania leków kardyvaskularnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w modelach niedokrwienia miażdżycowego z wykorzystaniem myszy ApoE-/-.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez standaryzowaną indukcję zamknięcia tętnicy udowej przy minimalnej inwazyjności.
- Wartość prognostyczna: Ułatwia ocenę zaangażowania celu i modulacji szlaków w modelach niedokrwienia kończyn dolnych.
Przesiew i opracowywanie testu
- Gotowość do analizy: Generuje mierzalne wyniki funkcjonalne poprzez ocenę w skali Tarlova oraz potwierdzoną obrazowaniem MRI okluzję tętnicy.
- Powtarzalność: Stała wielkość nacięcia (<5 mm) oraz skuteczna ligacja u wszystkich zwierząt wspierają standaryzację analizy.
- Użyteczność w badaniach przesiewowych: Umożliwia wiarygodną ocenę związków w modelach niedokrwienia kończyny dolnej z mierzalnymi punktami końcowymi histologicznymi i funkcjonalnymi.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie w kontekście chorobowym: Modeluje niedokrwienie u myszy ApoE-/-, co stanowi istotny klinicznie układ dla miażdżycowych chorób naczyniowych.
- Ciągłość translacyjna: Wspiera przejście od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez zastosowanie histologicznych i funkcjonalnych wskaźników regeneracji.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Umożliwia ocenę odpowiedzi zapalnej oraz przebudowy mikro naczyniowej jako biomarkerów uszkodzenia niedokrwiennego.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum odkryć, od walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności w modelach chorób naczyniowych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków w mechanizmach uszkodzenia reperfuzyjnego.
- Przesiewowanie: Dostarcza gotowe do analizy modele niedokrwienne z ilościowymi wynikami funkcjonalnymi i obrazowymi.
- Analityka: Umożliwia porównanie warunków za pomocą skali Tarlova, perfuzji w MRI, utraty masy ciała oraz oceny histologicznej.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną dzięki zastosowaniu odpowiedniego modelu ApoE-/- oraz punktów końcowych zgodnych z biomarkerami.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Stanowi powtarzalną procedurę chirurgiczną do badań nad patologią naczyniową dla zespołów badawczych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Przewidywalność w walidacji celu dzięki wglądowi w mechanizmy martwicy niedokrwiennej i nacieku zapalnego.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja, powtarzalność i skalowalność zapewnione przez miniaturowe nacięcie i spójne kroki proceduralne.
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje typu go/no-go dzięki zmniejszeniu zmienności biologicznej i zwiększeniu wierności modelu w kontekście miażdżycy.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja skorygowana o ryzyko dzięki obiektywnym punktom końcowym funkcjonalnym i histologicznym, wspierającym kryteria postępu.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w technikach mikrochirurgicznych oraz znajomości anatomii kończyn tylnych myszy.
- Niezbędne są instrumenty mikrochirurgiczne, maty grzewcze, sprzęt do anestezji oraz mikroskopy sekcyjne.
- Wymagana jest standaryzacja wielkości nacięcia, techniki ligacji oraz protokołów monitorowania pooperacyjnego pomiędzy zespołami.
- W kwestii adaptacji należy uwzględnić specyfikę anatomii naczyniowej modelu oraz zmienność fenotypową ApoE-/-.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zależność od umiejętności operatora oraz konieczność pooperacyjnej walidacji funkcjonalnej i obrazowej.
