Name: Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Poznaj zmodyfikowaną technikę chirurgiczną niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia. Ta metoda ma niską inwazyjność i umożliwia badanie patologii naczyniowej oraz mięśniowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Viktorii Skude, Alexandrowi Schlundowi i Felixowi Hörnerowi za doskonałe wsparcie techniczne.

UWAGA: Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi WE 2010/63/UE i zostały zatwierdzone przez lokalne niemieckie ustawodawstwo (35-9185.81/G[1]239/18). Dziesięć samców myszy ApoE-/- z tłem C57BL/6J, o wadze 29,6-38,0 g, trzymano w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność i karmiono zachodnią dietą (1,25% cholesterolu i 21% tłuszczu) i wodą ad libitum przez 12 tygodni od 8 tygodnia życia. HLI przeprowadzono na 20-tygodniowych myszach, jak opisano poniżej.
1. Indukcja HLI u myszy ApoE-/-
<ol>
	<li>Przygotuj wymagany sprzęt i narzędzia do operacji (patrz Tabela Materiałów i <silna klasa="xfig">Rysunek 1). Przed użyciem wysterylizuj narzędzia chirurgiczne za pomocą autoklawowania i użyj sterylizatora szklanych kulek podczas operacji.</li>
	<li>Znieczulić mysz wstrzyknięciem podskórnym (S.C.) mieszaniny midazolamu (5 mg/kg), medetomidyny (0,05 mg/ml/kg) i fentanylu (0,5 mg/kg) przed wszystkimi zabiegami chirurgicznymi.
	<ol>
		<li>Po rozpoczęciu znieczulenia należy użyć maści weterynaryjnej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i potwierdzić brak odruchu wycofania pedału w kończynie przedniej i tylnej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie około 37 °C. Za pomocą wacików i kremu do depilacji ostrożnie usuń włosy ze skóry kończyn tylnych po prawej stronie. 
	UWAGA: Krem do depilacji należy stosować w ilości wystarczającej do pokrycia kończyny tylnej, zwłaszcza okolicy pachwinowej, w której zostanie wykonane nacięcie. Krem do depilacji należy stosować krócej niż 3 minuty, a następnie usunąć go zwilżonymi wacikami 2 do 3 razy.</li>
	<li>Połóż mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj środka antyseptycznego do skóry (patrz Tabela materiałów), aby zdezynfekować skórę myszy. Następnie za pomocą spiczastych kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie o długości około 3-4 mm w środku okolicy pachwinowej. Zobacz Rysunek 2 aby zobaczyć schemat procedury.</li>
	<li>Ostrożnie usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą cienkich spiczastych kleszczy, aby odsłonić proksymalny pęczek nerwowo-naczyniowy kości udowej. Ostrożnie użyj cienkich spiczastych kleszczy, aby przebić błonę pochewki kości udowej. Użyj bawełnianego wacika zwilżonego solą fizjologiczną, aby ostrożnie odsunąć tętnicę udową (FA) od nerwu udowego (FN) i żyły udowej (FV).</li>
	<li>Przełóż dwa wchłanialne szwy 7-0 przez proksymalny FA i wykonaj podwójne węzły za pomocą nożyczek sprężynowych, aby przeciąć FA między dwoma wiązaniami.</li>
	<li>Aby odsłonić dystalną FA, przełóż szew wchłanialny 7-0 przez dolną krawędź nacięcia i delikatnie przeciągnij nacięcie do okolicy prawej strony kolana kończyny tylnej.</li>
	<li>Ostrożnie odsuń tkankę podskórną na bok, aby odsłonić pęczek nerwowo-naczyniowy. Użyj cienkich spiczastych kleszczy, aby przebić błonę pochewki kości udowej i wypreparować FA z FV i FN.</li>
	<li>Przełóż dwa wchłanialne szwy 7-0 przez dystalną FA i zawiąż podwójne węzły. Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć FA między dwoma krawatami. 
	UWAGA: Nie wykonano podwiązania na lewej kończynie, która służyła jako kontrola u każdej myszy.</li>
	<li>Następnie użyj wchłanialnych szwów 6-0, aby zszyć nacięcie. Umieść mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce i kontynuuj monitorowanie jej parametrów życiowych aż do wyzdrowienia. Podać pooperacyjne leki przeciwbólowe: Buprenorphine s.c. (0,1 mg/kg masy ciała co 8 godzin przez 48 godzin). 48 godzin po operacji należy podać metamizol w wodzie do picia (24 mg/5 ml wody odpowiada dawce 200 mg/kg 4 razy na dobę).</li>
</ol>
2. Rezonans magnetyczny
UWAGA: Jeden dzień po DLFA, myszy muszą przejść skany MRI, aby ocenić blokadę FA.
<ol>
	<li>Umieść mysz w przezroczystej komorze indukcyjnej i znieczul mysz 1,5-2% izofluranem w otaczającym powietrzu, aż do utraty odruchu prostowania.</li>
	<li>Umieść mysz na podgrzewanym łóżku dla zwierząt wyposażonym w uchwyt na gryzienie i ustawionym w kierunku magnesu za pomocą systemu sterowanego laserowo. Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37±1 °C.</li>
	<li>Podczas akwizycji obrazu utrzymuj znieczulenie 1,5-2% izofluranem w otaczającym powietrzu i monitoruj oddech za pomocą sondy ciśnieniowej.</li>
	<li>Uzyskuj obrazy w poprzecznej orientacji warstwy za pomocą trójwymiarowej (3D) sekwencji angiografii czasu przelotu (TOF) z parametrem czasu echa (TE)/czasu powtarzania (TR)/kąta odwrócenia (FA) = 2 ms/12 ms/13°, czterech średnich, macierzy akwizycji 178 x 144 zrekonstruowanej do 256 x 192 i 121 warstw, co daje rozdzielczość izotropową 0,15 mm3. Aby stłumić sygnał z żył, umieść plaster nasycenia dystalnie do kończyn tylnych.</li>
</ol>
3. Ocena kliniczna i obserwacja
<ol>
	<li>Oszacuj poprawę funkcjonalną w 1., 3., 5. i 7. dniu po operacji, korzystając z funkcjonalnej skali Tarlova18,19 (Tabela 1).</li>
</ol>
4. Ocena histologiczna
<ol>
	<li>Siedem dni po operacji należy zastosować zastrzyk z pentobarbitalu (115 mg/kg) w celu eutanazji myszy.</li>
	<li>Perfuzja soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zawierającej 1% paraformaldehydu (PFA) przez lewą komorę serca (100 ml na mysz). Utrwalić obustronny brzuchaty łydki (Gm) myszy w 4% PFA przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zanurz próbkę w parafinie zgodnie z wcześniej opisanym protokołem20.
	<ol>
		<li>Wytnij odcinki bloku tkankowego zatopionego w parafinie o grubości 4-5 μm na mikrotomie. Za pomocą okrągłego pędzla umieść wycięte skrawki tkanek w łaźni wodnej o temperaturze 42°C.</li>
		<li>Włóż szkiełko mikroskopowe do wody pod kątem 45° i ostrożnie umieść je pod grupą skrawków, które mają zostać pobrane.</li>
		<li>Ostrożnie podnieść szkiełko z wody, pozostawić sekcje do szkiełka i wyschnąć przez noc w inkubatorze stołowym w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać barwienie skrawków parafiny hematoksyliną/eozyną (HE).
	<ol>
		<li>Umieść slajdy zawierające sekcje w uchwytach na slajdy. Przygotuj 3 pojemniki ze świeżym ksylenem i umieść szkiełka w każdym pojemniku na 5 minut, aby odparafinować sekcje.</li>
		<li>Uwodnij sekcje, zanurzając plastry kolejno w 96%, 80%, 70%, 50%, 30% etanolu i wodzie dejonizowanej na 5 minut każda.</li>
		<li>Barwieć w roztworze hematoksyliny przez 10 min.</li>
		<li>Przełóż plastry do pojemnika z wodą dejonizowaną i spłucz, umieszczając pod bieżącą wodą z kranu na 5 minut.</li>
		<li>Za pomocą mikroskopu sprawdź intensywność barwienia hematoksyliną. Jeśli barwienie umożliwia wyraźną identyfikację jąder komórkowych, przejdź do następnego kroku. Jeżeli intensywność barwienia nie ułatwia identyfikacji jąder komórkowych lub jeżeli intensywność barwienia jest słaba, umieścić szkiełko w roztworze hematoksyliny na 1 minutę, powtórzyć mycie wodą (krok 4.4.4), a następnie ponownie sprawdzić.</li>
		<li>Barwienie przeciwstawne w roztworze eozyny-Y przez 5 min.</li>
		<li>Odwodnić sekcje, zanurzając plastry kolejno w pojemnikach zawierających wodę dejonizowaną i 30%, 50%, 70%, 80% i 96% etanolu kolejno przez 10 sekund każdy. Następnie umieść sekcje kolejno w trzech pojemnikach ze świeżym ksylenem na 10 s każdy.</li>
		<li>Umieść szkiełka poziomo na mikroskopijnych mapach do przechowywania szkiełek, sekcjami skierowanymi do góry. Dodaj wystarczającą ilość podłoża mocującego na szkiełko i zamontuj szkiełka nakrywkowe.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonać barwienie immunohistochemiczne (IHC) skrawków parafiny.
	<ol>
		<li>Powtórzyć etapy deparafinowania i ponownego nawodnienia 4.4.1-4.4.2. Następnie zanurzyć skrawki w pojemniku z 10 mM buforem cytrynianu sodu o pH 6 i doprowadzić próbkę do wrzenia w kuchence mikrofalowej. 
		UWAGA: Ponieważ przegrzanie lub niedogrzanie próbek może spowodować niespójne barwienie, należy utrzymywać temperaturę tuż poniżej temperatury wrzenia przez 10 minut.</li>
		<li>Następnie schładzaj sekcje na blacie przez 30 minut. Następnie umyj skrawki w PBS trzy razy przez 5 minut. Ostrożnie osusz obszar wokół próbki i narysuj duży okrąg wokół próbki za pomocą hydrofobowego pisaka. . 
		UWAGA: Nigdy nie dotykaj sample . Znakowanie pisakiem hydrofobowym tworzy granicę hydrofobową, która ułatwia użycie mniejszej objętości roztworu przeciwciała.</li>
		<li>Stłumić aktywność endogennej peroksydazy umieszczając wycinek w 0,3% H2O2 w PBS na 10 min. Blokuj skrawki z 400 μL buforu blokowego (PBS zawierają 3% albuminy surowicy bydlęcej i 0,3% detergentu niejonowego) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w wilgotnej komorze.</li>
		<li>Myj sekcje w PBS przez 5 minut. Następnie dodaj 100-400 μl rozcieńczonego przeciwciała anty-CD31 (1:250) wystarczającego do pokrycia sekcji. Następnie inkubować skrawki przez noc w temperaturze 4 °C w wilgotnej komorze. 
		UWAGA: Upewnij się, że sekcja jest całkowicie pokryta roztworem przeciwciała.</li>
		<li>Usunąć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyć skrawki trzykrotnie w PBS przez 5 minut każda.</li>
		<li>Przygotować mieszaninę 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), dodając 1 kroplę koncentratu DAB do 1 ml rozcieńczalnika DAB i dobrze wymieszać. Następnie dodać 100-400 μl mieszaniny DAB do sekcji i uważnie obserwować okiem przez 2 minuty, aż do uzyskania akceptowalnej intensywności barwienia. 
		UWAGA: Upewnij się, że sekcja jest całkowicie pokryta mieszanką DAB.</li>
		<li>Następnie płukać pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Wykonać barwienie hematoksyliną zgodnie z opisem w krokach 4.4.3-4.4.5.</li>
		<li>Wykonaj barwienie eozyną-Y opisane w kroku 4.4.6. Wykonaj kroki odwadniania opisane w kroku 4.4.7.</li>
		<li>Zamontowano sekcje z szkiełkami nakrywkowymi za pomocą medium montażowego. Użyj ImageJ, aby oszacować procent dodatniego obszaru CD31 (%) w 5 losowo wybranych polach (40x), które można uznać za gęstość mikronaczyniową, jak opisano wcześniej21.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analiza statystyczna
<ol>
	<li>Użyj oprogramowania do analizy statystycznej, aby wyrazić wyniki jako średnią ± odchylenie standardowe i przeprowadzić niesparowany test t na porównaniach. Uznajmy, że P < 0,05 jest statystycznie istotne.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że treść artykułu została skomponowana przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Badanie to przedstawia zmodyfikowane, uproszczone i chirurgicznie skuteczne podejście do ustalenia modelu HLI u myszy ApoE-/- przy użyciu podwójnej ligacji w proksymalnych i dystalnych obszarach FA przez nacięcie 3-4 mm bez żadnych wymaganych ulepszeń laboratoryjnych. Główną cechą tej metody jest mniejszy rozmiar nacięcia w porównaniu z wcześniej opisywanymi badaniami opisującymi mysie modele HLI 8,9,10,11,12,15,20,22,23,24 .<sup class="xref...

Istnieje niezaspokojona potrzeba przedklinicznych modeli zwierzęcych do badań nad chorobami naczyniowymi, takimi jak choroba tętnic obwodowych (PAD). Pomimo zaawansowanych postępów w diagnostyce i leczeniu, w 2018 roku było ponad 200 milionów pacjentów z PAD1, a ich liczba stale rośnie. Chociaż opisano kilka nowatorskich podejść terapeutycznych2,3,4,5,6,7 zostały opisane, pomyślne przełożenie tych metod terapeutycznych na zastosowanie kliniczne pozostaje trudnym zadaniem. W związku z tym potrzebne są wiarygodne i odpowiednie modele eksperymentalne in vivo symulujące stan chorobowy u ludzi, aby zbadać potencjalny mechanizm i skuteczność tych nowych podejść terapeutycznych w leczeniu PAD6,7.
Hiperlipidemia i miażdżyca (AS) są głównymi czynnikami ryzyka rozwoju PAD. Myszy ApoE-/- (na diecie wysokotłuszczowej) wykazują nieprawidłowy metabolizm tłuszczów i hiperlipidemię, a następnie rozwijają blaszki miażdżycowe, co sprawia, że myszy ApoE-/- są najlepszym wyborem do symulacji klinicznie istotnego PAD. Przedkliniczne modele zwierzęce HLI są generowane poprzez podwójne podwiązanie tętnicy udowej (DLFA), które jest najczęściej stosowanym podejściem w laboratoriach na całym świecie8,9,10,11,12,13,14,15 do symulacji ostrego i przewlekłego niedokrwienia. Jednak takie podejście zwykle wymaga stosunkowo dużego i inwazyjnego nacięcia. Co więcej, nieuchronnie prowadzi to do tego, że zwierzęta (zwłaszcza myszy) cierpią z powodu zwiększonego bólu i stanu zapalnego, co również wpływa na późniejsze wyniki eksperymentów5,6,16,17. W tym artykule opisano model HLI z ostrą i przewlekłą chorobą u myszy APOE-/- przy użyciu bardzo małego nacięcia.

<table><tbody><tr><td>10x Bufor fosforanowy sól fizjologiczna</td><td>Roth</td><td>9143.1</td><td>Stosowany do barwienia hematooksyliną i eozyną oraz barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>30% H2O2</td><td>Roth</td><td>9681.2</td><td>Stosowany do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>6-0 szwy wchłanialne</td><td>PROLENE</td><td>8776H</td><td>Służy do szycia skóry</td></tr><tr><td>6-0 szew absorpcyjny</td><td>PROLENE</td><td>EP8706</td><td>Stosowany w chirurgii</td></tr><tr><td>7-0 szwy wchłanialne</td><td>PROLENE</td><td>EH8021E</td><td>Stosowany do podwiązywania tętnicy</td></tr><tr><td>7-0 szew absorpalny</td><td>PROLENE</td><td>EP8755</td><td>Stosowany w chirurgii</td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Roth</td><td>6755.1</td><td>Stosowany do barwienia hematoksyny i eozyny</td></tr><tr><td>Albumina Fraktion V</td><td>Roth</td><td>8076.2</td><td>Stosowany do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Autoklaw</td><td>Systec GmbH</td><td>Systec VX-150</td><td>Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Mikroskop Axio vert A1</td><td>Carl Zeiss</td><td>ZEISS Axio Vert.A1</td><td>Służy do przeglądania i wykonywania zdjęć z barwienia hematooksyliną i eozyną oraz barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Bruker BioSpec 94/20 AVIII</td><td>Bruker Biospin MRI GmbH</td><td>N/A</td><td>Skan niedrożności tętnicy udowej</td></tr><tr><td>Buprenovet Sine 0,3mg/ml</td><td>Bayer AG</td><td>2542 (WDT)</td><td>Stosowany w leczeniu bólu pooperacyjnego. Dawka - 0,1 mg/kg masy ciała co 8 godzin przez 48 godzin po operacji</td></tr><tr><td>Przeciwciało CD31</td><td>Abcam</td><td>ab28364</td><td>Stosowany do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Eozyna Y roztwór 0,5 % w wodzie</td><td>Roth</td><td>X883.1</td><td>Stosowany do barwienia hematykaliną i eozyną</td></tr><tr><td>Roztwór do odzyskiwania epitopów pH 6</td><td>Leica Biosystems</td><td>6046945</td><td>Stosowany do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Etanol &ge; 99,5 %</td><td>Roth</td><td>5054.1</td><td>Stosowany do barwienia hematoksyliną i eozyną oraz barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Cayman Chemical</td><td>437-38-7</td><td>Używany do znieczulenia</td></tr><tr><td>Kleszcze drobnopunktowe</td><td>Medixplus</td><td>93-4505S</td><td>Służy do oddzielania tętnicy od nerwów i żył</td></tr><tr><td>Sterylizator kulek szklanych</td><td>Simon Keller</td><td>Typ 250</td><td>Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych</td></tr><tr><td>Przysłona kosmiczną Graefe kleszcze zakrzywione</td><td></td><td>VUBU VUBU-02-72207</td><td>Służy do oddzielania skóry i tkanki podskórnej</td></tr><tr><td>Krem do usuwania włosów, Veet (z aloesem)</td> <td>Reckitt Benckiser</td><td>108972</td><td>Usuń sierść z tylnych kończyn myszy</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>ST&Ouml; RK-TRONIC</td><td>7042092</td><td>Utrzymuj temperaturę otoczenia myszy</td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Roth</td><td>T865.2</td><td>Używany do barwienia hematoksyliną i eozyną oraz barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Mikroskop chirurgiczny Leica</td><td></td><td>Leica M651</td><td>Powiększ pole widzenia, aby ułatwić operację</td></tr><tr><td>Płynny system chromogenowy DAB+Substrate</td><td>Dako</td><td>K3468</td><td>Używany do barwienia</td></tr> <tr><td>immunohistochemicznegoSamce myszy ApoE-/-</td> Charles <td>River Laboratories</td><td>N/A</td><td>Używane do ustalenia modelu myszy z chorobą tętnic obwodowych</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Cayman Chemical</td><td>128366-50-7</td><td>Używane do znieczulenia</td></tr><tr><td>Mikro uchwyt na igły</td><td>i chirurgiczny</td><td>B3B-18-8</td><td>Trzymanie igły</td></tr><tr><td>Kleszcze do wiązania mikroszwów</td><td>Life Saver Surgical Industries</td><td>PS-MSF-145</td><td>Służy do pomocy w wiązaniu węzłów podczas operacji</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Biobase</td><td>Bk-MT268m</td><td>Służy do cięcia tkanek</td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm</td><td>44856.01.00</td><td>Używany do znieczulenia</td></tr><tr><td>System monitorowania i bramkowania małych zwierząt kompatybilny z MR Model 1025</td><td>SA Instruments</td><td>N/a</td><td>monitorujący parametry życiowe zwierzęcia podczas badania MRI</td></tr><tr><td>Octeniderm farblos</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td>180212</td><td>stosowany do dezynfekcji skóry</td></tr><tr><td>Maść do oczu i nosa</td><td>Bayer AG</td><td>1578675</td><td>Utrzymuj oczy mokre pod narkozą</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.1</td><td>Służy do utrwalania tkanki</td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Nembutal</td><td>76-74-4</td><td>Używany do znieczulenia</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna</td><td>DeltaSelect</td><td>1299.99.99</td><td>Używany do znieczulenie</td></tr><tr><td>Nożyczki z rękojeścią sprężynową z drobnymi, ostrymi końcówkami</td><td>& chirurgiczny</td><td>B66167</td><td>Używany do przecinania tętnicy</td></tr><tr><td>Nożyczki SuperCut</td><td>i chirurgiczny</td><td>B55992</td><td>Używany do cięcia skóry</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Roth</td><td>9002-93-1</td><td>Używany do barwienia immunohistochemicznego</td></tr><tr><td>Dieta zachodnia, 1,25% Cholesterol</td><td>ssniff Spezialdi&auml; ten GmbH</td><td>E15723-34</td><td>Dieta dla myszy</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Roth</td><td>4436.3</td><td>Stosowany do barwienia hematyoksyliną i eozyną oraz barwienia immunohistochemicznego</td></tr></tbody></table>

zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy apoe-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

A Modified Surgical Model of Hind Limb Ischemia in ApoE-/- Mice using a Miniature Incision

Celem tego badania jest wprowadzenie i ocena zmodyfikowanego podejścia chirurgicznego do wywoływania ostrego niedokrwienia u myszy, które może być wdrożone w większości laboratoriów zwierzęcych. W przeciwieństwie do konwencjonalnego podejścia do podwójnego podwiązania tętnicy udowej (DLFA), wykonano mniejsze nacięcie w prawej okolicy pachwinowej, aby odsłonić bliższą tętnicę udową (FA) do wykonania DLFA. Następnie, za pomocą szwu 7-0, nacięcie przeciągnięto w okolicę kolana, aby odsłonić dystalną FA. Rezonans magnetyczny (MRI) na obustronnych kończynach tylnych zastosowano w celu wykrycia okluzji FA po operacji. Po 0, 1, 3, 5 i 7 dniach od operacji odzyskanie funkcji kończyn tylnych zostało wizualnie ocenione i ocenione za pomocą skali Tarlova. Ocenę histologiczną przeprowadzono po eutanazji zwierząt 7 dni po DLFA. Zabiegi zostały pomyślnie przeprowadzone na prawej nodze u dziesięciu myszy ApoE-/- i żadna mysz nie zmarła podczas późniejszej obserwacji. Rozmiary nacięć u wszystkich 10 myszy były mniejsze niż 5 mm (4,2 ± 0,63 mm). Wyniki rezonansu magnetycznego wykazały, że przepływ krwi w FA po stronie niedokrwiennej był wyraźnie zablokowany. Wyniki skali Tarlova wykazały, że funkcja kończyn tylnych uległa znacznemu pogorszeniu po zabiegu i powoli wracała do normy w ciągu kolejnych 7 dni. Ocena histologiczna wykazała istotną odpowiedź zapalną po stronie niedokrwiennej i zmniejszoną gęstość mikrokrążenia w niedokrwionej kończynie tylnej. Podsumowując, w badaniu tym przedstawiono zmodyfikowaną technikę wykorzystującą miniaturowe nacięcie do wykonania niedokrwienia kończyn tylnych (HLI) przy użyciu DLFA.

Charakterystyka myszy-/- ApoE 
Operacje DLFA zostały pomyślnie przeprowadzone u 10 myszy w celu stworzenia modelu HLI, przy czym żadne z zwierząt nie padło po zabiegu. W celu monitorowania zmian masy ciała, myszy ważono przed procedurą DLFA (Pre-DLFA) oraz 7 dni po operacji DLFA (Post-DLFA). Masa ciała przed zabiegiem DLFA wynosiła od 29,6 do 38,0 g (średnia 34,74 ± 2,47 g), a masa po zabiegu DLFA od 26,5 do 34,1 g (średnia 30,77 ± 2,15 g), co było wartości...

Ten artykuł demonstruje skuteczne podejście chirurgiczne do ustalenia ostrego niedokrwienia u myszy z małym nacięciem. Takie podejście może być stosowane przez większość grup badawczych bez konieczności modernizacji laboratoriów.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

The purpose of this study is to introduce and evaluate a modified surgical approach to induce acute ischemia in mice that can be implemented in most ...

To, co dzisiaj wprowadziliśmy, to uproszczona, zmodyfikowana i chirurgicznie skuteczna metoda leczenia niedokrwienia kończyn tylnych u myszy z ApoE. Ta metoda może być wdrożona w każdym obiekcie dla zwierząt. Główną zaletą metody maziowej jest mała inwazyjność, przy użyciu nacięcia poniżej pięciu milimetrów.Metoda ma w sobie coś z uczenia się. Dlatego radzimy poćwiczyć na modelach mikrochirurgicznych przed rozpoczęciem pracy na zwierzętach, które zostaną uwzględnione w końcowej analizie. Metodę zademonstruje Kaixuan Yan, doktor medycyny i student z mojego laboratorium.Zacznij od przygotowania wymaganego sprzętu i narzędzi do zabiegu. Po podaniu znieczulenia myszy, nałóż tę maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie umieść mysz na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała na poziomie około 37 stopni Celsjusza.Za pomocą bawełnianego wacika i kremu do depilacji ostrożnie usuń włosy ze skóry kończyn tylnych po prawej stronie. Połóż mysz w pozycji leżącej na poduszce grzewczej pod mikroskopem preparacyjnym. Użyj alkoholu do dezynfekcji skóry i wytrzyj bawełną z dala od roślinnej strony nacięcia.Za pomocą spiczastych kleszczy i nożyczek chirurgicznych wykonaj nacięcie około trzech do czterech milimetrów w środku okolicy pachwinowej. Ostrożnie usuń podskórną tkankę tłuszczową za pomocą cienkich spiczastych kleszczy, aby odsłonić proksymalny pęczek nerwowo-naczyniowy kości udowej. Za pomocą bawełnianego wacika zwilżonego solą fizjologiczną ostrożnie odsuń tętnicę udową od nerwu udowego i żyły udowej.Następnie za pomocą końcówki szwu 7,0 ostrożnie przebij błonę pochewki kości udowej. Następnie przejść do 7-0 wchłanialnych szwów przez bliższą tętnicę udową i wykonać podwójne węzły za pomocą nożyczek sprężynowych. Następnie przeciąć tętnicę udową między dwoma wiązaniami.Przełóż szew wchłanialny 6-0 przez dolną krawędź nacięcia i delikatnie przeciągnij nacięcie do obszaru prawej strony kolana kończyny tylnej, aby odsłonić dystalną tętnicę udową. Ostrożnie odsuń tkankę podskórną na bok, aby odsłonić pęczek nerwowo-naczyniowy. Wyciąć tętnicę udową z żyły udowej i nerwu udowego i użyć bawełny do ochrony nerwu.Następnie za pomocą końcówki szwu 7,0 przebij błonę pochewki kości udowej. Przełóż dwa wchłanialne szwy 7-0 przez dystalną tętnicę udową i wykonaj podwójne węzły za pomocą nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tętnicę udową między dwoma wiązaniami. Następnie zszyj nacięcie za pomocą wchłanialnych szwów 6-0.Umieść mysz na poduszce grzewczej w czystej klatce i kontynuuj monitorowanie jej parametrów życiowych aż do wyzdrowienia. Określ powodzenie podwójnego podwiązania tętnicy udowej lub DLFA następnego dnia za pomocą rezonansu magnetycznego. Przed zabiegiem DLFA waga myszy wahała się od 29,6 do 38,0 gramów.Siedem dni po operacji DLFA waga wahała się od 26,5 do 34,1 gramów, znacznie niższa niż przed DLFA. Obszary proksymalne i dystalne prawego FA nie wykazywały perfuzji. Wyniki skali Tarlova uległy znacznemu obniżeniu w ciągu jednego dnia po operacji.Chociaż w kolejnych dniach powoli rosły, do siódmego dnia nadal były niższe niż wartość wyjściowa. Łapy niedokrwionych kończyn tylnych u siedmiu myszy nie były w stanie naturalnie się rozciągnąć w porównaniu ze stroną przeciwległą. Ponadto cztery myszy wykazywały niewielkie przebarwienia łap w porównaniu ze stroną przeciwległą.Barwienie H&E prawego mięśnia GM ujawniło włókna mięśniowe, które wykazywały nieregularną martwicę niedokrwienną, w której proliferujące komórki satelitarne zastąpiły nekrotyczne włókna mięśniowe i były rozmieszczone w masie lub z regularną dyspersją. Włókna mięśniowe wykazujące naciekanie zapalne przez wielojądrowe makrofagi utraciły swoje normalne cechy morfologiczne, przy czym obecnych było bardzo niewiele zregenerowanych włókien mięśniowych. Przekroje poprzeczne tych zregenerowanych włókien mięśniowych były okrągłe.Cytoplazma była zabarwiona na czerwono, a w środku znajdowało się jedno małe jądro lub wiele jąder. Jednak tego rodzaju wzorzec zapalny nie został zaobserwowany u lewego GM. Barwienie przeciwciałami CD31 przeprowadzone w celu obserwacji gęstości mikronaczyniowej wykazało, że niedokrwienne kończyny tylne wykazywały znacznie większą gęstość mikronaczyniową niż strona nieniedokrwienna. Najważniejsze jest rozwarstwienie tętnicy udowej.Operator musi mieć doświadczenie w technikach mikrochirurgicznych, a także być zaznajomiony z anatomią kończyn tylnych myszy. W zasadzie metoda ta może być również stosowana do badania uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego w nodze. W ten sposób tętnicę można zamknąć za pomocą miękkiego zacisku naczyniowego przed dopuszczeniem do reperfuzji.

a-modified-surgical-model-hind-limb-ischemia-apoe-mice-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

W badaniach nad ostrym uszkodzeniem niedokrwienno-reperfuzyjnym oraz przewlekłym przebudowywaniem serca u myszy, w wymiarze czasowym nanosi się liczne manipulacje genetyczne i/lub wewnątrzmięśniowe iniekcje genów, białek, komórek i/lub biomateriałów. Niniejsze wideo ilustruje mikrosurgicalne procedury stosowane w badaniach nad niedokrwieniem/reperfuzją, trwałą ligacją tętnicy wieńcowej oraz iniekcjami wewnątrzmięśniowymi.

Podwiązanie tętnicy wieńcowej i wtryskiwanie domięśniowe w mysim modelu zawału

Wprowadzamy metodę chirurgiczną do wywoływania eksperymentalnego uszkodzenia niedokrwienia/reperfuzji (I/R) symulującego zawał mięśnia sercowego (MI) w modelach mysich, co pozwala na większą przejrzystość w umiejscowieniu podwiązania na lewej tętnicy zstępującej przedniej (LAD) w celu zwiększenia powtarzalności eksperymentów MI u myszy.

Mysi model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mięśnia sercowego poprzez podwiązanie lewej tętnicy zstępującej przedniej

Opisano wysoce powtarzalny model zawału mięśnia sercowego u myszy z minimalnymi inwazyjnymi manipulacjami. Model można łatwo wykonać, co skutkuje wysoką odtwarzalnością i wskaźnikiem przeżycia. W związku z tym opisany model zmniejszy liczbę wymaganych zwierząt, zgodnie z zasadą 3R (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimalnie inwazyjny zabieg chirurgiczny indukcji zawału mięśnia sercowego u myszy

Chirurgiczna indukcja niedokrwienia kończyn tylnych u myszy jest przydatna do badania angiogenezy, jednak jest ona zagrożona u niektórych szczepów myszy wsobnych, które wykazują wyraźną nekrozę tkanek wywołaną niedokrwieniem. Opisano metody wywoływania podostrego niedokrwienia kończyn za pomocą ameroidowych zwężaczy w celu obejścia tego problemu poprzez indukcję stopniowej niedrożności tętnic.

Metody leczenia ostrego i podostrego mysiego niedokrwienia kończyn tylnych

Opisujemy mysi model udaru wywołanego przez zamknięcie środkowej tętnicy mózgowej za pomocą szwu pokrytego silikonem. Protokół może być stosowany w celu wywołania trwałej okluzji lub tymczasowego niedokrwienia, a następnie reperfuzji.

Indukcja udaru niedokrwiennego i reperfuzji niedokrwiennej u myszy przy użyciu techniki niedrożności tętnicy środkowej i wizualizacji obszaru zawału

Mysi model niedokrwienia i reperfuzji mózgu został stworzony w celu zbadania patofizjologii udaru. Podwiązujemy dystalnie prawą środkową tętnicę mózgową i prawą tętnicę szyjną wspólną i przywracamy przepływ krwi po 10 lub 40 minutach niedokrwienia.

Mysi model zamknięcia dwóch naczyń niedokrwienia mózgu-reperfuzji

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Tutaj opisujemy zabieg chirurgiczny pokazujący, jak osiągnąć trwałe podwiązanie lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej u myszy. Model ten ma duże znaczenie dla badania patofizjologii zawału mięśnia sercowego i towarzyszących mu procesów biologicznych.

Mysi model zawału mięśnia sercowego z wykorzystaniem trwałego podwiązania lewej przedniej zstępującej tętnicy wieńcowej

Obecny protokół opisuje unikalny, klinicznie istotny model choroby tętnic obwodowych, który łączy elektrokoagulację tętnicy udowej i żyły z podawaniem inhibitora syntazy tlenku azotu w celu wywołania zgorzeli kończyn tylnych u myszy FVB. Perfuzja DiI dosercowa jest następnie wykorzystywana do trójwymiarowego obrazowania naczyń krwionośnych opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości.

Trójwymiarowe obrazowanie unaczynienia opuszki stopy w wysokiej rozdzielczości w mysim modelu zgorzeli kończyn tylnych

Ten protokół opisuje pobieranie, zszywanie i monitorowanie płatów powięziowo-skórnych u szczurów, które pozwalają na dobrą wizualizację i manipulację przepływem krwi przez powierzchowne dolne naczynia nadbrzusza za pomocą zaciskania i podwiązywania naczyń udowych. Ma to kluczowe znaczenie dla badań obejmujących wstępne kondycjonowanie niedokrwienne.

Powierzchowny dolny płat osiowy tętnicy nadbrzusza do badania efektów kondycjonowania wstępnego niedokrwiennego w modelu szczurzym

Poznaj zmodyfikowaną technikę chirurgiczną niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia. Ta metoda ma niską inwazyjność i umożliwia badanie patologii naczyniowej oraz mięśniowej.

Zmodyfikowany model chirurgiczny niedokrwienia kończyn tylnych u myszy ApoE^-/- przy użyciu miniaturowego nacięcia

Przeglądaj więcej filmów