Zastosowanie obrazowania ultrasonograficznego i elastografii fali poprzecznej w szczurzym modelu NAFLD/NASH
20 kwietnia 2021
Ten protokół opisuje użycie ulepszonej techniki ultradźwiękowej do nieinwazyjnej obserwacji i ilościowego oznaczania zmian w tkance wątroby w modelach niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby u gryzoni
.Zastosowanie ultradźwięków i elastografii fali poprzecznej umożliwia naukowcom pomiar zmian w tkance tłuszczowej i zwłóknieniu wątroby zawartych w modelach niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby. Ta metoda obrazowania jest nieinwazyjną, wysokoprzepustową i klinicznie przekładalną techniką, która może być wykorzystana do oceny stopnia zaawansowania choroby i skuteczności w modelach niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby podczas odkrywania leku. Na początek umieść sześcio- do siedmiotygodniowych samców szczurów Wistar Han o wadze od 150 do 175 gramów w parach w indywidualnie wentylowanych klatkach z odpowiednią ściółką w temperaturze około 22 stopni Celsjusza i wilgotności względnej od 40 do 70% z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności.
Zapewnij 20 szczurom dietę wysokotłuszczową z niedoborem choliny i 1% cholesterolu, a kolejnym 20 szczurom standardową karmę dla gryzoni laboratoryjnych. Aby skonfigurować przyrząd do obrazowania, umieść rozgrzaną powierzchnię w obszarze obrazowania, aby zwierzę było ciepłe podczas obrazowania, i zamocuj stożek nosowy do znieczulenia wziewnego. Użyj uchwytu sondy ultradźwiękowej, aby przesunąć sondę ultradźwiękową w żądane miejsce i zapobiec spoczywaniu sondy na zwierzęciu.
Gdy szczur zostanie całkowicie znieczulony, przenieś go z komory indukcyjnej do ciepłego koca krążącego w gorącej wodzie. Użyj chemicznego kremu do depilacji, aby usunąć włosy z klatki piersiowej do miednicy po prawej stronie szczura. Umieść szczura w lewej bocznej pozycji leżącej i przyklej górne łapy nad głową do ciepłej platformy obrazowania.
Naciśnij przycisk pacjenta na tablicy sterowniczej przyrządu i zidentyfikuj uczestnika zgodnie z projektem badania. Nałóż niewielką ilość podgrzanego żelu ultradźwiękowego na depilowany obszar skóry szczura. Przesuń sondę ultradźwiękową, aby dotknąć obszaru pokrytego żelem.
Gdy na ekranie pojawi się obraz narządów wewnętrznych w trybie B na żywo, przesuń sondę ultrasonograficzną na obszar nieco powyżej biodra, tuż równolegle do kręgów lędźwiowych. Użyj wyświetlacza w trybie B, aby zlokalizować prawą nerkę, identyfikując dużą tętnicę nerkową i oddzielenie rdzenia kory mózgowej. Obserwuj część wątroby w jednej płaszczyźnie obrazu i upewnij się, że na obrazie nie ma pęcherzyków powietrza ani cieni.
Dostosuj ostrość i upewnij się, że kora nerkowa i miąższ wątroby znajdują się w tej samej płaszczyźnie, aby uzyskać wyraźny obraz. Upewnij się, że zwierzę znajduje się między oddechami podczas zamrażania ekranu, aby uniknąć robienia rozmytych obrazów. Wybierz współczynnik trybu B, aby zmierzyć względną jasność tkanki z wybranego obszaru zainteresowania.
Utwórz dwumilimetrowy okrąg i umieść go w obszarze zainteresowania na obrazie wątroby, który znajduje się po prawej stronie nerki. Umieść nowy okrąg na obrazie kory nerkowej, zachowując taką samą głębokość okręgów na wątrobie i korze nerki. Naciśnij przycisk wyboru na panelu sterowania, aby wyświetlić wskaźnik wątrobowo-nerkowy jako stosunek w trybie B i powtórz pomiar trzy razy na różnych głębokościach i płaszczyznach tkanki, a następnie oblicz średnią.
Przesuń sondę poprzecznie w prawym obszarze podżebrowym, aby zlokalizować wątrobę w trybie B. Zlokalizuj czysty obszar wątroby, który jest w większości miąższem i jest wolny od dużych naczyń krwionośnych, takich jak żyła wrotna i tętnica wątrobowa, a następnie naciśnij przycisk SWE na panelu sterowania, aby wygenerować mapę elastyczności ścinania tkanki. Dostosuj rozmiar i położenie pudełka SWE poniżej torebki wątrobowej w obszarze wolnym od cieni.
Gdy pudełko jest pełne i stabilne, naciśnij przycisk zamrażania na panelu sterowania, podczas gdy szczur jest między oddechami. Dotknij Q-Box na wyświetlaczu dotykowym instrumentu, aby obliczyć elastyczność na podstawie obszaru zainteresowania na mapie sprężystości fali poprzecznej. Pojawi się okrąg i pole danych.
Umieść okrąg w obszarze wolnym od cieni z jednolitym kolorem, unikając obszarów sztywności. Powtórz procedurę trzy razy, przesuwając sondę w górę iw dół lub na boki na brzuchu, aby zebrać obrazy zmapowane we wshe z różnych obszarów wątroby. Po zakończeniu usuń taśmę z łap i wytrzyj nadmiar żelu.
Umieść szczura z powrotem w ciepłej i suchej klatce i pozwól mu w pełni się zregenerować. Wybierz wszystkie skany wymagane do analizy danych, zaznaczając pole obok imienia i nazwiska pacjenta za pomocą trackballa i przycisku Wybierz. Po wyeksportowaniu plików otwórz indywidualny plik JPG z każdego skanu i obserwuj dane po prawej stronie obrazu.
Skopiuj wszystkie dane do arkusza kalkulacyjnego lub innego oprogramowania do zarządzania bazą danych i wykonaj żądane analizy statystyczne. Reprezentatywne obrazy wskaźników wątrobowo-nerkowych z grup kontrolnych i z niedoborem choliny, diety wysokotłuszczowej pokazują, że jasność wątroby w korze nerkowej była prawie taka sama, a wskaźnik wątrobowo-nerkowy był mniejszy niż jeden w grupie kontrolnej. W grupie stosującej dietę wysokotłuszczową jasność wątroby wzrosła, a wskaźnik wątrobowo-nerkowy wzrósł do 1,91 w sześciu tygodniach i 1,79 w 12-tygodniowych punktach czasowych.
Wartości indeksu wątrobowo-nerkowego w grupie diety wysokotłuszczowej szybko rosły w ciągu pierwszych trzech do sześciu tygodni, zanim osiągnęły plateau. Skrawki wątroby barwione barwnikiem O w kolorze czerwieni olejowej wykazały znacznie zwiększony obszar zabarwienia w grupie diety wysokotłuszczowej w porównaniu z grupą kontrolną. Stwierdzono również korelację między procentem powierzchni barwionej a wskaźnikiem wątrobowo-nerkowym.
Sztywność tkanek wzrastała stopniowo w grupie diety wysokotłuszczowej przez 12 tygodni i osiągnęła 23,1 kilopaskali z powodu zwłóknienia. Próbki wątroby barwiono czerwienią picrosirius w celu zlokalizowania kolagenu jako wskaźnika zwłóknienia. W grupie stosującej dietę wysokotłuszczową zaobserwowano istotny wzrost procentowego zabarwionego obszaru w porównaniu z grupą kontrolną.
Stwierdzono również silną korelację między procentowo zabarwionym obszarem a liczbami modułu E fali poprzecznej. Ważne jest, aby prawidłowo umieścić przetwornik i okręgi lub pola pomiarowe. Unikanie artefaktów na obrazach pozwoli na powtarzalne i spójne pomiary.
Po zabiegu można również wykonać pomiary ex vivo trójglicerydów wątrobowych i ekspresji genów kolagenu na tkance pochodnej, aby potwierdzić wyniki widoczne w obrazowaniu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nieinwazyjny protokół oparty na badaniu ultrasonograficznym do oceny gromadzenia tłuszczu w wątrobie (steatozy) oraz włóknienia w przedklinicznych modelach gryzoni z niealkoholowym stłuszczeniem wątroby (NASH). Dzięki połączeniu obrazowania USG w trybie B oraz elastografii fali poprzecznej (SWE), badacze mogą monitorować postęp choroby wzdłuż osi czasu i korelować biomarkery obrazowe z markerami histologicznymi, co ogranicza konieczność przeprowadzania inwazyjnych biopsji oraz zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Obrazowanie przedkliniczne
- Badania nad chorobami wątroby
- Modelowanie niealkoholowego stłuszczeniowego zapalenia wątroby (NASH)
Wstęp
- NASH to ciężka postać niealkoholowej stłuszczeniowej choroby wątroby (NAFLD), charakteryzująca się stłuszczeniem, stanem zapalnym i włóknieniem.
- Biopsja wątroby jest klinicznym złotym standardem oceny NAFLD/NASH, jednak jest ona inwazyjna i pracochłonna w badaniach przedklinicznych.
- Konieczne jest opracowanie nieinwazyjnych biomarkerów obrazowania do monitorowania progresji choroby i ograniczenia liczby wykorzystywanych zwierząt.
- Ultradźwiękowy tryb B oraz SWE mogą potencjalnie służyć do ilościowego określania stłuszczenia i włóknienia wątroby in vivo.
Cel badania
- Opracowanie nieinwazyjnego protokołu obrazowania do monitorowania progresji NASH w modelach gryzoni.
- Walidacja korelacji pomiędzy wynikającym z obrazowania indeksem wątrobowo-nerkowym (HR) i elastycznością a histologicznymi markerami stłuszczenia i włóknienia.
- Zapewnienie translacyjnej, wysokoprzepustowej metody dla przedklinicznych badań nad odkrywaniem leków ukierunkowanych na NAFLD/NASH.
Zastosowane metody
- Samce szczurów Wistar Han karmiono albo dietą wysokotłuszczową z niedoborem choliny (pro-NASH), albo standardową paszą.
- Obrazowanie ultradźwiękowe w trybie B służyło do pomiaru indeksu HR poprzez porównanie jasności kory nerek i wątroby.
- Wykonano elastografię fali poprzecznej (SWE) w celu oceny elastyczności tkanki wątrobowej jako markeru włóknienia.
- Obrazowanie przeprowadzano w wielu punktach czasowych, a wyniki porównywano z barwieniem histologicznym (Oil Red O dla stłuszczenia, Picro-Sirius Red dla włóknienia).
Główne wyniki
- Wskaźnik HR znacznie wzrósł w grupie z dietą wysokotłuszczową, co korelowało ze zwiększonym barwieniem Oil Red O (stłuszczenie).
- Elastyczność wątroby (mierzona za pomocą SWE) wzrosła w czasie w grupie z dietą wysokotłuszczową, co korelowało ze zwiększonym barwieniem Picro-Sirius Red (włóknienie).
- Biomarkery obrazowe wykazały silną korelację z klasycznymi metodami histologicznymi ex vivo.
- Protokół umożliwił powtarzalne, spójne i wolne od artefaktów pomiary przy zastosowaniu właściwej techniki.
Wnioski
- Ultradźwiękowe obrazowanie w trybie B oraz SWE dostarczają wiarygodnych, nieinwazyjnych biomarkerów do monitorowania progresji NASH w modelach przedklinicznych.
- Podejście to ogranicza konieczność wykonywania inwazyjnych biopsji oraz zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt.
- Metoda ta jest możliwa do przeniesienia do praktyki klinicznej i nadaje się do wysokoprzepustowych badań nad odkrywaniem leków.
Często zadawane pytania
Zastosowanie przemysłowe
Nieinwazyjne obrazowanie ultradźwiękowe oraz elastografia fal ścinających (SWE) umożliwiają podłużną, ilościową ocenę stłuszczenia i włóknienia wątroby w przedklinicznych modelach NAFLD/NASH. Podejście to zmniejsza zależność od inwazyjnych biopsji, wspierając rozwój translacyjnych biomarkerów oraz efektywną selekcję portfolio w procesie odkrywania leków na choroby metaboliczne. Silna korelacja z punktami końcowymi badania histologicznego zwiększa pewność prognostyczną we wczesnej fazie oceny terapeutycznej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia nieinwazyjne, ilościowe monitorowanie postępu choroby w modelach NAFLD/NASH.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów terapeutycznych poprzez korelację biomarkerów obrazowych z markerami histologicznymi.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego dzięki powtarzalnej ocenie patologii wątroby in vivo.
- Zwiększa pewność prognostyczną w procesie rozwoju celów terapeutycznych w chorobach metabolicznych.
Przesiewy i opracowanie testów
- Zapewnia zwalidowane i powtarzalne punkty końcowe obrazowania dla przedklinicznych badań skuteczności.
- Standaryzuje quantitative readouts (indeks HR, elastyczność) w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Umożliwia wysokoprzepustową, skalowalną ocenę wpływu związków na patologię wątroby.
- Ogranicza liczbę wykorzystywanych zwierząt dzięki możliwości przeprowadzania pomiarów podłużnych w obrębie tej samej kohorty.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia spójność translacyjną poprzez dopasowanie preklinicznych biomarkerów obrazowych do modalności stosowanych w praktyce klinicznej.
- Wspiera decyzje o dalszym rozwoju projektów w oparciu o analizę ryzyka, łącząc obrazowanie in vivo z histologią ex vivo.
- Ułatwia podejmowanie decyzji go/no-go opartych na biomarkerach w procesach rozwoju leków na choroby metaboliczne.
- Usprawnia walidację modeli istotnych dla przebiegu choroby w przypadku kandydatów na leki przeciwko NAFLD/NASH.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy protokół obrazowania integruje etapy od wczesnego odkrywania po walidację przedkliniczną, umożliwiając weryfikację hipotez, ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym oraz dostosowanie translacyjnych biomarkerów w badaniach nad NAFLD/NASH.
- Biologia odkryć: Ilościowe obrazowanie wspiera testowanie hipotez oraz wyjaśnianie mechanizmów progresji choroby.
- Przesiewy: Standaryzowany indeks HR oraz pomiary elastyczności umożliwiają powtarzalną i skalowalną ocenę związków.
- Analityka: Zapewnia wiarygodne, ilościowe wyniki do statystycznego porównania grup eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Biomarkery obrazowe są bezpośrednio przekładalne na punkty końcowe w badaniach klinicznych, co zapewnia ciągłość procesu badawczego.
- Zastosowania instytucjonalne: Protokół można adaptować do wielokrotnego wykorzystania w modelach chorób metabolicznych i programach terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w modelach NAFLD/NASH.
- Wartość operacyjna: Umożliwia standaryzowane, powtarzalne i skalowalne procesy obrazowania.
- Wartość strategiczna: Wspiera efektywne podejmowanie decyzji go/no-go oraz alokację kapitału w portfelach we wczesnej fazie rozwoju.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów związanych z chorobami metabolicznymi.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu małych zwierząt oraz ilościowej analizie ultradźwiękowej.
- Wymaga dostępu do aparatury do USG i SWE z odpowiednim oprogramowaniem.
- Wymaga standaryzacji protokołów obrazowania i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Możliwość adaptacji do różnych modeli gryzoni w chorobach metabolicznych wątroby po optymalizacji protokołu.
- Kluczowe dla wiarygodności danych jest uważne unikanie artefaktów obrazowania oraz konsekwentne rozmieszczenie punktów pomiarowych.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:40
Preparation of Rat for Imaging and Instrument Set-up
2:01
Image Acquisition for Hepato-Renal (HR) Index Measurement
3:27
Image Acquisition for the Shear Wave Elastography
4:43
Image Data Retrieval
5:12
Results: Analysis of the Hepato-renal Index and Shear Wave Elastography in High-fat and Control Diet Groups
6:37
Conclusion
