Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Celem tego protokołu jest wizualizacja agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila. Aby to osiągnąć, używamy komórek politenowych, które znajdują się w gruczołach ślinowych larw trzeciego stadium rozwojowego Genom tych komórek jest amplifikowany prawie tysiąc razy, a chromosomy zachowują cechy komórek interfejsowych. Mają dobrze zdefiniowane telomery i mostki zwane chromocentrum, w których agregują się wszystkie centromery i są głównie heterochromatyczne.

Wykorzystanie tkanki larw trzeciego stadium rozwojowego pozwala nam również ocenić zmiany w agregatach heterochromatycznych w tle różnych mutantów genetycznych. Aby zoptymalizować kulturę larw w trzecim stadium rozwojowym, musisz najpierw zebrać dorosłe osobniki w wieku od 5 do 10 dni i umieścić około 50 w butelce z szeroką szyjką standardowego podłoża. 25 mężczyzn i 25 kobiet.

Umieść butelkę w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 12 godzin. Po upływie czasu inkubacji usuń dorosłe osobniki i przenieś je do nowej butelki, aby powtórzyć procedurę. Pozwól zarodkom rosnąć w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 22 godziny.

Do zbierania larw upewnij się, że wybierasz larwy wędrujące, które nie mają jawnych kulistych kształtów. Wypreparuj 15 par gruczołów ślinowych lub tyle, ile możesz w ciągu 30 minut w zimnym PBS z inhibitorami protestu pod mikroskopem. Przenieś gruczoły ślinowe do innej rurki z lodowatym PBS.

Umyj raz zimnym PBS plus inhibitory protestów. Pamiętaj, zawsze poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna tuby. Po usunięciu PBS z ostatniego kroku, dodaj bezpośrednio 0,5 mililitra jednego bufora do utrwalania gum z grupy X i 50% metanolu plus 2% formaldehydu.

Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z łagodną rotacją. Przeprowadzić jedno pięciominutowe płukanie rotacyjne buforem Tris-Triton, dodając jeden mililitr. Zawsze poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna tubki.

Uwaga: poczekaj, aż tkanka dotrze do dna tuby. Inkubować gruczoły ślinowe z Tris-Tritonem, takim samym jak powyżej, plus 1% beta merkaptoetanolu przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z łagodnym wstrząsaniem. Przemyć buforem BO3 i inkubować z BO3 plus 10 milimolowym DTT w temperaturze 37 stopni Celsjusza, lekko wstrząsając przez 15 minut.

Pod koniec okresu inkubacji przeprowadzić płukanie jednym mililitrem samego buforu BO3. Inkubować gruczoły ślinowe w jednym mililitrze buforu B przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z rotacją. Usuń cały bufor B i dodaj bufor A oraz przeciwciało, które Cię interesuje.

W tym przypadku używamy HP jeden, A C 1 8 9 z banku Iridium. 1 na 3 000 w ciągu nocy pod czterema stopniami z obrotem. W tym momencie ważne jest, aby potrząsanie nie powodowało powstania pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić przeciwciało.

Podawaj smakołyk przez 15 minut mycia buforem B, mieszając w temperaturze pokojowej, używając za każdym razem jednego milimetra. Gruczoły są przenoszone do buforu B wraz z wtórną parą antybiotyków na podłogę na dwie godziny, pod rotacją o cztery stopnie. Na tym etapie ważne jest, aby przykryć probówkę folią aluminiową, aby chronić przeciwciało wtórne przed światłem.

Przeprowadzić myjki 2x15 minut w temperaturze pokojowej, obracając się jednym mililitrem buforu B. Inkubować z markerem DNA, takim jak Sydox lub OH, i rozpuścić w jednym mililitrze buforu B przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją. Przeprowadzić jedno pranie buforem B i raz PBS, przy czym każde pranie trwa 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontuj gruczoły ślinowe na zjeżdżalni, tworząc basen z szkiełkiem nakrywkowym.

Umieść gruczoły ślinowe na środku basenu i przykryj Sidiflor. Aby uniknąć deformacji pęcherzyka, rozciągnij lepką ciecz w całym miejscu. Następnie uszczelnij wszystkie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci.

Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym. Jeśli próbka nie będzie obserwowana tego samego dnia, należy przechowywać ją w świetle w temperaturze czterech stopni. Reprezentatywne wyniki barwienia monoenzymem HB1 w gruczołach ślinowych Drosophila przedstawiono na rycinie pierwszym.

Pozytywnym wynikiem jest obserwacja jednego punktu ogniskowego, takiego jak w A, athero chromatic aggregate lub kondensat. Wynik ujemny to brak sygnału lub sygnał rozproszony. Czasami podwójny sygnał można zaobserwować jak podwójny punkt w C, ale zwykle występuje w mniejszych ilościach.

Aby przeanalizować dane, można je przedstawić w postaci wykresu słupkowego, porównującego rozkład HP1 z różnymi zmutowanymi tłami. Na przykład na rysunku drugim widzimy, że 98% jąder ma rozkład jednego punktu. I 2% dwóch ognisk w typie dzikim.

U mutanta proporcja uległa zmianie, a obecność dwóch ognisk wzrosła do 40%Rycina trzecia przedstawia reprezentatywną trimetylację lizyny 9H3 w monobarwieniu. W rezultacie gruczoły ślinowe Drosophila obserwują jeden punkt ogniskowy w B, jest to korzystny wynik w agregatach chromatycznych lub kondensacie, podwójny lub potrójny sygnał w C można zobaczyć w rzadkich przypadkach, ale w niewielkich ilościach. Pod koniec tego protokołu będzie można zobaczyć diachromatyczne kondensaty białka HP1 pomimo ograniczeń stanowych, będzie to dobre pierwsze podejście.