Name: Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Poznaj technikę barwienia immunofluorescencyjnego do wizualizacji agregatów heterochromatyny w komórkach politenowych gruczołów ślinowych Drosophila. Metoda umożliwia ocenę wpływu mutacji genetycznych na organizację chromatyny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Marco Antonio Rosales Vega i Abelowi Segurze za wykonanie niektórych obrazów konfokalnych, Carmen Muñoz za przygotowanie podłoża oraz dr Arturo Pimentelowi, M.C. Andrésowi Saralegui i dr Chrisowi Woodowi z LMNA za porady dotyczące korzystania z mikroskopów.
FINANSOWANIE: 
Prace te były wspierane przez Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) (A1-S-8239 do VV-G) oraz Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (204915 i 200118 do VV-G)

1. Kultura larw trzeciego stadium rozwojowego
<ol>
	<li>Przygotuj 1 litr standardowej pożywki, dodając 100 g drożdży, 100 g nierafinowanego całego cukru trzcinowego, 16 g agaru, 10 ml kwasu propionowego i 14 g żelatyny. Rozpuść wszystkie składniki oprócz drożdży w 800 ml wody z kranu, a następnie rozpuść drożdże. Natychmiast w autoklawie na 30 minut.
	<ol>
		<li>Następnie pozwól pożywce ostygnąć do 60 °C i dodaj kwas propionowy do końcowego stężenia 0,01%. Odstaw butelkę, aż utworzy się żelatyna.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zoptymalizować hodowlę larw w stadium 3o, najpierw zbierz dorosłe osobniki w wieku od 5 do 10 dni i umieść 50 (25 samców i 25 samic) w butelce ze standardową pożywką z szeroką szyjką.</li>
	<li>Umieścić butelkę z muszkami w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 °C, aż liczba złożonych jaj wyniesie 50 (około 12 godzin w przypadku szczepu dzikiego).</li>
	<li>Po upływie czasu inkubacji usuń dorosłe osobniki i przenieś je do nowej butelki, aby powtórzyć procedurę. Pozwól zarodkom rosnąć w temperaturze 18 °C przez 72 godziny 
	UWAGA: Aby uzyskać więcej informacji na temat warunków utrzymania stada Drosophila, zobacz Tennessen & Thymmel13.</li>
</ol>
2. Kolekcja larw
<ol>
	<li>Do zbierania larw wybierz larwy wędrowne, które nie mają przetchlinki. Po wywinięciu przetchlinków larwa wchodzi w stadium przedsłupkowe, zachowując przy tym doskonałe chromosomy politenowe nadające się do analizy. Dopiero po 12 godzinach komórki gruczołu ślinowego zaczynają przygotowywać się do zaprogramowanej śmierci komórki14,15.</li>
	<li>Weź piętnaście larw 3° instar i włóż je do szkiełka zegarka, aby je umyć. Następnie przenieś je do lodowatego roztworu soli fizjologicznej lub PBS (1x PBS: 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, dostosuj pH do 7,4).</li>
	<li>Wypreparuj od 15 do 30 par gruczołów ślinowych (lub jak najwięcej w ciągu 30 minut) w zimnym PBS z inhibitorami proteazy pod mikroskopem stereoskopowym. Przenieś gruczoły ślinowe do probówki o pojemności 1,5 ml z lodowatym PBS.</li>
	<li>Przemyć raz 1 ml PBS plus inhibitory proteazy. Poczekaj, aż tkanka dotrze do dna probówki.</li>
	<li>Po umyciu wyjmij PBS za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Uważaj, aby nie dotykać tkanki.
	<ol>
		<li>Alternatywnie, należy rozciąć gruczoły ślinowe w 5 ml PBS, aby wyeliminować potrzebę tego etapu płukania i przejść do kroku 3, przenosząc gruczoły ślinowe do 0,5 ml buforu utrwalającego Ruvkun opisanego poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Utrwalenie tkanki gruczołu ślinowego
<ol>
	<li>Po usunięciu PBS z ostatniego kroku, bezpośrednio dodaj 0,5 ml 1x bufor utrwalający Ruvkun, z 50% metanolem (dodać 0,5 ml metanolu) i 2% formaldehydu. 
	UWAGA: 2x roztwór Ruvkun to 160 mM KCl, 40 mM NaCl, 20 mM EGTA, 30 mM RURY o pH 7,4.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C z łagodnymi obrotami.</li>
</ol>
4. Mycie tkanek gruczołów ślinowych
<ol>
	<li>Przeprowadź jedno 5-minutowe płukanie rotacyjne 1 ml buforu Tris/Triton (100 mM Tris pH 7,4, 1% Triton X-100 i 1 mM EDTA). 
	UWAGA: Poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna probówki.</li>
</ol>
5. Przepuszczalność
<ol>
	<li>Inkubować gruczoły ślinowe w 1 ml Tris/Triton X-100 (tak samo jak powyżej). W przypadku niektórych białek może być konieczne dodanie 1% β-merkaptoetanolu.</li>
	<li>Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 ° C z łagodnym wstrząsaniem (300 obr./min).</li>
</ol>
6. Krok konserwacji (opcjonalnie)
UWAGA: Jeśli nie przejdziesz natychmiast do inkubacji z przeciwciałem, zachowaj tkankę w następujący sposób.
<ol>
	<li>Przemyć 1 ml buforu BO3 (0,01 MH3BO3 pH 9,2 + 0,01 M NaOH), a następnie inkubować w BO3/10 mM DTT w temperaturze 37 ° C z łagodnym wytrząsaniem (300 obr./min) przez 15 minut.</li>
	<li>Pod koniec okresu inkubacji przepłukać 1 ml samego buforu BO3. 
	UWAGA: Poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna probówki.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS. Przechowywać tkankę w tym roztworze w temperaturze 4 °C przez okres do 72 godzin, a następnie przejść do następnego etapu. Ten krok jest szczególnie przydatny podczas pracy z różnymi zmutowanymi szczepami, które mogą mieć opóźniony cykl życiowy, dzięki czemu immunodetekcja może być wykonywana w tym samym czasie wraz z kontrolami.</li>
</ol>
7. Blokowanie tkanek
<ol>
	<li>Inkubować gruczoły ślinowe w 1 ml buforu B (PBS + 0,1% BSA + 0,5% Triton X-100 + 1 mM EDTA) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej z rotacją.</li>
</ol>
8. Barwienie immunologiczne
<ol>
	<li>Usuń cały bufor B i dodaj bufor A (PBS + 0,1% BSA) plus przeciwciało będące przedmiotem zainteresowania. 
	UWAGA: Używamy HP1a C1A9c (skoncentrowane przeciwciało) z Hybridoma Bank do 1:3000. Stosując C1A9s (supernatant), próbowaliśmy rozcieńczenia od 1:100 do 1:500 i każde rozcieńczenie między tą rangą działa dobrze) przez noc w temperaturze 4 oC z rotacją. W tym momencie ważne jest, aby potrząsanie nie powodowało powstania pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić przeciwciało.</li>
</ol>
9. Mycie immunologiczne
<ol>
	<li>Wykonaj 3 x 15-minutowe płukanie buforem B mieszając w temperaturze pokojowej, używając za każdym razem 1 ml.</li>
	<li>Przenieść gruczoły do buforu B razem z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z fluoroforem przez 2 godziny pod rotacją w temperaturze 4 oC (zastosowano przeciwciało drugorzędowe Alexa fluor 568 Invitrogen w stosunku 1:3000).
	<ol>
		<li>Przykryj probówkę aluminiową folią papierową, aby chronić przeciwciało wtórne przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić 2 x 15-minutowe płukanie w temperaturze pokojowej podczas obracania z 1 ml buforu B.</li>
	<li>Inkubować z markerem DNA, takim jak Sytox (wziąć 2 μl 5 mM bulionu i rozpuścić w 1 ml buforu B) lub Hoechst (wziąć 1 μl 10 mg/ml bulionu i rozpuścić w 1 ml buforu B) przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją.</li>
	<li>Przeprowadzić jedno płukanie buforem B i raz PBS, przy czym każde pranie trwa 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Pamiętaj, aby chronić go przed światłem.</li>
</ol>
10. Obrazowanie
<ol>
	<li>Zamontuj gruczoły ślinowe na zjeżdżalni, tworząc basen z szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Umieść gruczoły ślinowe na środku basenu i przykryj citifluorem AF1, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków rozciągających lepką ciecz na całe miejsce. Następnie uszczelnij wszystkie boki przezroczystym lakierem do paznokci.</li>
	<li>Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym. Jeżeli próbka nie będzie obserwowana tego samego dnia, należy ją przechowywać z dala od światła w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj GraphPad Prism 6 do generowania wszystkich wykresów i analiz statystycznych.</li>
	<li>Przeanalizuj dane z dystrybucji HP1a w gruczołach ślinowych za pomocą testu Kruskala-Wallisa. Istotność statystyczną ustalono na poziomie (p < 0,05*, < 0,01**, < 0,001***, < 0,0001****).</li>
</ol>

<ol><li>Berger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emil+Heitz%2C+a+true+epigenetics+pioneer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Emil Heitz, a true epigenetics pioneer.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 572(2019).</li>
<li>Irick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+function+for+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">A new function for heterochromatin.</a> Chromosoma. 103 (1), 1-3 (1994).</li>
<li>Kasinathan, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+of+heterochromatin+functions+drives+rapid+evolution+of+essential+ZAD-ZNF+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Innovation of heterochromatin functions drives rapid evolution of essential ZAD-ZNF genes in Drosophila.</a> Elife. , 1-31 (2020).</li>
<li>Lifschytz, E., Hareven, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+markers%3A+Arrangement+of+obligatory+heterochromatin%2C+histone+genes+and+multisite+gene+families+in+the+interphase+nucleus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin markers: Arrangement of obligatory heterochromatin, histone genes and multisite gene families in the interphase nucleus of D. melanogaster.</a> Chromosoma. 86 (4), 443-455 (1982).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Lee, Y. C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericentromeric+heterochromatin+is+hierarchically+organized+and+spatially+contacts+H3K9me2+islands+in+euchromatin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Pericentromeric heterochromatin is hierarchically organized and spatially contacts H3K9me2 islands in euchromatin.</a> PLoS Genetics. 16 (3), 1-27 (2020).</li>
<li>Koryakov, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SUUR+protein+is+involved+in+binding+of+SU+%28VAR%293-9+and+methylation+of+H3K9+and+H3K27+in+chromosomes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">The SUUR protein is involved in binding of SU (VAR)3-9 and methylation of H3K9 and H3K27 in chromosomes of Drosophila melanogaster.</a> Chromosome Research. 19 (2), 235-249 (2011).</li>
<li>Cao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Histone+H3+Lysine+27+Methylation+in+Polycomb-Group+Silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Role of Histone H3 Lysine 27 Methylation in Polycomb-Group Silencing.</a> Science. 298 (5595), 1039(2002).</li>
<li>Hines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domains+of+heterochromatin+protein+1+required+for+Drosophila+melanogaster+heterochromatin+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Domains of heterochromatin protein 1 required for Drosophila melanogaster heterochromatin spreading.</a> Genetics. 182 (4), 967-977 (2009).</li>
<li>Elgin, S. C. R., Reuter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-effect+variegation%2C+heterochromatin+formation%2C+and+gene+silencing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Position-effect variegation, heterochromatin formation, and gene silencing in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (8), 1-26 (2013).</li>
<li>Eissenberg, J. C., Elgin, S. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1a%3A+A+structural+chromosomal+protein+regulating+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">HP1a: A structural chromosomal protein regulating transcription.</a> Trends in Genetics. 30 (3), 103-110 (2014).</li>
<li>Meyer-Nava, S., Torres, A., Zurita, M., Valadez-graham, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+effects+of+dADD1+misexpression+in+chromatin+organization+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular effects of dADD1 misexpression in chromatin organization and transcription.</a> BMC Molecular and Cell Biology. 2, 1-17 (2020).</li>
<li>Tennessen, J. M., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+growth+and+maturation+-+Insights+from+drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Coordinating growth and maturation - Insights from drosophila.</a> Current Biology. 21 (18), 750-757 (2011).</li>
<li>Cai, W., Jin, Y., Girton, J., Johansen, J., Johansen, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+drosophila+polytene+chromosome+squashes+for+antibody+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of drosophila polytene chromosome squashes for antibody labeling.</a> Journal of Visualized Experiments. (36), 1-4 (2010).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 66 (1967), 57-80 (1981).</li>
<li>Larson, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+droplet+formation+by+HP1%CE%B1+suggests+a+role+for+phase+separation+in+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Liquid droplet formation by HP1α suggests a role for phase separation in heterochromatin.</a> Nature. 547 (7662), 236-240 (2017).</li>
<li>Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Phase+Separation+in+Heterochromatin+Formation%2C+Function%2C+and+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Phase Separation in Heterochromatin Formation, Function, and Regulation.</a> Biochemistry. 57 (17), 2540-2548 (2018).</li>
<li>Keenen, M. M., Larson, A. G., Narlikar, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+Quantitation+of+Phase-Separated+Droplet+Formation+by+Human+HP1%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Visualization and Quantitation of Phase-Separated Droplet Formation by Human HP1α.</a> Methods in Enzymology. , (2018).</li>
<li>Lu, B. Y., Emtage, P. C., Duyf, B. J., Hilliker, aJ., Eissenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterochromatin+protein+1+is+required+for+the+normal+expression+of+two+heterochromatin+genes+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heterochromatin protein 1 is required for the normal expression of two heterochromatin genes in Drosophila.</a> Genetics. 155 (2), 699-708 (2000).</li>
<li>Marsano, R. M., Giordano, E., Messina, G., Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Portrait+of+Constitutive+Heterochromatin%3A+Lessons+from+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">A New Portrait of Constitutive Heterochromatin: Lessons from Drosophila melanogaster.</a> Trends in Genetics. , (2019).</li>
<li>Strom, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+drives+heterochromatin+domain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation drives heterochromatin domain formation.</a> Nature. 547 (7662), 241-245 (2017).</li>
<li>Sanulli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HP1+reshapes+nucleosome+core+to+promote+phase+separation+of+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HP1 reshapes nucleosome core to promote phase separation of heterochromatin.</a> Nature. 575 (7782), 390-394 (2019).</li>
<li>Dialynas, G., Delabaere, L., Chiolo, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arp2%2F3+and+Unc45+maintain+heterochromatin+stability+in+Drosophila+polytene+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Arp2/3 and Unc45 maintain heterochromatin stability in Drosophila polytene chromosomes.</a> Experimental Biology and Medicine. 244 (15), 1362-1371 (2019).</li>
<li>Kolesnikova, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+decondensation+of+heterochromatin+in+drosophila+melanogaster+polytene+chromosomes+under+condition+of+ectopic+expression+of+the+supressor+of+underreplication+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Induced decondensation of heterochromatin in drosophila melanogaster polytene chromosomes under condition of ectopic expression of the supressor of underreplication gene.</a> Fly. 5 (3), Austin. 181-190 (2011).</li>
<li>Bettinger, J. C., Lee, K., Rougvie, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stage-specific+accumulation+of+the+terminal+differentiation+factor+LIN-29+during+Caenorhabditis+elegans+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Stage-specific accumulation of the terminal differentiation factor LIN-29 during Caenorhabditis elegans development.</a> Development. 122 (8), 2517-2527 (1996).</li>
<li>Messina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeti%2C+an+essential+Drosophila+melanogaster+gene%2C+encodes+a+protein+required+for+chromatin+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Yeti, an essential Drosophila melanogaster gene, encodes a protein required for chromatin organization.</a> Journal of Cell Science. 127 (11), 2577-2588 (2014).</li>
<li>Aguilar-Fuentes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p8%2FTTDA+overexpression+enhances+UV-irradiation+resistance+and+suppresses+TFIIH+mutations+in+a+Drosophila+trichothiodystrophy+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">p8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy model.</a> PLOS Genetics. 4 (11), 1-9 (2008).</li>
<li>Reynaud, E., Lomeli, H., Vazquez, M., Zurita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+melanogaster+Homologue+of+the+Xeroderma+Pigmentosum+D+Gene+Product+Is+Located+in+Euchromatic+Regions+and+Has+a+Dynamic+Response+to+UV+Light-induced+Lesions+in+Polytene+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The Drosophila melanogaster Homologue of the Xeroderma Pigmentosum D Gene Product Is Located in Euchromatic Regions and Has a Dynamic Response to UV Light-induced Lesions in Polytene Chromosomes.</a> Molecular Biology of the Cell. 10 (4), 1191-1203 (1999).</li>
<li>Farkaš, R., Mechler, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+Drosophila+salivary+gland+apoptosis+displays+an+I+%282%29gl-dose+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">The timing of Drosophila salivary gland apoptosis displays an I (2)gl-dose response.</a> Cell Death & Differentiation. 7 (1), 89-101 (2000).</li>
<li>Zhang, P., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+salivary+gland+chromocenter+contains+highly+polytenized+subdomains+of+mitotic+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin.</a> Genetics. 139 (2), 659-670 (1995).</li>
<li>Stormo, B. M., Fox, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyteny%3A+still+a+giant+player+in+chromosome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Research%22%5BJournal%5D)">Polyteny: still a giant player in chromosome research.</a> Chromosome Research. 25 (3-4), 201-214 (2017).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Funkcja komórkowa organizmów eukariotycznych może definiować strukturę 3D w jądrze, która jest wspierana przez interakcje między różnymi białkami z chromatyną i różnymi cząsteczkami, w tym RNA. W ciągu ostatnich trzech lat kondensaty biologiczne, które miały znaczenie, w tym heterochromatyna, odegrały fundamentalną rolę w określaniu separacji faz, promując odrębną organizację przestrzenną jądra chromatyny aktywnej i represyjnej 16,17,18<sup class="xref...

Od wczesnych badań Emila Heitza1, heterochromatyna jest uważana za ważny regulator procesów komórkowych, takich jak ekspresja genów, mejotyczne i mitotyczne rozdzielanie chromosomów oraz utrzymanie stabilności genomu2,3,4.
Heterochromatyna dzieli się głównie na dwa typy: konstytutywną heterochromatynę, która charakterystycznie definiuje powtarzające się sekwencje, oraz elementy transpozycyjne, które są obecne w określonych miejscach chromosomów, takich jak telomery i centromery. Ten typ heterochromatyny jest głównie definiowany epigenetycznie przez specyficzne znaczniki histonowe, takie jak di lub trimetylacja lizyny 9 histonu H3 (H3K9me3) i wiązanie białka heterochromatyny 1a (HP1a) 5,6. Z drugiej strony, fakultatywna heterochromatyna lokalizuje się w ramionach chromosomu i składa się głównie z genów wyciszonych rozwojowo7,8. Barwienie immunologiczne bloków heterochromatyny w komórkach metafazy, lub obserwacja agregatów heterochromatyny w komórkach interfazowych, odsłoniło wiele światła w zrozumieniu powstawania i funkcji regionów heterochromatycznych9.
Użycie Drosophila jako systemu modelowego pozwoliło na opracowanie niezbędnych narzędzi do badania heterochromatyny bez użycia mikroskopii elektronowej10. Od czasu opisu zmienności efektu pozycji i odkrycia białek związanych z heterochromatyną, takich jak HP1a, oraz modyfikacji potranslacyjnych histonów, wiele grup opracowało kilka technik immunohistochemicznych, które umożliwiają wizualizację tych regionów heterochromatycznych10,11.
Te techniki opierają się na użyciu specyficznych przeciwciał, które rozpoznają białka związane z heterochromatyną lub znaczniki histonowe. Dla każdego typu komórki i przeciwciała warunki wiązania i przepuszczalności muszą być określone empirycznie. Ponadto warunki mogą się różnić, jeśli stosowane są dodatkowe procesy mechaniczne, takie jak techniki zgniatania. W tym protokole opisujemy zastosowanie gruczołów ślinowych Drosophila do badania ognisk heterochromatycznych. Gruczoły ślinowe mają politeizowane komórki, które zawierają ponad 1000 kopii genomu, zapewniając w ten sposób wzmocniony widok większości cech chromatyny, z wyjątkiem satelitarnego DNA i niektórych regionów heterochromatycznych, które są niedostatecznie replikowane. Niemniej jednak regiony heterochromatyny są łatwo wizualizowane w preparatach chromosomów politenowych, ale techniki zgniatania mogą czasami zakłócać charakterystyczne kompleksy związane z chromatyną lub architekturę chromatyny. Dlatego immunolokalizacja białek w całej tkance gruczołów ślinowych może przewyższyć te niepożądane efekty. Użyliśmy tego protokołu do wykrycia kilku białek związanych z chromatyną i wykazaliśmy, że ten protokół w połączeniu ze zmutowanymi stadami Drosophila może być wykorzystany do badania zakłóceń heterochromatyny12.

<table><tbody><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Axygen MCT-150-C</td><td>11351904</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>16% formaldehydu</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>AF1 Citifluor</td><td>Ted pella</td><td>19470</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>BSA, klasa biologii molekularnej</td><td>Roche</td><td>10735078001</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>Kompletne inhibitory proteazy Ultra EDTA-free proteaza inhibitory</td><td>Merck</td><td>5892953001</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Corning</td><td>CLS285022-200EA</td><td>22x22, marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>d9779</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr>Marka<td>EGTA</td><td></td><td></td><td>nie jest krytyczna</td></tr><tr><td>Szkiełko</td> szklane <td>Złota uszczelka</td><td>3011</td><td>marka nie jest krytyczna</td></tr><tr><td>H3BO3</td><td>Baker</td><td>0084-01</td><td>marka nie jest krytyczna</td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Abcam</td><td>8889</td><td></td></tr><tr><td>HP1a</td><td>Hybridoma Bank</td><td>C1A9</td><td>Formularz produktu&nbsp; Koncentrat 0,1 ml</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Baker</td><td>3040-01</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Baker</td><td>9070-03</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr>Marka<td>NaOH</td><td></td><td></td><td>niekrytyczna Marka</td></tr><tr><td>RURY</td><td></td><td></td><td>Marka nie krytyczna</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>&nbsp; Labquake Tube Shaker</td></tr><tr><td>Thermo Mixer C</td><td>Eppendorf</td><td>13527550</td><td>SmartBlock 1,5 ml</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Milipore</td><td>648311</td><td>marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>100 ml, marka niekrytyczna</td></tr><tr><td>&beta;-merkaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td>25 mL, marka nie krytyczna</td></tr></tbody></table>

barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych drosophila

Immunofluorescent Staining for Visualization of Heterochromatin Associated Proteins in Drosophila Salivary Glands

Wizualizacja agregatów heterochromatyny za pomocą barwienia immunologicznego może być wyzwaniem. Wiele ssaczych składników chromatyny jest konserwatywnych w Drosophila melanogaster. Dlatego jest to doskonały model do badania powstawania i utrzymywania heterochromatyny. Upoliteizowane komórki, takie jak te znajdujące się w gruczołach ślinowych larw D. melanogaster w trzecim stadium rozwojowym, stanowią doskonałe narzędzie do obserwacji chromatyny wzmocnionej prawie tysiąckrotnie i pozwoliły naukowcom badać zmiany w rozmieszczeniu heterochromatyny w jądrze. Chociaż obserwację składników heterochromatyny można przeprowadzić bezpośrednio w preparatach chromosomów politenowych, lokalizacja niektórych białek może być zmieniona przez nasilenie leczenia. Dlatego bezpośrednia wizualizacja heterochromatyny w komórkach uzupełnia ten rodzaj badania. W tym protokole opisujemy techniki barwienia immunologicznego stosowane w tej tkance, zastosowanie wtórnych przeciwciał fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej w celu obserwacji tych agregatów heterochromatyny z większą precyzją i szczegółowością.

Reprezentatywne wyniki immunobarwienia HP1a w gruczołach ślinowych Drosophila przedstawiono na Rysunku 1. Wynik dodatni definiuje obserwacja jednego punktu ogniskowego (Rysunek 1a) (agregat heterochromatyny lub kondensat). Wynik ujemny to brak sygnału lub sygnał rozproszony. Czasami można zaobserwować podwójny sygnał, tzn. podwójny punkt (Rysunek 1c), lecz występuje on zazwyczaj rzadziej.
Analizę...

Ten protokół ma na celu wizualizację agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila polytene.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Visualization of heterochromatin aggregates by immunostaining can be challenging. Many mammalian components of chromatin are conserved in Drosophila ...

Celem tego protokołu jest wizualizacja agregatów heterochromatyny w komórkach Drosophila. Aby to osiągnąć, używamy komórek politenowych, które znajdują się w gruczołach ślinowych larw trzeciego stadium rozwojowego Genom tych komórek jest amplifikowany prawie tysiąc razy, a chromosomy zachowują cechy komórek interfejsowych. Mają dobrze zdefiniowane telomery i mostki zwane chromocentrum, w których agregują się wszystkie centromery i są głównie heterochromatyczne.Wykorzystanie tkanki larw trzeciego stadium rozwojowego pozwala nam również ocenić zmiany w agregatach heterochromatycznych w tle różnych mutantów genetycznych. Aby zoptymalizować kulturę larw w trzecim stadium rozwojowym, musisz najpierw zebrać dorosłe osobniki w wieku od 5 do 10 dni i umieścić około 50 w butelce z szeroką szyjką standardowego podłoża. 25 mężczyzn i 25 kobiet.Umieść butelkę w inkubatorze o kontrolowanej temperaturze w temperaturze 25 stopni Celsjusza na 12 godzin. Po upływie czasu inkubacji usuń dorosłe osobniki i przenieś je do nowej butelki, aby powtórzyć procedurę. Pozwól zarodkom rosnąć w temperaturze 18 stopni Celsjusza przez 22 godziny.Do zbierania larw upewnij się, że wybierasz larwy wędrujące, które nie mają jawnych kulistych kształtów. Wypreparuj 15 par gruczołów ślinowych lub tyle, ile możesz w ciągu 30 minut w zimnym PBS z inhibitorami protestu pod mikroskopem. Przenieś gruczoły ślinowe do innej rurki z lodowatym PBS.Umyj raz zimnym PBS plus inhibitory protestów. Pamiętaj, zawsze poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna tuby. Po usunięciu PBS z ostatniego kroku, dodaj bezpośrednio 0,5 mililitra jednego bufora do utrwalania gum z grupy X i 50% metanolu plus 2% formaldehydu.Inkubować przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza z łagodną rotacją. Przeprowadzić jedno pięciominutowe płukanie rotacyjne buforem Tris-Triton, dodając jeden mililitr. Zawsze poczekaj, aż chusteczka dotrze do dna tubki.Uwaga: poczekaj, aż tkanka dotrze do dna tuby. Inkubować gruczoły ślinowe z Tris-Tritonem, takim samym jak powyżej, plus 1% beta merkaptoetanolu przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza z łagodnym wstrząsaniem. Przemyć buforem BO3 i inkubować z BO3 plus 10 milimolowym DTT w temperaturze 37 stopni Celsjusza, lekko wstrząsając przez 15 minut.Pod koniec okresu inkubacji przeprowadzić płukanie jednym mililitrem samego buforu BO3. Inkubować gruczoły ślinowe w jednym mililitrze buforu B przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z rotacją. Usuń cały bufor B i dodaj bufor A oraz przeciwciało, które Cię interesuje.W tym przypadku używamy HP jeden, A C 1 8 9 z banku Iridium. 1 na 3 000 w ciągu nocy pod czterema stopniami z obrotem. W tym momencie ważne jest, aby potrząsanie nie powodowało powstania pęcherzyków, które mogłyby uszkodzić przeciwciało.Podawaj smakołyk przez 15 minut mycia buforem B, mieszając w temperaturze pokojowej, używając za każdym razem jednego milimetra. Gruczoły są przenoszone do buforu B wraz z wtórną parą antybiotyków na podłogę na dwie godziny, pod rotacją o cztery stopnie. Na tym etapie ważne jest, aby przykryć probówkę folią aluminiową, aby chronić przeciwciało wtórne przed światłem.Przeprowadzić myjki 2x15 minut w temperaturze pokojowej, obracając się jednym mililitrem buforu B. Inkubować z markerem DNA, takim jak Sydox lub OH, i rozpuścić w jednym mililitrze buforu B przez 10 minut w temperaturze pokojowej z rotacją. Przeprowadzić jedno pranie buforem B i raz PBS, przy czym każde pranie trwa 10 minut, obracając w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontuj gruczoły ślinowe na zjeżdżalni, tworząc basen z szkiełkiem nakrywkowym.Umieść gruczoły ślinowe na środku basenu i przykryj Sidiflor. Aby uniknąć deformacji pęcherzyka, rozciągnij lepką ciecz w całym miejscu. Następnie uszczelnij wszystkie szkiełka przezroczystym lakierem do paznokci.Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym lub konfokalnym. Jeśli próbka nie będzie obserwowana tego samego dnia, należy przechowywać ją w świetle w temperaturze czterech stopni. Reprezentatywne wyniki barwienia monoenzymem HB1 w gruczołach ślinowych Drosophila przedstawiono na rycinie pierwszym.Pozytywnym wynikiem jest obserwacja jednego punktu ogniskowego, takiego jak w A, athero chromatic aggregate lub kondensat. Wynik ujemny to brak sygnału lub sygnał rozproszony. Czasami podwójny sygnał można zaobserwować jak podwójny punkt w C, ale zwykle występuje w mniejszych ilościach.Aby przeanalizować dane, można je przedstawić w postaci wykresu słupkowego, porównującego rozkład HP1 z różnymi zmutowanymi tłami. Na przykład na rysunku drugim widzimy, że 98% jąder ma rozkład jednego punktu. I 2% dwóch ognisk w typie dzikim.U mutanta proporcja uległa zmianie, a obecność dwóch ognisk wzrosła do 40%Rycina trzecia przedstawia reprezentatywną trimetylację lizyny 9H3 w monobarwieniu. W rezultacie gruczoły ślinowe Drosophila obserwują jeden punkt ogniskowy w B, jest to korzystny wynik w agregatach chromatycznych lub kondensacie, podwójny lub potrójny sygnał w C można zobaczyć w rzadkich przypadkach, ale w niewielkich ilościach. Pod koniec tego protokołu będzie można zobaczyć diachromatyczne kondensaty białka HP1 pomimo ograniczeń stanowych, będzie to dobre pierwsze podejście.

immunofluorescent-staining-for-visualization-heterochromatin

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna działa poza limitami penetracji charakterystycznymi dla fluorescencyjnej mikroskopii sekcji tkanek. Technika ta opiera się na oświetleniu wieloprojekcyjnym oraz opisie transportu fotonów. Demonstrujemy wizualizację 3D całego organizmu in-vivo podczas morfogenezy wyobraźników skrzydeł wykazujących ekspresję GFP u Drosophila melanogaster.

Mezoskopowa tomografia fluorescencyjna do obrazowania in-vivo rozwijających się Drosophila

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Obrazowanie białek centrosomalnych podczas spermatogenezy Drosophila jest skuteczną metodą identyfikacji nowych białek krytycznych dla biologii centrosomów, a także wyjaśnienia szczególnej funkcji znanych graczy w tym procesie.

Obrazowanie centrosomów w jądrach much

Metody izolowania i przygotowywania próbek jąder Drosophila (żywych i stałych) do obrazowania za pomocą mikroskopii kontrastu fazowego i fluorescencji są opisane tutaj.

Cytologiczna analiza spermatogenezy: żywe i utrwalone preparaty jąder Drosophila

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Drosophila i systemy krwiotwórcze ssaków mają wiele wspólnych cech, co czyni Drosophila atrakcyjnym modelem genetycznym do badania hematopoezy. Tutaj pokazujemy rozwarstwienie i montaż głównego larwalnego narządu krwiotwórczego do immunohistochemii. Opisano również metody oznaczania różnych larwalnych przedziałów krwiotwórczych, w tym krążących hemocytów i siedzących komórek krystalicznych.

Metody badania gruczołu limfatycznego i hemocytów u larw Drosophila

Opisany protokół hybrydyzacji RNA in situ pozwala na wykrycie RNA w całych zarodkach Drosophila lub wypreparowanych tkankach. Korzystając z 96-dołkowych płytek mikromiareczkowych i wzmocnienia sygnału tyramidu, transkrypty mogą być wykrywane z wysoką rozdzielczością, czułością i przepustowością oraz przy stosunkowo niskich kosztach.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ o wysokiej rozdzielczości w zarodkach i tkankach Drosophila przy użyciu wzmocnienia sygnału tyramidowego

Prezentujemy tutaj ulepszony protokół przygotowania całego mocowania i barwienia immunologicznego jąder Drosophila, odpowiedni do mikroskopii konfokalnej, a także umożliwiający powtarzalne i wiarygodne znakowanie. Ilustrujemy ten protokół poprzez reprezentację 3D i kwantyfikację eksperymentów kolokalizacyjnych na dużych spermatocytach S4-S5.

Barwienie immunologiczne jąder Drosophila w celu analizy konfokalnej 3D dużych spermatocytów

Protokoły te określają, jak scharakteryzować organizację i funkcję zakrywającą złączeń przegrody plisowanej u nabłonka embrionalnego kontrolnego oraz mutacyjnego nabłonka embrionalnego Drosophila.

Eksperymenty immunobarwienia i penetracji barwnika w celu określenia białek styku przegrody w nabłonku embrionalnym Drosophila

Poznaj technikę barwienia immunofluorescencyjnego do wizualizacji agregatów heterochromatyny w komórkach politenowych gruczołów ślinowych Drosophila. Metoda umożliwia ocenę wpływu mutacji genetycznych na organizację chromatyny.

Barwienie immunofluorescencyjne do wizualizacji białek związanych z heterochromatyną w gruczołach ślinowych Drosophila

Przeglądaj więcej filmów