Name: Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj zaawansowaną metodę proteomiczną do globalnej analizy R-metylacji białek z wykorzystaniem spektrometrii mas i hmSILAC. Protokół umożliwia identyfikację z pojedynczą rozdzielczością miejsca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

MM i EM są doktorantami w Europejskiej Szkole Medycyny Molekularnej (SEMM). EM jest odbiorcą 3-letniego stypendium FIRC-AIRC (kod projektu: 22506). Globalne analizy proteomów R-metylowych w grupie gruźlicy są wspierane przez grant AIRC IG (kod projektu: 21834).

<ol><li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li>
<li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation%3A+the+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li>
<li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li>
<li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li>
<li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li>
<li>Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li>
<li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li>
<li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hmSEEKER%3A+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300(2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris%282-carboxyethyl%29phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896(2007).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li>
<li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li>
<li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li>
<li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li>
<li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethylQuant%3A+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Identyfikacja metylacji białek/peptydów in vivo za pomocą globalnej proteomiki opartej na stwardnieniu rozsianym jest trudna ze względu na ryzyko wysokiego FDR, przy czym podczas przygotowywania próbki zachodzi kilka podstawień aminokwasów i estryfikacji metylu, które są izobaryczne do metylacji i mogą powodować błędne przypisania w przypadku braku ortogonalnych strategii walidacji MS. Substechiometryczny charakter tego PTM dodatkowo komplikuje zadanie globalnej proteomiki metylowej, ale można go przezwyciężyć d...

Arginina (R)-metylacja to potranslacyjna modyfikacja (PTM), która zdobi około 1% proteomu ssaków1. Metylotransferazy białkowo-argininowe (PRMT) są enzymami katalizującymi reakcję metylacji R poprzez odkładanie jednej lub dwóch grup metylowych na atomy azotu (N) grupy guanidynowej łańcucha bocznego R w sposób symetryczny lub asymetryczny. U ssaków PRMT można podzielić na trzy klasy - typ I, typ II i typ III - w zależności od ich zdolności do deponowania zarówno monometylacji (MMA), jak i asymetrycznej dimetylacji (ADMA), MMA i symetrycznej dimetylacji (SDMA) lub tylko MMA, odpowiednio2,3. PRMT celują głównie w reszty R znajdujące się w regionach bogatych w glicynę i argininę, znane jako motywy GAR, ale niektóre PRMT, takie jak PRMT5 i CARM1, mogą metylować motywy bogate w prolinę, glicynę i metioninę (PGM)4. R-metylacja pojawiła się jako modulator białek w kilku procesach biologicznych, takich jak splicing RNA5, naprawa DNA6, biogeneza miRNA7, oraz translation2, wspierając badania nad tym PTM.
Spektrometria mas (MS) jest uznawana za najbardziej efektywną technologię do systematycznego badania globalnej metylacji R-metylacji w rozdzielczości białek, peptydów i miejsc. Ten PTM wymaga jednak pewnych szczególnych środków ostrożności w celu jego identyfikacji z dużą pewnością przez państwa członkowskie. Po pierwsze, R-metylacja jest substechiometryczna, przy czym niezmodyfikowana forma peptydów jest znacznie bardziej obfita niż zmodyfikowane, tak więc spektrometry mas działające w trybie akwizycji zależnej od danych (DDA) będą fragmentować niezmodyfikowane peptydy o wysokiej intensywności częściej niż ich metylowane odpowiedniki o niższej intensywności8. Co więcej, większość procesów pracy opartych na stwardnieniu rozsianym do identyfikacji miejsc zmetylowanych przez R cierpi z powodu ograniczeń na poziomie analizy bioinformatycznej. Rzeczywiście, obliczeniowa identyfikacja peptydów metylowych jest podatna na wysokie wskaźniki fałszywych odkryć (FDR), ponieważ ten PTM jest izobaryczny na różne substytucje aminokwasów (np. glicynę do alaniny) i modyfikacje chemiczne, takie jak estryfikacja metylowa asparaginianu i glutaminianu9. W związku z tym metody oparte na znakowaniu izotopowym grup metylowych, takie jak znakowanie ciężkich stabilnych izotopów metylu za pomocą aminokwasów w hodowli komórkowej (hmSILAC), zostały wdrożone jako ortogonalne strategie do pewnej identyfikacji metylacji in vivo przez MS, znacznie zmniejszając odsetek fałszywie dodatnich adnotacji10.
Ostatnio zoptymalizowano różne protokoły badania białek R-metylowanych dla całego proteomu. Opracowanie opartych na przeciwciałach strategii wzbogacania peptydów R-metylowych w powinowactwo immunologiczne doprowadziło do adnotacji kilkuset miejsc R-metylowanych w komórkach ludzkich11,12. Ponadto wiele badań3,13 wykazało, że sprzężenie wzbogacania opartego na przeciwciałach z technikami separacji peptydów, takimi jak frakcjonowanie chromatograficzne HpH-RP, może zwiększyć ogólną liczbę zidentyfikowanych peptydów metylowych.
Ten artykuł opisuje eksperymentalną strategię zaprojektowaną do systematycznej i wysoce pewnej identyfikacji miejsc R-metylowanych w komórkach ludzkich, opartą na różnych krokach biochemicznych i analitycznych: ekstrakcja białka z komórek znakowanych hmSILAC, równoległe podwójne trawienie enzymatyczne z trypsyną i proteazami LysargiNase, a następnie chromatograficzne frakcjonowanie trawionych peptydów metodą HpH-RP, połączone z immunologicznym wzbogaceniem MMA-, SDMA-, opartym na przeciwciałach. i peptydy zawierające ADMA. Wszystkie peptydy wzbogacone w powinowactwo są następnie analizowane za pomocą chromatografii cieczowej o wysokiej rozdzielczości (LC)-MS/MS w trybie DDA, a surowe dane MS są przetwarzane przez algorytm MaxQuant w celu identyfikacji R-metylopeptydów. Na koniec wyniki wyjściowe MaxQuant są przetwarzane za pomocą hmSEEKER, opracowanego przez nas narzędzia bioinformatycznego do wyszukiwania par ciężkich i lekkich peptydów metylowych. Krótko mówiąc, hmSEEKER odczytuje i filtruje identyfikacje peptydów metylowych z pliku msms, a następnie dopasowuje każdy peptyd metylowy do odpowiadającego mu piku MS1 w pliku allPeptides, a na koniec przeszukuje pik odpowiednika peptydu ciężkiego/lekkiego. Dla każdej przypuszczalnej pary ciężkie-lekkie obliczany jest stosunek Log2 H/L (LogRatio), różnica czasu retencji (dRT) i błąd masy (ME), a dublety, które znajdują się w zdefiniowanych przez użytkownika punktach odcięcia, są oznaczane jako prawdziwie dodatnie. Przebieg protokołu biochemicznego jest opisany w <silna klasa="xfig">Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Wodorowęglan amonu (AMBIC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Nadsiarczan amonu (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>497363</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolumny Sep-Pak vacc 6cc (1g)</td><td>Wody</td><td>WAT036905</td><td></td></tr><tr><td>Koloidalne barwienie Coomassie Instant</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini, wolne od EDTA</td><td>Roche-Sigma Aldrich</td><td>11836170001</td><td>Inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>żądany</td><td>&nbsp; ze stabilną glutaminą i bez metioniny</td></tr><tr><td>System chromatograficzny EASY-nano LC 1200</td><td>Kolumny HPLC ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-Spray</td><td>ThermoFisher</td><td>ES907</td><td></td></tr><tr><td>Glycerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Ogniwa HeLa</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid (IAA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>Jupiter C12-RP kolumna</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4396-E0</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5308</td><td>Lekki (L) Metionina</td></tr><tr><td>L-Metionina-(metylo-13C,d3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299154</td><td>Ciężki (H) Metionina</td></tr><tr><td>LysargiNase</td><td>Merck Millipore</td><td>EMS0008</td><td></td></tr><tr><td>Sonifier z mikrokońcówką 250</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche-Sigma Aldrich</td><td>4906837001</td><td>Inhibitor fosfatazy</td></tr><tr><td>Pierce C18 Końcówki</td><td>ThermoFisher</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; 0,1% kwas mrówkowy (v/v) w acetonitrylu, klasa</td> <td>LC-MSThermoFisher</td><td>85175</td><td>LC-MS Rozpuszczalnik B</td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; 0,1% kwas mrówkowy (v/v) w wodzie, klasa LC-MS</td><td>ThermoFisher</td><td>85170</td><td>LC-MS Rozpuszczalnik A</td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; Acetonitryl (ACN), klasa LC-MS</td><td>ThermoFisher</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; Woda, klasa LC-MS</td><td>ThermoFisher</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>Poliakryloamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92560</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Białko&nbsp; Wszystkie wzorce białek barwionych na niebiesko</td><td></td> Przeciwciała <td>Bio-Rad</td> 1610373 <td></td></tr><tr><td>PTMScan &alpha;-ADMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13474</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała PTMScan &alpha;-MMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12235</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciała PTMScan &alpha;-SDMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13563</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrydowa masa kwadrupolowo-orbitrapowa Spektrometr</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sekwencjonowanie Stopień Zmodyfikowana Trypsyna</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator próżni 5301</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Speed vac</td></tr></tbody></table>

podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy r-metylacji białek

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

Białko Arginina (R)-metylacja jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną białka (PTM) zaangażowaną w regulację kilku szlaków komórkowych, w tym przetwarzanie RNA, transdukcję sygnału, odpowiedź na uszkodzenie DNA, biogenezę miRNA i translację.
W ostatnich latach, dzięki biochemicznemu i analitycznemu rozwojowi, proteomika oparta na spektrometrii mas (MS) stała się najskuteczniejszą strategią charakteryzowania komórkowego proteomu metylowego z rozdzielczością pojedynczego miejsca. Jednak identyfikacja i profilowanie in vivo R-metylacji białek przez SM pozostaje trudne i podatne na błędy, głównie ze względu na substechiometryczny charakter tej modyfikacji oraz obecność różnych podstawień aminokwasów i chemicznej estryfikacji metylowej reszt kwasowych, które są izobaryczne do metylacji. W związku z tym potrzebne są metody wzbogacania w celu poprawy identyfikacji peptydów R-metylowych i ortogonalnych strategii walidacji w celu zmniejszenia liczby fałszywych odkryć (FDR) w badaniach proteomiki metylowej.
Tutaj opisany jest protokół specjalnie zaprojektowany do identyfikacji i kwantyfikacji R-metylowych peptydów o wysokim poziomie pewności z próbek komórkowych, który łączy metaboliczne znakowanie komórek za pomocą ciężkiej izotopowej kodowanej metioniny (hmSILAC) i trawienie w roztworze podwójnej proteazy ekstraktu z całych komórek, a następnie frakcjonowanie metodą chromatografii off-line High-pH Reversed Phase (HpH-RP) i wzbogacanie powinowactwa peptydów R-metylowych za pomocą przeciwciał anty-pan-R-metylowych. Po analizie MS o wysokiej rozdzielczości, surowe dane są najpierw przetwarzane za pomocą pakietu oprogramowania MaxQuant, a wyniki są następnie analizowane przez hmSEEKER, oprogramowanie przeznaczone do dogłębnego wyszukiwania par pików MS odpowiadających lekkiemu i ciężkiemu peptydowi metylowemu w plikach wyjściowych MaxQuant.

Artykuł opisuje schemat postępowania w celu wysokoniezawodnej identyfikacji globalnej R-metylacji białek, który opiera się na połączeniu enzymatycznego trawienia ekstraktu białkowego dwoma różnymi proteazami równolegle, a następnie frakcjonowania peptydów proteolitycznych za pomocą chromatografii cieczowej HpH-RP oraz wzbogacenia immunowydzielniczego R-metylopeptydów z użyciem przeciwciał przeciwko pan-R-metylacji (Rysunek 1).
Komórki hodowano w obecności metionin...

Metylacja argininy (R) jest szeroko rozpowszechnioną modyfikacją potranslacyjną regulującą wiele szlaków biologicznych. Spektrometria mas jest najlepszą technologią do globalnego profilowania proteomu R-metylowego, w połączeniu z podejściami biochemicznymi do wzbogacania zmodyfikowanych peptydów. Przepływ pracy przeznaczony do identyfikacji globalnej metylacji R-metylacji w komórkach ludzkich o wysokim poziomie pewności jest opisany tutaj.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

Protokół ten jest bardzo istotny, ponieważ reprezentuje najnowocześniejszy przepływ pracy do globalnej analizy metylacji argininy białek za pomocą spektrometrii mas. Jest to jedyna metoda identyfikacji i profilowania białka R-metylowanego z rozdzielczością pojedynczego stylu, co nie jest osiągalne przy użyciu innych technik biochemicznych. W połączeniu ze stosowaniem inhibitorów PRMT, z których kilka jest w badaniach klinicznych i leków przeciwnowotworowych, protokół ten pozwala na dogłębną analizę ich mechanizmu działania.Na początek należy przeprowadzić redukcję grupy tiolowej białek za pomocą podstawowego roztworu DTT rozpuszczonego w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 4,5 milimola i pozostawić reakcję na 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Przeprowadzić alkilowanie białek grupy tiolowej, dodając jodoacetamid o stężeniu 10 milimolowym i inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby zweryfikować skuteczność proteolizy, należy zapisać porcję ekstraktu białkowego do późniejszej analizy w żelu barwionym SDS-PAGE Coomassie i porównać ją z odpowiednią ilością próbki po trawieniu.Rozcieńczyć pozostały ekstrakt białkowy czterema objętościami 20-milimolowego HEPES-u o pH 8,0, aby osiągnąć końcowe stężenie mocznika wynoszące dwa molowe. Podziel próbkę na dwie części, a następnie dodaj zmodyfikowaną trypsynę do sekwencjonowania do jednej i proteazę LysargiNase do drugiej. Pozostaw próbki na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w mieszalniku termicznym z prędkością 600 obrotów na minutę, aby umożliwić trawienie enzymatyczne.Dla każdego gradientu chromatograficznego zbierz wszystkie frakcje na głęboką 96-dołkową płytkę. Zbierz ułamki zebrane przed rozpoczęciem gradientu w jedną frakcję o nazwie pre. Połącz 60 frakcji z gradientu chromatografii cieczowej o odwróconej fazie o wysokim pH, łącząc je w nieciągły sposób w 14 końcowych frakcji.Aby uzyskać nieciągłą konkatenację, należy połączyć frakcje odwróconych faz o wysokim pH, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Połącz ułamki zebrane po nachyleniu w unikalny ułamek o nazwie post. Przeprowadzić sekwencyjne wzbogacanie zmodyfikowanego peptydu w powinowactwo immunologiczne oddzielnie dla dwóch próbek z trawienia trypsyny i LysargiNase.Rozcieńczyć 10-krotnie skoncentrowany bufor oczyszczający z powinowactwa immunologicznego lub bufor IAP. Odwirować liofilizowane peptydy w stężeniu 2 000 G przez pięć minut, aby odwirować peptydy na dno probówki. Ponownie zawiesić peptydy w 250 mikrolitrach rozcieńczonego buforu IAP na 15-mililitrową probówkę i przenieść do 1,5 mililitrowej probówki o niskiej wiązalności.Użyj papierka lakmusowego, aby sprawdzić, czy pH jest większe niż sześć. Zachować małą podwielokrotność każdej frakcji jako dane wejściowe do kolejnej analizy w państwie członkowskim. Podziel każdą frakcję na dwie części, aby równolegle przeprowadzić wzbogacenie immunologiczne peptydów disymetrycznie dimetylowanych (ADMA) i symetrycznie dimetylowanych (SDMA).Przygotować trzy fiolki z wybranymi przeciwciałami anty-metylowymi R sprzężonymi z kulkami agarozy białka A na 10 miligramów początkowego ekstraktu białkowego. Przygotować odpowiednią ilość przeciwciała sprzężonego z kulkami agarozy, odwirowując każdą fiolkę o stężeniu 2 000 G przez 30 sekund i usuwając bufor z kulek. Umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem 1X PBS, odwirowując je w temperaturze 2 000 G przez 30 sekund.Po ostatnim myciu ponownie zawieś kulki w 40 mikrolitrach 1X PBS na każdą fiolkę, połącz je, a następnie na koniec podziel równo na 16 frakcji. Dodaj 250 mikrolitrów buforu 1X IAP do każdej probówki i wymieszaj, odwracając. Następnie inkubuj probówki na obracającym się kole przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Po inkubacji odwirować 1,5-mililitrowe probówki zawierające peptydy i roztoczyć kulki sprzężone z przeciwciałem R-metylowym pod ciśnieniem 2,000 G przez 30 sekund, aby zagnieździć kulki i przenieść przepływ z każdej frakcji do czystej 1,5 mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania. Dodać kulki do przepływowego sprzężone z przeciwciałami przeciwko metylacji R-mono i powtórzyć reprodukcję do PBS, inkubację z buforem IAP i odwirowanie. Podczas inkubacji próbek peptydów z kulkami monometylizacji lub MMA, frakcje, które wcześniej zostały immunoprecypitowane anty-ADMA i SDMA, należy dwukrotnie przemyć buforem IAP o pojemności 250 mikrolitrów i wyrzucić supernatant po każdym przemyciu.Następnie trzykrotnie umyj wodą klasy LC-MS. Usunąć peptydy SDMA lub ADMA wzbogacone w powinowactwo z kulek agarozy, dodając 50 mikrolitrów 0,15 TFA do każdej probówki. Pozostaw ten roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej, odwracając rurki co dwie do trzech minut.Przenieść pierwszą elucję do czystych 1,5 mililitrowych probówek o niskiej zawartości wiązania i powtórzyć elucję z 50 mikrolitrami 0,15 TFA. Zebrać dwie frakcje elucyjne w jednej probówce. Powtórz ten proces dla peptydów R-monometylowanych, które inkubowano z kulkami przeciwciała anty-MMA.Po zmieszaniu lekkich i ciężkich znakowanych komórek, białka zostały wyekstrahowane i poddane trawieniu przez trypsynę i LysargiNase. Żel barwiony SDS-PAGE Coomassie został użyty do sprawdzenia skutecznego trawienia enzymatycznego wszystkich białek w peptydach. Oceniono skuteczność etapu oczyszczania wykonanego przez kolumnę C18 Sep-Pak, potwierdzając brak peptydów w przepływie kolumny C18 oraz w pierwszym i drugim płukaniu, a także ich oczekiwaną obecność w eluencie.Oceniono prawidłowe włączenie MET4 do kanału ciężkiego oraz prawidłowe mieszanie ciężkiego lub lekkiego. Pokazano tutaj chromatogram z frakcjonowania peptydów metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami w trybie offline o wysokim pH i późniejszej nieciągłej konkatenacji frakcji. Peptydy zostały wykryte przez 250 nanometrów UV, podczas gdy potencjalnie pozostałe niestrawione białka oceniano za pomocą 280 nanometrów UV. Uzyskano pełne widma MS peptydów reprezentujących prawdziwie dodatnią adnotację peptydu metylowego.Różnice między M i Z obserwowane między trzema pikami są zgodne z obecnością enzymatycznie metylowanej reszty. Uzyskano pełne widma MS peptydów reprezentujących fałszywie dodatnią adnotację peptydu metylowego. Różnice M i Z zaobserwowane między lekkim peptydem metylowym a jego karnym ciężkim odpowiednikiem odbiegają od wartości oczekiwanej o 0,0312.Przepływ pracy protokołu jest ogólnie liniowy, ale jest kilka kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Na przykład separacja chromatograficzna IPH z konkatenacją frakcji nieciągłych, a także konfiguracja IP. Ten sam protokół można połączyć ze standardowym SILAC lub kwantyfikacją bez znaczników w celu profilowania dynamiki metylacji argininy w odpowiedzi na różne perturbacje.Protokół ten toruje drogę do scharakteryzowania zakresu i dynamiki metylacji białek w kilku typach komórek i systemach modelowych wspierających wszystkie aspekty badań podstawowych i translacyjnych skoncentrowanych na PRMT.

a-mass-spectrometry-based-proteomics-approach-for-global-high

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Związki wychwytujące (Capture Compounds) to trifunkcyjne małe cząsteczki służące do redukcji złożoności proteomu poprzez funkcjonalną, odwracalną oddziaływanie małej cząsteczki z białkiem, a następnie fotousieciowanie i oczyszczanie. W niniejszej procedurze wykorzystujemy związek wychwytujący z funkcją selektywności wiązania S-adenozylo-L-homocysteiny w celu wyizolowaniay metylotransferaz z lizatu całych komórek Escherichia coli oraz ich identyfikacji metodą MS.

Profilowanie metylotransferaz i innych białek wiążących S-adenozylo- L-homocysteinę za pomocą spektrometrii mas z wykorzystaniem związków wychwytujących (CCMS)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Sekwencjonowanie amplikonów bisulfitowych (BSAS) to metoda ilościowego określania metylacji cytozyny w docelowych regionach genomu. Metoda ta wykorzystuje konwersję wodorosiarczynów w połączeniu z amplifikacją PCR regionów docelowych przed sekwencjonowaniem nowej generacji w celu uzyskania bezwzględnej oceny ilościowej metylacji DNA na poziomie specyficznym dla zasady.

Ukierunkowana analiza metylacji DNA za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Protokół został opracowany w celu skutecznego wydobywania nienaruszonych histonów z materiałów z liści sorgo w celu profilowania modyfikacji histonów po translacji, które mogą służyć jako potencjalne markery epigenetyczne do pomocy w inżynierii upraw odpornych na suszę.

Izolacja histonu z tkanki liści sorgo w celu profilowania potencjalnych markerów epigenetycznych metodą spektrometrii mas z góry na dół

Opisany protokół zapewnia zoptymalizowaną ilościową analizę proteomiczną próbek tkanek przy użyciu dwóch podejść: ilościowego opartego na znacznikach i bez etykiety. Podejścia oparte na znacznikach mają tę zaletę, że zapewniają dokładniejszą ocenę ilościową białek, podczas gdy podejście bez znaczników jest bardziej opłacalne i służy do analizy setek próbek kohorty.

Kompleksowy przepływ pracy proteomiki próbek tkanek opartej na spektrometrii mas

Te protokoły dostarczają metodologii używanej do oceny aktywności enzymatycznej poszczególnych członków rodziny białkowej metylotransferazy argininowej (PRMT) w komórkach. Opisano szczegółowe wytyczne dotyczące oceny aktywności PRMT z wykorzystaniem biomarkerów endogennych i egzogennych, przeciwciał rozpoznających metylo-argininę oraz związków narzędziowych inhibitorów.

Ilościowe metody badania aktywności metylotransferazy argininy 1-9 białek w komórkach

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

Elastyczność konformacyjna odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu białek. W tym artykule opisujemy zastosowanie czasowo-rozdzielczej spektrometrii mas z jonizacją elektronrozpylającą sprzężoną z wymianą wodorowo-deuterową do badania szybkich zmian strukturalnych, które napędzają funkcję w uporządkowanych i nieuporządkowanych białkach.

Spektrometria mas z jonizacją wodorowo-deuterową z jonizacją elektrorozpylającą do badania struktury i dynamiki białek

Poznaj zaawansowaną metodę proteomiczną do globalnej analizy R-metylacji białek z wykorzystaniem spektrometrii mas i hmSILAC. Protokół umożliwia identyfikację z pojedynczą rozdzielczością miejsca.

Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Przeglądaj więcej filmów