Podejście proteomiczne oparte na spektrometrii mas do globalnej i wysoce wiarygodnej analizy R-metylacji białek

Protokół ten jest bardzo istotny, ponieważ reprezentuje najnowocześniejszy przepływ pracy do globalnej analizy metylacji argininy białek za pomocą spektrometrii mas. Jest to jedyna metoda identyfikacji i profilowania białka R-metylowanego z rozdzielczością pojedynczego stylu, co nie jest osiągalne przy użyciu innych technik biochemicznych. W połączeniu ze stosowaniem inhibitorów PRMT, z których kilka jest w badaniach klinicznych i leków przeciwnowotworowych, protokół ten pozwala na dogłębną analizę ich mechanizmu działania.

Na początek należy przeprowadzić redukcję grupy tiolowej białek za pomocą podstawowego roztworu DTT rozpuszczonego w ultraczystej wodzie o końcowym stężeniu 4,5 milimola i pozostawić reakcję na 30 minut w temperaturze 55 stopni Celsjusza. Przeprowadzić alkilowanie białek grupy tiolowej, dodając jodoacetamid o stężeniu 10 milimolowym i inkubując przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Aby zweryfikować skuteczność proteolizy, należy zapisać porcję ekstraktu białkowego do późniejszej analizy w żelu barwionym SDS-PAGE Coomassie i porównać ją z odpowiednią ilością próbki po trawieniu.

Rozcieńczyć pozostały ekstrakt białkowy czterema objętościami 20-milimolowego HEPES-u o pH 8,0, aby osiągnąć końcowe stężenie mocznika wynoszące dwa molowe. Podziel próbkę na dwie części, a następnie dodaj zmodyfikowaną trypsynę do sekwencjonowania do jednej i proteazę LysargiNase do drugiej. Pozostaw próbki na noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w mieszalniku termicznym z prędkością 600 obrotów na minutę, aby umożliwić trawienie enzymatyczne.

Dla każdego gradientu chromatograficznego zbierz wszystkie frakcje na głęboką 96-dołkową płytkę. Zbierz ułamki zebrane przed rozpoczęciem gradientu w jedną frakcję o nazwie pre. Połącz 60 frakcji z gradientu chromatografii cieczowej o odwróconej fazie o wysokim pH, łącząc je w nieciągły sposób w 14 końcowych frakcji.

Aby uzyskać nieciągłą konkatenację, należy połączyć frakcje odwróconych faz o wysokim pH, jak opisano w manuskrypcie tekstowym. Połącz ułamki zebrane po nachyleniu w unikalny ułamek o nazwie post. Przeprowadzić sekwencyjne wzbogacanie zmodyfikowanego peptydu w powinowactwo immunologiczne oddzielnie dla dwóch próbek z trawienia trypsyny i LysargiNase.

Rozcieńczyć 10-krotnie skoncentrowany bufor oczyszczający z powinowactwa immunologicznego lub bufor IAP. Odwirować liofilizowane peptydy w stężeniu 2 000 G przez pięć minut, aby odwirować peptydy na dno probówki. Ponownie zawiesić peptydy w 250 mikrolitrach rozcieńczonego buforu IAP na 15-mililitrową probówkę i przenieść do 1,5 mililitrowej probówki o niskiej wiązalności.

Użyj papierka lakmusowego, aby sprawdzić, czy pH jest większe niż sześć. Zachować małą podwielokrotność każdej frakcji jako dane wejściowe do kolejnej analizy w państwie członkowskim. Podziel każdą frakcję na dwie części, aby równolegle przeprowadzić wzbogacenie immunologiczne peptydów disymetrycznie dimetylowanych (ADMA) i symetrycznie dimetylowanych (SDMA).

Przygotować trzy fiolki z wybranymi przeciwciałami anty-metylowymi R sprzężonymi z kulkami agarozy białka A na 10 miligramów początkowego ekstraktu białkowego. Przygotować odpowiednią ilość przeciwciała sprzężonego z kulkami agarozy, odwirowując każdą fiolkę o stężeniu 2 000 G przez 30 sekund i usuwając bufor z kulek. Umyj koraliki trzykrotnie jednym mililitrem 1X PBS, odwirowując je w temperaturze 2 000 G przez 30 sekund.

Po ostatnim myciu ponownie zawieś kulki w 40 mikrolitrach 1X PBS na każdą fiolkę, połącz je, a następnie na koniec podziel równo na 16 frakcji. Dodaj 250 mikrolitrów buforu 1X IAP do każdej probówki i wymieszaj, odwracając. Następnie inkubuj probówki na obracającym się kole przez dwie godziny w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po inkubacji odwirować 1,5-mililitrowe probówki zawierające peptydy i roztoczyć kulki sprzężone z przeciwciałem R-metylowym pod ciśnieniem 2,000 G przez 30 sekund, aby zagnieździć kulki i przenieść przepływ z każdej frakcji do czystej 1,5 mililitrowej probówki o niskim stopniu wiązania. Dodać kulki do przepływowego sprzężone z przeciwciałami przeciwko metylacji R-mono i powtórzyć reprodukcję do PBS, inkubację z buforem IAP i odwirowanie. Podczas inkubacji próbek peptydów z kulkami monometylizacji lub MMA, frakcje, które wcześniej zostały immunoprecypitowane anty-ADMA i SDMA, należy dwukrotnie przemyć buforem IAP o pojemności 250 mikrolitrów i wyrzucić supernatant po każdym przemyciu.

Następnie trzykrotnie umyj wodą klasy LC-MS. Usunąć peptydy SDMA lub ADMA wzbogacone w powinowactwo z kulek agarozy, dodając 50 mikrolitrów 0,15 TFA do każdej probówki. Pozostaw ten roztwór na 10 minut w temperaturze pokojowej, odwracając rurki co dwie do trzech minut.

Przenieść pierwszą elucję do czystych 1,5 mililitrowych probówek o niskiej zawartości wiązania i powtórzyć elucję z 50 mikrolitrami 0,15 TFA. Zebrać dwie frakcje elucyjne w jednej probówce. Powtórz ten proces dla peptydów R-monometylowanych, które inkubowano z kulkami przeciwciała anty-MMA.

Po zmieszaniu lekkich i ciężkich znakowanych komórek, białka zostały wyekstrahowane i poddane trawieniu przez trypsynę i LysargiNase. Żel barwiony SDS-PAGE Coomassie został użyty do sprawdzenia skutecznego trawienia enzymatycznego wszystkich białek w peptydach. Oceniono skuteczność etapu oczyszczania wykonanego przez kolumnę C18 Sep-Pak, potwierdzając brak peptydów w przepływie kolumny C18 oraz w pierwszym i drugim płukaniu, a także ich oczekiwaną obecność w eluencie.

Oceniono prawidłowe włączenie MET4 do kanału ciężkiego oraz prawidłowe mieszanie ciężkiego lub lekkiego. Pokazano tutaj chromatogram z frakcjonowania peptydów metodą chromatografii cieczowej z odwróconymi fazami w trybie offline o wysokim pH i późniejszej nieciągłej konkatenacji frakcji. Peptydy zostały wykryte przez 250 nanometrów UV, podczas gdy potencjalnie pozostałe niestrawione białka oceniano za pomocą 280 nanometrów UV. Uzyskano pełne widma MS peptydów reprezentujących prawdziwie dodatnią adnotację peptydu metylowego.

Różnice między M i Z obserwowane między trzema pikami są zgodne z obecnością enzymatycznie metylowanej reszty. Uzyskano pełne widma MS peptydów reprezentujących fałszywie dodatnią adnotację peptydu metylowego. Różnice M i Z zaobserwowane między lekkim peptydem metylowym a jego karnym ciężkim odpowiednikiem odbiegają od wartości oczekiwanej o 0,0312.

Przepływ pracy protokołu jest ogólnie liniowy, ale jest kilka kroków, które wymagają szczególnej uwagi. Na przykład separacja chromatograficzna IPH z konkatenacją frakcji nieciągłych, a także konfiguracja IP. Ten sam protokół można połączyć ze standardowym SILAC lub kwantyfikacją bez znaczników w celu profilowania dynamiki metylacji argininy w odpowiedzi na różne perturbacje.

Protokół ten toruje drogę do scharakteryzowania zakresu i dynamiki metylacji białek w kilku typach komórek i systemach modelowych wspierających wszystkie aspekty badań podstawowych i translacyjnych skoncentrowanych na PRMT.