Name: Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: Poznaj proces XChem do przesiewania fragmentów metodą krystalografii rentgenowskiej w Diamond Light Source. Ta metoda usprawnia odkrywanie leków poprzez identyfikację słabych ligandów i dostarczanie szczegółowych map strukturalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca stanowi duży wspólny wysiłek pomiędzy Diamentowym Źródłem Światła i Konsorcjum Genomicznym Struktury. Autorzy chcieliby podziękować różnym grupom wsparcia Diamond i grupie MX za ich wkład w automatyzację linii badawczej i04-1 oraz za zapewnienie usprawnionych potoków gromadzenia i automatycznego przetwarzania danych, które są powszechnie uruchamiane na wszystkich liniach badawczych MX. Chcieliby również podziękować grupie SGC PX za ich wytrwałość, ponieważ byli pierwszymi użytkownikami, którzy przetestowali konfigurację, oraz firmie Evotec za to, że jest pierwszym poważnym użytkownikiem przemysłowym. Prace te były wspierane przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany z programu Horyzont 2020 Komisji Europejskiej.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Proces opisany w tym dokumencie został gruntownie przetestowany przez społeczność użytkowników, a zdolność adaptacji opisanych tutaj protokołów jest kluczem do obsługi szerokiej gamy projektów zwykle spotykanych na platformie. Konieczne jest jednak spełnienie kilku warunków wstępnych systemu kryształowego.
W przypadku każdej kampanii przesiewowej fragmentów przeprowadzanej z wykorzystaniem krystalografii rentgenowskiej kluczowe znaczenie ma powtarzalny i solidny system krystaliczny. Ponieważ standardowy protokół XChem polega na dodawaniu fragmentu bezpośrednio do kropli kryształu, optymalizacja powinna skupić się na liczbie kropli zawierających kryształy wysokiej jakości, a nie na całkowitej liczbie kryształów. Jeśli krople zawierają wiele kryształów, są one skutecznie zbędne, chociaż mogą złagodzić proces zbioru. Co więcej, przeniesienie protokołu krystalizacji z instytutu macierzystego do obiektów na miejscu może być wyzwaniem. Na ogół najlepiej osiąga się to za pomocą zasiewu kryształów w celu promowania powtarzalnego zarodkowania54, a zatem dobrą praktyką jest, aby użytkownicy dostarczali zapasy nasion wraz z roztworami białkowymi i krystalizacyjnymi.
Aby zapewnić dobrą rozpuszczalność i nośnik związku, w rozpuszczalnikach organicznych, w szczególności DMSO i glikolu etylenowy, zapewniono wysokie stężenia nasączania, które mają na celu napędzanie wiązania słabych fragmentów. Dostarczenie dwóch różnych rozpuszczalników daje użytkownikom alternatywę dla kryształów, które w ogóle nie tolerują DMSO lub gdy blokują one wiązanie fragmentów w miejscu zainteresowania. Użytkownicy mogą dostarczać alternatywne biblioteki w buforze wodnym: związki będą dobrze dozować, pod warunkiem, że zostaną całkowicie rozpuszczone i sformatowane w płytkach kompatybilnych z robotem dozującym ciecze.
W przypadku projektów, w przypadku których nie jest możliwe znalezienie odpowiedniego rozpuszczalnika organicznego, który zarówno rozpuściłby bibliotekę, jak i byłby tolerowany przez system krystaliczny, alternatywną procedurą jest użycie wysuszonych związków, jak ustalono w BESSY55.
W społeczności od dawna pojawia się pytanie o możliwość wchłaniania związków chemicznych do kryształów hodowanych w warunkach krystalizacji zawierających wysokie stężenia soli. W praktyce obserwuje się większe wytrącanie się związków i szybkie tworzenie się kryształów soli na etapie zbioru, co jest redukowane przez zastosowanie wilgotnego środowiska wokół obszaru zbioru. Ogólnie rzecz biorąc, kampanie przesiewowe w układach krystalicznych w warunkach wysokiej krystalizacji soli dają porównywalny wskaźnik trafień do warunków o niskiej zawartości soli.
Początkowe etapy procesu XChem (badanie tolerancji rozpuszczalników i wstępne badanie) to stosunkowo małe i szybkie eksperymenty, ale pozwalają na jasną decyzję o rozpoczęciu lub odrzuceniu projektu. Najbardziej bolesne jest to, że alternatywne systemy kryształów będą musiały zostać znalezione, jeśli żaden rozpuszczalnik nie jest tolerowany lub wstępne badanie przesiewowe skutkuje bardzo niskim wskaźnikiem trafień. W przeciwieństwie do tego, jeśli się powiedzie, wyniki bezpośrednio informują o warunkach namaczania, które należy wykorzystać w eksperymencie przesiewowym, oraz o najlepszej strategii zbierania danych. Ponieważ jakość danych, a zwłaszcza rozdzielczość, będzie miała wpływ na jakość gęstości elektronów do identyfikacji i analizy trafień, celem jest nasiąkanie w najwyższym możliwym stężeniu związku, które nie ma szkodliwego wpływu na jakość dyfrakcji (przy czym większość zbiorów danych (~80%) ulega dyfrakcji z rozdzielczością 2,8 A lub lepszą).
Proces analizy danych jest usprawniony w XChemExplorer, który opiera się na oprogramowaniu PanDDA do wykrywania słabych spoiw i umożliwia użytkownikom szybką wizualizację i przegląd wyników kampanii przesiewowej. XChemExplorer importuje wyniki przetwarzania danych z pakietów dostępnych w Diamond (DIALS16, autoPROC30, STARANISO31 i Xia214) z limitami rozdzielczości określonymi przez standardową metodę dla każdego pakietu (tj. CC1/2 = 0,3). Domyślnie wybór zestawu danych opiera się na wyniku obliczonym na podstawie I/sigI, kompletności i liczby unikalnych odbić, ale konkretne wyniki przetwarzania można wybrać do użycia zarówno globalnie, jak i dla poszczególnych próbek25. Dane są również wykluczane z analizy przez PanDDA w oparciu o kryteria, takie jak rozdzielczość,brak R i różnica w objętości komórki elementarnej między danymi referencyjnymi i docelowymi (wartości domyślne to odpowiednio 3,5 A, 0,4 i 12%), tak że słabo dyfrakcyjne, źle wyśrodkowane lub błędnie indeksowane kryształy nie wpływają na analizę.
Algorytm PanDDA wykorzystuje znaczną liczbę zestawów danych zebranych podczas kampanii fragmentów w celu wykrycia ligandów częściowego zajęcia, które nie są widoczne na standardowych mapach krystalograficznych. Początkowo PanDDA wykorzystuje dane zebrane podczas testów tolerancji rozpuszczalników i etapów wstępnego badania przesiewowego w celu przygotowania mapy średniej gęstości, która jest następnie wykorzystywana do stworzenia modelu stanu podstawowego. Ponieważ model ten będzie używany we wszystkich kolejnych etapach analizy, ważne jest, aby dokładnie reprezentował niezligandowane białko w warunkach stosowanych do badania przesiewowego fragmentów. Następnie PanDDA wykorzystuje analizę statystyczną do identyfikacji związanych ligandów, generując mapę zdarzeń dla stanu związanego kryształu. Mapa zdarzeń jest generowana przez odjęcie niezwiązanej frakcji kryształu od zestawu danych częściowego zajętości i przedstawia, co można by zaobserwować, gdyby ligand był związany przy pełnym zajęciu. Nawet fragmenty, które wydają się wyraźne na konwencjonalnych mapach 2mFo-DF c , mogą być błędnie modelowane, jeśli nie zapozna się z mapami zdarzeń32. Chociaż PanDDA jest potężną metodą identyfikacji zestawów danych, które różnią się od średnich map (co zwykle wskazuje na wiązanie fragmentów), a metryki, takie jak RSCC, RSZD, współczynnik B i RMSD podczas udoskonalania, są dostarczane z korzyścią dla użytkownika, użytkownik jest ostatecznie odpowiedzialny za podjęcie decyzji, czy obserwowana gęstość dokładnie przedstawia oczekiwany ligand i najbardziej odpowiednią konformację.
Po analizie i udoskonaleniu danych wszyscy użytkownicy mogą jednocześnie deponować wiele struktur w Banku Danych Białkowych (PDB) za pomocą XChemExplorer. Dla każdego ekranu fragmentu wykonywane są dwa grupowe zeznania. Pierwsza depozycja zawiera wszystkie modele związane z fragmentami, ze współczynnikami do obliczania map zdarzeń PanDDA zawartych w plikach MMCIF. Drugie osadzanie dostarcza towarzyszącego modelu stanu podstawowego, wraz ze zmierzonymi współczynnikami struktury wszystkich zestawów danych eksperymentu: dane te mogą być wykorzystane do odtworzenia analizy PanDDA i do opracowania przyszłych algorytmów. Jeśli chodzi o struktury trafień, gdy zajętość fragmentów jest niska, wyrafinowanie jest lepiej prowadzone, jeśli modele są złożeniem struktur stanu podstawowego związanych z ligandem i mylących32; Niemniej jednak praktyka polega na deponowaniu tylko frakcji w stanie ograniczonym, ponieważ pełne modele złożone są na ogół złożone i trudne do interpretacji. W związku z tym niektóre wskaźniki jakości ponownie obliczone przez WPB (w szczególności R/Rfree) są czasami nieznacznie zawyżone. Możliwe jest również dostarczanie wszystkich surowych danych za pomocą platform takich jak Zenodo56, chociaż nie jest to obecnie obsługiwane przez potok XChem.
Ogólnie rzecz biorąc, od czasu uruchomienia w 2016 r. ligandy fragmentaryczne można było zidentyfikować w ponad 95% celów przy użyciu tej procedury. Doświadczenia z wielu projektów wspieranych przez XChem zostały przekształcone w najlepsze praktyki w zakresie przygotowania kryształów33, podczas gdy biblioteka fragmentów została rozwinięta, która wdrożyła koncepcję wspomagania progresji fragmentów29, pomagając również w ustanowieniu praktyki publicznego udostępniania kompozycji bibliotecznych. Platforma pokazała, jak ważna jest dobrze utrzymana infrastruktura i udokumentowane procesy, szczegółowo opisane tutaj, a także umożliwiła ocenę innych bibliotek fragmentów57,58, porównanie bibliotek48 oraz dostarczenie informacji na temat projektu wspólnej biblioteki EUOpenscreen-DRIVE59,60.

Odkrywanie leków na podstawie fragmentów (FBDD) jest szeroko stosowaną strategią odkrywania wiodących źródeł, a od czasu jej powstania 25 lat temu, dostarczyła cztery leki do użytku klinicznego, a ponad 40 cząsteczek zostało zaawansowanych do badań klinicznych1,2,3. Fragmenty to małe jednostki chemiczne, zwykle o masie cząsteczkowej 300 Da lub mniejszej. Są one wybierane ze względu na ich niską złożoność chemiczną, co stanowi dobry punkt wyjścia do opracowania wysoce wydajnych inhibitorów ligandów o doskonałych właściwościach fizykochemicznych. Ich rozmiar oznacza, że próbkują one krajobraz wiązań białek dokładniej niż biblioteki większych związków podobnych do leków lub ołowiu, a tym samym ujawniają również gorące punkty i domniemane miejsca allosteryczne. W połączeniu z informacjami strukturalnymi, fragmenty dostarczają szczegółowej mapy potencjalnych interakcji molekularnych między białkiem a ligandem. Niemniej jednak niezawodne wykrywanie i walidacja tych jednostek, które mają tendencję do słabego wiązania się z białkiem docelowym, wymaga szeregu solidnych i czułych biofizycznych metod przesiewowych, takich jak powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), magnetyczny rezonans jądrowy (NMR) lub izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC)4,5.
Krystalografia rentgenowska jest istotną częścią zestawu narzędzi FBDD: jest wystarczająco czuła, aby zidentyfikować słabe spoiwa i bezpośrednio dostarcza informacji strukturalnych o interakcjach na poziomie molekularnym. Jest komplementarny z innymi badaniami przesiewowymi biofizyki i zwykle jest niezbędny do postępu uderzeń fragmentów w związki ołowiu; wymaga wysokiej jakości systemów kryształowych, co oznacza, że krystalizacja jest wysoce powtarzalna, a kryształy idealnie ulegają dyfrakcji z rozdzielczością lepszą niż 2,8 A.
Historycznie rzecz biorąc, bardzo trudno było używać krystalografii jako podstawowego ekranu fragmentów6,7,8, czy to w środowisku akademickim, czy w przemyśle. W przeciwieństwie do tego, synchrotrony osiągnęły ulepszenia o rząd wielkości w robotyce, automation9,10,11 i technologii detektorów12,13, i połączone z równie przyspieszoną mocą obliczeniową i algorytmami przetwarzania danych14,15,16, kompletne zestawy danych dyfrakcyjnych mogą być mierzone w ciągu kilku sekund, a duża liczba z nich jest całkowicie bezobsługowa, jak to zapoczątkowano w LillyCAT7 i późniejszych MASSIF17,18 (Europejski Ośrodek Promieniowania Synchrotronowego (ESRF)). To skłoniło synchrotrony do opracowania wysoce usprawnionych platform, aby ekranowanie fragmentów opartych na kryształach jako główny ekran było dostępne dla szerokiej społeczności użytkowników (XChem w Diamond; CrystalDirect w EMBL/ESRF19; BESSY w: Helmholtz-Zentrum Berlin20; FragMax w MaxIV21).
Ten artykuł dokumentuje protokoły, które tworzą platformę XChem do badania fragmentów za pomocą krystalografii rentgenowskiej, od przygotowania próbki do końcowych wyników strukturalnych uderzeń modelowanych w 3D. Pipeline (Rysunek 1) wymagał opracowania nowych podejść do identyfikacji kryształów22, soaking23 i harvesting24, a także oprogramowania do zarządzania danymi25 oraz algorytmicznego podejścia do identyfikacji fragmentów26, które jest obecnie szeroko stosowane w społeczności. Technologia pozyskiwania kryształów jest obecnie sprzedawana przez jednego z dostawców (patrz Tabela Materiałów), a otwarta dostępność narzędzi pozwoliła innym synchrotronom na dostosowanie ich do tworzenia równoważnych platform21. Trwające projekty dotyczą analizy danych, uzupełniania modeli i rozpowszechniania danych za pośrednictwem platformy Fragalysis27. Laboratorium przygotowania próbek sąsiaduje z linią badawczą I04-1, co upraszcza logistykę przesyłania setek zamrożonych próbek na linię badawczą, a dedykowany czas trwania badania na I04-1 umożliwia szybkie przekazywanie informacji zwrotnych na temat promieniowania rentgenowskiego, które kieruje kampanią.
XChem jest integralną częścią programu użytkowników Diamond, z dwoma połączeniami rocznie (początek kwietnia i października). Proces recenzowania został dopracowany w porozumieniu z ekspertami w dziedzinie odkrywania leków ze środowisk akademickich i przemysłowych. Wraz z mocnymi dowodami naukowymi, proces propozycji28 wymaga od wnioskodawców samooceny nie tylko gotowości systemu kryształowego, ale także ich wiedzy specjalistycznej w zakresie biochemicznych i ortogonalnych metod biofizycznych oraz zdolności do postępów w badaniach przesiewowych poprzez chemię kontrolną. Tryby dostępu również ewoluowały, aby dostosować się do multidyscyplinarnej społeczności użytkowników:
Poziom 1 (pojedynczy projekt) jest przeznaczony dla projektów na etapie eksploracyjnym i narzędzi walidacji trafień (narzędzia biofizyczne lub biochemiczne) oraz strategie kontynuacji nie muszą być stosowane. Jeśli projekt zostanie zaakceptowany, zostanie mu przyznana zmniejszona liczba zmian w czasie wiązki, wystarczająca do weryfikacji koncepcji.
Poziom 2 (pojedynczy projekt) jest przeznaczony dla dobrze zweryfikowanych projektów i wymaga dalszych narzędzi i strategii kontynuacji. Jeśli projekt zostanie zaakceptowany, zostanie mu przydzielony czas badawczy wystarczający na przeprowadzenie pełnej kampanii przesiewowej. Pojedyncze projekty (Tier 1 lub Tier 2) muszą zostać ukończone w ciągu 6 miesięcy okresu rozliczeniowego (od kwietnia do września lub od października do marca).
Grupa Alokacji Bloków (BAG) jest przeznaczona dla konsorcjów grup i projektów, gdzie w ramach BAG istnieje solidny proces wyboru celów i priorytetyzacji, wraz z jasnym procesem kontynuacji. BAG muszą mieć co najmniej jednego w pełni przeszkolonego eksperta (superużytkownika) przeszkolonego przez XChem, który koordynuje ich działania z personelem Diamond i szkoli członków BAG. Przydzielona liczba przesunięć w czasie trwania projektu jest określana przez liczbę solidnych naukowo projektów w BAG i jest ponownie oceniana dla każdego okresu alokacji na podstawie raportu BAG. Dostęp jest dostępny przez 2 lata.
Eksperyment XChem jest podzielony na trzy etapy, z punktem decyzyjnym dla każdego z nich: test tolerancji rozpuszczalnika, wstępne badanie przesiewowe i główny ekran (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Test tolerancji rozpuszczalnika pomaga określić parametry namaczania, ilość rozpuszczalnika (DMSO, glikolu etylenowego lub innych krioprotektantów, jeśli to konieczne), którą system kryształowy może tolerować i jak długo. Stężenia rozpuszczalników zwykle wahają się od 5% do 30% w co najmniej dwóch punktach czasowych. Dane dyfrakcyjne są zbierane i porównywane z dyfrakcją podstawową układu kryształowego; To określi parametry namaczania na następny etap. W przypadku badania wstępnego 100-150 związków jest moczonych w warunkach określonych w teście rozpuszczalnikowym, a jego celem jest potwierdzenie, że kryształy mogą tolerować związki w tych warunkach. W razie potrzeby krioprotektant jest następnie dodawany do kropli już zawierających fragmenty. Kryterium sukcesu jest to, że 80% lub więcej kryształów przetrwa wystarczająco dobrze, aby uzyskać dane dyfrakcyjne o dobrej i stałej jakości; Jeśli to się nie powiedzie, warunki namaczania są zwykle zmieniane poprzez zmianę czasu namaczania lub stężenia rozpuszczalnika. Po pomyślnym przeprowadzeniu wstępnego badania przesiewowego, pozostałe związki wybrane do eksperymentu można skonfigurować przy użyciu parametrów końcowych.
Biblioteka DSI (zobacz Tabelę Materiałów) została celowo zaprojektowana, aby umożliwić szybki postęp za pomocą opanowanej chemii29 i była koniem pociągowym placówki. Jest dostępny dla użytkowników w stężeniu 500 mM w DMSO. Użytkownicy akademiccy mają również dostęp do innych bibliotek dostarczanych przez współpracowników (łącznie ponad 2 000 związków) w stężeniach 100-500 mM w DMSO (pełną listę można znaleźć na stronie internetowej28). Znaczna część całej kolekcji jest również dostępna w postaci glikolu etylenowego, dla systemów krystalicznych, które nie tolerują DMSO. Użytkownicy mogą również przynosić własne biblioteki, pod warunkiem, że znajdują się one na płytach kompatybilnych z systemem obsługi cieczy akustycznej (patrz tabela materiałów).
Dla wszystkich trzech etapów eksperymentu (charakterystyka rozpuszczalnika, wstępne badanie przesiewowe lub pełny ekran), następujące procedury przygotowania próbki są identyczne (<silna klasa="xfig">Rysunek 3): wybór miejsca dozowania związku poprzez obrazowanie i celowanie w krople krystalizacji za pomocą TeXRank22; dozowanie do kropli za pomocą systemu dozowania płynów akustycznych zarówno dla rozpuszczalnika, jak i związków23; efektywne zbieranie kryształów za pomocą Crystal shifter24; oraz wgrywanie przykładowych informacji do bazy danych linii badawczej (ISPyB). Obecnym interfejsem do projektowania i wykonywania eksperymentów jest aplikacja oparta na Excelu (SoakDB), która generuje niezbędne pliki wejściowe dla różnych urządzeń platformy oraz śledzi i rejestruje wszystkie wyniki w bazie danych SQLite. Skanery kodów kreskowych są używane na różnych etapach procesu, aby pomóc w śledzeniu próbek, a dane te są dodawane do bazy danych.
Dane dyfrakcyjne są zbierane w trybie nienadzorowanym za pomocą dedykowanego czasu wiązki na linii I04-1. Dostępne są dwa tryby centrowania, a mianowicie optyczny i oparty na promieniowaniu rentgenowskim17. W przypadku kryształów w kształcie igieł i prętów zaleca się centrowanie promieniowania rentgenowskiego, podczas gdy bardziej masywne kryształy na ogół obsługują tryb optyczny, który jest szybszy, a zatem pozwala na zebranie większej liczby próbek w wyznaczonym czasie wiązki. W zależności od rozdzielczości kryształów (ustalonej przed wejściem na platformę) zbieranie danych może wynosić 60 s lub 15 s całkowitej ekspozycji. Zbieranie danych na etapie badania rozpuszczalnikiem zazwyczaj informuje o tym, która kombinacja najlepiej sprawdzi się w połączeniu z wydajnością linii badawczej I04-1.
Duża ilość analizy danych jest zarządzana przez XChemExplorer (XCE)25, który może być również użyty do uruchomienia kroku identyfikacji trafienia za pomocą PanDDA26. XCE to narzędzie do zarządzania danymi i przepływu pracy, które obsługuje wielkoskalową analizę struktur białkowo-ligandowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 4); odczytuje wszystkie wyniki automatycznego przetwarzania z danych zebranych w Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 i STARANISO31) i automatycznie wybiera jeden z wyników na podstawie jakości danych i podobieństwa do modelu referencyjnego. Ważne jest, aby model był reprezentatywny dla układu kryształów używanego do badań przesiewowych XChem i musiał zawierać wszystkie wody lub inne cząsteczki rozpuszczalników, a także wszystkie kofaktory, ligandy i alternatywne konformacje widoczne w kryształach nasączonych wyłącznie rozpuszczalnikiem. Jakość tego modelu referencyjnego będzie miała bezpośredni wpływ na ilość pracy wymaganej na etapie budowania i udoskonalania modelu. PanDDA służy do analizy wszystkich danych i identyfikacji miejsc wiązania. Wyrównuje struktury do struktury odniesienia, oblicza mapy statystyczne, identyfikuje zdarzenia i oblicza mapy zdarzeń 26,32. W paradygmacie PanDDA nie jest ani konieczne, ani pożądane budowanie pełnego modelu krystalograficznego; To, co musi być modelowane, to tylko widok białka, w którym fragment jest związany (model stanu związanego), więc należy skupić się tylko na budowaniu liganda i otaczających go reszt/cząsteczek rozpuszczalnika zgodnie z mapą zdarzeń32.

<table><tbody><tr><td>Biblioteka DSI</td><td>Biblioteka fragmentów</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td></tr><tr><td>Seria Echo 550 i 650</td><td>Akustyczny system dozowania</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytki Echo</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>Mikropłytki 1536-dołkowe i 384-dołkowe</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>Urządzenie do pobierania</td></tr><tr><td>mikropłytek wirówka z odchylanym wirnikiem</td><td>Sigma</td><td>model 11121</td><td>wirówka mikropłytkowa</td></tr><tr><td>3-kroplowe płytki krystalizacyjne</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>Płytki krystalizacyjne</td></tr><tr><td>Formulatrix imager płytek i oprogramowanie Rockmaker</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>Urządzenie do obrazowania płytek krystalizacyjnych</td></tr></tbody></table>

osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie xchem w diamond light source

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

W odkrywaniu leków na podstawie fragmentów, setki, a często tysiące związków mniejszych niż ~300 Da są testowane na interesującym białku w celu zidentyfikowania jednostek chemicznych, które mogą zostać rozwinięte w silnych kandydatów na leki. Ponieważ związki są małe, interakcje są słabe, a zatem metoda przesiewowa musi być bardzo czuła; Co więcej, informacje strukturalne wydają się być kluczowe dla opracowania tych trafień w związki podobne do ołowiu. W związku z tym krystalografia białek zawsze była techniką o najwyższym standardzie, ale historycznie zbyt trudna, aby znaleźć powszechne zastosowanie jako podstawowe badanie przesiewowe.
Początkowe eksperymenty XChem zostały zademonstrowane w 2014 roku, a następnie przetestowane z partnerami akademickimi i przemysłowymi w celu walidacji procesu. Od tego czasu duży wysiłek badawczy i znaczny czas badania usprawniły przygotowanie próbek, opracowały bibliotekę fragmentów z możliwością szybkiego śledzenia, zautomatyzowały i poprawiły zdolność linii badawczej I04-1 do bezobsługowego gromadzenia danych oraz wdrożyły nowe narzędzia do zarządzania danymi, analizy i identyfikacji trafień.
XChem jest teraz obiektem do badań przesiewowych fragmentów krystalograficznych na dużą skalę, wspierającym cały proces osadzania kryształów i dostępnym dla użytkowników akademickich i przemysłowych na całym świecie. Od 2016 r. aktywnie rozwijany jest recenzowany program dla użytkowników akademickich, aby uwzględnić projekty o jak najszerszym zakresie naukowym, w tym projekty dobrze zweryfikowane i eksploracyjne. Dostęp akademicki jest przyznawany poprzez dwa razy w roku zaproszenia do składania recenzowanych wniosków, a prace własne są organizowane przez grupę Diamond's Industrial Liaison group. Ten przepływ pracy został już rutynowo zastosowany do ponad stu celów z różnych obszarów terapeutycznych i skutecznie identyfikuje słabe spoiwa (1%-30% współczynnika trafień), które zarówno służą jako wysokiej jakości punkty wyjścia do projektowania mieszanek, jak i dostarczają obszernych informacji strukturalnych na temat miejsc wiązania. Odporność procesu została wykazana poprzez kontynuację badań przesiewowych celów SARS-CoV-2 podczas pandemii COVID-19, w tym 3-tygodniowy okres oczekiwania na główną proteazę.

Przebieg analizy XChem w celu przesiewania fragmentów za pomocą krystalografii rentgenowskiej został w znacznym stopniu zoptymalizowany, co umożliwiło jego wdrożenie przez społeczność naukową (Rysunek 5). Proces ten został zwalidowany w ponad 150 kampaniach przesiewowych z odsetkiem trafień wahającym się od 1% do 30%47,48,49,50,51,52 oraz przez wielu stałych użytkowników. Systemy krystaliczne, które nie są odpowiednie (niska rozdzielczość, niespójna krystalizacja lub jakość dyfrakcji) lub nie tolerują DMSO bądź glikolu etylenowego, są eliminowane na wczesnym etapie procesu, co pozwala oszczędzić czas, wysiłek i zasoby. Udane kampanie dostarczają trójwymiarowej mapy potencjalnych miejsc oddziaływania na białku docelowym; typowym wynikiem jest przesiew XChem głównej proteazy SARS-CoV-2 (Rysunek 6). Zazwyczaj trafienia fragmentów znajdują się w: (a) znanych obszarach zainteresowania, takich jak centra aktywne enzymów i subkieszenie48; (b) domniemanych miejscach allosterycznych, na przykład w oddziaływaniach białko-białko53; (c) na interfejsach upakowania kryształów, co zazwyczaj uznaje się za wyniki fałszywie dodatnie (Rysunek 6). Takie dane strukturalne stanowią zazwyczaj podstawę do łączenia, wiązania lub rozbudowywania trafień fragmentów w małe cząsteczki o charakterze leadopodobnym1,3.
<img alt="Przebieg procesu odkrywania leków: obrazowanie kryształów, dozowanie związków, gromadzenie danych, identyfikacja trafień." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Potok XChem. Platforma została przedstawiona schematycznie, od propozycji projektu, przez przygotowanie próbek i gromadzenie danych, aż po identyfikację trafień. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat procesu przesiewowego krystalografii z wynikami testów dyfrakcyjnych i modelem strukturalnym." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Strategia przesiewowa. Schemat przedstawia cel każdego etapu, wymagania eksperymentalne oraz punkty decyzyjne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Przebieg krystalografii: obrazowanie kryształów, celowanie w kropelki, dozowanie związków, analiza próbek." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Schemat przygotowania próbek. Kluczowe etapy przygotowania próbek, przy czym informacje z każdego kroku są zapisywane w bazie danych SQLite. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat procesu krystalograficznego: seryjne zastępowanie molekularne, analiza PanDDA, identyfikacja trafień." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4: Analiza danych przy użyciu XCE. Kluczowe etapy analizy danych przedstawiono na schemacie przepływu pracy wraz z odpowiednimi pakietami oprogramowania. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający liczbę próbek i wniosków badawczych od 2015 do 2020 roku, podkreślający trendy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5: Ewolucja programu użytkownika XChem: Wykres przedstawia wzrost i konsolidację programu użytkownika od 2015 do 2019 roku, wraz z utworzeniem grup BAG w 2019 roku oraz odporność platformy podczas pandemii COVID-19 w 2020 roku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Schemat struktury białka, podkreślający oddziaływania molekularne, miejsca wiązania enzymów, analizę biomolekularną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6: Reprezentatywne wyniki przesiewu fragmentów XChem. Dimer głównej proteazy (Mpro) SARS-CoV2 przedstawiono w formie powierzchniowej, gdzie trafienia w centrum aktywnym zaznaczono kolorem żółtym, domniemane trafienia allosteryczne kolorem purpurowym, a artefakty powierzchniowe/upakowania kryształów kolorem zielonym. Rysunek wykonano przy użyciu programu Chimera oraz wpisów PDB dla Mpro z depozycji grupowej G_1002156. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Ten artykuł opisuje cały proces XChem do badania fragmentów na bazie kryształów, począwszy od złożenia wniosku o dostęp i wszystkich kolejnych kroków do rozpowszechniania danych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Zakład XChem w Diamond Light Source zapewnia rutynowe, wielkoskalowe przesiewanie fragmentów graficznych kryształów, wspierając cały proces osadzania kryształu. Krystalografia rentgenowska jest istotną częścią zestawu narzędzi FBDD. Jest wystarczająco czuły, aby zidentyfikować słabe spoiwa i bezpośrednio dostarcza informacji strukturalnych o oddziaływaniach na poziomie molekularnym.Odkrywanie leków na podstawie fragmentów jest szeroko stosowaną strategią odkrywania potencjalnych klientów. Dostarczyła ona sześć leków do użytku klinicznego, a ponad 50 cząsteczek przeszło do badań klinicznych. Wpływ postępów i wydajności zapewnianej przez platformę XChem na tradycyjne metody namaczania, gromadzenia danych i analizy, które najlepiej można zademonstrować wizualnie.Zacznij od wybrania kryształów i lokalizacji związku. Otwórz TextRank z komputera i wybierz kryształową tacę z listy w prawym dolnym rogu lub wpisując kod kreskowy w polu w lewym górnym rogu. Wybierz odpowiedni format obrazu i widok pojedynczego dołka.Aby dodać rozpuszczalnik lub związki do kropli bez uderzania w kryształ, kliknij prawym przyciskiem myszy w obrębie kropli, ale z dala od kryształu, gdy podczas poruszania się po obrazach kropli zostanie znaleziony odpowiedni kryształ do eksperymentu. Otwórz oprogramowanie Echo i wybierz nowe, aby dozować roztwory za pomocą dozownika akustycznego. Wybierz odpowiednią płytkę studzienki źródłowej i klasę cieczy.Upewnij się, że jako blachę docelową wybrano właściwy typ blachy. Następnie zaznacz pole niestandardowe i kontynuuj. Wybierz opcję importuj i wybierz odpowiedni plik wsadowy.Następnie wykonaj kroki importowania zgodnie z monitem oprogramowania. Skorzystaj z map płytowych, aby sprawdzić roztwór, który ma być dozowany, i lokalizacje docelowe. Następnie uruchom protokół, postępując zgodnie z wyświetlanymi monitami.Roztwory z płytki źródłowej zostaną dozowane do wybranych kryształowych kropli. Płytkę należy przechowywać w inkubatorze przez wymagany czas. Aby zebrać kryształy za pomocą półautomatycznego urządzenia do zbierania kryształów, naciśnij przycisk rozpoczęcia przepływu pracy, aby przejść do pierwszej wybranej pozycji dołka.Jeśli kryształ przetrwał, zamontuj go w pętli i zanurz w ciekłym azocie, umieszczając go na pozycji pierwszej w pierwszym krążku na liście. Wybierz odpowiedni opis kryształu z interfejsu. Jeśli kropla jest nasączaniem związkiem, zapisz opis stanu związku.Jeśli kryształ został pomyślnie zamontowany, wybierz zamontowany, w przeciwnym razie wybierz niepowodzenie. Po zebraniu kryształów zanieś krążki do skanera kodów kreskowych i umieść je pojedynczo w uchwycie, aby zeskanować krążek i przypiąć kody kreskowe. Po zakończeniu skanowania umieść pokrywki na krążkach i przechowuj je w zbiorniku na ciekły azot Dewar.Aby przypomnieć sobie nieprawidłowo wyśrodkowane próbki, spójrz na widok zmieniacza próbek w ISPyB i wybierz pozycję rangi według rozdzielczości AP, aby sklasyfikować próbki według rozdzielczości przetworzonej automatycznie z podziałką kolorów od zielonego do czerwonego. Kliknij próbki, aby sprawdzić, czy nie ma ich czerwonych lub żółtych próbek. Następnie sprawdź migawki kryształu, aby zobaczyć, czy kryształ został wyśrodkowany.Aby pobrać i przeanalizować wyniki automatycznego przetwarzania Diamonda za pomocą XChem Explorer lub XCE, w terminalu przejdź do podfolderu przetwarzania i użyj aliasu XCE, aby otworzyć XChem Explorer. Wybierz przycisk Aktualizuj tabele ze źródła danych na karcie przeglądu, aby odświeżyć podsumowanie danych eksperymentalnych. Na karcie ustawień wybierz katalog zbierania danych, otwórz kartę zestawów danych.Wybierz element docelowy z menu rozwijanego Wybierz element docelowy, wybierz opcję Pobierz nowe wyniki z automatycznego przetwarzania z menu rozwijanego zestawów danych i kliknij przycisk Uruchom. Aby obliczyć początkowe mapy za pomocą Dimple, otwórz zakładkę mapy, wybierz model referencyjny z menu rozwijanego i wybierz żądane zestawy danych, a następnie uruchom Dimple na wybranych plikach MTZ. Aby wygenerować umocowania ligandów, wybierz żądane zestawy danych, a następnie utwórz plik SCF lub PDB lub PNG wybranych związków z listy rozwijanej map i umocowań.Aby zidentyfikować trafienia za pomocą biblioteki Panda, wybierz kartę Pandas, upewnij się, że katalog wyjściowy jest poprawnie zdefiniowany i uruchom polecenie panda. Analizuj z menu rozwijanego identyfikacji trafień. Aby przeanalizować działania zidentyfikowane przez Pandę, uruchom polecenie panda.Sprawdź z menu rozwijanego Identyfikacja trafienia. Aby otworzyć Coot za pomocą panelu sterowania Panda. Mapy średniej obciążenia i 2mFo-DFc firmy Dimple do porównania z mapą i modelem zdarzeń.Po dopasowaniu liganda kliknij przycisk Scal ligand z modelem i zapisz model przed przejściem do innego zdarzenia, aby uniknąć utraty jakichkolwiek zmian w modelu stanu powiązanego. Dodawanie adnotacji do zdarzenia powiązania przy użyciu pola komentarza do zdarzenia i dodawanie adnotacji do witryn powiązań przy użyciu informacji o witrynie rekordu. Gdy wszystkie żywotne ligandy zostaną wymodelowane, połączone i zapisane na podstawie mapy zdarzeń, zamknij panda.inspect.Wyeksportuj modele inspekcji Panda z powrotem do katalogu projektu i uruchom wstępną rundę udoskonalania dla wybranych zestawów danych, a udoskonalenie będzie teraz widoczne na karcie uściślania. Linia produkcyjna XChem do badań przesiewowych fragmentów za pomocą krystalografii rentgenowskiej została znacznie uproszczona, co umożliwiło jej wykorzystanie przez społeczność naukową. Wykres ten pokazuje absorpcję i konsolidację programu użytkowników w latach 2015-2019 wraz z utworzeniem grup alokacji bloków w 2019 r. oraz odpornością platformy na pandemię COVID-19 w 2020 r.Udane kampanie dają trójwymiarową mapę potencjalnych miejsc interakcji z docelowym białkiem. Typowym wynikiem jest badanie przesiewowe XChem głównej proteazy SARS-CoV-2. Znane miejsca zainteresowania, takie jak miejsca aktywne enzymów i podkieszenie, są pokazane na żółto.Przypuszczalne miejsca allosteryczne, takie jak te zaangażowane w interakcje białko-białko, są pokazane w kolorze magenta, a interfejsy upakowania kryształów, ogólnie uważane za fałszywie dodatnie, są pokazane na zielono. Historycznie rzecz biorąc, stosowanie krystalografii jako podstawowego badania przesiewowego fragmentów było trudne. W badaniu tym udokumentowano protokoły rurociągu XChem od przygotowania próbki do końcowych struktur.Krystalograficzne badanie przesiewowe fragmentów uzupełnia inne techniki biofizyczne i jest zwykle niezbędne do postępu uderzeń fragmentów w związki ołowiu. Można go zastosować do dowolnej klasy docelowej odkrywania leków.

achieving-efficient-fragment-screening-at-xchem-facility-at-diamond

Research

JoVE Journal

Chemistry

Chemia

W tym raporcie opisujemy szczegółowe procedury przeprowadzania eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej monokryształów z komórką kowadełka diamentowego na linii badawczej GSECARS 13-BM-C w Zaawansowanym Źródle Fotonów. Do analizy danych wykorzystywane są programy ATREX i RSV.

Dyfrakcja monokryształów pod wysokim ciśnieniem w PX^2

Przedstawiono uproszczony protokół do przeprowadzenia obszernej charakterystyki biochemicznej i strukturalnej białka wiążącego substrat węglowodanowy ze Streptococcus pneumoniae.

Charakterystyka biochemiczna i strukturalna białka wiążącego substrat transportu węglowodanów SP0092

Opisujemy konfigurację linii badawczej przeznaczoną do przeprowadzania szybkiej dwuwymiarowej fluorescencji rentgenowskiej i mapowania mikrodyfrakcji rentgenowskiej próbek monokryształów lub proszków za pomocą dyfrakcji Laue (promieniowanie polichromatyczne) lub proszkowej (promieniowanie monochromatyczne). Wynikowe mapy dostarczają informacji o odkształceniu, orientacji, rozkładzie fazowym i odkształceniu plastycznym.

Synchrotronowe obrazowanie mikrodyfrakcji rentgenowskiej i fluorescencji próbek minerałów i skał

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Prezentujemy obszerny przewodnik po przygotowywaniu próbek do stałego celu, zbieraniu danych i przetwarzaniu danych dla szeregowej krystalografii synchrotronowej na linii badawczej Diamond I24.

Poprawiono zbieranie danych szeregowych celu w Diamond Light Source

Badanie przesiewowe fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin odbywa się za pomocą przepływu pracy z dedykowanymi bibliotekami związków, narzędziami do obsługi kryształów, szybkimi urządzeniami do zbierania danych i w dużej mierze zautomatyzowaną analizą danych. Przedstawiony protokół ma na celu maksymalizację wyników takich eksperymentów, aby zapewnić obiecujące punkty wyjścia do projektowania ligandów opartych na dalszej strukturze.

Przebieg pracy i narzędzia do badania przesiewowego fragmentów krystalograficznych w Helmholtz-Zentrum Berlin

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj prezentujemy protokół przygotowania próbek kriogenicznych i transferu kryształów do stacji końcowej próżni na linii badawczej I23 w Diamond Light Source, dla eksperymentów makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej o długich falach.

Protokół przygotowania i transferu próbki do krystalografii długofalowej w próżni na linii badawczej I23 przy diamentowym źródle światła

Monitorowanie zmian temperatury topnienia docelowego białka (np. test przesunięcia termicznego, TSA) jest efektywną metodą badania bibliotek fragmentów kilkuset związków. Przedstawiamy protokół TSA implementujący wspomaganą robotyką nanoróżnicową fluorymetrię skaningową (nano-DSF) do monitorowania wewnętrznej fluorescencji tryptofanu i rozpraszania wstecznego światła w celu badania przesiewowego fragmentów.

Nanoróżnicowa fluorymetria skaningowa do badań przesiewowych w wykrywaniu odprowadzeń na podstawie fragmentów

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Poznaj proces XChem do przesiewania fragmentów metodą krystalografii rentgenowskiej w Diamond Light Source. Ta metoda usprawnia odkrywanie leków poprzez identyfikację słabych ligandów i dostarczanie szczegółowych map strukturalnych.

Osiągnięcie efektywnego przesiewania fragmentów w zakładzie XChem w Diamond Light Source

Przeglądaj więcej filmów