Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Analiza kriogeniczna pojedynczych cząstek stała się rutynową techniką w zestawie narzędzi biologów strukturalnych, mającą zastosowanie do szerokiej gamy próbek, w tym białek błonowych, włókienek amyloidowych, białek wiążących kwasy nukleinowe i wirusów. Po zakończeniu przygotowywania próbki i załadowaniu siatek do mikroskopu, zbieranie danych można przeprowadzić zdalnie w wielu obiektach kriogenicznych, takich jak Astbury Biostructure Laboratory i eBIC. Główne przeszkody w pomyślnym określeniu struktury często leżą na etapach przygotowania próbki i przesiewania siatki, przy czym czasami w tym procesie wymagane jest wiele iteracji.

W tym miejscu zademonstrujemy zdalne przesiewanie sieci i pozyskiwanie danych o pojedynczych cząstkach. Na karcie automatycznego ładowania w interfejsie użytkownika mikroskopu wyjdź z okna dialogowego opcji za pomocą strzałki i naciśnij przycisk inwentaryzacji. Spowoduje to sekwencyjne sprawdzenie każdej pozycji w kasecie, aby określić, czy wkład jest obecny.

Ekwipunek będzie uruchamiany w każdym miejscu po kolei. Gdy wszystkie zajęte miejsca zostaną zmapowane, ekwipunek zostanie zatrzymany. Podświetl siatkę, która ma zostać przeniesiona do kolumny mikroskopu, i kliknij przycisk Załaduj.

Etykieta miejsca zmieni kolor z niebieskiego na żółty po pomyślnym załadowaniu siatki na scenę. Aby prześwietlić siatki, otwórz oprogramowanie EPU. Na stronie przygotowania wybierz optykę i ustawienia akwizycji, a następnie wybierz ustawienie atlasu z menu rozwijanego.

Wybierz odpowiednie ustawienia wiązki i naciśnij set, aby przesunąć parametry do mikroskopu. Naciśnij, aby otworzyć zawory kolumny i włóż sitko przeciw grypie. Sprawdź, czy wiązka jest widoczna i wystarczająco rozproszona i wyśrodkowana, aby zakryć detektor.

W razie potrzeby przejdź do cieńszego obszaru siatki za pomocą joysticka lub wirtualnych paneli dłoni, aby sterować ruchami stage w X i Y.Podnieś ekran grypy i zrób zdjęcie za pomocą przycisku podglądu w EPU. W EPU przejdź do strony atlasu i naciśnij nową sesję. Wybierz format obrazu MRC i wprowadź odpowiednią nazwę folderu oraz lokalizację, w której chcesz zapisać sesję przesiewową, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Wybierz selekcję z menu po lewej stronie. Zaznacz pola wyboru obok każdej siatki, aby uzyskać montaż atlasu, a następnie rozpocznij sesję przesiewową w EPU. Dla każdej zaznaczonej siatki pobierany jest atlas, a dostępne kwadraty siatki są wyświetlane po ukończeniu.

Każdy atlas można przeglądać, podświetlając go na stronie projekcji. Po zakończeniu przejrzyj zebrane atlasy i zidentyfikuj siatki odpowiednie do oceny jakości próbki przy większych powiększeniach. Podświetl wybraną siatkę w menu rastrowania EPU i kliknij przycisk załaduj próbkę.

Z menu rastrowania atlasu wybierz aktualnie załadowaną siatkę i przenieś scenę do kwadratu siatki zawierającego wypełnione otwory, klikając prawym przyciskiem myszy żądane miejsce na obrazie siatki i wybierając tutaj przesuń scenę. Wróć do strony przygotowania EPU i wybierz ustawienie kwadratu siatki. Otwórz stronę automatycznych funkcji EPU i uruchom auto-eucentryczność przez pochylenie stolika z ustawionym kwadratem siatki, aby przesunąć próbkę na wysokość eucentryczną.

Przygotowując EPU, zrób nowy obraz podglądu kwadratu siatki. Zwróć uwagę na szare wartości na różnych otworach, wskazujące na różną grubość lodu. Przesuń scenę nad otwór za pomocą prawego przycisku myszy i przesuń scenę tutaj.

Wybierz ustawienie predefiniowane wysokości otworu lub eucentryczności, a następnie kliknij przycisk Podgląd. Wybierz ustawienie akwizycji danych i ustaw powiększenie, które umożliwia łatwą identyfikację cząstek. Ustaw przesunięcie rozmycia na minus od trzech do pięciu mikrometrów.

Wykonaj iteracje w celu ponownej oceny zakresu grubości lodu pod kątem rozkładu cząstek, orientacji i zanieczyszczenia w siatce. W zależności od dostępności mikroskopu, przejdź bezpośrednio do zbierania danych lub siatki mogą zostać usunięte z mikroskopu w celu ich zebrania w przyszłości, w tym w innych miejscach. Zbierz atlas, jeśli nie jest on dostępny podczas selekcji, konfigurując ustawienia atlasu i wybierając siatkę, aby uzyskać atlas.

Pobierz atlas i kliknij lokalizację siatki, aby zobaczyć dane wyjściowe. Po ukończeniu atlasu zdefiniuj każde z ustawień wstępnych wiązki zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami projektu. Wykonaj kalibrację przesunięcia obrazu.

Skonfiguruj sesję EPU, wybierając konfigurację sesji na stronie EPU, a następnie wybierając opcję Nowa sesja lub Nowa z preferencji. Po wybraniu nowej sesji pojawi się wyskakujące okienko z opcją skorzystania z poprzednich ustawień. Ustawienia zostaną automatycznie załadowane od poprzedniej do bieżącej sesji EPU.

Możesz też wybrać nowy z preferencji i wybrać plik z zapisanymi preferencjami, aby wstępnie załadować te informacje do bieżącego pliku EPU. Wpisz nazwę sesji czymś informacyjnym. W polu Typ wybierz opcję ręcznie.

W trybie akwizycji wybierz dokładne centrowanie otworów lub szybszą akwizycję, jeśli dostępna i pożądana jest kolekcja przesunięć obrazu bez aberracji. Wybierz żądany format obrazu, a następnie wybierz folder przechowywania, a EPU utworzy katalog z nazwą sesji. Wybierz odpowiednią siatkę, zgodnie z którą używany jest rozstaw otworów w siatce, i naciśnij Zastosuj.

Wybierz początkowy kwadrat siatki i ustaw szablon przejęcia. Przejdź do zaznaczenia kwadratu. Jeśli wszystkie kwadraty są zielone, kliknij odznacz wszystkie w lewym górnym rogu.

Otwórz kafelki, klikając prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierając polecenie Otwórz kafelek. Dodaj lub wybierz kwadrat siatki, klikając przycisk Zaznacz, a następnie klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając polecenie przenieś scenę do kwadratu siatki. Przejdź do wyboru otworów i naciśnij auto-eucentryczny.

Poczekaj, aż zostanie zrobione zdjęcie kwadratu siatki. Jeśli funkcja automatyczna nie powiedzie się, może to być spowodowane tym, że wysokość jest znacznie obniżona. Można go regulować ręcznie za pomocą ekranu przeciw grypie w powiększeniu siatki kwadratowej.

Aby zmierzyć rozmiar otworu, przesuń i dostosuj żółte kółka tak, aby znajdowały się nad otworami o odpowiednim rozmiarze i odstępach. Naciśnij przycisk Znajdź otwory. Sprawdź, czy otwory zostały znalezione prawidłowo.

Jeśli nie, zmień rozmiar otworu i ponownie naciśnij przycisk znajdź otwory. Jeśli ten proces konsekwentnie kończy się niepowodzeniem, rozważ przejście do niższej liczby lub jaśniejszego rozmiaru plamki przy powiększeniu siatki do kwadratu. Użyj histogramu jakości lodu filtra po prawej stronie, aby dostosować wybór otworu.

Może to być przydatne do wykluczenia obszarów z grubym lodem i cienkim lodem. Zostanie to zapamiętane dla przyszłych kwadratów siatki wybranych podczas sesji. Zoptymalizuj wybór otworów za pomocą narzędzi w menu wyboru u góry.

Na przykład kliknij przycisk Usuń otwory w pobliżu paska siatki. Przejdź do definicji szablonu i naciśnij pobierz. Kliknij przycisk znajdź i wyśrodkuj otwór.

Zmień opóźnienie po przesunięciu sceny i opóźnienie po przesunięciu obrazu na jedną do pięciu sekund, a następnie, jeśli to możliwe, sprawdź, czy maksymalna wartość przesunięcia obrazu jest zgodna z potrzebami. Kliknij dodaj obszar akwizycji i kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przenieś obszar pozyskiwania do żądanej lokalizacji.

Dodaj zakres rozmycia w prawym górnym rogu. Typowa lista rozmycia dla projektu białka błonowego to rozogniskowanie od minus 0,8 do minus trzech mikrometrów, a następnie dodanie innych obszarów akwizycji, układając je tak, aby obszary akwizycji nie były podwójnie naświetlone wiązką. Kliknij dodaj obszar autofokusa i kliknij w dowolnym miejscu obrazu.

Przesuń obszar autofokusa na węgiel otaczający otwór. Standardową praktyką jest automatyczne ustawianie ostrości po wyśrodkowaniu podczas korzystania z AFIS lub co pięć do 15 mikrometrów, w zależności od zmiany wysokości Z w poprzek kwadratu. Kliknij dodaj obszar pomiaru dryfu.

Pomiar dryfu wykonywany raz na kwadrat siatki z ustawionym progiem 0,05 nanometra na sekundę jako ustawieniem standardowym. Obszar pomiaru dryftu może pokrywać się bezpośrednio z obszarem autofokusa. Upewnij się, że ani dryf, ani obszar autofokusa nie nakładają się na obszar akwizycji.

Wróć do wyboru kwadratów i wybierz kwadraty do przejęcia na siatce. Użyj liczby obszarów pozyskiwania i oczekiwanej szybkości pozyskiwania danych, aby przewidzieć, ile obszarów pozyskiwania jest wymaganych. Po wybraniu wszystkich żądanych kwadratów naciśnij przycisk przygotuj wszystkie kwadraty.

Po zebraniu każdego kwadratu nawiguj między kwadratami siatki i dostosuj otwory za pomocą pędzla wyboru. Przejdź do miejsca na stole montażowym nad próbką i użyj funkcji automatycznych, aby ustawić wysokość eucentryczną. Wykonaj wyrównanie mikroskopu za pomocą oprogramowania mikroskopowego, jak opisano wcześniej i w tekście.

Wykonaj wyrównanie bez komy w funkcjach automatycznych przed ponownym włożeniem i wyśrodkowaniem przysłony obiektywu oraz korekcją astygmatyzmu soczewki obiektywu za pomocą EPU. Upewnij się, że oba wyrównania zbiegają się w odpowiednich wartościach. Przed rozpoczęciem automatycznego przebiegu akwizycji upewnij się, że pompa turbo automatycznej ładowarki jest wyłączona, a w razie potrzeby włożony jest otwór obiektywu.

W przypadku automatycznego pozyskiwania naciśnij przycisk start run, aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych. Korzystając z tego protokołu, uszkodzone lub wysuszone siatki mogą być przesiewane i odrzucane na etapie atlasu. Na większości siatek obserwuje się gradient lodu.

Podczas przesiewania idealny rozkład cząstek jest monorozproszony z widocznym zakresem orientacji cząstek. Jeśli lód jest zbyt cienki, może się stopić po oświetleniu wiązką elektronów, powodując nadmierny ruch na mikrofotografii. Jest to najczęściej obserwowane, gdy w buforze znajduje się detergent.

Lód musi być szklisty, więc obszary siatki, w których większość zdjęć pokazuje lód krystaliczny, zostały wykluczone. Dołączono graficzne podsumowanie danych w celu oceny jakości mikrofotografii i podjęcia decyzji, czy wymagane są zmiany w zbiorze danych. Zbieracze cząstek, takie jak crYOLO, działają wystarczająco dobrze dla pierwszego przejścia danych, umożliwiając przejście do uśredniania klas 2D.

Klasy, które pokazują szczegóły struktury drugorzędnej, powinny być wybrane do analizy 3D, a cząstki śmieci powinny zostać odrzucone. Podzbiór cząstek można wykorzystać do wygenerowania początkowego modelu do klasyfikacji i udoskonalenia 3D. W przypadku RagAB zbiór danych zawierał trzy odrębne konformery, które można rozdzielić podczas klasyfikacji 3D.

Należy pamiętać, że sukces na etapie pozyskiwania danych i późniejszej analizy obrazu zależy od uzyskania i zidentyfikowania dobrze zoptymalizowanych siatek na etapie przesiewowym. Po uzyskaniu mapy gęstości 3D EM można ją dalej interpretować poprzez dopasowanie i udoskonalenie modelu białka lub zbudowanie modelu atomowego de novo. Analiza pojedynczych cząstek Cryo-EM umożliwia ustrukturyzowane określenie wielu celów, które wcześniej nie były możliwe.

Warto zauważyć, że te przepływy pracy zostały ostatnio wykorzystane do rozwiązywania struktur makrocząsteczek związanych z COVID-19.