Name: Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj mikroskopię krioelektronową pojedynczych cząstek w biologii strukturalnej. Naucz się przygotowywania próbek, selekcji siatek i zdalnej akwizycji danych dla kompleksów makromolekularnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez iNEXT-Discovery (Grant 871037) finansowany przez program Horyzont 2020 Komisji Europejskiej. J. B. R. White jest finansowany przez Wellcome Trust (215064/Z/18/Z). Mikroskopy FEI Titan Krios zostały ufundowane przez Uniwersytet w Leeds (nagroda UoL ABSL) i Wellcome Trust (108466/Z/15/Z). Dziękujemy M. Iadanzie za skorzystanie z jego skryptu do analizy mikrograficznej. Dziękujemy firmie Diamond Light Source za dostęp i wsparcie urządzeń kriogenicznych w brytyjskim krajowym Centrum Bioobrazowania Elektronów (eBIC) finansowanych przez Wellcome Trust, MRC i BBRSC.

Nie zgłasza się żadnych konfliktów interesów.

W tym protokole opisaliśmy podstawowy potok mający zastosowanie do próbek podatnych na rutynowe SPA. Chociaż ta metoda bibuły filtracyjnej polegająca na tworzeniu cienkich warstw i witryfikacji jest niewątpliwie skuteczna, biorąc pod uwagę jej zastosowanie w zdecydowanej większości dotychczasowych projektów SPA, ma ona szereg wad. Należą do nich: marnotrawstwo próbki, powolne czasy (sekundy) wymagane do uformowania cienkiej warstwy i zamrożenia próbki, zgłoszona nieodtwarzalność27 oraz zgłoszone negatywne skutki stosowania bibuły filtracyjnej do usuwania nadmiaru cieczy50. Ostatnio opracowano nowe technologie poprawiające odtwarzalność produkcji cienkich warstw51, 52. Opracowano inne technologie, które skracają czas między nałożeniem próbki a witryfikacją 53,54,55. Podczas gdy metody tworzenia cienkich warstw oparte na bibule filtracyjnej pozostają najbardziej wszechobecną metodą przygotowania próbek krioEM SPA w momencie pisania tego tekstu, te nowe technologie mogą przynieść szereg korzyści w zakresie wydajności i odtwarzalności witryfikacji siatki, a także stworzyć nowe możliwości wprowadzenia dodatkowych wymiarów eksperymentalnych, takich jak rozdzielczość czasowa i szybkie mieszanie przed witryfikacją.
Proces przesiewania siatki dla większości użytkowników jest obecnie procesem jakościowym, który obejmuje pozyskiwanie atlasów o małym powiększeniu, a następnie wykonywanie obrazów w dużym powiększeniu w poprzek siatki w celu oceny rozkładu cząstek. Chociaż jest to wystarczająco solidne podejście dla niektórych typów próbek, może być trudno ocenić, czy próbka jest rzeczywiście tym, co badacz ma nadzieję zobrazować, czy też ma preferowaną orientację, na przykład w przypadku małych (<200 kDa) próbek lub gdy morfologia o niskiej rozdzielczości utrudnia identyfikację wzrokową, czy obecny jest zakres rozkładów cząstek. W przypadku niektórych projektów niemożliwe jest określenie, czy próbka jest zgodna z oczekiwaniami, na przykład gdzie związany jest ligand lub gdzie próbka jest badana przesiewowo w celu oceny, czy mała (np. 10 kDa) podjednostka jest nadal obecna w połączeniu z kompleksem. W przypadku tych projektów w pełni zautomatyzowane potoki do analizy danych w połączeniu z "krótkimi" zbiorami trwającymi od 0,5 do 1 godziny, które mogą przechodzić przez kolejne etapy przetwarzania obrazu do klasyfikacji 2D, a nawet klasyfikacji i udoskonalania 3D, pomogłyby skutecznie określić, czy uzasadniona jest dłuższa kolekcja. Rurociągi te są nadal w fazie rozwoju i nie są obecnie powszechnie stosowane, ale mają potencjał, aby poprawić wydajność przesiewania siatek krioEM, zwłaszcza w przypadku trudnych próbek.
Ulepszenia w bezpośrednich detektorach elektronów, a także modyfikacje mikroskopii w połączeniu z postępami w przetwarzaniu obrazów, takich jak gromadzenie danych o przesunięciach obrazu, zwiększyły przepustowość i jakość obrazów wytwarzanych podczas pozyskiwania danych. Ten wzrost szybkości gromadzenia danych podkreśla potrzebę dokładnych badań przesiewowych sieci krioelektromagnetycznych przed pozyskaniem wielu TB danych.
CryoEM SPA stało się naprawdę główną techniką biologii strukturalnej, a w wielu przypadkach podejściem "go-to" dla niektórych klas próbek, takich jak heterogeniczne i labilne kompleksy makromolekularne. Podczas gdy niniejszy protokół opisuje podstawowy przegląd rurociągu SPA, każda omówiona tutaj sekcja (witryfikacja i przesiewanie siatki, krioEM i przetwarzanie obrazu) jest tematem samym w sobie i wartym zbadania podczas opracowywania projektu SPA. Wraz z postępem technologii przygotowywania próbek i mikroskopii oraz pojawianiem się nowych algorytmów i podejść do przetwarzania obrazu, SPA będzie nadal rozwijać się jako rurociąg, pomagając naukowcom w uzyskiwaniu wglądu w złożone systemy biologiczne.

Kriomikroskopia elektronowa pojedynczych cząsteczek (Single particle CryoEM) 
Aby badać życie na poziomie molekularnym, musimy zrozumieć strukturę. Dostępnych jest wiele technik badania struktury białek, takich jak NMR, krystalografia rentgenowska, spektrometria mas oraz mikroskopia elektronowa (EM). Do tej pory większość struktur zdeponowanych w Protein Databank (PDB) została rozwiązana za pomocą krystalografii rentgenowskiej. Jednak od ok. 2012 roku kriomikroskopia elektronowa (cryoEM) stała się główną techniką wyznaczania struktury białek, a jej zastosowanie gwałtownie wzrosło. Całkowita liczba map EM zdeponowanych w Electron Microscopy Databank (EMDB) (stan na grudzień 2020 r.) wyniosła 13 421 w porównaniu do 1 566 w 2012 roku (Rycina 1, www.ebi.co.uk). W 2012 roku liczba współrzędnych atomowych wymodelowanych w mapach gęstości cryoEM i zdeponowanych w PDB wynosiła zaledwie 67, ale do grudnia 2020 r. zdeponowano już 2 309 struktur, co stanowi 35-krotny wzrost. Ten podstawowy wzrost jakości i ilości generowanych map gęstości cryoEM, czasem nazywany „rewolucją rozdzielczości'1, był wynikiem splotu postępów w wielu obszarach: opracowania nowych kamer do obrazowania, znanych jako detektory elektronów bezpośrednich; nowego oprogramowania oraz bardziej stabilnych&#160;mikroskopów2,3,4.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg" /> 
Rycina 1: Skumulowana liczba zgłoszeń do EMDB od 2012 roku do grudnia 2020 roku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
Analiza pojedynczych cząsteczek (SPA) jest potężnym narzędziem służącym do uzyskiwania wiedzy biologicznej na temat szerokiej gamy typów próbek poprzez wyznaczanie struktur o wysokiej rozdzielczości izolowanych kompleksów5, 6, w tym wirusów7,8, białek błonowych9, 10, struktur helikalnych11 oraz innych dynamicznych i heterogennych kompleksów makromolekularnych12, 13, których rozmiary różnią się o rzędy wielkości (od 39 kDa14, 15 do dziesiątek megadaltonów). W niniejszym opracowaniu opisano protokół standardowego procesu cryoEM SPA, obejmujący etapy od przygotowania próbki po wyznaczenie struktury.
Przed rozpoczęciem tej procedury oczyszczoną próbkę należy poddać analizie biochemicznej w celu oceny szans na sukces w dalszych etapach. Przygotowanie odpowiedniej próbki jest prawdopodobnie największą barierą w SPA, szczególnie w przypadku kompleksów przejściowych i heterogenicznych (zarówno pod względem składu, jak i konformacji). Preparat kompleksu makromolekularnego powinien zawierać jak najmniej zanieczyszczeń, znajdować się w stężeniu wystarczającym do uzyskania wielu cząsteczek na każdej mikrografii cryoEM oraz w składzie buforu dobrze dostosowanym do analizy cryoEM. Niektóre składniki buforu, w tym sacharoza, glicerol oraz wysokie (&#62; 350 mM) stężenia soli, w zależności od wielkości próbki, jej właściwości i innych składników buforu, mogą zakłócać proces witryfikacji lub obniżać stosunek sygnału do szumu na obrazach, co utrudnia wyznaczenie struktury16.
Zazwyczaj, w ramach minimum, do oceny czystości próbki należy wykorzystać chromatografię wykluczania cząsteczkowego (SEC) oraz analizę żelową SDS-PAGE17, 18, jednak dichroizm kołowy, testy funkcjonalne, SEC sprzężona z wielokątnym rozpraszaniem światła oraz testy stabilności termicznej stanowią przydatne narzędzia do analizy jakościowej preparatów kompleksów makromolekularnych przed analizą cryoEM. Niemniej jednak wyniki tych analiz biochemicznych mogą dostarczyć niewielkiej wiedzy na temat heterogeniczności strukturalnej próbki i jej zachowania na siatce do cryoEM. Z tego powodu EM z barwieniem negatywowym jest rutynowo stosowane jako szybkie, tanie i skuteczne narzędzie do oceny heterogeniczności składu i konformacji, a tym samym stanowi dobry sposób na ustalenie, która frakcja elucji z procesu oczyszczania jest najbardziej obiecująca lub do screeningu różnych składów buforów19, 20. Po zidentyfikowaniu obiecującej próbki można przejść do procedury SPA cryoEM. Barwienie negatywowe nie zawsze pokrywa się z późniejszymi wynikami uzyskanymi w cryoEM; czasami próbka wygląda słabo w barwieniu negatywowym, ale jej jakość poprawia się w lodzie witryfikowanym w cryoEM. Z kolei niektóre próbki wyglądają doskonale podczas etapów barwienia negatywowego, lecz wymagają znacznej dalszej optymalizacji przy przejściu do cryoEM. Jednak w większości przypadków barwienie negatywowe stanowi przydatny etap kontroli jakości.
Witryfikacja 
Surowe warunki panujące w systemie próżniowym mikroskopu elektronowego powodują zarówno dehydratację, jak i uszkodzenia radiacyjne nieutrwalonych preparatów biologicznych21. Dlatego, aby obrazować próbkę w stanie zbliżonym do naturalnego, preparat biologiczny musi zostać zakonserwowany przed obrazowaniem. W przypadku oczyszczonych preparatów kompleksów makromolekularnych, witryfikacja jest preferowaną metodą umożliwiającą ich wizualizację za pomocą cryoEM przy jednoczesnym zachowaniu szczegółów atomowych kompleksu. Odkrycie witryfikacji jako metody przygotowania próbek stanowiło fundamentalny postęp w mikroskopii elektronowej preparatów biologicznych, za co Dubochet został uhonorowany Nagrodą Nobla w dziedzinie chemii w 2017 roku. Witryfikacja próbki polega na stworzeniu cienkiej warstwy roztworu zawierającego badany preparat, zazwyczaj o grubości kilkudziesięciu nm, zawieszonej na siatce wspierającej do cryoEM. Cienka warstwa jest następnie zamrażana niezwykle szybko w kriogenie, takim jak ciekły etan w temperaturze ~-175 °C. Szybkość zamrażania wynosi ~106 °C/s, co jest wystarczająco szybkie, aby utworzył się lód amorficzny, czyli szklisty, zawieszający preparat w cienkiej, stałej warstwie22.
Pierwszą zmienną, którą należy rozważyć, jest wybór nośnika siatki do cryoEM23. Siatka EM zazwyczaj składa się z amorficznej folii węglowej z perforacjami (regularnymi lub nieregularnymi), naniesionej na strukturę wsporczą. Struktura wsporcza to zazwyczaj kolista metalowa siatka o średnicy 3,05 mm, najczęściej wykonana z miedzi, choć można stosować inne metale, takie jak złoto lub molibden (który posiada korzystne właściwości rozszerzalności cieplnej24). Czasami na całej siatce nanosi się dodatkowy cienki, ciągły nośnik, taki jak grafen, tlenek grafenu lub cienka (~1-2 nm) warstwa węgla amorficznego. Choć w ogromnej większości opisanych do tej pory struktur stosowano standardowe siatki cryoEM (najczęściej miedziane 400-200 mesh z perforowanym nośnikiem węglowym – choć dostępne jest wiele różnych wzorów; otwory okrągłe o średnicy 1,2 µm oddzielone 1,3 µm węgla (r1.2/1.3) lub 2 µm oddzielone 2 µm węgla (r2/2)), doniesiono o nowych technologiach siatek o poprawionej przewodności i zredukowanym ruchu preparatu25. Wybrane siatki poddaje się obróbce wyładowaniem żarowym/czyszczeniu plazmowemu, aby uczynić je hydrofilowymi i podatnymi na aplikację próbki26.
Po wyładowaniu żarowym kolejnym etapem jest formowanie cienkiej warstwy. Cienką warstwę najczęściej tworzy się przy użyciu papieru filtrującego w celu usunięcia nadmiaru cieczy z siatki. Choć czynność tę można wykonać ręcznie, w sprzedaży dostępnych jest wiele urządzeń do mrożenia w technice plunge freezing, w tym Vitrobot Mk IV (Thermo Fisher Scientific), EM GP II (Leica) oraz CP3 (Gatan). W urządzeniach tych na siatkę EM nakłada się ~3-5 µL próbki w roztworze, a następnie usuwa nadmiar roztworu za pomocą papieru filtrującego. Siatkę z zawieszoną na niej cienką warstwą zanurza się następnie w etanie w stanie ciekłym, schłodzonym ciekłym azotem (LN2) do temperatury ~-175 °C. Po zamrożeniu siatkę utrzymuje się w temperaturze poniżej punktu dewitryfikacji (-137 °C) przed obrazowaniem oraz w jego trakcie.
Przesiewanie preparatów i zbieranie danych 
Po witryfikacji siatki do cryoEM kolejnym etapem jest przesiewanie siatki w celu oceny jej jakości oraz ustalenia, czy nadaje się ona do wysokorozdzielczego zbierania danych. Idealna siatka do cryoEM posiada lód witryfikowany (w przeciwieństwie do lodu krystalicznego) o grubości wystarczającej jedynie do pomieszczenia najdłuższego wymiaru preparatu, co zapewnia, że otaczający lód wprowadza jak najmniej szumu do otrzymanego obrazu. Cząsteczki w lodzie powinny mieć rozmiar i (jeśli jest znany) kształt zgodny z danymi biochemicznymi, a idealnie powinny być monodyspersyjne z losową dystrybucją orientacji cząsteczek. Wreszcie, siatka powinna posiadać wystarczającą liczbę obszarów odpowiedniej jakości, aby zrealizować zamierzony czas zbierania danych. W zależności od preparatu może to wymagać wielu iteracji witryfikacji i przesiewania, aż do uzyskania optymalnych siatek. Zarówno na szczęście, jak i na nieszczęście, istnieje ogromna liczba zmiennych, które można testować empirycznie w celu zmiany dystrybucji cząsteczek na siatkach cryoEM (przegląd w16,27). W niniejszym opracowaniu przedstawiono reprezentatywne wyniki dla projektu dotyczącego białka błonowego10.
Po zidentyfikowaniu odpowiedniej siatki można przystąpić do gromadzenia danych. Kilka modeli krio-transmisyjnych mikroskopów elektronowych do preparatów biologicznych jest zoptymalizowanych pod kątem automatycznego gromadzenia danych o wysokiej rozdzielczości. Zazwyczaj dane są zbierane na systemach 300 kV lub 200 kV. Automatyczne gromadzenie danych można zrealizować przy użyciu oprogramowania takiego jak EPU (Thermo Fisher Scientific)28, Leginon29, JADAS30&#160;oraz SerialEM31, 32. Automatyczne gromadzenie danych z użyciem nowoczesnych detektorów zazwyczaj skutkuje uzyskaniem terabajtów (TB) surowych danych w ciągu 24 h (średnie zestawy danych mają rozmiar ~ 4 TB).
Ze względu na ograniczenia związane z COVID-19 obowiązujące w wielu częściach świata (stan na grudzień 2020 r.), wiele ośrodków mikroskopowych przeszło na system zdalnego dostępu. Po załadowaniu siatek do autoloadera mikroskopu, akwizycja danych może być prowadzona zdalnie.
Przetwarzanie obrazów i budowanie modelu 
Podczas gdy sesja zbierania danych trwa zazwyczaj od 0,5 do 4 dni, późniejsze przetwarzanie obrazów może zająć wiele tygodni i miesięcy, w zależności od dostępności zasobów obliczeniowych. Standardem jest, aby wstępne etapy przetwarzania obrazów, a mianowicie korekcja ruchu i estymacja funkcji przenoszenia kontrastu (CTF), odbywały się „w locie” 33, 34. Do dalszego przetwarzania dostępnych jest wiele pakietów oprogramowania. Cząstki są „wybierane” (picking) i ekstrahowane z mikrografii35, 36. Po ekstrakcji cząstek standardowy protokół polega na poddaniu ich kilku rundom klasyfikacji (zarówno w dwóch wymiarach (2D), jak i trzech wymiarach (3D) i/lub w skupieniu na konkretnych obszarach zainteresowania), aby uzyskać jednorodny podzbiór cząstek. Ten jednorodny podzbiór cząstek jest następnie uśredniany w celu stworzenia rekonstrukcji 3D. Na tym etapie dane są często dodatkowo korygowane, aby uzyskać mapę o najwyższej możliwej jakości, na przykład poprzez udoskonalenie CTF, korekcje zniekształceń37&#160;oraz polerowanie bayesowskie (Bayesian polishing)38&#160;. Wynikiem tego przetwarzania obrazów jest 3D mapa cryoEM badanego preparatu biologicznego. Zakres rozdzielczości osiągany w „standardowym” zautomatyzowanym eksperymencie pojedynczych cząstek z siatki o wystarczającej jakości, przy danych zebranych na systemie mikroskopowym 300 kV, wynosi zazwyczaj od 10 Å do 2 Å, w zależności od rozmiaru i elastyczności kompleksu białkowego. Przy idealnym preparacie, stosując workflow SPA, osiągnięto obecnie rozdzielczości rzędu ~1,2 Å5. Choć niniejszy protokół szczegółowo opisuje kroki prowadzące do uzyskania mapy gęstości EM, po jej otrzymaniu można ją dalej interpretować poprzez dopasowanie i udoskonalanie modelu białka (jeśli rozdzielczość jest &#60; 3,5 Å) lub budowanie de novo39. Dane związane z eksperymentami określania struktury mogą być deponowane w publicznych repozytoriach online, w tym mapy gęstości EM (Electron Microscopy Data Bank)40, wynikowe współrzędne atomowe (Protein Data Bank)41&#160;oraz surowe zestawy danych (Electron Microscopy Public Image Archive)42.
W niniejszym protokole jako przykładowy kompleks makromolekularny wykorzystano kompleks białek błony zewnętrznej RagAB (~340 kDa) z Porphyromonas gingivalis10 (EMPIAR-10543). Dla osób rozpoczynających pracę z cryoEM, wsparcie w przygotowaniu próbek w ramach tego procesu – od próbki do struktury – jest dostępne, po przejściu recenzji, poprzez finansowane programy dostępu, takie jak iNEXT Discovery oraz Instruct.

<table><tbody><tr><td>pęseta</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5022</td><td></td></tr><tr><td>Okrągłe pudełko do przechowywania Cryo EM</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3736</td><td></td></tr><tr><td>Pudełka z autosiatką CryoEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1084591</td><td></td></tr><tr><td>Siatki CryoEM</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>Etan</td><td>Boc</td><td>270595-F</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; pianka dewar</td><td>Agar Scientific</td><td>AG81760-500</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; przechowywanie dewar</td><td>Worthington industries</td><td>HC 34</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet</td><td>Gilson</td><td>10082012</td><td></td></tr><tr><td>Star</td><td>labs</td><td>s1111-1706</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka</td><td>BD</td><td>BD 300869</td><td></td></tr><tr><td>Woda laboratoryjna typu II</td><td>Suez</td><td>select fusion</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td> Bibuła filtracyjna <td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Zespół pojemników styrophome Vitrobot</td><td>Pęsety ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU</td><td>Serwer TEM ThermoFisher Scientific</td><td>2.8.1.10REL</td><td></td></tr><tr><td>ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>6.15.3.22415REL</td><td></td></tr><tr><td>Tia</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>5.0.0.2896REL</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Titan Krios</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

Mikroskopia krioelektronowa (cryoEM) to potężna technika określania struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą analizy pojedynczych cząstek (SPA). Cały proces polega na i) zeszkleniu próbki w cienkiej warstwie umieszczonej na siatce krioelektromagnetycznej; (ii) badanie przesiewowe próbki w celu oceny rozmieszczenia cząstek i jakości lodu; (iii) jeżeli siatka jest odpowiednia, gromadzenie zbioru danych dotyczących pojedynczych cząstek do analizy; oraz iv) przetwarzanie obrazu w celu uzyskania mapy gęstości EM. W tym protokole znajduje się przegląd każdego z tych kroków, ze szczególnym uwzględnieniem zmiennych, które użytkownik może modyfikować podczas przepływu pracy, oraz rozwiązywania typowych problemów. W związku z tym, że zdalna obsługa mikroskopu staje się standardem w wielu obiektach, opisane zostaną różne warianty protokołów obrazowania, które pomagają użytkownikom w wydajnej pracy i obrazowaniu, gdy fizyczny dostęp do mikroskopu jest ograniczony.

Podczas screeningu siatki mogą zostać odrzucone na etapie tworzenia atlasu, gdy cechy widoczne przy niskim powiększeniu wskazują, że siatka nie nadaje się do akwizycji danych. Przykładem jest sytuacja, w której siatka uległa znacznym uszkodzeniom mechanicznym i większość pól siatki jest pęknięta (Rysunek 2A), lub gdy siatka wydaje się być „sucha”, bez lodu witryfikowanego (Rysunek 2B). Takie siatki są zazwyczaj możliwe do zidentyfikowania, ponieważ krawędzie pól siatki wydają się ostre i wyraźne. W większości siatek przygotowanych za pomocą urządzenia do mrożenia przez zanurzenie obserwuje się gradient lodu (Rysunek 2C,D). Rozkład cząsteczek, w zależności od badanego preparatu, może drastycznie różnić się wraz z grubością lodu, dlatego zaleca się screening wielu pól siatki w celu oceny rozkładu cząsteczek. W oprogramowaniu EPU, podczas etapu screeningu atlasu, zaimplementowano narzędzia pomagające użytkownikowi zidentyfikować pola siatki o podobnej lub różnej grubości lodu, co może być szczególnie pomocne dla osób rozpoczynających pracę z siatkami do cryoEM (Rysunek 2E, F).
<img alt="Rycina 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg" /> 
Rycina 2: Przykładowe montaże „atlasu” o niskim powiększeniu z sesji przesiewowych. A) Siatka, która uległa znacznym uszkodzeniom, przy czym większość pól siatki jest pęknięta – nieodpowiednia do zbierania danych. B) Sucha siatka bez lodu witryfikowanego – nieodpowiednia do zbierania danych. C) Siatka wykazująca gradient lodu, z ok. 50% powierzchni nadającej się do użytku. D) Gradient lodu z ok. 33% powierzchni siatki nadającej się do użytku. Zarówno C, jak i D nadają się do zbierania danych, jeśli użyteczne pola siatki mają grubość lodu odpowiednią do akwizycji, a liczba obszarów akwizycji jest wystarczająca, aby spełnić minimalny czas zbierania danych (np. 24 h). E) Przykładowy atlas z różnymi grubościami lodu. F) Ten sam atlas przedstawiony w E, ale z polami siatki skategoryzowanymi i pokolorowanymi przez oprogramowanie EPU zgodnie z grubością lodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Podczas oceny rozkładu cząstek należy upewnić się, że parametry obrazowania, takie jak powiększenie i całkowna dawka elektronów, są zbliżone do tych, których planuje się użyć podczas akwizycji danych, aby uzyskać wierny obraz oczekiwanych wyników. Podczas przeglądu idealny rozkład cząstek powinien być monodyspersyjny, z widocznym zakresem orientacji cząstek (zależnie od próbki i istniejącej wiedzy na temat morfologii cząstek, może to być trudne do ustalenia) (Rycina 3A). Lód powinien być tak cienki, jak to możliwe, przy jednoczesnym pomieszczeniu największego wymiaru cząstek; jeśli lód jest zbyt cienki, może ulec stopieniu pod wpływem wiązki elektronów. Powoduje to nadmierny ruch na mikrografii, a obszary wykazujące tę charakterystykę należy pomijać (Rycina 3B). Z doświadczenia wynika, że efekt ten najczęściej występuje, gdy w buforze znajduje się detergent. Może to prowadzić do powstania bardzo cienkiego lodu w centrum&#160;otworu, przez co cząstki mogą zostać fizycznie wykluczone i wypchnięte w stronę krawędzi. Efekt ten widoczny jest na Rycynie 3C, jednak w tym przypadku nie jest on ekstremalny i takie obrazy nadal mogłyby użytecznie wnieść wkład do zbioru danych. Wreszcie, lód musi być amorficzny; z akwizycji danych należy wykluczyć wszelkie obszary siatki (lub siatek), w których większość lub wszystkie wykonane obrazy wykazują lód krystaliczny (Rycina 3D). Często lód nieamorficzny obserwuje się na krawędziach pól siatki. W celu uzyskania dalszych informacji czytelników odsyłamy do szczegółowych przeglądów zmiennych, które można modyfikować podczas witryfikacji siatki16, oraz do opisów zachowania cząstek w środowisku cienkiej warstwy46, 47&#160;.
<img alt="Rysunek 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg" /> 
Rysunek 3: Reprezentatywne mikrografie przedstawiające różne rozkłady cząsteczek. A) „Idealny” rozkład monodyspersyjnych cząsteczek przyjmujących różne orientacje. B) Zbyt cienki lód w środku otworu, który odkształca się pod wpływem wiązki elektronów, powodując nadmierny ruch na mikrografii. Efekt ten obserwuje się najczęściej w przypadku obecności detergentu w buforze. C) Gdy lód jest cieńszy w centrum otworu, fizycznie wypycha to cząsteczki z centrum, powodując ich zagęszczenie przy krawędzi otworu. W tym przypadku zjawisko nie jest na tyle silne, aby uniemożliwić wykorzystanie tych obrazów, ale sugeruje to, że warto przeszukać obszary o nieco większej grubości. D) Lód nie jest witryfikowany; dane nie powinny być zbierane z obszarów wyglądających jak na tej przykładowej mikrografii. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
Przetwarzanie obrazów w czasie rzeczywistym pozwala na wykrywanie błędów i problemów z akwizycją danych, dlatego jest zawsze zalecane, gdy tylko jest to możliwe. Na przykład nadmierny ruch na mikrografiach może wskazywać na aktywność pompy turbo autoloadera lub na to, że dane są zbierane z pękniętego pola siatki, w którym lód przesuwa się znacząco w wiązce elektronów, co oznacza, że pole to należy pominąć. Estymacja CTF w czasie rzeczywistym może ujawnić sytuacje, w których zastosowano dodatnią wartość punktu ostrości (zamiast defokusowania) (przy użyciu programów i parametrów do estymacji CTF służących do znajdowania tych punktów) oraz określić przesunięcie fazowe w przypadku zastosowania płytek fazowych Volta48&#160;. Potoki przetwarzania obrazów w czasie rzeczywistym często zawierają graficzne podsumowanie danych (Rycina 4A), aby ułatwić użytkownikom szybką ocenę jakości mikrografii i decyzję, czy konieczne są korekty w procesie zbierania danych.
Wybór cząsteczek z mikrografii, przy jednoczesnym unikaniu „fałszywie dodatnich” wyników, takich jak zanieczyszczenia czy folia wspierająca siatkę, może wymagać optymalizacji. Jednak programy do wyboru cząsteczek, takie jak crYOLO, często działają wystarczająco dobrze przy użyciu domyślnych parametrów podczas „pierwszego przejścia” przez dane (Rycina 4B), co umożliwia przejście do uśredniania klas 2D, gdzie łatwiej jest ocenić jakość danych i prawdopodobieństwo sukcesu w dalszych etapach. W większości projektów klasyfikacja 2D ~&#62; 10 tys. cząsteczek powinna zacząć ujawniać klasy posiadające szczegóły struktury drugorzędowej. Aby przejść do etapu 3D, etap klasyfikacji 2D powinien zazwyczaj ujawnić klasy reprezentujące szereg orientacji cząsteczek. Jeśli ujawniona zostanie orientacja preferencyjna, może być wymaganych więcej iteracji przygotowania próbki16 lub dalsza akwizycja danych z próbką nachyloną49. Do analizy 3D należy wybrać wszystkie klasy wykazujące szczegóły struktury drugorzędowej, natomiast cząsteczki „śmieciowe” należy odrzucić (Rycina 4C).
<img alt="Rycina 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg" /> 
Rycina 4: Początkowe etapy przetwarzania obrazów. A) Wynik działania skryptu do przetwarzania obrazów w czasie rzeczywistym („on the fly”). B) Przykładowa mikrografia (po lewej) z odpowiednio automatycznie wybranymi cząsteczkami zidentyfikowanymi przy użyciu ogólnego modelu crYOLO (po prawej, cząsteczki obramowane czerwonymi kwadratami). Paski skali (białe) wynoszą 50 nm. C) Wyniki klasyfikacji 2D pokazujące klasy, które zostały odrzucone (w czerwonym kwadracie), oraz klasy, z których wybrano cząsteczki do dalszego przetwarzania (w kolorze zielonym). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
Mały podzbiór cząsteczek można wykorzystać do wygenerowania modelu początkowego (Rysunek 5A). Model ten może następnie posłużyć jako model startowy w klasyfikacji 3D i udoskonalaniu (refinement). W przypadku RagAB zestaw danych zawierał trzy odrębne konformery, które można rozdzielić podczas klasyfikacji 3D (Rysunek 5B). Cząsteczki przypisane do każdej z tych klas mogą być następnie przetwarzane niezależnie i wykorzystane do udoskonalenia mapy gęstości EM, która może być następnie poddana dalszej interpretacji i budowie modelu.
<img alt="Rysunek 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg" /> 
Rysunek 5: Generowanie trójwymiarowej mapy gęstości EM. A) Typowy model początkowy wygenerowany przy użyciu programu RELION. B) Klasyfikacja 3D na 5 klas wykazująca podział cząsteczek na trzy odrębne stany konformacyjne: otwarty-otwarty (zielony), otwarty-zamknięty (niebieski), zamknięty-zamknięty (fioletowy). C) Proces tworzenia maski. Mapę z udoskonalenia 3D (lewo) należy zwizualizować w programie Chimera. Następnie można użyć przeglądarki wolumetrycznej do zidentyfikowania najniższego progu, przy którym mapa jest wolna od rozłączonej, szumowej gęstości (środek). Wartość tego progu jest wprowadzana jako początkowy próg binaryzacji w zadaniu tworzenia maski w programie RELION. Przykład wyjściowej maski pokazano na kolor szary (prawo). D) Wysokorozdzielcza mapa gęstości EM stanu otwartego-zamkniętego RagAB (EMD-10245), przefiltrowana i pokolorowana według lokalnej rozdzielczości (Å).&#160;<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

Analiza kriogeniczna pojedynczych cząstek stała się rutynową techniką w zestawie narzędzi biologów strukturalnych, mającą zastosowanie do szerokiej gamy próbek, w tym białek błonowych, włókienek amyloidowych, białek wiążących kwasy nukleinowe i wirusów. Po zakończeniu przygotowywania próbki i załadowaniu siatek do mikroskopu, zbieranie danych można przeprowadzić zdalnie w wielu obiektach kriogenicznych, takich jak Astbury Biostructure Laboratory i eBIC. Główne przeszkody w pomyślnym określeniu struktury często leżą na etapach przygotowania próbki i przesiewania siatki, przy czym czasami w tym procesie wymagane jest wiele iteracji.W tym miejscu zademonstrujemy zdalne przesiewanie sieci i pozyskiwanie danych o pojedynczych cząstkach. Na karcie automatycznego ładowania w interfejsie użytkownika mikroskopu wyjdź z okna dialogowego opcji za pomocą strzałki i naciśnij przycisk inwentaryzacji. Spowoduje to sekwencyjne sprawdzenie każdej pozycji w kasecie, aby określić, czy wkład jest obecny.Ekwipunek będzie uruchamiany w każdym miejscu po kolei. Gdy wszystkie zajęte miejsca zostaną zmapowane, ekwipunek zostanie zatrzymany. Podświetl siatkę, która ma zostać przeniesiona do kolumny mikroskopu, i kliknij przycisk Załaduj.Etykieta miejsca zmieni kolor z niebieskiego na żółty po pomyślnym załadowaniu siatki na scenę. Aby prześwietlić siatki, otwórz oprogramowanie EPU. Na stronie przygotowania wybierz optykę i ustawienia akwizycji, a następnie wybierz ustawienie atlasu z menu rozwijanego.Wybierz odpowiednie ustawienia wiązki i naciśnij set, aby przesunąć parametry do mikroskopu. Naciśnij, aby otworzyć zawory kolumny i włóż sitko przeciw grypie. Sprawdź, czy wiązka jest widoczna i wystarczająco rozproszona i wyśrodkowana, aby zakryć detektor.W razie potrzeby przejdź do cieńszego obszaru siatki za pomocą joysticka lub wirtualnych paneli dłoni, aby sterować ruchami stage w X i Y.Podnieś ekran grypy i zrób zdjęcie za pomocą przycisku podglądu w EPU. W EPU przejdź do strony atlasu i naciśnij nową sesję. Wybierz format obrazu MRC i wprowadź odpowiednią nazwę folderu oraz lokalizację, w której chcesz zapisać sesję przesiewową, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.Wybierz selekcję z menu po lewej stronie. Zaznacz pola wyboru obok każdej siatki, aby uzyskać montaż atlasu, a następnie rozpocznij sesję przesiewową w EPU. Dla każdej zaznaczonej siatki pobierany jest atlas, a dostępne kwadraty siatki są wyświetlane po ukończeniu.Każdy atlas można przeglądać, podświetlając go na stronie projekcji. Po zakończeniu przejrzyj zebrane atlasy i zidentyfikuj siatki odpowiednie do oceny jakości próbki przy większych powiększeniach. Podświetl wybraną siatkę w menu rastrowania EPU i kliknij przycisk załaduj próbkę.Z menu rastrowania atlasu wybierz aktualnie załadowaną siatkę i przenieś scenę do kwadratu siatki zawierającego wypełnione otwory, klikając prawym przyciskiem myszy żądane miejsce na obrazie siatki i wybierając tutaj przesuń scenę. Wróć do strony przygotowania EPU i wybierz ustawienie kwadratu siatki. Otwórz stronę automatycznych funkcji EPU i uruchom auto-eucentryczność przez pochylenie stolika z ustawionym kwadratem siatki, aby przesunąć próbkę na wysokość eucentryczną.Przygotowując EPU, zrób nowy obraz podglądu kwadratu siatki. Zwróć uwagę na szare wartości na różnych otworach, wskazujące na różną grubość lodu. Przesuń scenę nad otwór za pomocą prawego przycisku myszy i przesuń scenę tutaj.Wybierz ustawienie predefiniowane wysokości otworu lub eucentryczności, a następnie kliknij przycisk Podgląd. Wybierz ustawienie akwizycji danych i ustaw powiększenie, które umożliwia łatwą identyfikację cząstek. Ustaw przesunięcie rozmycia na minus od trzech do pięciu mikrometrów.Wykonaj iteracje w celu ponownej oceny zakresu grubości lodu pod kątem rozkładu cząstek, orientacji i zanieczyszczenia w siatce. W zależności od dostępności mikroskopu, przejdź bezpośrednio do zbierania danych lub siatki mogą zostać usunięte z mikroskopu w celu ich zebrania w przyszłości, w tym w innych miejscach. Zbierz atlas, jeśli nie jest on dostępny podczas selekcji, konfigurując ustawienia atlasu i wybierając siatkę, aby uzyskać atlas.Pobierz atlas i kliknij lokalizację siatki, aby zobaczyć dane wyjściowe. Po ukończeniu atlasu zdefiniuj każde z ustawień wstępnych wiązki zgodnie z eksperymentalnymi potrzebami projektu. Wykonaj kalibrację przesunięcia obrazu.Skonfiguruj sesję EPU, wybierając konfigurację sesji na stronie EPU, a następnie wybierając opcję Nowa sesja lub Nowa z preferencji. Po wybraniu nowej sesji pojawi się wyskakujące okienko z opcją skorzystania z poprzednich ustawień. Ustawienia zostaną automatycznie załadowane od poprzedniej do bieżącej sesji EPU.Możesz też wybrać nowy z preferencji i wybrać plik z zapisanymi preferencjami, aby wstępnie załadować te informacje do bieżącego pliku EPU. Wpisz nazwę sesji czymś informacyjnym. W polu Typ wybierz opcję ręcznie.W trybie akwizycji wybierz dokładne centrowanie otworów lub szybszą akwizycję, jeśli dostępna i pożądana jest kolekcja przesunięć obrazu bez aberracji. Wybierz żądany format obrazu, a następnie wybierz folder przechowywania, a EPU utworzy katalog z nazwą sesji. Wybierz odpowiednią siatkę, zgodnie z którą używany jest rozstaw otworów w siatce, i naciśnij Zastosuj.Wybierz początkowy kwadrat siatki i ustaw szablon przejęcia. Przejdź do zaznaczenia kwadratu. Jeśli wszystkie kwadraty są zielone, kliknij odznacz wszystkie w lewym górnym rogu.Otwórz kafelki, klikając prawym przyciskiem myszy, a następnie wybierając polecenie Otwórz kafelek. Dodaj lub wybierz kwadrat siatki, klikając przycisk Zaznacz, a następnie klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając polecenie przenieś scenę do kwadratu siatki. Przejdź do wyboru otworów i naciśnij auto-eucentryczny.Poczekaj, aż zostanie zrobione zdjęcie kwadratu siatki. Jeśli funkcja automatyczna nie powiedzie się, może to być spowodowane tym, że wysokość jest znacznie obniżona. Można go regulować ręcznie za pomocą ekranu przeciw grypie w powiększeniu siatki kwadratowej.Aby zmierzyć rozmiar otworu, przesuń i dostosuj żółte kółka tak, aby znajdowały się nad otworami o odpowiednim rozmiarze i odstępach. Naciśnij przycisk Znajdź otwory. Sprawdź, czy otwory zostały znalezione prawidłowo.Jeśli nie, zmień rozmiar otworu i ponownie naciśnij przycisk znajdź otwory. Jeśli ten proces konsekwentnie kończy się niepowodzeniem, rozważ przejście do niższej liczby lub jaśniejszego rozmiaru plamki przy powiększeniu siatki do kwadratu. Użyj histogramu jakości lodu filtra po prawej stronie, aby dostosować wybór otworu.Może to być przydatne do wykluczenia obszarów z grubym lodem i cienkim lodem. Zostanie to zapamiętane dla przyszłych kwadratów siatki wybranych podczas sesji. Zoptymalizuj wybór otworów za pomocą narzędzi w menu wyboru u góry.Na przykład kliknij przycisk Usuń otwory w pobliżu paska siatki. Przejdź do definicji szablonu i naciśnij pobierz. Kliknij przycisk znajdź i wyśrodkuj otwór.Zmień opóźnienie po przesunięciu sceny i opóźnienie po przesunięciu obrazu na jedną do pięciu sekund, a następnie, jeśli to możliwe, sprawdź, czy maksymalna wartość przesunięcia obrazu jest zgodna z potrzebami. Kliknij dodaj obszar akwizycji i kliknij w dowolnym miejscu obrazu. Przenieś obszar pozyskiwania do żądanej lokalizacji.Dodaj zakres rozmycia w prawym górnym rogu. Typowa lista rozmycia dla projektu białka błonowego to rozogniskowanie od minus 0,8 do minus trzech mikrometrów, a następnie dodanie innych obszarów akwizycji, układając je tak, aby obszary akwizycji nie były podwójnie naświetlone wiązką. Kliknij dodaj obszar autofokusa i kliknij w dowolnym miejscu obrazu.Przesuń obszar autofokusa na węgiel otaczający otwór. Standardową praktyką jest automatyczne ustawianie ostrości po wyśrodkowaniu podczas korzystania z AFIS lub co pięć do 15 mikrometrów, w zależności od zmiany wysokości Z w poprzek kwadratu. Kliknij dodaj obszar pomiaru dryfu.Pomiar dryfu wykonywany raz na kwadrat siatki z ustawionym progiem 0,05 nanometra na sekundę jako ustawieniem standardowym. Obszar pomiaru dryftu może pokrywać się bezpośrednio z obszarem autofokusa. Upewnij się, że ani dryf, ani obszar autofokusa nie nakładają się na obszar akwizycji.Wróć do wyboru kwadratów i wybierz kwadraty do przejęcia na siatce. Użyj liczby obszarów pozyskiwania i oczekiwanej szybkości pozyskiwania danych, aby przewidzieć, ile obszarów pozyskiwania jest wymaganych. Po wybraniu wszystkich żądanych kwadratów naciśnij przycisk przygotuj wszystkie kwadraty.Po zebraniu każdego kwadratu nawiguj między kwadratami siatki i dostosuj otwory za pomocą pędzla wyboru. Przejdź do miejsca na stole montażowym nad próbką i użyj funkcji automatycznych, aby ustawić wysokość eucentryczną. Wykonaj wyrównanie mikroskopu za pomocą oprogramowania mikroskopowego, jak opisano wcześniej i w tekście.Wykonaj wyrównanie bez komy w funkcjach automatycznych przed ponownym włożeniem i wyśrodkowaniem przysłony obiektywu oraz korekcją astygmatyzmu soczewki obiektywu za pomocą EPU. Upewnij się, że oba wyrównania zbiegają się w odpowiednich wartościach. Przed rozpoczęciem automatycznego przebiegu akwizycji upewnij się, że pompa turbo automatycznej ładowarki jest wyłączona, a w razie potrzeby włożony jest otwór obiektywu.W przypadku automatycznego pozyskiwania naciśnij przycisk start run, aby rozpocząć automatyczne pobieranie danych. Korzystając z tego protokołu, uszkodzone lub wysuszone siatki mogą być przesiewane i odrzucane na etapie atlasu. Na większości siatek obserwuje się gradient lodu.Podczas przesiewania idealny rozkład cząstek jest monorozproszony z widocznym zakresem orientacji cząstek. Jeśli lód jest zbyt cienki, może się stopić po oświetleniu wiązką elektronów, powodując nadmierny ruch na mikrofotografii. Jest to najczęściej obserwowane, gdy w buforze znajduje się detergent.Lód musi być szklisty, więc obszary siatki, w których większość zdjęć pokazuje lód krystaliczny, zostały wykluczone. Dołączono graficzne podsumowanie danych w celu oceny jakości mikrofotografii i podjęcia decyzji, czy wymagane są zmiany w zbiorze danych. Zbieracze cząstek, takie jak crYOLO, działają wystarczająco dobrze dla pierwszego przejścia danych, umożliwiając przejście do uśredniania klas 2D.Klasy, które pokazują szczegóły struktury drugorzędnej, powinny być wybrane do analizy 3D, a cząstki śmieci powinny zostać odrzucone. Podzbiór cząstek można wykorzystać do wygenerowania początkowego modelu do klasyfikacji i udoskonalenia 3D. W przypadku RagAB zbiór danych zawierał trzy odrębne konformery, które można rozdzielić podczas klasyfikacji 3D.Należy pamiętać, że sukces na etapie pozyskiwania danych i późniejszej analizy obrazu zależy od uzyskania i zidentyfikowania dobrze zoptymalizowanych siatek na etapie przesiewowym. Po uzyskaniu mapy gęstości 3D EM można ją dalej interpretować poprzez dopasowanie i udoskonalenie modelu białka lub zbudowanie modelu atomowego de novo. Analiza pojedynczych cząstek Cryo-EM umożliwia ustrukturyzowane określenie wielu celów, które wcześniej nie były możliwe.Warto zauważyć, że te przepływy pracy zostały ostatnio wykorzystane do rozwiązywania struktur makrocząsteczek związanych z COVID-19.

single-particle-cryo-electron-microscopy-from-sample-to-structure

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Przedstawiono instrument i metody do przygotowania objętości próbek o rozmiarach nanolitrów do transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Nie są wymagane żadne etapy papierowego blottingu, co pozwala uniknąć szkodliwych konsekwencji, jakie może to mieć dla białek, znacznie zmniejszając utratę próbki i umożliwiając analizę lizatu pojedynczej komórki do wizualnej proteomiki.

Zminiaturyzowane przygotowanie próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Analiza pojedynczych cząstek w mikroskopii krioelektronowej jest jedną z głównych technik używanych do określania struktury zespołów biologicznych w wysokiej rozdzielczości. Scipion dostarcza narzędzia do stworzenia całego procesu przetwarzania informacji uzyskanych przez mikroskop i uzyskania rekonstrukcji 3D próbki biologicznej.

Cryo-EM i analiza pojedynczych cząstek za pomocą Scipion

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Ten artykuł opisuje, jak efektywnie wykorzystać trzy platformy przetwarzania cryo-EM, tj. cryoSPARC v3, RELION-3 i Scipion 3, aby stworzyć pojedynczy i solidny przepływ pracy mający zastosowanie do różnych zestawów danych o pojedynczych cząstkach do określania struktury w wysokiej rozdzielczości.

Solidny przebieg przetwarzania w mikroskopii krioelektronowej jednocząsteczkowej (cryo-EM) z cryoSPARC, RELION, i Scipion

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Obecny protokół opisuje uogólniony i łatwy do wdrożenia schemat zbierania danych o pojedynczych cząstkach w eksperymentach kriogenicznych. Taka procedura jest szczególnie przydatna do uzyskania wysokiej jakości mapy EM dla próbek cierpiących na odchylenie preferencyjnej orientacji ze względu na przyleganie do granicy faz powietrze-woda.

Zbieranie danych Cryo-EM z pojedynczymi cząstkami z pochyleniem stolika przy użyciu Leginon

Ten protokół przedstawia praktyczną metodę wykorzystującą Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) jako przykład rozwiązania problemu nierównomiernego rozkładu cząstek poprzez optymalizację przygotowania próbki, stanowiąc punkt odniesienia dla badaczy do efektywnego wyjaśniania struktur makromolekularnych za pomocą kriogenicznej mikroskopii elektronowej (cryo-EM).

Optymalizacja przygotowania próbek do kriogenicznej mikroskopii elektronowej

Ten artykuł przedstawia protokół do przetwarzania obrazów cryo-EM za pomocą pakietu oprogramowania SPHIRE. Obecny protokół może być stosowany do prawie wszystkich projektów EM pojedynczych cząstek, które są ukierunkowane na rozdzielczość bliską atomowi.

Analiza pojedynczych cząstek w wysokiej rozdzielczości na podstawie obrazów kriomikroskopii elektronowej przy użyciu SPHIRE

Poznaj mikroskopię krioelektronową pojedynczych cząstek w biologii strukturalnej. Naucz się przygotowywania próbek, selekcji siatek i zdalnej akwizycji danych dla kompleksów makromolekularnych.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Przeglądaj więcej filmów