Name: Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj protokół mikroiniekcji zarodków skoczka kukurydzianego Peregrinus maidis do edycji genomu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia tworzenie stabilnych linii mutacyjnych i transformację zarodkową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

North Carolina State University, Department of Entomology and Plant Pathology, jest częścią zespołu wspierającego program DARPA Insect Allies Program. Wyrażone poglądy, opinie i/lub ustalenia są poglądami autorów i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące oficjalne poglądy lub politykę Departamentu Obrony lub rządu Stanów Zjednoczonych. Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. MDL, DR i AEW wymyśliły projekt i zapewniły pozyskanie funduszy, administrację projektu i zasoby. FC, WK, NG i MDL wymyśliły i zaprojektowały eksperymenty z mikroiniekcją; OH wymyślił i zaprojektował metodę składania jaj. FC i WK przeprowadziły eksperymenty; FC i WK przeanalizowały wyniki; a FC, WK, NG i MDL napisały manuskrypt. Autorzy pragną złożyć specjalne podziękowania Kyle'owi Sozanskiemu i Victorii Barnett za ich pomoc w utrzymaniu kolonii P. maidis.

1. Hodowla dorosłych P. maidis na poziomie kolonii
<ol>
	<li>Posadź co najmniej cztery doniczki kukurydzy tygodniowo na klatkę hodowlaną, po 3-4 nasiona w doniczce. Rosną w środowisku wolnym od owadów.</li>
	<li>Gdy rośliny osiągną wiek ~5 tygodni, umieść je w klatce o wymiarach 30 cm x 30 cm x 60 cm.</li>
	<li>Uzyskaj wystarczającą ilość dorosłych P. maidis (~500) z laboratorium badawczego lub na wolności i umieść w klatce odpornej na owady z 9-12 roślinami kukurydzy (3-4 doniczki).</li>
	<li>Utrzymuj kolonię w inkubatorze do hodowli owadów w temperaturze 25 °C (± 1 °C), przy wilgotności co najmniej 70% i cyklu świetlnym 14:10.</li>
	<li>Aby wygenerować kolonię skalibrowaną pod względem wieku, usuń wszystkie początkowe dorosłe osobniki po czterech dniach składania jaj i pozwól zarodkom złożonym w klatce wykluć się i naturalnie się zestarzeć.</li>
	<li>Przenieś 5-tygodniowe owady P. maidis (dorosłe) do świeżych roślin kukurydzy w celu cotygodniowej subkultury, zbierając je za pomocą aspiratora (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Następnie wypuść dorosłe osobniki do czystej klatki ze świeżymi roślinami kukurydzy. Aby utrzymać stały dopływ młodych dorosłych do celów eksperymentalnych, co tydzień przygotowuj świeże klatki skalibrowane pod kątem wieku.</li>
	<li>Podlewaj doniczki w klatkach dwa razy dziennie. Okresowo przycinaj łodygi, usuwaj rozkładający się materiał roślinny i w razie potrzeby zastępuj świeżymi doniczkami z kukurydzą. 
	UWAGA: Przy odpowiednim utrzymaniu kolonia może trwać ~5 tygodni (tj. wystarczająco długo, aby zarodki złożone w klatce mogły stać się dorosłe).</li>
</ol>
2. Komora do składania jaj na bazie agarozy
<ol>
	<li>Przygotować naczynia do zbierania jaj (podłoże do składania jaj), wlewając 1% w/v agarozy do wody do czystych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm. Po zestaleniu się podłoża do składania jaj przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotuj 10% w/v roztwór sacharozy do karmienia dorosłych. Roztwór sacharozy należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca.</li>
	<li>Zrób komorę do trzymania dorosłych, wycinając otwór w dnie kubka o pojemności 1 uncji (patrz Tabela Materiałów) i przyklejając ekran do wymiany powietrza (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Pokrój plastikową folię parafinową na kwadraty o wymiarach 5 cm x 5 cm; odłóż 2 kwadraty na każdą filiżankę.</li>
	<li>Zbierz ~15 1-tygodniowych dorosłych samic z kolonii P. maidis skalibrowanej pod względem wieku. Aby wybrać samice, zbadaj brzuszną stronę brzucha i poszukaj pokładełka, które jest zazwyczaj ciemniejsze niż reszta brzucha (<silna klasa = "xfig">Ryc. 3). Dorosłe osobniki należy przechowywać do jednej godziny w stożkowej fiolce o pojemności 15 ml w przypadku ustawiania wielu komór do składania jaj. Przed dobraniem płci owady należy krótko schłodzić na lodzie i przenieść do pojemnika dla dorosłych. 
	UWAGA: To badanie można wykonać bez mikroskopu. Dorosłe samice, które miały czas na karmienie i kopulację, zazwyczaj mają również większe brzuchy niż dorosłe samce i są bardziej posłuszne; W związku z tym można je łatwiej wybrać z populacji klatkowej.</li>
	<li>Przenieś samice do dorosłego pojemnika i zamknij kubek 1 warstwą plastikowej folii wosku parafinowego, równomiernie rozciągając ją 3-4 razy w stosunku do pierwotnego rozmiaru (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4A, B).</li>
	<li>Nałóż 400 μl 10% w/v roztworu sacharozy na wierzch plastikowej uszczelki z wosku parafinowego i dodaj drugą warstwę plastikowej folii parafinowej, rozciągając plastikową folię parafinową dokładnie tak, jak powyżej (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 4C,D). 
	UWAGA: Kanapka z rozciągniętą plastikową folią parafinową zwiększa ciśnienie roztworu sacharozy, co jest bardzo ważne w przypadku karmienia dorosłych, ale nie zapobiegnie samicom przed przebiciem pokładełek aż do podłoża do składania jaj.</li>
	<li>Umieść komorę dla dorosłych na naczyniu do zbierania jaj stroną z plastikową folią parafinową bezpośrednio na podłożu do składania jaj i owiń całą komorę do składania jaj folią spożywczą, nie zakrywając otworów wentylacyjnych, ponieważ są one wymagane do wymiany powietrza (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 5).</li>
	<li>Inkubować każdą komorę składania jaj w temperaturze 25 °C przy wilgotności 70% i cyklu świetlnym 14:10.</li>
	<li>Codziennie zmieniaj kanapkę z plastikowej folii parafinowej i 10% w/v roztworu sacharozy i usuń wodę, która gromadzi się wewnątrz kubka.</li>
</ol>
3. Pobieranie i wyrównywanie zarodków w środowisku o wysokiej wilgotności
<ol>
	<li>Zainstaluj system mikroiniekcji oparty na mikroskopie stereoskopowym w wilgotnym pomieszczeniu lub okapie (nawilżony kaptur; <silna klasa="xfig">Rysunek 6) aby zapewnić, że środowisko pracy osiąga co najmniej 70% wilgotności podczas całego procesu mikroiniekcji.</li>
	<li>Sprawdź podłoże do składania jaj pod kątem jaj po pożądanym okresie składania jaj. Zrób to w wilgotnym okapie lub innym wilgotnym środowisku. 
	UWAGA: Okres składania jaj zwykle trwał noc, od 18:00 do 10:00 rano, trwając ~16 godzin.</li>
	<li>Jeśli jakieś jaja zostaną złożone w agarozie, użyj cienkich kleszczy, aby ostrożnie je wykopać i umieść je na powierzchni agarozy, aby były wilgotne (<silna klasa = "xfig">Rysunek 7A).</li>
	<li>Nałóż pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 mm x 15 mm na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 mm x 30 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 7B). Umieść szkiełko nakrywkowe taśmą do góry na podłożu do składania jaj (Rysunek 7C).</li>
	<li>Podnieś każde jajko z powierzchni agaru i przenieś na dwustronną taśmę za pomocą cienkiej szczoteczki. Usuń wszystkie jaja, które są całkowicie białe lub mają na sobie czarne zabarwienie. Zdrowe jaja będą półprzezroczyste.</li>
	<li>Jajka w kształcie banana ułożyć na boku, z większym końcem przyklejonym do dwustronnej taśmy (<silna klasa="xfig">Rysunek 7D). 
	UWAGA: Zawsze przechowuj jaja w środowisku o wysokiej wilgotności, takim jak szalka Petriego odlana z warstwą 1% agaru na dnie.</li>
</ol>
4. Przygotowanie odczynników CRISPR i igieł iniekcyjnych
<ol>
	<li>Wyciągnij igły kwarcowe za pomocą ściągacza do mikropipet typu Flaming/Brown.</li>
	<li>Ukosuj igły kwarcowe za pomocą ukosowarki do mikropipet.</li>
	<li>Użyj dwustronnej taśmy klejącej, aby zabezpieczyć wyciągnięte igły w przezroczystym pojemniku, takim jak szalka Petriego, aż będą gotowe do użycia.</li>
	<li>Przygotować roztwór do wstrzykiwań, łącząc 0,5 μl białka Cas9 (5 μg/μl roztworu podstawowego) i 0,5 μl sgRNA (4 μg/μl roztworu podstawowego; patrz tabela materiałów) z 1 μl buforu czerwieni fenolowej w końcowej objętości 5 μl. Aby wytrącić cząstki, które mogłyby zatkać igłę, należy krótko wymieszać roztwór i wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością.</li>
	<li>Wypełnić igłę do wstrzykiwań, uważając, aby pozostawić mieszankę do wstrzykiwań w pobliżu zwężającego się końca igły. Usunąć pęcherzyki powietrza, jeśli występują, z końcówki igły.</li>
	<li>Ostrożnie umieścić wypełnioną igłę w uchwycie igły i dokręcić kołnierz ze stali nierdzewnej, aby bezpiecznie utrzymać igłę na miejscu podczas mikroiniekcji.</li>
	<li>Wygeneruj niezawodny przepływ roztworu iniekcyjnego z igły, delikatnie głaszcząc ściętą końcówkę drobnym, zwilżonym pędzlem, jednocześnie dostarczając impulsy ciśnienia powietrza do igły za pomocą systemu iniekcyjnego. 
	UWAGA: Igła jest gotowa do wstrzyknięcia, gdy mieszanka iniekcyjna może opuścić końcówkę w małych ilościach.</li>
</ol>
5. Mikroiniekcja i pielęgnacja po iniekcji
<ol>
	<li>Przygotować platformę do mikroiniekcji, wypełniając czystą szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm 1% agarem, aby utworzyć równą warstwę agaru, która jest równo z górną częścią naczynia.</li>
	<li>Umieść wcześniej przygotowane szkiełko nakrywkowe z ~25 zarodkami na platformie agarowej (<klasa silna="xfig">Rysunek 8A). 
	UWAGA: Wszystkie etapy iniekcji muszą być wykonywane wewnątrz nawilżonego okapu (~70% wilgotności).</li>
	<li>Sprawdzić ciśnienie iniekcji, umieszczając końcówkę igły w kropli wody i rozpoczynając cykl wstrzykiwania. 
	UWAGA: Niewielka ilość roztworu do wstrzykiwań powinna rozproszyć się w wodzie, jeśli ustawienie ciśnienia jest prawidłowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 8B).</li>
	<li>Wbić igłę w większy koniec zarodka, zbliżając się od lewej strony szkiełka nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 8C). Dostarczyć roztwór do wstrzykiwań do komórki jajowej i szybko wyciągnąć igłę.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich jaj umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni nowego naczynia z 1% agaru i przenieś naczynie do komory wilgotnościowej (<silna klasa = "xfig">Rysunek 9).</li>
</ol>
6. Inkubacja i wylęg zarodków
<ol>
	<li>Umieścić komorę wylęgową w inkubatorze o temperaturze 25 °C na 6 dni.</li>
	<li>Przenieść wszystkie ocalałe zarodki, używając czystej wody i cienkiej szczoteczki, na szalkę Petriego o wymiarach 35 mm x 10 mm z bibułą filtracyjną zwilżoną wodą, pokrywającą dno szalki. Uszczelnić szalkę Petriego folią z wosku parafinowego z tworzywa sztucznego i utrzymać w temperaturze 25 °C, aby umożliwić wylęg zarodków. Badanie zarodków należy rozpocząć 6 dni po wstrzyknięciu pod kątem przeżycia. 
	UWAGA: Pierwsze nimfy w stadium rozwojowym zaczną się wykluwać około 8 dnia.</li>
	<li>Przenieś nimfy za pomocą cienkiego pędzelka na szalkę Petriego zawierającą ścinki liści. Przykryj naczynie i uszczelnij plastikową folią z wosku parafinowego.</li>
	<li>Inkubować zamknięte naczynie piskląt na sadzonkach liści przez 48 godzin w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Przenieś wszystkie 2-dniowe nimfy z serii wstrzyknięć do klatki hodowlanej z roślinami kukurydzy za pomocą cienkiej szczotki. Jeśli wstrzyknięte osoby z widocznym fenotypem zostaną odzyskane w wystarczającej liczbie, należy je hodować oddzielnie, aby zmaksymalizować odzyskanie cechy docelowej w następnym pokoleniu. W przeciwnym razie należy przeprowadzić masowe krycie wszystkich wstrzykiwaczy. 
	UWAGA: Pisklęta należy delikatnie umieszczać w okółku kukurydzy, aby zapewnić schronienie i zapewnić odpowiednią wilgotność w ich najbliższym otoczeniu.</li>
	<li>Hoduj owady w warunkach opisanych powyżej, zapewniając odpowiednią temperaturę, wilgotność i regularne przenoszenie na świeże rośliny kukurydzy.</li>
	<li>Badanie przesiewowe potomstwa pod kątem oczekiwanych fenotypów. Umieść osobniki wykazujące pożądany fenotyp w ich własnej klatce, aby ustalić linie homozygotyczne.</li>
</ol>

<ol><li>Namba, R., Higa, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+studies+of+the+corn+planthopper%2C+Peregrinus+maidis+%28Ashmead%29+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Hawaiian+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">Host plant studies of the corn planthopper, Peregrinus maidis (Ashmead) in Hawaii.</a> Proceedings of the Hawaiian Entomological Society. 21, 105-108 (1971).</li>
<li>Singh, B. U., Seetharama, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+plant+interactions+of+the+corn+planthopper%2C+Peregrinus+maidis+Ashm.%28Homoptera%3A+Delphacidae%29+in+maize+and+sorghum+agroecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod-Plant+Interactions%22%5BJournal%5D)">Host plant interactions of the corn planthopper, Peregrinus maidis Ashm.(Homoptera: Delphacidae) in maize and sorghum agroecosystems.</a> Arthropod-Plant Interactions. 2 (3), 163-196 (2008).</li>
<li>Tsai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occurrence+of+a+corn+disease+in+Florida+transmitted+by+Peregrinus+maidis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Reporter%22%5BJournal%5D)">Occurrence of a corn disease in Florida transmitted by Peregrinus maidis.</a> Plant Disease Reporter. 59 (10), 830-833 (1975).</li>
<li>Chelliah, S., Basheer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+studies+of+Peregrinus+maidis+%28Ashmead%29+%28Araeopidae%3A+Homoptera%29+on+sorghum%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Biological studies of Peregrinus maidis (Ashmead) (Araeopidae: Homoptera) on sorghum.</a> Indian Journal of Entomology. 27, 466-471 (1965).</li>
<li>Lastra, J., Esparza, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplication+of+vesicular+stomatitis+virus+in+the+leafhopper+Peregrinus+maidis+%28Ashm.%29%2C+a+vector+of+a+plant+rhabdovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Multiplication of vesicular stomatitis virus in the leafhopper Peregrinus maidis (Ashm.), a vector of a plant rhabdovirus.</a> Journal of General Virology. 32 (1), 139-142 (1976).</li>
<li>Nault, L. R., Ammar, E. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leafhopper+and+planthopper+transmission+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Leafhopper and planthopper transmission of plant viruses.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 503-529 (1989).</li>
<li>Ammar, E. -D., Tsai, C. -W., Whitfield, A. E., Redinbaugh, M. G., Hogenhout, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+aspects+of+rhabdovirus+interactions+with+insect+and+plant+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular aspects of rhabdovirus interactions with insect and plant hosts.</a> Annual Review of Entomology. 54, 447-468 (2009).</li>
<li>Barandoc-Alviar, K., Ramirez, G. M., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+acquisition+and+titer+of+Maize+mosaic+rhabdovirus+in+its+vector%2C+Peregrinus+maidis+%28Hemiptera%3A+Delphacidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Analysis of acquisition and titer of Maize mosaic rhabdovirus in its vector, Peregrinus maidis (Hemiptera: Delphacidae).</a> Journal of Insect Science. 16 (1), 14(2016).</li>
<li>Tsai, J. H., Steinberg, B., Falk, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+residual+effects+of+seven+insecticides+on+Dalbulus+maidis+%28Homoptera%3A+Cicadellidae%29+and+Peregrinus+maidis+%28Homoptera%3A+Delphacidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and residual effects of seven insecticides on Dalbulus maidis (Homoptera: Cicadellidae) and Peregrinus maidis (Homoptera: Delphacidae).</a> Journal of Entomological Science. 25 (1), 106-111 (1990).</li>
<li>Yao, J., Rotenberg, D., Afsharifar, A., Barandoc-Alviar, K., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+RNAi+methods+for+Peregrinus+maidis%2C+the+corn+planthopper%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of RNAi methods for Peregrinus maidis, the corn planthopper.</a> PloS One. 8 (8), 70243(2013).</li>
<li>Esvelt, K. M., Smidler, A. L., Catteruccia, F., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+technology%3A+concerning+RNA-guided+gene+drives+for+the+alteration+of+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Emerging technology: concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations.</a> Elife. 3, 03401(2014).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Yao, J., Rotenberg, D., Whitfield, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+maize+mosaic+virus+to+planthopper+vectors+by+microinjection+increases+infection+efficiency+and+facilitates+functional+genomics+experiments+in+the+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of maize mosaic virus to planthopper vectors by microinjection increases infection efficiency and facilitates functional genomics experiments in the vector.</a> Journal of Virological Methods. 270, 153-162 (2019).</li>
<li>Kimelman, D., Martin, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterior-posterior+patterning+in+early+development%3A+three+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Anterior-posterior patterning in early development: three strategies.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Developmental Biology. 1 (2), 253-266 (2012).</li>
<li>Mito, T., Nakamura, T., Noji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+insect+development%3A+to+the+hemimetabolous+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Evolution of insect development: to the hemimetabolous paradigm.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 20 (4), 355-361 (2010).</li>
<li>Grubbs, N., Haas, S., Beeman, R. W., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABCs+of+eye+color+in+Tribolium+castaneum%3A+orthologs+of+the+Drosophila+white%2C+scarlet%2C+and+brown+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The ABCs of eye color in Tribolium castaneum: orthologs of the Drosophila white, scarlet, and brown Genes.</a> Genetics. 199 (3), 749-759 (2015).</li>
<li>Xue, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+knockout+of+two+eye+pigmentation+genes+in+the+brown+planthopper%2C+Nilaparvata+lugens+%28Hemiptera%3A+Delphacidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated knockout of two eye pigmentation genes in the brown planthopper, Nilaparvata lugens (Hemiptera: Delphacidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 93, 19-26 (2018).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3998(2012).</li>
<li>Sanger, F., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+determining+sequences+in+DNA+by+primed+synthesis+with+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase.</a> Journal of Molecular Biology. 94 (3), 441-448 (1975).</li>
<li>Chu, F. C., Wu, P. S., Pinzi, S., Grubbs, N., Lorenzen, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%2C+embryos+for+germline+transformation%2C+or+CRISPR%2FCas9+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, embryos for germline transformation, or CRISPR/Cas9 genome editing.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57497(2018).</li>
<li>Brent, C. S., Hull, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-mediated+knockdown+of+eye+coloration+genes+in+the+western+tarnished+plant+bug+%28Lygus+hesperus+Knight%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Insect+Biochemistry+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">RNA interference-mediated knockdown of eye coloration genes in the western tarnished plant bug (Lygus hesperus Knight).</a> Archives of Insect Biochemistry and Physiology. 100 (2), 21527(2019).</li>
<li>Khan, S. A., Reichelt, M., Heckel, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+ABCs+of+eye+color+in+Helicoverpa+armigera+with+CRISPR%2FCas9-induced+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the ABCs of eye color in Helicoverpa armigera with CRISPR/Cas9-induced mutations.</a> Scientific Reports. 7 (1), 1-14 (2017).</li>
<li>Manghwar, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas+systems+in+genome+editing%3A+methodologies+and+tools+for+sgRNA+design%2C+off-target+evaluation%2C+and+strategies+to+mitigate+off-target+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Science%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas systems in genome editing: methodologies and tools for sgRNA design, off-target evaluation, and strategies to mitigate off-target effects.</a> Advanced Science. 7 (6), 1902312(2020).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jakość i wartości odżywcze jaj nieśnych Niedawno naukowcy pracujący z pokrewnym gatunkiem, Nilaparvata lugens, uzyskali jaja, których używali do mikroiniekcji, bezpośrednio z liścia, utrzymując wstrzyknięte jaja w tkance liścia do czasu wyklucia się17. Chociaż ta metoda oparta na liściach zapewniła bardziej naturalne środowisko do rozwoju embrionalnego, zwiększyła również ryzyko infekcji i uszkodzenia jaj podczas procesu usuwania. Przedstawiony tutaj system sztucznego składania jaj zapewnia bardziej jednolite środowisko i zmniejsza ryzyko uszkodzenia jaj podczas obchodzenia się z nimi. Dzięki ustawieniu miseczek do składania jaj w piątek, większość jaj z jaj została zebrana w ciągu typowego tygodnia pracy, z korzyścią dla osób wykonujących prace związane z mikroiniekcją. Jednym zastrzeżeniem do tej metody jest jednak to, że brak składników odżywczych w diecie zawierającej 10% roztwór sacharozy ostatecznie wpłynie na zdrowie owadów, a samice w miseczkach zwykle zaczynają umierać już po 10 dniach. Jakość jaj również zaczyna spadać po 6 dniach, o czym świadczy wzrost liczby martwych lub niezdrowo wyglądających jaj. W związku z tym ważne jest, aby być selektywnym w stosunku do jaj używanych do mikroiniekcji i nie trzymać samic po 6 dniu.
Przeżywalność i wilgotność Dwa czynniki wydają się mieć kluczowe znaczenie dla przeżycia zarodka w procesie mikroiniekcji. Najtrudniejszym aspektem obchodzenia się z zarodkami P. maidis jest zapobieganie ich wysuszeniu po wyjęciu z pożywki do składania jaj i podczas mikroiniekcji. Ponieważ jaja są zwykle składane w tkance roślinnej, brakuje im odpowiedniej skorupy, aby zapobiec odwodnieniu. Nawet w nawilżonym kapturze z powodu wysuszenia gubiły się całe zestawy jaj. Jednak zbyt wysoka wilgotność może również wpływać na mikroiniekcje, jeśli woda gromadzi się na taśmie dwustronnej lub na lunecie. Niestety, odwodnienie jaj zwykle nie było łatwe do zauważenia podczas procesu mikroiniekcji i często wydawało się normalne aż do 2 lub 3 dni później, kiedy stały się całkowicie przezroczyste, nie wykazując żadnych oznak rozwoju.
Jakość igieł również wydaje się odgrywać ważną rolę w przetrwaniu. Igła powinna być skośna, aby zminimalizować niepotrzebne uszkodzenia jaja. Gdy igła jest zablokowana, użycie funkcji czyszczenia na wstrzykiwaczu podczas delikatnego głaskania końcówki igły zwilżonym pędzlem (patrz krok 4.7) zazwyczaj przywracało igłę do stanu funkcjonalnego. Niezależnie od tego, zaleca się umieszczanie tylko niewielkich ilości roztworu do wstrzykiwań (~0,25 μl) do każdej igły i zmienianie igły na nową igłę co kilka szkiełek (~50-60 jaj), aby zapewnić utrzymanie jakości igły przez cały proces wstrzykiwania.
Pomyślne generowanie fenotypu nokautującego Aby skutecznie przekształcić komórki rozrodcze, mikroiniekcje zarodków zwykle muszą być wykonane jak najwcześniej przed komórką. W zależności od gatunku owadów, okno czasowe na wykonanie mikroiniekcji waha się od zaledwie kilku godzin do nawet całego dnia 14,15,20. Nadal nie jest jasne, kiedy zarodki P. maidis ulegają celalizacji. Nokaut za pośrednictwem Cas9 testowano na zarodkach w wieku od 4 godzin po złożeniu jaj (pel) do nawet 16 godzin pel, a oczekiwane fenotypy obserwowano we wszystkich eksperymentach, co sugeruje, że wszystkie mikroiniekcje zostały wykonane w oknie preceluryzacji.
Ortolog genu koloru oczu, biały, P. maidis został wybrany, ponieważ oczekiwano, że fenotyp nokautu będzie łatwy do zbadania u osób otrzymujących zastrzyki ze względu na jego autonomiczną naturę komórkową. Rzeczywiście, zgodnie z oczekiwaniami, zarówno mozaikowe, jak i całkowite nokautowanie były wyraźnie identyfikowalne wśród zarodków otrzymujących mieszaninę iniekcyjną zawierającą Cas9 i prowadzące RNA. Niestety, nie wykluły się żadne iniekcje z całkowitym nokautem, a masowe krycie ocalałych iniekcji nie przyniosło potomstwa białookiego. Jednak później udało się wygenerować zmutowaną linię poprzez celowanie w inny gen (Klobasa i wsp., w toku). Sugerowałoby to, że niepowodzenie w ustaleniu linii białych mutantów jest najprawdopodobniej spowodowane albo efektami niecelowymi (tj. Cas9 przecinającymi ważne regiony w innym miejscu genomu) generującymi ściśle powiązaną mutację śmiertelną, albo nieprzewidywalną krytyczną rolą bieli u P. maidis.
Dane fenotypowe i molekularne (ryc. 8 i ryc. 9) potwierdzają, że w próbce wstrzykniętych zarodków powstał znaczny nokaut w białym locus, co skutkowałoby całkowitą utratą funkcji genu. Co więcej, podczas gdy mutacje u bieli są żywotne u niektórych gatunków, istnieje precedens, w którym zmniejszona aktywność bieli jest szkodliwa21,22. To powiedziawszy, nie można całkowicie wykluczyć efektów off-target. Przewidywanie prawdopodobnych nietrafionych celów wymaga dokładnych danych dotyczących sekwencji genomu23, co jest obecnie niemożliwe ze względu na obecny stan zasobów genomowych P. maidis. Niezależnie od tego, dzięki tym nowym metodom, testowanie innych genów docelowych może być przeprowadzone bez obaw, a nawet przejście do bardziej tradycyjnej transgenezy w celu wprowadzenia nowych narzędzi genetycznych do tego szkodliwego szkodnika.

Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest ważnym ekonomicznie szkodnikiem kukurydzy1,2,3. Powodują one bezpośrednie fizyczne uszkodzenia rośliny, zarówno podczas żerowania aparatem gębowym do przekłuwania i ssania, jak i podczas rozmnażania, gdy składają swoje zarodki bezpośrednio w tkance roślinnej2,4. Pomimo wielu dróg bezpośredniego uszkadzania upraw, największy wpływ tych owadów na zdrowie upraw jest pośredni, ponieważ działają jako wektor wirusa mozaiki kukurydzy (MMV) i wirusa pasiastego kukurydzy5,6. MMV jest zdolny do replikacji w ciele wektora P. maidis, co pozwala wirusowi przetrwać w poszczególnych owadach przez całe ich życie, dzięki czemu mogą one kontynuować rozprzestrzenianie wirusa na nowe rośliny żywicielskie7,8. Najczęstszymi metodami zwalczania P. maidis, a tym samym przenoszonych przez niego wirusów, są insektycydy.
Niestety, niewłaściwe zarządzanie tymi produktami spowodowało rozwój odporności u docelowego szkodnika, jak również zanieczyszczenie środowiska9. Dlatego potrzebne są nowe strategie, aby zmniejszyć straty w plonach spowodowane tą kombinacją owadów, wirusów i szkodników. Wcześniejsze prace wykazały, że interferencja RNA (RNAi) może być skuteczną metodą kontroli P. maidis, ponieważ są one podatne na obniżenie ekspresji genów nawet po spożyciu dwuniciowego RNA (dsRNA)10. Jednak najskuteczniejszym sposobem podawania dsRNA w terenie byłyby rośliny, którymi żywią się owady; W związku z tym uprawy mogą być nadal podatne na wszelkie wirusy, które owady już przenoszą. Wraz z pojawieniem się edycji genomu CRISPR/Cas9 możliwe są nowe strategie zwalczania szkodników, w tym oparty na Cas9 napęd genowy 11,12, które można wykorzystać do zmniejszenia wielkości populacji szkodników lub zastąpienia tej populacji osobnikami odpornymi na wirusy, które przenoszą.
Jednak rozwój i wdrożenie jakiegokolwiek rodzaju systemu napędu genowego będzie wymagało rozwoju technik transgenicznych. Takie metody nie były konieczne do przeprowadzenia eksperymentów z RNAi u P. maidis, ponieważ zakłada się, że dsRNA i/lub siRNA są w stanie przenikać przez błony komórkowe ze względu na wydajność RNAi u P. maidis10,13. Nie jest to prawdą w przypadku DNA i/lub białek stosowanych w tradycyjnej transgenezie lub w edycji genów opartej na Cas9, z których każde byłoby prekursorem do stworzenia owadów przenoszących napęd genowy. Aby dokonać edycji genów lub innych form transformacji linii zarodkowej, te DNA i białka są idealnie mikrowstrzykiwane do zarodków na etapie blastodermy syncytialnej, przed momentem, w którym zarodek owada się celularyzuje. Czas ma kluczowe znaczenie, ponieważ etap syncytialny jest najwcześniejszą częścią rozwoju14,15. Ponieważ samice P. maidis preferencyjnie składają jaja w tkance roślinnej, pobranie wystarczającej ilości zarodków przedkomórkowych do mikroiniekcji może być pracochłonne i czasochłonne. W związku z tym opracowano nowe techniki szybkiego pobierania i mikrowstrzykiwania zarodków P. maidis przed komórkowaniem.

<table><tbody><tr><td>1 oz Pojemniki</td><td>Dart</td><td>P100N</td><td>Pojemnik dla dorosłych do składania jaj</td></tr><tr><td>15 ml Rurki stożkowe</td><td>Olympus</td><td>Genesee 28-103</td><td>Służy jako probówka zbiorcza w konfiguracji aspiratora próżniowego</td></tr><tr><td>15 ml Probówki stożkowe</td><td>Olympus</td><td>Genesee 28-106</td><td>Do sporządzania 10% roztworu sacharozy i do trzymania dorosłych podczas schładzania przed badaniem przesiewowym</td></tr><tr><td>Aspirator</td><td>Bioquip</td><td>1135A</td><td>Do obsługi skoczków</td></tr><tr><td>Aspirator próżniowy</td><td>Fischer Technical</td><td>LAV-3</td><td>Odkurzacz do zasysania większej liczby owadów</td></tr><tr><td>Niebieskie światła LED Spectrum Home</td><td>Depot</td><td>GLP24FS/19W/LED</td><td>Oświetlenie do uprawy doniczkowych roślin kukurydzianych Zbiorniki żywią się</td></tr><tr><td>Cas9</td><td>TrueCut Cas9 Protein v2</td><td>A36498</td><td>Endonukleaza do cięcia genów skoczka</td></tr><tr><td>Przezroczyste rurki winylowe</td><td>Home Depot</td><td>3/8 cala ID x 1/2 cala OD x 10 stóp</td><td>Łączy rurkę zbiorczą z pompą w konfiguracji aspiratora próżniowego</td></tr><tr><td>Skoczki kukurydziane</td><td>Uniwersytet Stanowy Karoliny Północnej</td><td>Nie dotyczy Prośba</td><td>z laboratorium dr Anny Whitfield</td></tr><tr><td>Waciki</td><td>Genessee</td><td>51-101</td><td>Służy jako filtr/łapacz owadów w probówce zbiorczej w konfiguracji aspiratora próżniowego</td></tr><tr><td>Taśma dwustronna</td><td>Scotch Dwustronna taśma</td><td>NA</td><td>Trzymanie jaj do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Wczesny blask kukurydzy</td><td>Park Seed Company</td><td>05093-PK-N</td><td>Kukurydza do hodowli skoczków</td></tr><tr><td>epTIPS Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Końcówki do napełniania igłami</td></tr><tr><td>System mikroiniekcji Femtojet</td><td>Eppendorf</td><td>5247</td><td>Kontroluje ciśnienie wtrysku (12-20 psi, w zależności od wielkości otworu igły)</td></tr><tr><td>Nutri-Fly Drosophila Agar</td><td>Genessee</td><td>66-103</td><td>Podłoże do wszystkiego oprócz naczynia do składania jaj</td></tr><tr><td>Drobne kleszcze</td><td>Bioquip</td><td>4731</td><td>Obchodzenie się z jajami</td></tr><tr><td>ogólnego przeznaczenia LE Agarose</td><td>Apex</td><td>20-102</td><td>Podłoże i naczynie do składania jaj (podłoże do składania jaj)</td></tr><tr><td>Przewodnik RNA 1 - GGUUCAUCGCAAAAUAGCAG</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)</td><td>Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene</td></tr><tr><td>Guide RNA 2 - UCUGAAAUCACUGGCCAAUA</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)</td><td>Przewodniki RNA do celowania w skoczka roślinnego white gene</td></tr><tr><td>Przewodnik RNA 3 - GAGGGCAGAGUCUCGCUUUCUU</td><td>Synthego</td><td>CRISPRevolution sgRNA EZ Kit (1,5 nmol)</td><td>Prowadnice RNA do celowania w skoczek roślinny white gene</td></tr><tr><td>Nawilżacz</td><td>Homedics</td><td>UHE-CM45</td><td>Do dostarczania wilgoci w nawilżanym kapturze</td></tr><tr><td>Komora wilgotnościowa</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td>Do przetrzymywania wstrzykniętych zarodków do czasu wyklucia</td></tr><tr><td>Klatki do hodowli owadów</td><td>Bioquip (na specjalne zamówienie)</td><td>Blisko 1450 l (ma plastikowy przód i boki z siatki)</td><td>Klatka dla skoczków na kukurydzy</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz Micropipiette</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-2000/G</td><td>Do wytwarzania igieł iniekcyjnych / Ciepło = 700, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 170, PUL = 160</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Stereoskop fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>M165 FC</td><td>Przesiewanie skoczków roślinnych</td></tr><tr><td>Zakres mikroiniekcji</td><td>Leica</td><td>MZ12-5</td><td>Luneta do mikroiniekcji wyposażona w stolik XY</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Do pozycjonowania igły do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Skośnik do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>FG-BV10-D</td><td>Do ukosowania igieł iniekcyjnych / Używana płytka o "drobnym" stopniu pod kątem 20& stopni</td></tr><tr><td>Stolik</td><td>mikroskopowy AmScope</td><td>GT100 X-Y Stół ślizgowy</td><td>Do pozycjonowania i przenoszenia zarodków pod mikroskopem</td></tr><tr><td>Miniaturowy pędzel do malowania</td><td>Testor #2 8733</td><td>Sprzedawane w 3 opakowaniach 281206</td><td>Drobne pędzle do obróbki zarodków</td></tr><tr><td>Uchwyt na igły</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Do trzymania igły do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Percival</td><td>I41VLH3C8</td><td>Odchów iniekcji do momentu wyklucia</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100 x 15 mm)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Przygotowanie naczynia agarowego do składania jaj</td></tr><tr><td>pGEM-T Zestaw do klonowania Easy Vector System I</td><td>Promega</td><td>A1360</td><td>Klonowanie Pm biały miejsce docelowe</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Bufor do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Zwykły mikroskop Szkiełka podstawowe lub szkiełko nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Trzymaj jaja do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Zymo</td><td>D4200</td><td>Oczyszczanie plazmidowych DNA gotowych do wstrzyknięcia</td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa</td><td>Pechiney Opakowanie z tworzywa sztucznego</td><td>PM-996</td><td>Rozmiar rolki 4 cale x 125 stóp</td></tr><tr><td>Folia</td><td>plastikowa Glad ClingWrap Folia</td><td>plastikowa NA</td><td>Owiń całą komorę składania jaj</td></tr><tr><td>Podkład - PmW CRISPR check F1 - AAGGAATTTCTGGAGGTGAAA</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA Oligo</td><td>Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white</td></tr><tr><td>Starter - PmW CRISPR check R1 - GATTCCTCGCTGTTGGGTGT</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA Oligo</td><td>Podkład pierwszej rundy do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white</td></tr><tr><td>Starter - PmW CRISPR check F3 - TCACAGACCCTGGTGCTAATC</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA Oligo</td><td>Starter drugiej rundy do amplifingu w miejscu docelowym w genie Pm white</td></tr><tr><td>Primemer - PmW CRISPR check R3 - GTCCACAATCCACACTTCTGA</td><td>IDT</td><td>25 nmole DNA Oligo Drugorundowy</td><td>podkład do amplifowania w miejscu docelowym w obrębie genu Pm white</td></tr><tr><td>Kapilary kwarcowe</td><td>Sutter Instruments</td><td>QF100-50-10</td><td>Do wykonywania igieł do mikroiniekcji / średnica zewnętrzna 1 mm, Średnica wewnętrzna 0,7 mm, długość 10 cm</td></tr><tr><td>Ekran (biała tkanina z organzy)</td><td>Joann Tkaniny</td><td>16023889</td><td>Do przykrycia pojemnika dla dorosłych</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Umyj naczynia</td></tr><tr><td>Sacharoza Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP220-1</td><td>Aby zrobić 10% roztwór sacharozy</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu crispr/cas9

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Skoczek kukurydziany, Peregrinus maidis, jest szkodnikiem kukurydzy i wektorem kilku wirusów kukurydzy. Wcześniej opublikowane metody opisują wyzwalanie interferencji RNA (RNAi) u P. maidis poprzez mikroiniekcję dwuniciowych RNA (dsRNA) nimfom i dorosłym osobnikom. Pomimo mocy RNAi, fenotypy generowane za pomocą tej techniki są przejściowe i nie mają długoterminowego dziedziczenia mendlowskiego. W związku z tym zestaw narzędzi P. maidis musi zostać rozszerzony o funkcjonalne narzędzia genomiczne, które umożliwiłyby produkcję stabilnych zmutowanych szczepów, otwierając naukowcom drzwi do wprowadzenia nowych metod zwalczania tego ważnego gospodarczo szkodnika. Jednak w przeciwieństwie do dsRNA używanych do RNAi, składniki używane w edycji genomu i transformacji linii zarodkowej opartej na CRISPR/Cas9 nie przenikają łatwo przez błony komórkowe. W rezultacie, plazmidowe DNA, RNA i/lub białka muszą zostać mikrowstrzyknięte do zarodków, zanim zarodek się uceluloaryzuje, co sprawia, że czas wstrzyknięcia jest krytycznym czynnikiem sukcesu. W tym celu opracowano metodę składania jaj na bazie agarozy, która umożliwia pobieranie zarodków od samic P. maidis w stosunkowo krótkich odstępach czasu. W niniejszym artykule przedstawiono szczegółowe protokoły pobierania i mikroiniekcji przedkomórkowych zarodków P. maidis ze składnikami CRISPR (nukleaza Cas9, która została skompleksowana z przewodnikowymi RNA), a także przedstawiono wyniki nokautu genu P. maidis w kolorze białym, opartego na Cas9. Chociaż protokoły te opisują edycję genomu CRISPR/Cas9 u P. maidis, mogą być również wykorzystywane do produkcji transgenicznego P. maidis poprzez transformację linii zarodkowej poprzez prostą zmianę składu roztworu do wstrzykiwań.

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the ...

Do tej pory CRISPR był używany tylko u kilku pluskwiaków. Przedstawiony tutaj protokół może pomóc naukowcom w zastosowaniu CRISPR i transformacji linii zarodkowej u innych gatunków pluskwiaków. Protokół ten został opracowany specjalnie dla zarodków owadów, które są wrażliwe na wysuszenie.Wiele etapów protokołu może potencjalnie poprawić wyniki w przypadku innych gatunków owadów. Zdolność do generowania transgenicznych skoczków otwiera drzwi dla nowatorskich metod kontroli, takich jak tworzenie owadów, które nie mogą już przenosić wirusów. Technika ta będzie rewolucyjna w badaniu funkcji genów u innych szkodników, takich jak wciornastki zachodnie.Dostosowaliśmy tę technikę CRISPR do zarodków wciornastków z obiecującymi wynikami. Uważamy, że praktyka w tym systemie jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu. Przedstawione tutaj metody, jeśli są wykonywane rutynowo, powinny pozwalać na elastyczne stosowanie w różnych ustawieniach.Aby zrobić komorę do przechowywania dorosłych owadów Peregrinus maidis, wytnij otwór w dnie jednouncjowego kubka i przyklej ekran do otworu w celu wymiany powietrza. W celu selekcji jednotygodniowych dorosłych samic owadów należy zassać kolonię do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na godzinę, a następnie krótko schłodzić owady na lodzie. Zidentyfikuj samice po obecności pokładełka, które jest zwykle ciemniejsze niż reszta brzucha, po brzusznej stronie brzucha.Przenieś samice do kubka podczas ich zbierania. Po wybraniu 15 samic zamknij kubek kawałkiem folii parafinowej o wymiarach pięć na pięć centymetrów. Nałóż 400 mikrolitrów 10% roztworu sacharozy na wierzch folii i umieść drugi kawałek folii o wymiarach pięć na pięć centymetrów na roztworze.Umieść komorę dla dorosłych na naczyniu do zbierania jaj tak, aby strona z folią z wosku parafinowego z tworzywa sztucznego miała bezpośredni kontakt z podłożem do składania jaj i owinąć całą komorę do składania jaj folią, nie zakrywając otworów wentylacyjnych. Następnie umieść komorę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 70% i 14-godzinnym świetle, 10-godzinnym cyklu ciemności. W celu pobrania zarodków, po pożądanym okresie składania jaj, należy nałożyć pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 na 15 milimetrów na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 30 milimetrów i umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu do składania jaj w komorze do składania jaj.Za pomocą cienkiej szczoteczki i mikroskopu preparacyjnego przenieś pojedyncze półprzezroczyste zarodki z powierzchni agaru na taśmę dwustronną. Po wybraniu około 25 zarodków ułóż zarodki w kształcie banana na bokach z większymi końcami przyklejonymi do taśmy. W przypadku mikroiniekcji zarodków, najpierw umieść szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 mililitrów, przepłukanej 1% agarem pod mikroskopem preparacyjnym wewnątrz nawilżonego kaptura.Aby sprawdzić ciśnienie wtrysku, umieść końcówkę kwarcowej igły iniekcyjnej w kropli wody i rozpocznij cykl wstrzykiwania. Po potwierdzeniu ustawienia ciśnienia, zbliżając się od lewej strony szkiełka nakrywkowego, wprowadzić igłę w większy koniec jednego zarodka. Dostarczyć roztwór do wstrzykiwań do komórki jajowej i szybko wyciągnąć igłę.Po wstrzyknięciu wszystkich jaj umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni nowego naczynia z 1% agarem i umieść naczynie w komorze wilgotnościowej. Po sześciu dniach użyj czystej wody i cienkiej szczoteczki, aby przenieść wszystkie ocalałe zarodki na szalkę Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającą zwilżoną wodą bibułę filtracyjną. Uszczelnij szalkę Petriego plastikową folią parafinową i umieść komorę wylęgową w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza.Po sześciu do ośmiu dniach za pomocą cienkiego pędzla przenieś pojawiające się nimfy w pierwszym stadium rozwoju na szalkę Petriego z wycinkami liści i uszczelnij naczynie plastikową folią z wosku parafinowego. Po 48 godzinach w temperaturze 25 stopni Celsjusza za pomocą cienkiego pędzla przenieś wszystkie dwudniowe nimfy do klatki hodowlanej z roślinami kukurydzy. Jeśli wstrzyknięte osoby z widocznym fenotypem zostaną odzyskane w wystarczającej liczbie, należy umieścić te owady w klatkach oddzielnie, aby zmaksymalizować odzyskanie cechy docelowej w następnym pokoleniu.Hoduj owady w odpowiednich warunkach temperatury i wilgotności, w razie potrzeby regularnie przenosząc je na świeże rośliny kukurydzy i regularnie badaj potomstwo pod kątem oczekiwanych fenotypów, umieszczając osobniki wykazujące pożądany fenotyp we własnych klatkach w celu ustanowienia linii homozygotycznych. W tej reprezentatywnej analizie w ciągu czterech tygodni zebrano łącznie 6 483 jaja od łącznie 645 samic. Samice zazwyczaj zaczynają składać jaja po dwóch dniach i dostarczają większość jaj od czwartego do szóstego dnia, przy czym aktywność składania jaj zwalnia w dziewiątym dniu.Wstrzyknięcie Cas9 nine nie wpływa na rozwój P.maidis, ponieważ tempo rozwoju zarodków leczonych buforem do iniekcji, buforem do iniekcji uzupełnionym Cas9 i buforem do iniekcji uzupełnionym Cas9 i trzema przewodnikowymi RNA jest podobne. Szybkości wylęgu dla bufora i kontrolek Cas9 są również podobne. Jednak wskaźniki wylęgu osobników otrzymujących mieszankę trzech przewodników są zazwyczaj stosunkowo niższe.W tym reprezentatywnym eksperymencie, spośród 71 osób, którym wstrzyknięto przewodnik, 23 wykazały pewien stopień utraty pigmentu, a dziewięć się wykluło, co spowodowało wskaźnik nokautu około 30% Oczekuje się, że mieszanka trzech przewodników usunie około 180 par zasad z białego locus, jak zaobserwowano w produktach PCR amplifikowanych z genomowego DNA wyizolowanego od osób, którym wstrzyknięto, a także w powiązanych danych sekwencyjnych generowanych z tych produktów. Zalecamy stosowanie igieł ze skosem, aby zminimalizować uraz po wstrzyknięciu. Jeśli wydaje się, że zarodki przeciekają po wstrzyknięciu, należy sprawdzić końcówki igieł, aby uzyskać lepsze wyniki.Dalsza praktyka zwiększy przeżywalność zarodków. Do tej pory nie ma publikacji opisujących transformację linii zarodkowej u Hemipterans. Użyliśmy jednak tego protokołu do stworzenia skoczków roślinnych wykazujących ekspresję Cas9.Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do przeprowadzania transformacji linii zarodkowej u pluskwiaków otwiera drzwi do szerokiego zakresu genetycznych strategii zwalczania szkodników, zmniejszając w ten sposób stosowanie insektycydów.

microinjection-corn-planthopper-peregrinus-maidis-embryos-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Poznaj protokół mikroiniekcji zarodków skoczka kukurydzianego Peregrinus maidis do edycji genomu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia tworzenie stabilnych linii mutacyjnych i transformację zarodkową.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów