Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Do tej pory CRISPR był używany tylko u kilku pluskwiaków. Przedstawiony tutaj protokół może pomóc naukowcom w zastosowaniu CRISPR i transformacji linii zarodkowej u innych gatunków pluskwiaków. Protokół ten został opracowany specjalnie dla zarodków owadów, które są wrażliwe na wysuszenie.

Wiele etapów protokołu może potencjalnie poprawić wyniki w przypadku innych gatunków owadów. Zdolność do generowania transgenicznych skoczków otwiera drzwi dla nowatorskich metod kontroli, takich jak tworzenie owadów, które nie mogą już przenosić wirusów. Technika ta będzie rewolucyjna w badaniu funkcji genów u innych szkodników, takich jak wciornastki zachodnie.

Dostosowaliśmy tę technikę CRISPR do zarodków wciornastków z obiecującymi wynikami. Uważamy, że praktyka w tym systemie jest niezbędna do osiągnięcia sukcesu. Przedstawione tutaj metody, jeśli są wykonywane rutynowo, powinny pozwalać na elastyczne stosowanie w różnych ustawieniach.

Aby zrobić komorę do przechowywania dorosłych owadów Peregrinus maidis, wytnij otwór w dnie jednouncjowego kubka i przyklej ekran do otworu w celu wymiany powietrza. W celu selekcji jednotygodniowych dorosłych samic owadów należy zassać kolonię do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów na godzinę, a następnie krótko schłodzić owady na lodzie. Zidentyfikuj samice po obecności pokładełka, które jest zwykle ciemniejsze niż reszta brzucha, po brzusznej stronie brzucha.

Przenieś samice do kubka podczas ich zbierania. Po wybraniu 15 samic zamknij kubek kawałkiem folii parafinowej o wymiarach pięć na pięć centymetrów. Nałóż 400 mikrolitrów 10% roztworu sacharozy na wierzch folii i umieść drugi kawałek folii o wymiarach pięć na pięć centymetrów na roztworze.

Umieść komorę dla dorosłych na naczyniu do zbierania jaj tak, aby strona z folią z wosku parafinowego z tworzywa sztucznego miała bezpośredni kontakt z podłożem do składania jaj i owinąć całą komorę do składania jaj folią, nie zakrywając otworów wentylacyjnych. Następnie umieść komorę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 70% i 14-godzinnym świetle, 10-godzinnym cyklu ciemności. W celu pobrania zarodków, po pożądanym okresie składania jaj, należy nałożyć pasek taśmy dwustronnej o wymiarach 1 na 15 milimetrów na szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na 30 milimetrów i umieścić szkiełko nakrywkowe na podłożu do składania jaj w komorze do składania jaj.

Za pomocą cienkiej szczoteczki i mikroskopu preparacyjnego przenieś pojedyncze półprzezroczyste zarodki z powierzchni agaru na taśmę dwustronną. Po wybraniu około 25 zarodków ułóż zarodki w kształcie banana na bokach z większymi końcami przyklejonymi do taśmy. W przypadku mikroiniekcji zarodków, najpierw umieść szkiełko nakrywkowe na szalce Petriego o wymiarach 100 na 15 mililitrów, przepłukanej 1% agarem pod mikroskopem preparacyjnym wewnątrz nawilżonego kaptura.

Aby sprawdzić ciśnienie wtrysku, umieść końcówkę kwarcowej igły iniekcyjnej w kropli wody i rozpocznij cykl wstrzykiwania. Po potwierdzeniu ustawienia ciśnienia, zbliżając się od lewej strony szkiełka nakrywkowego, wprowadzić igłę w większy koniec jednego zarodka. Dostarczyć roztwór do wstrzykiwań do komórki jajowej i szybko wyciągnąć igłę.

Po wstrzyknięciu wszystkich jaj umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni nowego naczynia z 1% agarem i umieść naczynie w komorze wilgotnościowej. Po sześciu dniach użyj czystej wody i cienkiej szczoteczki, aby przenieść wszystkie ocalałe zarodki na szalkę Petriego o wymiarach 35 na 10 milimetrów zawierającą zwilżoną wodą bibułę filtracyjną. Uszczelnij szalkę Petriego plastikową folią parafinową i umieść komorę wylęgową w inkubatorze o temperaturze 25 stopni Celsjusza.

Po sześciu do ośmiu dniach za pomocą cienkiego pędzla przenieś pojawiające się nimfy w pierwszym stadium rozwoju na szalkę Petriego z wycinkami liści i uszczelnij naczynie plastikową folią z wosku parafinowego. Po 48 godzinach w temperaturze 25 stopni Celsjusza za pomocą cienkiego pędzla przenieś wszystkie dwudniowe nimfy do klatki hodowlanej z roślinami kukurydzy. Jeśli wstrzyknięte osoby z widocznym fenotypem zostaną odzyskane w wystarczającej liczbie, należy umieścić te owady w klatkach oddzielnie, aby zmaksymalizować odzyskanie cechy docelowej w następnym pokoleniu.

Hoduj owady w odpowiednich warunkach temperatury i wilgotności, w razie potrzeby regularnie przenosząc je na świeże rośliny kukurydzy i regularnie badaj potomstwo pod kątem oczekiwanych fenotypów, umieszczając osobniki wykazujące pożądany fenotyp we własnych klatkach w celu ustanowienia linii homozygotycznych. W tej reprezentatywnej analizie w ciągu czterech tygodni zebrano łącznie 6 483 jaja od łącznie 645 samic. Samice zazwyczaj zaczynają składać jaja po dwóch dniach i dostarczają większość jaj od czwartego do szóstego dnia, przy czym aktywność składania jaj zwalnia w dziewiątym dniu.

Wstrzyknięcie Cas9 nine nie wpływa na rozwój P.maidis, ponieważ tempo rozwoju zarodków leczonych buforem do iniekcji, buforem do iniekcji uzupełnionym Cas9 i buforem do iniekcji uzupełnionym Cas9 i trzema przewodnikowymi RNA jest podobne. Szybkości wylęgu dla bufora i kontrolek Cas9 są również podobne. Jednak wskaźniki wylęgu osobników otrzymujących mieszankę trzech przewodników są zazwyczaj stosunkowo niższe.

W tym reprezentatywnym eksperymencie, spośród 71 osób, którym wstrzyknięto przewodnik, 23 wykazały pewien stopień utraty pigmentu, a dziewięć się wykluło, co spowodowało wskaźnik nokautu około 30% Oczekuje się, że mieszanka trzech przewodników usunie około 180 par zasad z białego locus, jak zaobserwowano w produktach PCR amplifikowanych z genomowego DNA wyizolowanego od osób, którym wstrzyknięto, a także w powiązanych danych sekwencyjnych generowanych z tych produktów. Zalecamy stosowanie igieł ze skosem, aby zminimalizować uraz po wstrzyknięciu. Jeśli wydaje się, że zarodki przeciekają po wstrzyknięciu, należy sprawdzić końcówki igieł, aby uzyskać lepsze wyniki.

Dalsza praktyka zwiększy przeżywalność zarodków. Do tej pory nie ma publikacji opisujących transformację linii zarodkowej u Hemipterans. Użyliśmy jednak tego protokołu do stworzenia skoczków roślinnych wykazujących ekspresję Cas9.

Ogólnie rzecz biorąc, zdolność do przeprowadzania transformacji linii zarodkowej u pluskwiaków otwiera drzwi do szerokiego zakresu genetycznych strategii zwalczania szkodników, zmniejszając w ten sposób stosowanie insektycydów.