Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Wykorzystanie izolowanych komórek zastawki myszy jest niezbędne do zbadania szlaku sygnałowego prowadzącego do zwapnienia zastawki w przypadku stosowania genetycznie zmodyfikowanych komórek myszy transgenicznych. Dwuetapowe trawienie jest szybką i skuteczną metodą. Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest izolacja zastawki aortalnej od myszy w wieku ośmiu tygodni

Lepiej jest ćwiczyć na starszych myszach, aby lepiej uwidocznić zastawkę aortalną. Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i miejsce pracy 70% etanolem i sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 30 minut. Kiedy wstępna konfiguracja jest gotowa, zacznij od oczyszczenia klatki piersiowej i okolicy brzucha ośmiotygodniowej myszy poddanej eutanazji za pomocą etanolu.

Za pomocą nożyczek otwórz brzuch i klatkę piersiową myszy, a następnie przetnij między lewym przedsionkiem a lewą komorą małymi nożyczkami chirurgicznymi. Usuń krew z serca, przetapiając 10 mililitrów zimnego PBS i przetnij serce, zachowując trzy milimetry aorty wstępującej. Pod mikroskopem stereoskopowym wypreparuj zastawkę aortalną, przecinając serce poziomo na środku komór i przecinając lewą komorę w kierunku aorty, a następnie ostrożnie wypreparuj zastawkę aortalną.

Połącz zawory razem w małym 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Umyj izolowane zawory w 75-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowych z pięcioma mililitrami świeżo przygotowanego 10-milimolowego zimnego HEPES, uzupełnionego antybiotykami i inkubuj w pięciu mililitrach kolagenazy typu jeden przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle wstrząsając. Po inkubacji odwirować probówkę przez pięć minut, przy 150 razy G i przemyć osad raz dwoma mililitrami 10-milimolowych HEPES, wirując z dużą prędkością przez 30 sekund.

Zbierz powstałą zawiesinę z probówki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego i za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie przenieś fragmenty tkanki do świeżej probówki. Następnie inkubować osad w 15-mililitrowej probówce z pięcioma mililitrami kolagenazy typu pierwszego w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem przez 35 minut. Oddzielić komórki przez ponowne zawieszenie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i odwirować przy 150 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Oczyść komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając oddzielony osad w dwóch mililitrach kompletnego DMEM i odwirowując w temperaturze 150 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do posiewu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnej pożywki i dodać go do jednego dołka sześciodołkowego naczynia do hodowli komórkowych w minimalnej ilości pożywki. Utrzymuj talerze w spokoju w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.

Po trzech dniach inkubacji potwierdź wzrost w pobliżu resztek tkanki, obserwując komórki pod mikroskopem. Gdy 1 000 komórek będzie widocznych, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień podłoże. Trypsynizuj komórki po osiągnięciu 70% konfluencji i przenieś je do 75-mililitrowej naczynia do hodowli tkankowej.

Przed rozpoczęciem testu należy oczyścić kaptur bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i podgrzać podłoże DMEM do 37 stopni Celsjusza. Następnie wysiewaj 100 000 komórek na warunki do sześciu dołków w kompletnym DMEM i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę sklarowaną pożywką wapniejącą i inkubować komórki przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wymieniając pożywkę trzeciego dnia.

Po siedmiu dniach zmierz stężenie wapnia w 96-dołkowej płytce za pomocą odczynnika Arsenazo III i zapisz absorbancję na 650 nanometrach. W reprezentatywnej analizie różne fenotypy komórek zastawki zidentyfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego po trzech do pięciu dniach hodowli. Mysie VIC wyrażają wimentynę i alfa SMA, znaczące markery komórek zastawki.

Dodatkowo, barwienie immunofluorescencyjne CD31 potwierdziło brak zanieczyszczenia komórkami śródbłonka w hodowli VIC. Hodowla VIC z bogatą w fosforany pożywką wapniową stymuluje zwapnienie komórek, co dodatkowo potwierdza się czerwonym dodatnim barwieniem węzłów wapniowych. Protokół opiera się na puli od trzech do pięciu zaworów od różnych myszy.

Wykorzystanie partnera z miotu i trzech różnych powtórzeń biologicznych jest ważne dla potwierdzenia wyników. Zastosowanie mysich komórek zastawki jest niezbędne do zrozumienia szlaku molekularnego prowadzącego do zwężenia zastawki aortalnej poprzez izolację komórek od myszy transgenicznych. Protokół ten był wcześniej używany do badania implikacji szlaku do receptora w regresji mineralnej zwapniałej zastawki aortalnej.