Name: Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: Poznaj dwuetapową metodę kolagenazową izolacji komórek zastawki aortalnej myszy do badań zwapnienia zastawki in vitro. Technika umożliwia analizę szlaków sygnałowych w modelach transgenicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

UWAGA: Wszystkie opisane tutaj procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Icahn School of Medicine w Mount Sinai institutional core and use committee.
1. Przygotowanie przed izolacją komórek zaworu od dorosłych myszy
<ol>
	<li>Oczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne pokazane w <silna klasa="xfig">Rysunek 1A, używając 70% v/v etanolu, a następnie autoklawując je w autoklawie przez 30 minut. Wyczyść miejsce pracy chirurgicznej 70% etanolem.</li>
	<li>Dodać 500 μl penicyliny-streptomycyny do 50 ml 10 mm HEPES. Przygotować porcję 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Utrzymuj roztwory na lodzie.</li>
	<li>Przygotuj roztwory kolagenazy o stężeniu 1 mg/ml i 4,5 mg/ml i użyj 5 ml każdego roztworu w probówkach o pojemności 15 ml do wykonania całej procedury. Aby przygotować 5 ml kolagenazy 1 mg/ml, zmieszaj 5 mg kolagenazy z 2,5 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium firmy Dulbecco (DMEM, wolna od płodowej surowicy bydlęcej (FBS)) i 2,5 ml 10 ml 10 mM HEPES uzupełnionych antybiotykami (1% penicylina-streptomycyna z kroku 1.2). Przefiltruj roztwory przez filtr 0,22 μm, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia. 
	UWAGA: Roztwory należy przechowywać na lodzie, aby chronić enzymy.</li>
	<li>Przed użyciem podgrzać roztwór DMEM do temperatury 37 °C, wykonując wszystkie czynności opisane poniżej. Przygotować kompletną pożywkę, uzupełniając DMEM 1% penicyliny-streptomycyny, 1% pirogronianu sodu, 5 ml 200 mM L-glutaminy, 1 ml odczynnika do eliminacji mykoplazmy (patrz tabela materiałów) i 10% FBS.</li>
</ol>
2. Izolacja komórek zaworu
<ol>
	<li>Aby uzyskać 106 komórek do eksperymentu, użyj pięciu 8-tygodniowych myszy (minimum trzy). Umieść mysz w komorze indukcyjnej wraz z małym kawałkiem bibuły nasączonej 1 ml izofluranu, ale nie dopuszczaj do kontaktu z tkanką. Aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone; Sprawdź, czy nie ma odruchu szczypania palców u stóp, a następnie poddaj mysz eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy. Stosować izofluran w celu złagodzenia bólu przed zwichnięciem szyjki macicy, ponieważ procedura opisana poniżej jest nieuleczalna.</li>
	<li>Umieść mysz na platformie preparacyjnej i przymocuj łapy kaniulami, aby utrzymać ją na miejscu. Oczyść klatkę piersiową i brzuch etanolem; Otwórz brzuch i klatkę piersiową nożyczkami. Małymi nożyczkami chirurgicznymi przeciąć między lewym przedsionkiem a lewą komorą, aby wykrwawić mysz. Perfuzję serca za pomocą 10 ml zimnego 1x PBS, aby usunąć krew z serca.</li>
	<li>Przetnij serce i zachowaj 3 mm od aorty wstępującej, jak pokazano na rysunku <silna klasa="xfig">Rysunek 1B. Wypreparuj zastawkę aortalną pod mikroskopem stereoskopowym. Przetnij serce poziomo na środku komór (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Przetnij lewą komorę w kierunku aorty i ostrożnie wypreparuj zastawkę aortalną (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1D-F). Umieść zawory razem w małym naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Umyj izolowane zastawki w naczyniu do hodowli komórkowej o średnicy 75 mm z 5 ml zimnego HEPES (10 mM) uzupełnionego antybiotykami (1% penicyliny-streptomycyny) w celu usunięcia krwi (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Przygotuj dwie probówki kolagenazy o pojemności 15 ml 1 mg/ml i 4,5 mg/ml zgodnie z powyższym opisem w kroku 1.3. 
	UWAGA: Po rozbiorze manipuluj izolowanymi zaworami w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego, aby zminimalizować zanieczyszczenie.</li>
	<li>Inkubować zastawki w kolagenazie typu I (1 mg/ml) przez 30 minut w temperaturze 37 °C z ciągłym wytrząsaniem (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2). Odwirować probówkę przez 5 minut przy 150 × g, przemyć osad raz 2 ml HEPES (10 mM) i wirować przez 30 s z dużą prędkością. Wlej zawartość tej probówki do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i ostrożnie przenieś fragmenty tkanki za pomocą cienkiej pęsety do nowej probówki. 
	UWAGA: Na tym etapie VIC nadal nie są oddzielone od tkanki, a osad zawiera kawałki tkanki. Aby uniknąć zanieczyszczenia komórkami śródbłonka, nie należy odwirowywać po wirowaniu w kroku 2.5.</li>
	<li>Inkubować osad w probówce o pojemności 15 ml z 5 ml kolagenazy typu I (4,5 mg/ml) w temperaturze 37 °C w ciągłym mieszaniu przez 35 minut. Ponownie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu rozdzielenia komórek i odwirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml kompletnego DMEM. Wirować przy 150 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok dwukrotnie, aby oczyścić komórki. 
	UWAGA: Osad nadal będzie zawierał fragmenty tkanek.</li>
	<li>Ponownie zawiesić osad w 1 ml kompletnej pożywki i umieścić komórki w jednym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli komórkowej w minimalnej ilości pożywki, aby ułatwić ich przyłączenie do szalki hodowlanej. Pozostaw komórki w spokoju w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla.</li>
	<li>Po 3 dniach sprawdź komórki pod mikroskopem, aby zweryfikować dobry wzrost w pobliżu resztek tkanki. Gdy 1,000 komórek będzie widocznych pod mikroskopem, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień pożywkę. 
	UWAGA: Płyta nie powinna być naruszona; Jeśli wymagana liczba komórek nie zostanie zaobserwowana, umieść naczynie do hodowli komórkowych z powrotem w inkubatorze na kolejne 2 dni.</li>
	<li>Gdy komórki zlewają się w 70% (2,5 × 105), trypsynizuj, a następnie przenieś je do naczynia do hodowli tkankowej o średnicy 75 mm.</li>
</ol>
3. Analiza tożsamości i morfologii komórek
UWAGA: Barwienie immunofluorescencyjne zostało użyte do zbadania morfologii komórek i zanieczyszczenia komórek śródbłonka.
<ol>
	<li>Wyczyść okap 70% v/v/ etanolem. Umieść sterylne szkiełka nakrywkowe (22 mm x 22 mm) na płytkach 6-dołkowych. 
	UWAGA: Aby wysterylizować szkiełka nakrywkowe, umyj je 70% etanolem i trzymaj w kapturze przez noc w świetle ultrafioletowym.</li>
	<li>Wysiej 100 000 komórek na dołek na płytce 6-dołkowej. Po 24 godzinach umyj komórki dwukrotnie w 1x PBS i utrwal je w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 20 minut. Ponownie umyj komórki dwukrotnie za pomocą 1x PBS. 
	UWAGA: W tym momencie komórki mogą być przechowywane w PBS w temperaturze 4 °C do rozpoczęcia procedury barwienia.</li>
	<li>Aby zweryfikować czystość VIC, użyj aktyny alfa-mięśni gładkich (αSMA), wimentyny i klastra różnicowania 31 (CD31) w celu wykrycia zanieczyszczenia VEC.</li>
	<li>Przygotować podwielokrotność buforu blokującego, mieszając 500 μl normalnej surowicy (tego samego gatunku co przeciwciało drugorzędowe), 9,5 ml 1x PBS i 30 μl Triton X-100. Inkubować komórki w 2 ml buforu blokującego przez 1 godzinę.</li>
	<li>Przygotować bufor do rozcieńczania przeciwciał zawierający 30 μl Triton X-100, 10 ml 1x PBS i 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Weź puste pudełko na końcówki, napełnij połowę pudełka wodą, aby stworzyć wilgotną komorę. Przykryj uchwyt końcówki wilgotną chusteczką, a następnie arkuszem parafilmu.</li>
	<li>Pobrać 1 μl pierwszorzędowego przeciwciała i wymieszać je ze 100 μl buforu rozcieńczającego przygotowanego w kroku 3.5. Umieścić 50 μl rozcieńczonego przeciwciała na parafilmie. Wyjmij szkiełka nakrywkowe z dołków, odwróć je i umieść na kroplach przeciwciała; Inkubować komórki przez noc z przeciwciałem.</li>
	<li>Dodaj 1 ml PBS do płytki 6-dołkowej. Ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z parafilmu, odwróć je i umieść w studzience. Myć komórki ciągłym delikatnym mieszaniem przez 5 minut. Zastąp PBS nowym PBS; Umyj komórki 3 razy.</li>
	<li>Inkubować komórki z rozcieńczonym przeciwciałem drugorzędowym (1/500) (Alexa-488, Alexa-555) przez 1 godzinę. Dodać 1 μl przeciwciała drugorzędowego do 500 μl buforu do rozcieńczania przeciwciał (przygotowanego w kroku 3.5). Przykryj talerz folią aluminiową. Umyj komórki 3 razy 1 ml 1x PBS z ciągłym mieszaniem.</li>
	<li>Na szkiełka nakrywkowe należy zamontować 50 μl pożywki montującej 4′,6-diamidyno-2-fenyloindol (DAPI) i obserwować komórki pod mikroskopem w celu analizy morfologii komórek i zanieczyszczenia VEC.</li>
</ol>
4. Test zwapnienia in vitro
<ol>
	<li>Wyczyść okap 70% etanolem, ogrzej podłoże DMEM do 37 °C.</li>
	<li>Wysiewać 100 000 komórek/kondycję na 6-dołkowe płytki w kompletnym DMEM i hodować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować pożywkę wapniącą, mieszając 2 mM NaH2PO4, 10-7 M insuliny i 50 μg/ml kwasu askorbinowego w DMEM z 5% FBS. Na 93 ml DMEM dodać 5 ml FBS, 1 ml antybiotyków (stężenie końcowe 1%), 1 ml pirogronianu sodu (100 mM), 27,5 mg NaH2PO4, 5,8 μl insuliny i 5 mg kwasu askorbinowego. 
	UWAGA: Przed użyciem przefiltrować roztwór za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
	<li>Po upływie 24 godzin zastąpić pożywkę sklarowaną przez pożywkę wapniejącą. Inkubować komórki przez 7 dni w temperaturze 37 °C. W 3dniu należy zastąpić je świeżą pożywką wapniącą i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze, aby zakończyć 7-dniowe leczenie.</li>
	<li>Po 7 dniach usuń pożywkę i przemyj komórki dwukrotnie 2 ml 1x PBS. Inkubować komórki w 1 ml 0,6 N kwasu solnego (HCl) przez 24 godziny w temperaturze 37 °C. Zebrać HCl do probówki o pojemności 1,5 ml i odparować w wyparce obrotowej. Ponownie zawiesić zawartość wszystkich probówek w 60 μl HCl. 
	UWAGA: Procedura suszenia jest ważna, aby stężyć roztwór i uzyskać taką samą objętość dla każdego stanu.</li>
	<li>Użyj 96-dołkowej płytki do pomiaru stężenia wapnia za pomocą odczynnika Arsenazo III, dostępnego w gotowym do użycia zestawie (więcej szczegółów w Tabeli Materiałów).</li>
	<li>Przygotować roztwór wzorcowy wapnia o stężeniu 10 mg/dl. Odważyć 10 mg wodorotlenku wapnia (Ca(OH)2) i rozpuścić w 100 ml wody destylowanej.</li>
	<li>Na klarownej 96-dołkowej płytce odpipetować 2 μl roztworu próby ślepej (HCl, 0,6 N), roztwór wzorcowy, próbkę na studzienkę (10 mg/dl) i próbki. Przeprowadzić doświadczenie w trzech egzemplarzach, aby sprawdzić zmienność pipetowania. Dodać 200 μl odczynnika dla każdego warunku. 
	UWAGA: Próbki powyżej 15 mg/dl należy rozcieńczyć solą fizjologiczną w stosunku 1:1, ponownie oznaczyć, a wynik pomnożyć przez dwa.</li>
	<li>Inkubować reakcję przez 15 minut w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Reakcja jest stabilna przez 60 min.</li>
	<li>Odczytać i zapisać absorbancję płytki przy długości fali 650 nm. Aby obliczyć ilość wapnia w próbkach, należy użyć następującego wzoru: 
	Wapń (mg/ml) = (absorbancja próbki/absorbancja wzorca) × Stężenie wzorca</li>
</ol>

<ol><li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+disease+in+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li>
<li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li>
<li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+treatment+of+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li>
<li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stenosis+and+heart+failure%3A+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li>
<li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li>
<li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Healthcare+Engineering%22%5BJournal%5D)">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li>
<li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cells%3A+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li>
<li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics%3A+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification%3A+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA%2FROCK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenazo+III%3A+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Chemistry+and+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li>
<li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li>
</ol>

W artykule przedstawiono szczegółowy protokół izolacji komórek zastawki myszy dla hodowli pierwotnej. Trzy zastawki aortalne od 8-tygodniowych myszy połączono w celu uzyskania odpowiedniej liczby komórek. Ponadto protokół ten opisuje charakterystykę fenotypu VIC i test mineralizacji in vitro. Metoda została zaadaptowana z wcześniej opisanego protokołu z Mathieu et al.7.
Podczas izolacji zastawek aortalnych należy zachować ostrożność, aby uniknąć wszelk...

Zwapniała choroba zastawki aortalnej (CAVD) jest najbardziej rozpowszechnioną chorobą zastawkową serca w populacjach zachodnich, dotykającą prawie 2,5% osób starszych powyżej 65 roku życia1. CAVD dotyka ponad sześć milionów Amerykanów i jest związana ze zmianami we właściwościach mechanicznych ulotek, które upośledzają normalny przepływ krwi1,2. Obecnie nie ma leczenia farmakologicznego, które zatrzymałoby postęp choroby lub aktywowało regresję mineralną. Jedyną skuteczną terapią w leczeniu CAVD jest chirurgiczna wymiana zastawki aortalnej lub przezcewnikowa wymiana zastawki aortalnej3. Dlatego konieczne jest zbadanie mechanizmów molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki w celu zidentyfikowania nowych celów farmakologicznych. Rzeczywiście, nieleczone zwężenie zastawki aortalnej ma kilka niekorzystnych konsekwencji, takich jak dysfunkcja lewej komory i niewydolność serca4.
Zastawka aortalna składa się z trzech warstw znanych jako fibrosa, spongiosa i ventricularis, które zawierają VIC jako dominujący typ komórek5. Włóknienie i komora są pokryte warstwą komórek śródbłonka naczyń krwionośnych (VEC)5. VEC regulują przepuszczalność komórek zapalnych, a także sygnałów parakrynnych. Zwiększone naprężenia mechaniczne mogą wpływać na integralność VEC i zaburzać homeostazę zastawki aortalnej, prowadząc do inwazji komórek zapalnych6. Analizy skaningowej mikroskopii elektronowej wykazały przerwanie śródbłonka w ludzkiej zwapniałej zastawce aortalnej7. 
Analizy histologiczne zwapniałej tkanki ujawniają obecność osteoblastów i osteoklastów. Ponadto zaobserwowano osteogenne różnicowanie VIC zarówno in vitro, jak i w tkance zastawki ludzkiej8. Proces ten jest głównie koordynowany przez czynnik transkrypcyjny związany z Runt 2 (Runx2) i białka morfogenetyczne kości (BMPs)8,9.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki do krawędzi tnącej 3 mm</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Anty-alfa mięśnie gładkie Przeciwciało aktynowe</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anty-myszy, Alexa Fluor 488 sprzężony</td><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>4412</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw odczynników Arsenazo-III</td><td>POINT SCIENTIFIC</td><td>C7529-500</td><td>Zestaw do pomiaru stężenia wapnia</td></tr><tr><td>Nożyczki Bonn</td><td>FST</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek wapnia</td><td>SIGMA -Aldrich 31219</td><td>31219</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Novusbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I&nbsp; (125 jednostek/mg)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tthermofisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Bardzo drobne kleszczyki do graefe</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 16000044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze drobnoziarniste</td><td>F.S.T Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M roztwór</td><td>KOMÓRKI MACIERZYSTE TECHNOLOGIE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>Mycozap</td><td>Lanza</td><td>VZA-2011</td><td>Odczynnik do eliminacji Mykoplazmy</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>penecylina streptomycyna 100x</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Pirogronian sodu 100 mM</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>Kleszczyki o standardowym wzorze</td><td>&nbsp; Nożyczki chirurgiczne FST</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>- Sharp-Blunt</td><td>FST</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,05%</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>abcam</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

Zwapnienie komórek zastawki aortalnej jest cechą charakterystyczną zwężenia zastawki aortalnej i jest związane ze zwłóknieniem guzka zastawki. Komórki śródmiąższowe zastawki (VIC) odgrywają ważną rolę w procesie zwapnienia w zwężeniu zastawki aortalnej poprzez aktywację ich programu odróżnicowania do komórek podobnych do osteoblastów. Mysie VIC są dobrym narzędziem in vitro do wyjaśnienia szlaków sygnałowych napędzających mineralizację komórki zastawki aortalnej. Opisana tu metoda, z powodzeniem stosowana przez tych autorów, wyjaśnia, w jaki sposób uzyskać świeżo wyizolowane komórki. Przeprowadzono dwuetapową procedurę kolagenazy z dawkami 1 mg/ml i 4,5 mg/ml. Pierwszym krokiem jest usunięcie warstwy komórek śródbłonka i uniknięcie jakiegokolwiek zanieczyszczenia. Druga inkubacja kolagenazy ma na celu ułatwienie migracji VIC z tkanki na płytkę. Ponadto omówiono procedurę barwienia immunofluorescencyjnego w celu charakterystyki fenotypu izolowanych komórek zastawki myszy. Ponadto test zwapnienia przeprowadzono in vitro przy użyciu procedury pomiaru odczynnika wapniowego i barwienia czerwienią alizarynową. Wykorzystanie hodowli pierwotnej komórek zastawki myszy jest niezbędne do testowania nowych celów farmakologicznych w celu zahamowania mineralizacji komórek in vitro.

Ponieważ zastawki aortalne myszy mają zazwyczaj średnicę 1 mm, w celu zebrania miliona żywych komórek do różnych procedur eksperymentalnych należy połączyć materiał z co najmniej trzech zastawek. Poszczególne etapy procesu izolacji VIC przedstawiono na Rysunku 1 i Rysunku 2. Ze względu na trudność w mechanicznym zeskrobywaniu tkanki zastawkowej, zaleca się wykorzystanie naprężeń ścinających powstałych podczas wirowania w wortexie w celu usunięcia VEC. Rzeczywiśc...

Ten artykuł opisuje izolację komórek mysiej zastawki aortalnej za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy. Izolowane komórki zastawki myszy są ważne dla wykonywania różnych testów, takich jak test zwapnienia in vitro, oraz dla badania szlaków molekularnych prowadzących do mineralizacji zastawki aortalnej.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Wykorzystanie izolowanych komórek zastawki myszy jest niezbędne do zbadania szlaku sygnałowego prowadzącego do zwapnienia zastawki w przypadku stosowania genetycznie zmodyfikowanych komórek myszy transgenicznych. Dwuetapowe trawienie jest szybką i skuteczną metodą. Najtrudniejszą częścią tego protokołu jest izolacja zastawki aortalnej od myszy w wieku ośmiu tygodni.Lepiej jest ćwiczyć na starszych myszach, aby lepiej uwidocznić zastawkę aortalną. Przed rozpoczęciem eksperymentu wyczyść i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne i miejsce pracy 70% etanolem i sterylizuj narzędzia chirurgiczne w autoklawie przez 30 minut. Kiedy wstępna konfiguracja jest gotowa, zacznij od oczyszczenia klatki piersiowej i okolicy brzucha ośmiotygodniowej myszy poddanej eutanazji za pomocą etanolu.Za pomocą nożyczek otwórz brzuch i klatkę piersiową myszy, a następnie przetnij między lewym przedsionkiem a lewą komorą małymi nożyczkami chirurgicznymi. Usuń krew z serca, przetapiając 10 mililitrów zimnego PBS i przetnij serce, zachowując trzy milimetry aorty wstępującej. Pod mikroskopem stereoskopowym wypreparuj zastawkę aortalną, przecinając serce poziomo na środku komór i przecinając lewą komorę w kierunku aorty, a następnie ostrożnie wypreparuj zastawkę aortalną.Połącz zawory razem w małym 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowych. Umyj izolowane zawory w 75-mililitrowym naczyniu do hodowli komórkowych z pięcioma mililitrami świeżo przygotowanego 10-milimolowego zimnego HEPES, uzupełnionego antybiotykami i inkubuj w pięciu mililitrach kolagenazy typu jeden przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, ciągle wstrząsając. Po inkubacji odwirować probówkę przez pięć minut, przy 150 razy G i przemyć osad raz dwoma mililitrami 10-milimolowych HEPES, wirując z dużą prędkością przez 30 sekund.Zbierz powstałą zawiesinę z probówki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego i za pomocą cienkiej pęsety ostrożnie przenieś fragmenty tkanki do świeżej probówki. Następnie inkubować osad w 15-mililitrowej probówce z pięcioma mililitrami kolagenazy typu pierwszego w temperaturze 37 stopni Celsjusza pod ciągłym mieszaniem przez 35 minut. Oddzielić komórki przez ponowne zawieszenie za pomocą pipety o pojemności jednego mililitra i odwirować przy 150 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Oczyść komórki dwukrotnie, ponownie zawieszając oddzielony osad w dwóch mililitrach kompletnego DMEM i odwirowując w temperaturze 150 razy G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Do posiewu ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze kompletnej pożywki i dodać go do jednego dołka sześciodołkowego naczynia do hodowli komórkowych w minimalnej ilości pożywki. Utrzymuj talerze w spokoju w temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla.Po trzech dniach inkubacji potwierdź wzrost w pobliżu resztek tkanki, obserwując komórki pod mikroskopem. Gdy 1 000 komórek będzie widocznych, ostrożnie usuń resztki tkanki za pomocą autoklawowanej pęsety i zmień podłoże. Trypsynizuj komórki po osiągnięciu 70% konfluencji i przenieś je do 75-mililitrowej naczynia do hodowli tkankowej.Przed rozpoczęciem testu należy oczyścić kaptur bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i podgrzać podłoże DMEM do 37 stopni Celsjusza. Następnie wysiewaj 100 000 komórek na warunki do sześciu dołków w kompletnym DMEM i hoduj w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę sklarowaną pożywką wapniejącą i inkubować komórki przez siedem dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wymieniając pożywkę trzeciego dnia.Po siedmiu dniach zmierz stężenie wapnia w 96-dołkowej płytce za pomocą odczynnika Arsenazo III i zapisz absorbancję na 650 nanometrach. W reprezentatywnej analizie różne fenotypy komórek zastawki zidentyfikowano za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego po trzech do pięciu dniach hodowli. Mysie VIC wyrażają wimentynę i alfa SMA, znaczące markery komórek zastawki.Dodatkowo, barwienie immunofluorescencyjne CD31 potwierdziło brak zanieczyszczenia komórkami śródbłonka w hodowli VIC. Hodowla VIC z bogatą w fosforany pożywką wapniową stymuluje zwapnienie komórek, co dodatkowo potwierdza się czerwonym dodatnim barwieniem węzłów wapniowych. Protokół opiera się na puli od trzech do pięciu zaworów od różnych myszy.Wykorzystanie partnera z miotu i trzech różnych powtórzeń biologicznych jest ważne dla potwierdzenia wyników. Zastosowanie mysich komórek zastawki jest niezbędne do zrozumienia szlaku molekularnego prowadzącego do zwężenia zastawki aortalnej poprzez izolację komórek od myszy transgenicznych. Protokół ten był wcześniej używany do badania implikacji szlaku do receptora w regresji mineralnej zwapniałej zastawki aortalnej.

isolation-mouse-interstitial-valve-cells-to-study-calcification

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przedstawiamy metodę izolacji i hodowli czystych populacji komórek śródbłonka zastawek serca (VEC). Komórki VEC można izolować z obu stron cuspisu lub płatka zastawki, a bezpośrednio po tym procesie możliwe jest łatwe wyizolowanie znajdujących się pod nimi komórek śródmiąższowych (VIC).

Izolacja komórek śródbłonka zastawek

W tym filmie pokazujemy izolację komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej z serca dorosłej myszy za pomocą dwuetapowej procedury kolagenazy i ich późniejszą hodowlę w małej ilości pożywki wzrostowej.

Izolacja komórek śródmiąższowych zastawki myszy: enzymatyczna metoda izolowania i hodowli VIC z mysiej zastawki aortalnej

Ten film demonstruje technikę oceny zwapnienia komórek śródmiąższowych zastawki aortalnej in vitro. Test pomaga określić ilościowo stężenie wapnia za pomocą odczynnika arsenazo III, barwnika wrażliwego na wapń, który reaguje z jonami wapnia, tworząc fioletowy kompleks wapniowo-arsenazowy.

Test zwapnienia do pomiaru stężenia wapnia w komórkach śródmiąższowych zastawki aortalnej

Zdolność do izolowania komórek śródbłonka zastawki serca (VEC) jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów rozwoju, utrzymania i choroby zastawki.  W tym miejscu opisujemy izolację VEC od embrionalnych i dorosłych myszy Tie2-GFP za pomocą FACS, co pozwoli na badania określające udział VEC w procesach rozwojowych i chorobowych.

Izolacja komórek śródbłonka mysiej zastawki

Zwapnienie naczyń krwionośnych jest ważnym czynnikiem predykcyjnym i przyczyniającym się do chorób sercowo-naczyniowych u ludzi. Protokół ten opisuje metody indukowania zwapnienia hodowanych pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz ilościowego określania zwapnienia i obciążenia makrofagami w aorcie zwierzęcej za pomocą obrazowania fluorescencyjnego w bliskiej podczerwieni.

zwapnienie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych oraz obrazowanie zwapnień i stanów zapalnych aorty

Ten protokół opisuje izolację, hodowlę i zwapnienie komórek śródmiąższowych zastawki pochodzących od szczurów, wysoce fizjologiczny model in vitro zwapnienia zastawki aortalnej (CAVD). Wykorzystanie tego szczurzego modelu ułatwia badania nad CAVD w badaniu mechanizmów komórkowych i molekularnych, które leżą u podstaw tego złożonego procesu patologicznego.

Izolacja i charakterystyka pierwotnych komórek śródmiąższowych zastawki szczura: nowy model do badania zwapnienia zastawki aortalnej

Modele mysie pozwalają badać kluczowe mechanizmy arytmogenezy. W tym celu niezbędne są wysokiej jakości kardiomiocyty do wykonywania pomiarów typu patch-clamp. W tym miejscu opisano metodę izolacji mysich miocytów przedsionków i komór za pomocą wstecznej perfuzji Langendorffa opartej na enzymach, która umożliwia jednoczesne pomiary stanów przejściowych wapnia i prądu wapniowego typu L.

Izolacja wysokiej jakości mysich miocytów przedsionkowych i komorowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądu wapniowego typu L

W tym badaniu opisujemy proces izolacji limfocytów T ze świeżych próbek zwapniałych zastawek aortalnych oraz etapy analityczne klonowania limfocytów T w celu scharakteryzowania adaptacyjnych podzbiorów leukocytów za pomocą analizy cytometrii przepływowej.

Badanie zwapnienia zastawki aortalnej poprzez izolację i hodowlę limfocytów T przy użyciu komórek zasilających z napromieniowanej Buffy Coat

Ten protokół opisuje zbieranie ludzkich zastawek aortalnych pobranych podczas zabiegów chirurgicznej wymiany zastawki aortalnej lub z tkanki zwłok, a następnie izolację, rozszerzanie i charakterystykę specyficznych dla pacjenta komórek śródbłonka i śródmiąższu pierwotnej zastawki. Uwzględniono ważne szczegóły dotyczące procesów potrzebnych do zapewnienia żywotności komórek i swoistości fenotypu.

Izolacja ludzkich pierwotnych komórek zastawki do modelowania chorób in vitro

Ten artykuł przedstawia metodologię uzyskiwania i oceny zwapnienia naczyń krwionośnych poprzez izolację mysich aort, a następnie ekstrakcję zwapniałych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych w celu obserwacji potencjału mineralizacji.

Analiza zwapnienia naczyń krwionośnych za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych przy użyciu modeli in vitro i in vivo

Poznaj dwuetapową metodę kolagenazową izolacji komórek zastawki aortalnej myszy do badań zwapnienia zastawki in vitro. Technika umożliwia analizę szlaków sygnałowych w modelach transgenicznych.

Izolacja komórek zastawki śródmiąższowej myszy w celu zbadania zwapnienia zastawki aortalnej in vitro

Przeglądaj więcej filmów