Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regulacji genów kandydujących na cel poprzez modyfikacje epigenetyczne podczas patogenezy grzybów w patologii roślin. Technologia sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny może skutecznie wykrywać segmenty DNA, które oddziałują z histonami i czynnikami transkrypcyjnymi w całym genomie. W porównaniu z innymi metodami może poprawić wydajność i rozdzielczość.

Zacznij od dodania 100 mikrolitrów płynnego kompletnego podłoża do płatków owsianych pomidorów Agger za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów. Używając pętli inokulacyjnej, zeskrob grzybnię szczepu dzikiego i szczepu nokautującego. Zbierz resztki grzybni i przenieś je do 250 mililitrów płynnego, kompletnego podłoża.

Umyj strzępki grzybów 500 mililitrami 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Następnie zbierz grzybnię grzybni i zważ ją. Dodać około jednego mililitra roztworu przenikającego enzym do lizy na jeden gram grzybni grzybów.

Umieść strzępki do licowania w temperaturze 28 stopni Celsjusza na trzy do czterech godzin, potrząsając przy 150 obr./min. Umyj strzępki w postaci 50 mililitrami 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Odwirować próbkę i ostrożnie odrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić protoplast w 20 mililitrach 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Dodaj 55 mikrolitrów 37% formaldehydu kropla po kropli do dwóch mililitrów buforu chlorku sodu zawierającego protoplasty do sieciowania, aż końcowe stężenie wyniesie 1%Aby ugasić nieprzereagowany formaldehyd, dodaj 20 mikrolitrów 10-krotności glicyny do każdej probówki. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant.

Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 750 mikrolitrach buforu RIPA. Dodaj 37,5 mikrolitrów 20-krotnego inhibitora proteazy.

Ścinać chromatynę przez sonikację przez osiem minut za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego. Po rozbiciu próbki ultradźwiękowej, należy wyjąć część próbki jako wsad zawierający całe DNA i białko uwolnione po sonikacji próbki. Aby przeanalizować długość fragmentów DNA, po sonikacji należy przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 1%.

Po odwirowaniu przenieś odwirowany supernatant do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Przed wykonaniem eksperymentu IP należy rozcieńczyć każdą próbkę chromatyny w stosunku od 1 do 10 za pomocą jednorazowego bufora RIPA. Odpipetuj 50 mikrolitrów super paramagnetycznych kulek białkowych do dwumililitrowej probówki wirówkowej.

Umieść rurki na stojaku magnetycznym i pozwól, aby kulki magnetyczne wytrąciły się. Następnie usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr wstępnie schłodzonego jednorazowego buforu RIPA do probówki i trzykrotnie umyj super paramagnetyczne kulki białkowe.

Umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Dodaj 100 mikrolitrów jednorazowego buforu RIPA do każdej probówki. Dodaj 30 mikrolitrów próbki chromatyny, 100 mikrolitrów super paramagnetycznych kulek białkowych i cztery mikrolitry przeciwciała H3K4me3 do probówki, dobrze je mieszając.

Umieść próbki na wytrząsarce obrotowej, aby inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 30 razy G. Umyj super paramagnetyczne przeciwciało białkowe i kompleks chromatyny, ponownie zawieszając kulki w jednym mililitrze jednorazowego buforu RIPA. Przemyć próbkę jednym mililitrem buforu do przemywania kompleksu immunologicznego o niskiej zawartości soli, a następnie jednym mililitrem buforu do płukania kompleksu odpornościowego o wysokiej zawartości soli. Przepłukać kulki jednym mililitrem buforu chlorku litu i usunąć supernatant.

Następnie dodaj jeden mililitr buforu TE do probówki. Umieścić probówkę ponownie z jednym mililitrem buforu TE i usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej probówki wirówkowej.

Wykonuj elucję w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wirować przez jedną minutę w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowych probówek wirówkowych. Dodaj osiem mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu do wszystkich probówek i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin lub przez noc, aby odwrócić wiązania krzyżowe białek DNA.

Dodaj jeden mikrolitr Rnazy A i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj cztery mikrolitry proteinazy K do każdej probówki i inkubuj w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Dodać 550 mikrolitrów mieszaniny chloroformu fenalowego i alkoholu izoamylowego do probówki wirówkowej.

Wirować przez 15 minut w temperaturze 10 000 razy G i zassać supernatant. Dodać 1/10 objętości trzech molowych roztworów octanu sodu do probówki, 2,5 objętości absolutnego etanolu i trzy mikrolitry glikogenu do probówki. Umieść próbkę w lodówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc w celu wytrącenia.

Następnego dnia odwirować probówki i wyrzucić supernatant. Umyj granulkę trzykrotnie jednym mililitrem świeżo przygotowanego 75% etanolu w temperaturze 10 000 razy G. Dodaj 50 mikrolitrów sterylnej wody dejonizowanej, aby wystarczająco rozpuścić osad. Napraw końce DNA, aby wygenerować tępo zakończone DNA za pomocą zestawu do naprawy końca DNA i instrukcji wymienionych w manuskrypcie tekstowym.

Aby dodać bazę adeninową do trzech pierwszych końców, dodaj 30 mikrolitrów DNA, dwa mikrolitry wody, pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu Taq, 10 mikrolitrów jednego milimolowego dATP i trzy mikrolitry polimerazy DNA Taq do 0,2 mikrolitra probówki wirówkowej PCR. Wymieszaj je i reaguj w maszynie do PCR w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wykonaj ligację łącznika, mieszając 10 mikrolitrów DNA, 9,9 mikrolitrów wody, 2,5 mikrolitra buforu ligazy DNA T4, 0,1 mikrolitra mieszanki oligazowej adaptera i 2,5 mikrolitra ligazy DNA T4 w probówce wirówkowej PCR o pojemności 0,2 mikrolitra.

Inkubuj probówkę w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Aby amplifikować DNA za pomocą starterów PCR, dodaj 10,5 mikrolitra DNA, 12,5 mikrolitra dwukrotnie wyższej jakości mieszanki głównej. jeden mikrolitr startera PCR PE 1,0 i jeden mikrolitr startera PCR PE 2,0 do 0,2 mikrolitra probówki wirówkowej PCR i dobrze wymieszaj.

Sygnały H3K4me3 mutantów delecji mobre2, mospp1 i moswd2 były znacznie zmniejszone w funkcjonalnych regionach docelowych. W porównaniu ze szczepem P131 typu dzikiego, sygnały odczytów sekwencjonowania immunoprecypitacji wzbogaconej chromatyny H3K4me3 w mutantach delecji mobre2, mospp1 i moswd2 były znacznie zmniejszone. Po tej procedurze można przeprowadzić chip on chip i chip qPCR.

Są one zwykle używane do badań przesiewowych dalszego genu docelowego białka i badania interakcji DNA białek w znanych miejscach wiązania genomu.