Name: Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Poznaj metodę ChIP-seq do analizy modyfikacji histonów w Magnaporthe oryzae. Technika ta umożliwia identyfikację genów docelowych i badanie mechanizmów epigenetycznych regulujących patogenezę grzybów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (Grant nr 31871638), Specjalny Projekt Badań Naukowych Pekińskiego Uniwersytetu Rolniczego (YQ201603), Projekt Naukowy Pekińskiego Komitetu Edukacyjnego (KM201610020005), Projekt Kultywacji Badań Naukowych Wysokiego Poziomu BUA (GJB2021005).

1. Przygotowanie protoplastów z M. oryzae
<ol>
	<li>Przygotuj agar owsiano-pomidorowy (OTA).
	<ol>
		<li>Odważyć 30-50 g płatków owsianych i gotować je w 800 ml wody (ddH2O) przez 20 min. Przefiltrować przez dwie warstwy gazy i pobrać filtrat.</li>
		<li>Zbierz dojrzałe pomidory i obierz je. Wyciśnij sok i przefiltruj przez dwie warstwy gazy, aby zebrać 150 ml przefiltrowanego soku.</li>
		<li>Dokładnie wymieszaj cały sok pomidorowy i przygotowany filtrat owsiany i dodaj ddH2O do 1000 ml.</li>
		<li>Dodać 250 ml tubyki optycznej i 2,5 g proszku agarowego do kolby stożkowej o pojemności 500 ml i sterylizować w autoklawie przez 20 minut. Przechowywać w temperaturze 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wlać 25 ml autoklawowanej tuby optycznej do szklanej szalki Petriego o wymiarach 5 cm x 5 cm. Przygotuj w sumie 10 takich szalek Petriego. Po zestaleniu się tuby optycznej na szalkach Petriego, przechowywać szalki do góry nogami w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Użyj wysterylizowanej wykałaczki, aby wykopać mały kawałek grzybni z M. oryzae (szczep typu dzikiego P131, szczepy nokautujące Δmobre2, Δmospp1 i Δmoswd2) i umieść je na przygotowanych naczyniach OTA. Hodować je przez 4-6 dni w temperaturze 28 °C w warunkach świetlnych. 
	UWAGA: Odwróć szalkę Petriego do góry nogami, aby zapobiec zanieczyszczeniu.</li>
	<li>Dodać 1000 μl płynnego Complete Medium (CM) (0,6% ekstraktu drożdżowego, 0,3% enzymatycznego hydrolizatu kazeiny, 0,3% kwaśnego hydrolizatu kazeiny, 1% glukozy) do szalek OTA za pomocą pipety 1000 μL. 
	UWAGA: Strzępki rosły na szalkach OTA przez 4-6 dni.</li>
	<li>Zeskrobać grzybnię szczepu dzikiego i szczepu nokautującego za pomocą pętli inokulacyjnej.</li>
	<li>Zbierz resztki grzybni i przenieś je do 250 ml płynnego Complete Medium (CM).</li>
	<li>Hodować szczątki grzybów w trójkątnej kolbie w temperaturze 28 °C przez 36 godzin z wytrząsaniem przy 150 obr./min.</li>
	<li>Użyj lejka, aby przefiltrować i zebrać strzępki grzybów.</li>
	<li>Przemyć strzępki grzybów 500 ml 0,7 M roztworu NaCl.</li>
	<li>Zbierz grzybnię grzyba i zważ ją. 
	UWAGA: Grzybnia nie musi być suszona przed ważeniem.</li>
	<li>Dodać ~ 1 ml roztworu przenikającego enzym do lizy na 1 g grzybni.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór do przenikania enzymu do lizy o stężeniu 20 mg/ml, rozpuszczając enzym do lizy z Trichoderma harzianum w 0,7 M NaCl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić strzępki do lizy w temperaturze 28 °C na 3-4 godziny z wytrząsaniem przy 150 obr./min.</li>
	<li>Przemyć zlizowane strzępki 50 ml 0,7 M roztworu NaCl.</li>
	<li>Zebrać protoplasty i odwirowywać przez 15 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić protoplasty w 20 ml 0,7 M buforu NaCI w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Sieciowanie in vivo i sonikacja
<ol>
	<li>Dodaj 55 μl 37% formaldehydu (dodawaj formaldehyd kropla po kropli, aż końcowe stężenie wyniesie 1%) do 2 ml buforu NaCI zawierającego protoplast do sieciowania.</li>
	<li>Inkubować protoplasty w temperaturze 25 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodaj 20 μl 10x glicyny do każdej probówki, aby ugasić nieprzereagowany formaldehyd.</li>
	<li>Mieszać do mieszania i inkubować w temperaturze 25 °C przez 5 minut.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 2.000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 1 ml 0,7 M roztworu NaCI</li>.
	<li>Wirować przez 10 minut przy 2.000 x g i 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 750 μl buforu RIPA (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 1% NP-40, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS i inhibitory proteazy).</li>
	<li>Dodaj 37,5 μl 20x inhibitora proteazy.</li>
	<li>Przenieś protoplasty z poprzedniego kroku do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wykonaj sonikację (25% W, wyjście 3 s, zatrzymanie 5 s, 4 °C) natychmiast za pomocą sonikatora na około 10 minut. Celem tego etapu jest sonikacja usieciowanego lizatu przez pewien czas w celu określenia najlepszych warunków. 
	UWAGA: Na tym etapie lizat można zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Jeśli optymalne warunki do sonikacji zostały już określone, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>W razie potrzeby usuń 5 μl protoplastów do analizy w żelu agarozowym (nieścięte DNA).</li>
	<li>Ścinać chromatynę przez sonikację za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego przez 8 minut (25% W, moc 3 s, zatrzymanie 5 s, 4 °C).</li>
	<li>Po rozbiciu próbki ultradźwiękowo wyjmij część próbki jako "wejście".. Dane wejściowe nie przeprowadzają eksperymentu ChIP i zawierają całe DNA i białka uwolnione po sonikacji próbki.</li>
	<li>Po sonikacji należy przeprowadzić elektroforezę w 1% żelu agarozowym, aby przeanalizować długość fragmentów DNA. 
	UWAGA: Wyniki elektroforezy w żelu agarozowym pokazują, że długość fragmentu DNA wynosi 200-500 pz (<silna klasa = "xfig">Ryc. 4).</li>
	<li>Umieść soniczną probówkę na lodzie, aby zapobiec degradacji białka.</li>
	<li>Wirować przez 10 minut przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu przenieść odwirowany supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania. Otrzymany w tym etapie roztwór chromatyny może być użyty do kolejnego IP.</li>
	<li>Przed wykonaniem eksperymentu IP należy rozcieńczyć każdą próbkę chromatyny w stosunku 1:10 za pomocą 1x buforu RIPA (np. dodać 10 μl próbki chromatyny do 1 μl buforu 1×RIPA).</li>
</ol>
3. IP usieciowanego białka/DNA
<ol>
	<li>Odpipetować 50 μl superparamagnetycznych kulek białkowych do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml. Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Niech koraliki magnetyczne wytrącą się. Usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodaj 1 ml 1x buforu RIPA (wstępnie schłodzonego na lodzie) do probówki i trzykrotnie umyj superparamagnetyczne kulki białkowe. Po umyciu umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Dodać 100 μl 1x buforu RIPA do każdej probówki.</li>
	<li>Do probówki dodać 300 μl próbki chormatyny (użyto 2 x 107 komórek), 100 μl superparamagnetycznych kulek białkowych i 4 μl przeciwciała H3K4me3.</li>
	<li>Użyj próbek z mysią IgG jako kontrolą ujemną. 
	UWAGA: Mysia IgG używana w tym protokole zawiera 0,01 M buforu fosforanowego i 0,15 M NaCl i pozostanie zamrożona w temperaturze poniżej 20 °C (patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Po dokładnym wymieszaniu umieścić próbki na wytrząsarce obrotowej i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, 30 x g. 
	UWAGA: Możliwe jest skrócenie czasu inkubacji immunoprecypitacji (IP). Czas inkubacji zależy od różnych czynników (np. przeciwciała, celu genu, typu komórki itp.) i będzie musiał zostać przetestowany empirycznie.</li>
</ol>
4. Zbieranie i płukanie produktów IP
<ol>
	<li>Granuluj superparamagnetyczne kulki białkowe, umieszczając je na stojaku magnetycznym. Odessać i wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Przemyć superparamagnetyczny kompleks kulek białkowych, przeciwciała i chromatyny, ponownie zawieszając kulki w 1 ml buforu 1x RIPA.</li>
	<li>Przepłukać probówkę na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut i usunąć supernatant o stężeniu 30 x g.</li>
	<li>Dodać 1 ml niskosolnego kompleksu immunologicznego do płukania (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 i 150 mM NaCl).</li>
	<li>Płukać probówkę na wytrząsarce obrotowej przez 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml wysokosolnego kompleksu immunologicznego do płukania (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH 8,1 i 500 mM NaCl) do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Umieścić probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Przepłukać 1 ml LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP-40, 1% kwasu deoksycholowego, 1 mM EDTA i 10 mM Tris-HCl pH 8,1) w probówce wirówkowej.</li>
	<li>Umieścić probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut i usunąć supernatant.</li>
	<li>Ponownie przepłukać probówkę 1 ml 0,25 M buforu LiCI, usunąć supernatant za pomocą pipety, a następnie wyrzucić supernatant.</li>
	<li>Dodać 1 ml buforu TE (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 1 mM EDTA).</li>
	<li>Umieść probówkę na wytrząsarce obrotowej na 5 minut przy 30 x g.</li>
	<li>Ponownie przemyć probówkę 1 ml buforu TE i usunąć supernatant za pomocą pipety.</li>
	<li>Zbierz koraliki.</li>
</ol>
5. Elucja kompleksów białkowo-DNA
<ol>
	<li>Przygotować bufor elucyjny (10 μl 20% SDS, 20 μl 1 M NaHCO3, 170 μl sterylnego destylowanegoH2O) dla wszystkich IP i probówek wejściowych.</li>
	<li>Dodać 100 μl buforu elucyjnego do każdej probówki wirówkowej.</li>
	<li>Elucja w temperaturze 65 °C przez 15 min.</li>
	<li>Wirować przez 1 minutę przy 10 000 x g i temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do nowych probówek wirówkowych.</li>
	<li>Powtórzyć kroki 5.2 - 5.4 i połączyć eluaty. Dodać 190 μl buforu elucyjnego do 10 μl wejściowego DNA. (objętość całkowita = 200 μL).</li>
</ol>
6. Odwrotne sieciowanie kompleksów białko/DNA
<ol>
	<li>Dodać 8 μl 5 M NaCl do wszystkich probówek i inkubować w temperaturze 65 °C przez 4-5 godzin lub przez noc, aby odwrócić wiązania krzyżowe DNA-białko. 
	UWAGA: Po tym etapie należy przechowywać próbki w temperaturze -20 °C i w razie potrzeby kontynuować protokół następnego dnia.</li>
	<li>Dodać 1 μl RNazy A i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać 4 μl proteinazy K (rozpuszczonej wH2Ow stężeniu 20 mg/ml i przechowywanej w temperaturze -20 °C) do każdej probówki i inkubować w temperaturze 45 °C przez 1-2 godziny.</li>
</ol>
7. Oczyszczanie i odzyskiwanie DNA
<ol>
	<li>Dodać 550 μl mieszaniny fenolu/chloroformu/alkoholu izoamylowego (w stosunku 25:24:1) do probówki wirówkowej.</li>
	<li>Dokładnie mieszaj mieszaninę przez 1 minutę.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut przy 10 000 x g i odessać supernatant.</li>
	<li>Przenieść wyekstrahowany supernatant z poprzedniego etapu do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Dodać 1/10 objętości 3 M roztworu octanu sodu, 2,5 objętości absolutnego etanolu i 3 μl glikogenu (20 mg/ml) do probówki.</li>
	<li>Umieścić próbkę w lodówce w temperaturze -20 °C na noc w celu wytrącenia się.</li>
	<li>Wirować przez 15 minut w temperaturze 10 000 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Umyj granulkę trzy razy 1 ml 75% etanolu (musi być przygotowana na świeżo) w temperaturze 10 000 x g.</li>
	<li>Umyty osad umieścić na czystej ławce, aby alkohol wysechł.</li>
	<li>Dodać 50 μl sterylnego dejonizowanegoH2O, aby wystarczająco rozpuścić osad.</li>
	<li>Zwiąż adapter sekwencjonowania do fragmentu DNA i użyj wysokoprzepustowej platformy sekwencjonowania do sekwencjonowania DNA.</li>
</ol>
8. Naprawa DNA i budowa biblioteki Solexa
<ol>
	<li>Napraw końce DNA, aby wygenerować tępo zakończone DNA za pomocą zestawu do naprawy końców DNA (1-34 μl DNA, 5 μl 10x buforu do naprawy końców, 5 μl po 2,5 mM każdy dNTP, 5 μl 10 mM ATP, 1 μl mieszanki enzymów naprawy końców iH2O, aby dostosować objętość reakcji do 49 μL).</li>
	<li>Użyj zestawu do oczyszczania PCR lub ekstrakcji fenolem: chloroformem, aby oczyścić DNA. Eluować lub ponownie zawiesić DNA w 30 μL 1x TE pH 7,4.</li>
	<li>Dodaj "A" do końców 3' (30 μl DNA z kroku 2, 2 μl H2O, 5 μl 10x buforu Taq, 10 μl 1 mM dATP i 3 μl polimerazy DNA Taq). Dodać odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml, dobrze wymieszać i reagować w maszynie do PCR w temperaturze 72 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Wykonaj ligację łącznika, mieszając 10 μl DNA, 9,9 μl H2O, 2,5 μl buforu ligazy DNA T4, 0,1 μl mieszanki oligazoligografii adaptera i 2,5 μl ligazy DNA T4. Dodaj odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml i dobrze wymieszaj. Inkubować je w temperaturze 16 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z protokołem producenta. Eluować za pomocą 20-25 μl buforu elucyjnego.</li>
	<li>Zanim biblioteka DNA zostanie ustanowiona, należy określić stężenie oczyszczonego DNA, aby potwierdzić jego użycie w kolejnych eksperymentach sekwencjonowania.</li>
	<li>Wykryj stężenie DNA za pomocą fluorometru. Po stopieniu próbki na lodzie należy ją dokładnie wymieszać i odwirowywać przez 30 s w temperaturze 1000 x g i temperaturze 4 °C. Następnie należy pobrać odpowiednią ilość próbki i zmierzyć ją we fluorometrze o długości fali 260 nm.</li>
	<li>Umieść próbki DNA o kwalifikowanej jakości i stężeniu na platformie sekwencjonowania Illumina w celu sekwencjonowania.</li>
	<li>Przed sekwencjonowaniem amplifikuj DNA za pomocą starterów PCR, PE1.0 i PE2.0 oraz 2x wysokiej jakości mieszanki głównej (10,5 μl DNA, 12,5 μl 2 wysokiej jakości mieszanki głównej, 1 μl startera PCR PE1.0 i 1 μl startera PCR PE2.0). Dodaj odczynniki do probówki wirówkowej PCR o pojemności 0,2 ml i dobrze wymieszaj.</li>
	<li>Uruchomić reakcję PCR w maszynie do PCR: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, następnie 35 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 10 s, wyżarzanie w temperaturze 60 °C przez 15 s, przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 s; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 5 minut. Na koniec przeprowadzić inkubację reakcji w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Użyj DNA do generowania klastrów i wykonaj sekwencjonowanie przez syntezę na Illumina Hiseq 2000. 
	UWAGA: W tym protokole do generowania klastrów użyto komórek przepływowych Illumina. Sekwencjonowanie przez syntezę przeprowadzono na analizatorze genomu Illumina zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
</ol>

<ol><li>Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+structure%3A+are+repeating+unit+of+histones+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromatin structure: are repeating unit of histones and DNA.</a> Science. 184 (4139), 868-871 (1974).</li>
<li>Luger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+nucleosomecore+particle+at+2.8+a+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the nucleosomecore particle at 2.8 a resolution.</a> Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).</li>
<li>Strathl, B. D., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+language+of+covalent+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The language of covalent histone modifications.</a> Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).</li>
<li>Lachner, M., Jenuwein, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+many+faces+of+histone+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The many faces of histone lysine methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 14 (3), 286-298 (2002).</li>
<li>Bhaumik, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+modifications+of+histones+during+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Covalent modifications of histones during development and disease pathogenesis.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 1008-1016 (2007).</li>
<li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+implementation+and+physiological+roles+for+histone+H3+lysine+4+%28H3K4%29+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular implementation and physiological roles for histone H3 lysine 4 (H3K4) methylation.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (3), 341-348 (2008).</li>
<li>Berger, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+language+of+chromatin+regulation+during+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The complex language of chromatin regulation during transcription.</a> Nature. 447 (7143), 407-412 (2007).</li>
<li>Bernstein, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammalian+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The mammalian epigenome.</a> Cell. 128 (4), 669-681 (2007).</li>
<li>Weake, V. M., Workman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+ubiquitination%3A+triggering+gene+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Histone ubiquitination: triggering gene activity.</a> Molecular Cell. 29 (6), 653-663 (2008).</li>
<li>Workman, J. L., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+nucleosome+structure+as+a+mechanism+of+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.</a> Annual Review of Biochemistry. 67 (1), 545-579 (2003).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+modifications+and+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin modifications and their function.</a> Cell. 128 (4), 693-705 (2007).</li>
<li>Akhtar, J., More, P., Albrecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-Seq+from+limited+starting+material+of+K562+cells+and+Drosophila+neuroblasts+using+tagmentation+assisted+fragmentation+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">ChIP-Seq from limited starting material of K562 cells and Drosophila neuroblasts using tagmentation assisted fragmentation approach.</a> Bio-protocol. 10 (4), 3520(2020).</li>
<li>Steinhauser, S., Kurzawa, N., Eils, R., Herrmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+comparison+of+tools+of+differential+ChIP-seq+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A comprehensive comparison of tools of differential ChIP-seq analysis.</a> Briefings in Bioinformatics. 17 (6), 953-966 (2016).</li>
<li>Kieu, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MoSET1+%28histone+H3K4+methyltransferase+in+Magnaporthe+oryzae%29+regulates+global+gene+expression+during+infection-related+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">MoSET1 (histone H3K4 methyltransferase in Magnaporthe oryzae) regulates global gene expression during infection-related morphogenesis.</a> Plos Genetics. 11 (7), 11005385(2015).</li>
<li>Vu, B. V., Pham, K. T., Nakayashiki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-induced+transcriptional+activation+of+the+MoCel7C+cellulase+gene+is+associated+with+methylation+of+histone+H3+at+lysine+4+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Substrate-induced transcriptional activation of the MoCel7C cellulase gene is associated with methylation of histone H3 at lysine 4 in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 79 (21), 6823-6832 (2013).</li>
<li>Kazan, K., Gardiner, D. M., Manners, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+trail+of+a+cereal+killer%3A+recent+advances+in+Fusarium+graminearum+pathogenomics+and+host+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">On the trail of a cereal killer: recent advances in Fusarium graminearum pathogenomics and host resistance.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (4), 399-413 (2012).</li>
<li>Wang, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AMT1+arginine+methyltransferase+gene+is+important+for+plant+infection+and+normal+hyphal+growth+in+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The AMT1 arginine methyltransferase gene is important for plant infection and normal hyphal growth in Fusarium graminearum.</a> PLoS One. 7 (5), 38324(2012).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K4+methylation+regulates+hyphal+growth%2C+secondary+metabolism+and+multiple+stress+responses+in+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Histone H3K4 methylation regulates hyphal growth, secondary metabolism and multiple stress responses in Fusarium graminearum.</a> Environmental Microbiology. 17 (11), 4615-4630 (2016).</li>
<li>Zhang, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+infection+test%3A+spray+and+wound-mediated+inoculation+with+the+plant+pathogen+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The plant infection test: spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).</li>
<li>Connolly, L. R., Smith, K. M., Freitag, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+histone+H3K27+methyltransferase+KMT6+regulates+development+and+expression+of+secondary+metabolite+gene+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum histone H3K27 methyltransferase KMT6 regulates development and expression of secondary metabolite gene clusters.</a> PloS Genetics. 9 (10), 1003916(2013).</li>
<li>Palmer, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CclA%2C+required+for+histone+3+lysine+4+methylation%2C+decreases+growth+but+increases+secondary+metabolite+production+in+Aspergillus+fumigatus%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Loss of CclA, required for histone 3 lysine 4 methylation, decreases growth but increases secondary metabolite production in Aspergillus fumigatus.</a> PeerJ. 1, 4(2013).</li>
<li>Ding, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tig1+histone+deacetylase+complex+regulates+infectious+growth+in+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Tig1 histone deacetylase complex regulates infectious growth in the rice blast fungus Magnaporthe oryzae.</a> The Plant Cell. 22 (7), 2495-2508 (2010).</li>
<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li>
<li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases%3A+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li>
<li>Zhou, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COMPASS-like+complex+modulates+fungal+development+and+pathogenesis+by+regulating+H3K4me3-mediated+targeted+gene+expression+in+Magnaporthe+oryzae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The COMPASS-like complex modulates fungal development and pathogenesis by regulating H3K4me3-mediated targeted gene expression in Magnaporthe oryzae.</a> Molecular Plant Pathology. 22 (4), 422-439 (2021).</li>
</ol>

Autorzy oświadczyli, że nie istnieją konkurencyjne interesy.

Ostatnio ChIP-seq stał się szeroko stosowaną metodą analizy genomowej do określania miejsc wiązania TF lub miejsc wzbogacania zmodyfikowanych przez określone histony. W porównaniu z poprzednią technologią ChIP-seq, nowa technologia ChIP-seq jest bardzo czuła i elastyczna. Wyniki są dostarczane w wysokiej rozdzielczości bez negatywnych skutków, takich jak sygnał szumu spowodowany niespecyficzną hybrydyzacją kwasów nukleinowych. Chociaż jest to powszechna analiza ekspresji genów, wiele metod obliczeniowych zostało zwalidow...

Epigenetyka to gałąź badań genetycznych, która odnosi się do dziedzicznej zmiany ekspresji genów bez zmiany sekwencji nukleotydów genów. Coraz więcej badań wykazało, że regulacja epigenetyczna odgrywa ważną rolę we wzroście i rozwoju komórek eukariotycznych, w tym chromatyny, która reguluje i wpływa na ekspresję genów poprzez dynamiczny proces składania i składania w struktury wyższego rzędu1,2. Przebudowa chromatyny i kowalencyjna modyfikacja histonów wpływają i regulują funkcję i strukturę chromatyny poprzez zmienność polimerów chromatyny, osiągając w ten sposób funkcję regulacji ekspresji genów3,4,5,6. Potranslacyjne modyfikacje histonu obejmują acetylację, fosforylację, metylację, monoubikwitynację, sumoilację i rybozylację ADP7,8,9. Metylacja histonów H3K4, w szczególności trimetylacja, została zmapowana do miejsc początkowych transkrypcji, w których jest związana z replikacją transkrypcji, rekombinacją, naprawą i przetwarzaniem RNA u eukariontów10,11.
Technologia ChIP-seq została wprowadzona w 2007 roku i stała się eksperymentalnym standardem do analizy całego genomu regulacji transkrypcji i mechanizmów epigenetycznych12,13. Metoda ta jest odpowiednia w skali całego genomu i do uzyskiwania informacji o interakcjach histonów lub czynników transkrypcyjnych, w tym segmentów DNA białek wiążących DNA. Wszelkie sekwencje DNA usieciowane z białkami będącymi przedmiotem zainteresowania będą współstrącać się jako część kompleksu chromatyny. Techniki sekwencjonowania nowej generacji są również wykorzystywane do sekwencjonowania 36-100 pz DNA, które są następnie dopasowywane do odpowiedniego genomu docelowego.
W grzybach fitopatogennych niedawno rozpoczęły się badania nad tym, jak modyfikacje metylacji histonów regulują ich docelowe geny w procesie chorobotwórczości. Niektóre wcześniejsze badania dowiodły, że regulacja genów związanych z metylazą histonów znajduje odzwierciedlenie głównie w wyciszaniu genów i katalizowaniu produkcji metabolitów wtórnych (SM). MoSet1 to metylaza H3K4 w M. oryzae. Nokaut tego genu powoduje całkowitą delecję modyfikacji H3K4me314. W porównaniu ze szczepem typu dzikiego, ekspresja genu MoCEL7C w mutancie jest zahamowana w stanie indukowanym przez CMC, a w stanie nieindukowanym (glukoza lub celobioza) ekspresja MoCEL7C wzrosła15. W Fusarium graminearum, KMT6 może katalizować modyfikację metylacji H3K27me3, regulować normalny rozwój grzybów i pomagać w regulacji "tajemniczego genomu" zawierającego klaster genu SM16,17,18,19. W 2013 roku Connolly poinformował, że metylacja H3K9 i H3K27 reguluje proces patogenny grzybów poprzez metabolity wtórne i czynniki efektorowe, które regulują hamowanie docelowych genów20. W Aspergillus modyfikacja histonów H3K4me2 i H3K4me3 jest związana z aktywacją genów i odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu regulacji poziomu chromatyny w klastrach genów SM 21. U M. oryzae, Tig1 (homologiczny do Tig1 u drożdży i ssaków) jest HADC (deacetylazą histonową)22. Nokaut genu Tig1 prowadzi do całkowitej utraty patogenności i zdolności do produkcji przetrwalników u mutanta zerowego. Jest bardziej wrażliwy na środowisko nadtlenowe, które nie może wytwarzać zakaźnych strzępek22.
Podmuch ryżu spowodowany przez M. oryzae. jest jedną z najpoważniejszych chorób ryżu w większości obszarów uprawy ryżu na świecie19. Ze względu na reprezentatywny proces infekcji, M. oryzae jest podobny do procesu infekcji wielu ważnych grzybów chorobotwórczych. Ponieważ grzyb może z łatwością przeprowadzać molekularne operacje genetyczne, stał się organizmem modelowym do badania interakcji między grzybami a roślinami23. Zablokowanie każdego etapu procesu infekcji M. oryzae może skutkować nieudanym zakażeniem. Zmiany morfologiczne podczas procesu infekcji są ściśle regulowane przez funkcję całego genomu i transkrypcję genów. Wśród nich modyfikacje epigenetyczne, takie jak metylacja histonów, odgrywają istotną rolę w regulacji transkrypcji funkcjonalnych genów24,25. Jednak do tej pory przeprowadzono niewiele badań nad molekularnym mechanizmem modyfikacji epigenetycznych, takich jak metylacja histonów i acetylacja histonów w transkrypcji genów patogenezy u M. oryzae. W związku z tym dalszy rozwój mechanizmu regulacji epigenetycznej grzyba zarazowego ryżu przy jednoczesnym prowadzeniu badań nad siecią regulacyjną tych patogennie powiązanych genów pomoże w opracowaniu strategii zapobiegania i kontroli zarazów ryżu.
Wraz z rozwojem funkcjonalnej genomiki, takiej jak ChIP-seq, szczególnie w epigenetyce, ta wysokoprzepustowa metoda pozyskiwania danych przyspieszyła badania nad chromosomami. Korzystając z eksperymentalnej technologii ChIP-seq, można zidentyfikować rozkład metylacji histonów w całym genomie (takich jak H3K4me3, H3K27me3, H3K9me3) u M. oryzae i innych grzybów strzępkowych. W związku z tym metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tego, w jaki sposób modyfikacje epigenetyczne regulują swoje kandydujące geny docelowe podczas patogenezy grzybów w patologii roślin.

<table><tbody><tr><td>kwaśny hydrolizat kazeiny</td><td>WAKO</td><td>65072-00-6</td><td>Agar w proszku o średniej konfiguracji</td></tr><tr><td></td><td>scientan</td><td>9002-18-0</td><td>Konfiguracja podłoża</td></tr><tr><td>kwas deoksycholowy</td><td>MedChemExpress</td><td>83-44-3</td><td>białko i rozpuszczanie</td></tr><tr><td>DNA Zestaw naprawczy</td><td>NovoBiotec</td><td>ER81050</td><td>Naprawa DNA lub cDNA uszkodzone przez ścinanie</td></tr> <tr><td>enzymatyczne lub mechaniczneDynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>no.100.02D</td><td>Binding target</td></tr><tr><td>EB buffer</td><td>JIMEI</td><td>JC2174</td><td>Membrana i płyn</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9912</td><td>inhibitor proteazy</td></tr><tr><td>enzymatyczny hydrolizat kazeiny</td><td>Sigma</td><td>91079-40-2</td><td>Średnia konfiguracja</td></tr><tr><td>glukozy</td><td>Sigma</td><td>50-99-7</td><td>Glikogen w średniej konfiguracji</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>AM9510</td><td>Przeciwciała o działaniu strącającym</td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>Abcam</td><td>ab8580</td><td>Odpowiedź immunologiczna na białko H3K4me3</td></tr><tr><td>illumina Analizator genomu illumina illumina</td><td></td><td>Hiseq 2000</td><td>Duża konfiguracja</td></tr><tr><td>Startery Illumina PCR</td><td>illumina</td><td>CleanPlex</td><td>Losowy uniwersalny starter</td></tr><tr><td>alkohol izoamylowy</td><td>książka chemiczna</td><td>30899-19-5</td><td>Oczyszczone DNA</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9480</td><td>specyficzne usuwanie RNA</td></tr> enzymy <tr><td>lizujące</td><td>Sigma</td><td>L1412-10G</td><td>Bufor do lizy komórek</td></tr><tr><td>Mysie IgG</td><td>Yeasen</td><td>36111ES10</td><td>Normalna immunoglobulina zwierzęca</td></tr><tr><td>Roztwór NaCl</td><td>ThermoFisher</td><td>7647-14-5</td><td>Konfiguracja medium</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Seebio</td><td>SH30173.08*</td><td>Przygotowanie eluentu z kompleksu białkowego</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td>lizat komórkowy wspomagający lizę</td></tr><tr><td>komórek PCR Zestaw do oczyszczania</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Procedura oczyszczania usuwa startery z próbek DNA</td></tr><tr><td>inhibitory proteazy</td><td>ThermoFisher</td><td>A32965</td><td>Inhibitor białka, który zmniejsza aktywność białka</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>do ekstrakcji DNA ThermoFisher AM2546Qubit 4.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td><td>Konfiguracja medium</td></tr><tr><td>Bufor RIPA Bufor</td> do <td>lizy komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>9806S</td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2271</td><td>Oczyszczone DNA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9820</td><td>zakrywa różnice ładunków</td></tr><tr><td>roztwór octanu sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>R1181</td><td>Bufor</td></tr> <tr><td>kwasu octowegodeoksycholan sodu</td><td>ThermoFisher</td><td>89904</td><td>hamowanie degradacji proteazy</td></tr><tr><td>Ligaza DNA T4</td><td>ThermoFisher</td><td>EL0011</td><td>W warunkach ATP jako koenzymu, ligazy DNA</td></tr><tr><td>T4 Bufor ligazy DNA Bufor ligazy</td> DNA <td>ThermoFisher</td><td>B69</td><td>Bufor ligazy DNA</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>ThermoFisher</td><td>1185-53-1</td><td>działanie buforowe</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>ThermoFisher</td><td>HFH10</td><td>utrzymuje stabilny ekstrakt drożdżowy z białkiem błonowym</td></tr><tr><td></td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td>Konfiguracja podłoża</td></tr></tbody></table>

analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Sekwencjonowanie immunoprecypitacji chromatyny (ChIP-seq) jest potężną i szeroko stosowaną techniką molekularną do mapowania lokalizacji całego genomu czynników transkrypcyjnych (TF), regulatorów chromatyny i modyfikacji histonów, a także wykrywania całych genomów w celu odkrycia wzorców wiązania TF i potranslacyjnych modyfikacji histonów. Działania modyfikujące chromatynę, takie jak metylacja histonów, są często rekrutowane do określonych sekwencji regulatorowych genów, powodując miejscowe zmiany w strukturach chromatyny i powodując określone efekty transkrypcyjne. Podmuch ryżu jest niszczycielską chorobą grzybiczą na ryżu na całym świecie i jest modelowym systemem do badania interakcji grzyb-roślina. Jednak mechanizmy molekularne w tym, jak modyfikacje histonów regulują swoje geny wirulencji w Magnaporthe oryzae, pozostają nieuchwytne. Więcej badaczy musi użyć ChIP-seq, aby zbadać, w jaki sposób modyfikacja epigenetyczna histonów reguluje ich docelowe geny. ChIP-seq jest również szeroko stosowany do badania interakcji między białkiem a DNA u zwierząt i roślin, ale jest rzadziej stosowany w dziedzinie patologii roślin i nie został dobrze opracowany. W tym artykule opisano proces eksperymentalny i metodę działania ChIP-seq w celu zidentyfikowania rozkładu metylacji histonów (takich jak H3K4me3) w całym genomie, która wiąże się z funkcjonalnymi genami docelowymi u M. oryzae. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Cały schemat metody ChIP-seq przedstawiono na Rysunku 1. Eksperymenty ChIP-seq przeprowadzono z użyciem przeciwciał przeciwko H3K4me3 w szczepie typu dzikiego P131 oraz trzech szczepach mutantów null, pozbawionych genów mobre2, mospp1 i moswd2, aby zweryfikować w skali całego genomu profil rozmieszczenia histony H3K4me3 w M. oryzae. Protoplasty szczepu typu dzikiego, Δmobre2, Δmospp1 oraz Δmoswd2 przygotowano i poddano sonikacji ...

Tutaj prezentujemy protokół do analizy rozkładu modyfikacji histonów w całym genomie, który może zidentyfikować nowe geny docelowe w patogenezie M. oryzae i innych grzybów strzępkowych.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych leżących u podstaw regulacji genów kandydujących na cel poprzez modyfikacje epigenetyczne podczas patogenezy grzybów w patologii roślin. Technologia sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny może skutecznie wykrywać segmenty DNA, które oddziałują z histonami i czynnikami transkrypcyjnymi w całym genomie. W porównaniu z innymi metodami może poprawić wydajność i rozdzielczość.Zacznij od dodania 100 mikrolitrów płynnego kompletnego podłoża do płatków owsianych pomidorów Agger za pomocą pipety o pojemności 100 mikrolitrów. Używając pętli inokulacyjnej, zeskrob grzybnię szczepu dzikiego i szczepu nokautującego. Zbierz resztki grzybni i przenieś je do 250 mililitrów płynnego, kompletnego podłoża.Umyj strzępki grzybów 500 mililitrami 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Następnie zbierz grzybnię grzybni i zważ ją. Dodać około jednego mililitra roztworu przenikającego enzym do lizy na jeden gram grzybni grzybów.Umieść strzępki do licowania w temperaturze 28 stopni Celsjusza na trzy do czterech godzin, potrząsając przy 150 obr./min. Umyj strzępki w postaci 50 mililitrami 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Odwirować próbkę i ostrożnie odrzucić supernatant.Ponownie zawiesić protoplast w 20 mililitrach 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Dodaj 55 mikrolitrów 37% formaldehydu kropla po kropli do dwóch mililitrów buforu chlorku sodu zawierającego protoplasty do sieciowania, aż końcowe stężenie wyniesie 1%Aby ugasić nieprzereagowany formaldehyd, dodaj 20 mikrolitrów 10-krotności glicyny do każdej probówki. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant.Ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze 0,7-molowego roztworu chlorku sodu. Po odwirowaniu należy ostrożnie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 750 mikrolitrach buforu RIPA. Dodaj 37,5 mikrolitrów 20-krotnego inhibitora proteazy.Ścinać chromatynę przez sonikację przez osiem minut za pomocą homogenizatora ultradźwiękowego. Po rozbiciu próbki ultradźwiękowej, należy wyjąć część próbki jako wsad zawierający całe DNA i białko uwolnione po sonikacji próbki. Aby przeanalizować długość fragmentów DNA, po sonikacji należy przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 1%.Po odwirowaniu przenieś odwirowany supernatant do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do późniejszego wykorzystania. Przed wykonaniem eksperymentu IP należy rozcieńczyć każdą próbkę chromatyny w stosunku od 1 do 10 za pomocą jednorazowego bufora RIPA. Odpipetuj 50 mikrolitrów super paramagnetycznych kulek białkowych do dwumililitrowej probówki wirówkowej.Umieść rurki na stojaku magnetycznym i pozwól, aby kulki magnetyczne wytrąciły się. Następnie usunąć supernatant. Dodaj jeden mililitr wstępnie schłodzonego jednorazowego buforu RIPA do probówki i trzykrotnie umyj super paramagnetyczne kulki białkowe.Umieść probówki na stojaku magnetycznym i usuń supernatant. Dodaj 100 mikrolitrów jednorazowego buforu RIPA do każdej probówki. Dodaj 30 mikrolitrów próbki chromatyny, 100 mikrolitrów super paramagnetycznych kulek białkowych i cztery mikrolitry przeciwciała H3K4me3 do probówki, dobrze je mieszając.Umieść próbki na wytrząsarce obrotowej, aby inkubować je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w temperaturze 30 razy G. Umyj super paramagnetyczne przeciwciało białkowe i kompleks chromatyny, ponownie zawieszając kulki w jednym mililitrze jednorazowego buforu RIPA. Przemyć próbkę jednym mililitrem buforu do przemywania kompleksu immunologicznego o niskiej zawartości soli, a następnie jednym mililitrem buforu do płukania kompleksu odpornościowego o wysokiej zawartości soli. Przepłukać kulki jednym mililitrem buforu chlorku litu i usunąć supernatant.Następnie dodaj jeden mililitr buforu TE do probówki. Umieścić probówkę ponownie z jednym mililitrem buforu TE i usunąć supernatant za pomocą pipety. Dodać 100 mikrolitrów buforu elucyjnego do każdej probówki wirówkowej.Wykonuj elucję w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut. Wirować przez jedną minutę w temperaturze 10 000 razy G w temperaturze czterech stopni Celsjusza i zebrać supernatant do nowych probówek wirówkowych. Dodaj osiem mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu do wszystkich probówek i inkubuj w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin lub przez noc, aby odwrócić wiązania krzyżowe białek DNA.Dodaj jeden mikrolitr Rnazy A i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Dodaj cztery mikrolitry proteinazy K do każdej probówki i inkubuj w temperaturze 45 stopni Celsjusza przez jedną do dwóch godzin. Dodać 550 mikrolitrów mieszaniny chloroformu fenalowego i alkoholu izoamylowego do probówki wirówkowej.Wirować przez 15 minut w temperaturze 10 000 razy G i zassać supernatant. Dodać 1/10 objętości trzech molowych roztworów octanu sodu do probówki, 2,5 objętości absolutnego etanolu i trzy mikrolitry glikogenu do probówki. Umieść próbkę w lodówce w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na noc w celu wytrącenia.Następnego dnia odwirować probówki i wyrzucić supernatant. Umyj granulkę trzykrotnie jednym mililitrem świeżo przygotowanego 75% etanolu w temperaturze 10 000 razy G. Dodaj 50 mikrolitrów sterylnej wody dejonizowanej, aby wystarczająco rozpuścić osad. Napraw końce DNA, aby wygenerować tępo zakończone DNA za pomocą zestawu do naprawy końca DNA i instrukcji wymienionych w manuskrypcie tekstowym.Aby dodać bazę adeninową do trzech pierwszych końców, dodaj 30 mikrolitrów DNA, dwa mikrolitry wody, pięć mikrolitrów 10-krotnego buforu Taq, 10 mikrolitrów jednego milimolowego dATP i trzy mikrolitry polimerazy DNA Taq do 0,2 mikrolitra probówki wirówkowej PCR. Wymieszaj je i reaguj w maszynie do PCR w temperaturze 72 stopni Celsjusza przez 10 minut. Wykonaj ligację łącznika, mieszając 10 mikrolitrów DNA, 9,9 mikrolitrów wody, 2,5 mikrolitra buforu ligazy DNA T4, 0,1 mikrolitra mieszanki oligazowej adaptera i 2,5 mikrolitra ligazy DNA T4 w probówce wirówkowej PCR o pojemności 0,2 mikrolitra.Inkubuj probówkę w temperaturze 16 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Aby amplifikować DNA za pomocą starterów PCR, dodaj 10,5 mikrolitra DNA, 12,5 mikrolitra dwukrotnie wyższej jakości mieszanki głównej. jeden mikrolitr startera PCR PE 1,0 i jeden mikrolitr startera PCR PE 2,0 do 0,2 mikrolitra probówki wirówkowej PCR i dobrze wymieszaj.Sygnały H3K4me3 mutantów delecji mobre2, mospp1 i moswd2 były znacznie zmniejszone w funkcjonalnych regionach docelowych. W porównaniu ze szczepem P131 typu dzikiego, sygnały odczytów sekwencjonowania immunoprecypitacji wzbogaconej chromatyny H3K4me3 w mutantach delecji mobre2, mospp1 i moswd2 były znacznie zmniejszone. Po tej procedurze można przeprowadzić chip on chip i chip qPCR.Są one zwykle używane do badań przesiewowych dalszego genu docelowego białka i badania interakcji DNA białek w znanych miejscach wiązania genomu.

genome-wide-analysis-histone-modifications-distribution-using

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Opisano niezawodne i użyteczne podejście do wykrywania modyfikacji histonów w konkretnych genach roślin. Metoda ta łączy immunoprecypitację chromatyny (ChIP) z ilościową PCR w czasie rzeczywistym. Pozwala ona na wykrycie modyfikacji histonów w konkretnych genach odgrywających rolę w różnych procesach fizjologicznych.

Wykrywanie modyfikacji histonów w liściach roślin

Nasz algorytm Bayesian Change Point (BCP) opiera się na najnowocześniejszych osiągnięciach w modelowaniu punktów zmiany przy użyciu ukrytych modeli Markowa i stosuje je w analizie danych z sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIPseq). BCP sprawdza się dobrze zarówno w przypadku danych o charakterze szerokim, jak i punktowym, lecz szczególnie wyróżnia się w dokładnej identyfikacji trwałych i powtarzalnych wysp rozproszonego wzbogacenia histonów.

Nowy bajesowski algorytm detekcji punktów zmiany w analizie genomowej zróżnicowanych typów danych ChIP-seq

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Ten protokół przedstawia w pełni zintegrowany przepływ pracy do charakteryzowania modyfikacji potranslacyjnych histonów za pomocą spektrometrii mas (MS). Przepływ pracy obejmuje oczyszczanie histonów z kultur komórkowych lub tkanek, derywatyzację i trawienie histonów, analizę MS za pomocą nanoprzepływowej chromatografii cieczowej oraz instrukcje analizy danych. Protokół jest przeznaczony do wypełnienia w ciągu 2 - 3 dni.

Kompletny przepływ pracy do analizy modyfikacji potranslacyjnych histonów przy użyciu spektrometrii mas od dołu do góry: od ekstrakcji histonów do analizy danych

Prezentujemy zmodyfikowaną metodologię sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny natywnej (ChIP-seq) do generowania zestawów danych sekwencji odpowiednich dla struktury analitycznej gęstości nukleosomów ChIP-seq integrującej dostępność nukleazy mikrokokowej (MNazy) z pomiarami modyfikacji histonów.

Generowanie bibliotek sekwencjonowania immunoprecypitacji natywnej chromatyny do analizy gęstości nukleosomów

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) i przygotowania biblioteki ChIP-seq do generowania globalnych profili epigenomicznych z próbek embrionalnych kurczaków o niskiej liczebności.

Protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) dla próbek embrionalnych o niskiej liczebności

Prezentujemy skuteczną i powtarzalną metodę izolacji i hodowli nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnej i postnatalnej tkanki mózgowej do immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) histonu 3 lizyny 79 dimetylacji (H3K79me2) - znacznika histonowego znajdującego się w domenie globularnej histonu 3.

Izolacja i hodowla progenitorów nerwowych, a następnie immunoprecypitacja chromatyny znacznika dimetylacji histonu 3 lizyny 79

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj opisujemy protokół immunoprecypitacji chromatyny zmodyfikowanych histonów z pączkujących drożdży Saccharomyces cerevisiae. Immunoprecypitowane DNA jest następnie wykorzystywane do ilościowego PCR w celu zbadania obfitości i lokalizacji modyfikacji potranslacyjnych histonów w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) modyfikacji histonów z Saccharomyces cerevisiae

Poznaj metodę ChIP-seq do analizy modyfikacji histonów w Magnaporthe oryzae. Technika ta umożliwia identyfikację genów docelowych i badanie mechanizmów epigenetycznych regulujących patogenezę grzybów.

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae (Wideo) | JoVE Journal

Analiza całego genomu rozkładu modyfikacji histonów przy użyciu metody sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny w Magnaporthe oryzae

Przeglądaj więcej filmów