Name: Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Poznaj chromatografię wykluczania wielkości do analizy niejednorodnych pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Ta metoda skutecznie usuwa kwasy nukleinowe i białka z nadnatrętów bakteryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez National Science Foundation (1554417) i National Institutes of Health (DE027769).

1. Przygotowanie buforów
<ol>
	<li>Aby przygotować bufor do płukania w teście ELISA, należy dodać 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl oraz 1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do 1 L wody dejonizowanej (DI). Dodać 500 µL polisorbatasu-20. Dostosować pH do wartości 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.</li>
	<li>Aby przygotować bufor blokujący, należy dodać 3,94 g Tris-base, 8,77 g NaCl oraz 10 g BSA. Dodać 500 µL polisorbatasu-20 do 1 L wody DI. Dostosować pH do wartości 7,2 za pomocą HCl lub NaOH.</li>
	<li>Aby przygotować bufor do elucji (PBS), należy dodać 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g Na2HPO4 oraz 0,24 g KH2PO4 do 1 L wody DI. Dostosować pH do wartości 7,4 za pomocą HCl lub NaOH. 
	UWAGA: Można przygotować 10-krotnym stężeniem tego buforu i rozcieńczać go wodą DI w zależności od potrzeb.</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbki OMV
<ol>
	<li>Hodować komórki A. actinomycetemcomitans do późnej fazy wzrostu wykładniczego (gęstość optyczna przy 600 nm wynosząca 0,7). Osadzić komórki poprzez dwukrotne wirowanie przy 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min. Przesączyć nadsącz przez filtr 0,45 µm.</li>
	<li>Skoncentrować nadsącz wolny od bakterii, korzystając z filtrów z progiem odcięcia masy cząsteczkowej 50 kDa. Poddać skoncentrowany roztwór ultrawirowaniu przy 105 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 min.</li>
	<li>Resuspendować osad w PBS i ponownie poddać ultrawirowaniu (105 000 x g w 4 °C przez 30 min). Resuspendować osad w 2 mL PBS.</li>
</ol>
3. Pakowanie kolumny S-1000
<ol>
	<li>Wymieszać zapasową butelkę z medium do filtracji żelowej za pomocą szklanej rurki do mieszania i przelać do szklanej butelki objętość niezbędną do wypełnienia kolumny, zwiększoną o około 50% nadmiaru (około 135 mL). Pozostawić kuleczki do czasu ich osiadania, a następnie odlać nadmiar cieczy. Ponownie zawiesić kuleczki w buforze elucyjnym w taki sposób, aby końcowy roztwór składał się z około 70% (objętościowo) żelu i 30% buforu. Odgazować roztwór pod próżnią.</li>
	<li>Zamocować szklaną kolumnę pionowo za pomocą statywu z obręczą i wypełnić buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki kolumny. Odlać bufor, aż w kolumnie pozostanie tylko około 1 cm cieczy.</li>
	<li>Ostrożnie pipetować kuleczki do kolumny, wypełniając ją do pełna, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Przez cały ten proces stale odlać nadmiar buforu. Należy dopilnować, aby kuleczki nie osiadły całkowicie przed dodaniem kolejnych porcji na górę kolumny. Kolumna powinna być upakowana do wysokości około 2 cm poniżej dna zbiornika kolumny.</li>
</ol>
4. Nakładanie próbki i zbieranie frakcji
<ol>
	<li>Odgazuj bufor elucyjny w próżni. Przemyj kolumnę dwiema objętościami kolumny (180 mL) buforu elucyjnego.</li>
	<li>Pozostaw pozostały bufor do całkowitego wniknięcia do kolumny. Gdy bufor osiągnie górną krawędź warstwy żelu, ostrożnie nanieś pipetą 2-mL próbkę zawierającą OMVs (przy stężeniu lipidów około 100 - 200 nmol/L) na powierzchnię kulek, uważając, aby nie poruszyć kulek na górze kolumny. Pozostaw próbkę do całkowitego wniknięcia w żel, aż nad warstwą żelu nie pozostanie żadna ciecz. </li>
	<li>Ostrożnie i powoli dodaj bufor elucyjny na górę kolumny żelowej. Nie zaburzaj górnej warstwy żelu, ponieważ spowoduje to rozcieńczenie próbki.</li>
	<li>Umieść jedną probówkę 50-mL pod kolumną i otwórz kolumnę. Zbierz pierwsze 20 mL eluentu. W razie potrzeby ostrożnie dodawaj dodatkowy bufor elucyjny na górę kolumny, aby zapobiec jej wyschnięciu.</li>
	<li>Umieść serię probówek 1,5 mL pod kolumną. Uruchom przepływ w kolumnie i zbierz serię 1-mL próbek do każdej probówki. W trakcie zbierania próbek kontynuuj dodawanie buforu elucyjnego na górę kolumny, jeśli jest to konieczne. Powtarzaj czynność, aż zostanie zebranych 96 frakcji. Zatrzymaj przepływ w kolumnie. 
	UWAGA: Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego przechowywania lub w 4 °C do krótkotrwałego przechowywania do czasu dalszej analizy.</li>
	<li>Aby wyczyścić kolumnę, przepuść przez nią jedną objętość kolumny (90 mL) 0,1 M NaOH. Następnie przepuść przez kolumnę dwie objętości kolumny (180 mL) buforu elucyjnego.</li>
</ol>
5. Analiza próbek
<ol>
	<li>Aby zmierzyć stężenie lipidów w każdej frakcji, nanieś pipetą 50 µL każdej frakcji do pojedynczej studzienki płytki 96-dołkowej. Do każdej studzienki dodaj 2,5 µL barwnika lipofilowego. Inkubuj przez 15 s. Zmierz intensywność fluorescencji na czytniku płytek przy długości fali wzbudzenia 515 nm i długości fali emisji 640 nm. Aby obliczyć ułamek wszystkich lipidów w każdej próbce, zsumuj wszystkie intensywności emisji i podziel każdą pojedynczą wartość intensywności przez sumę całkowitą.</li>
	<li>Aby zmierzyć stężenie konkretnego białka, nanieś pipetą 100 µL każdej frakcji do pojedynczej studzienki immunopłytki ELISA. Inkubuj w temperaturze 25 °C przez 3 h.
	<ol>
		<li>Odlej próbki. Do każdej studzienki dodaj 200 µL buforu płuczącego do ELISA, a następnie odlej. Powtórz czynność cztery razy, aby w sumie przeprowadzić pięć płukań.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodaj 200 µL buforu blokującego i inkubuj przez 1 h w temperaturze 25 °C. Odlej.</li>
		<li>Inkubuj płytki z 100 µL buforu blokującego z dodatkiem przeciwciała pierwszorzędowego (1:10 000 dla przeciwciał oczyszczonych; 1:10 dla przeciwciał nieoczyszczonych) przez noc w temperaturze 4 °C. Odlej.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodaj 200 µL buforu płuczącego do ELISA, a następnie odlej. Powtórz czynność cztery razy, aby w sumie przeprowadzić pięć płukań.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodaj 100 µL buforu płuczącego do ELISA z dodatkiem przeciwciała wtórnego (1:30 000). Inkubuj przez 1 h w temperaturze 25 °C.</li>
		<li>Do każdej studzienki dodaj 200 µL buforu płuczącego do ELISA, a następnie odlej. Powtórz czynność cztery razy, aby w sumie przeprowadzić pięć płukań.</li>
		<li>Dodaj 100 µL jednoetapowego roztworu 3,3',5,5'-tetrametylobenzyidyny (TMB) i inkubuj przez 15-30 min lub do momentu pojawienia się niebieskiego zabarwienia. Zatrzymaj reakcję TMB, dodając 50 µL roztworu stopującego.</li>
		<li>Za pomocą czytnika płytek zmierz absorbancję każdej studzienki przy długości fali 450 nm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby zmierzyć całkowite stężenie białka, zmierz absorbancję każdej frakcji przy długości fali 280 nm (A280) przy użyciu spektrofotometru UV-vis.</li>
</ol>
Schemat procedury przedstawiono na Rysunku 1.
<img alt="Schemat chromatografii żelowej; pakowanie kolumny, pobieranie próbek OMV, fluorescencja, pomiar absorbancji." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62429/62429fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Schemat procedury SEC. Kolumnę pakuje się odgazowanym medium do filtracji żelowej, dbając o uniknięcie pęcherzyków powietrza i nieciągłości, a następnie przemywa dwiema objętościami kolumny buforu elucyjnego. Następnie próbkę ostrożnie nanosi się pipetą na wierzch żelu, tak aby nie naruszyć jego struktury. Kolumnę otwiera się i prowadzi proces do czasu całkowitego wprowadzenia próbki w głąb żelu. W tym momencie na górę kolumny nanosi się bufor i zbiera pierwsze 20 mL eluatu. Następnie zbiera się serię frakcji o objętości 1 mL. Frakcje te są następnie przenoszone do płytki 96-dołkowej lub immunopłytki 96-dołkowej w celu analizy zawartości lipidów i białek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62429/62429fig01large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<ol><li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li>
<li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+the+Type+I+secreted+%CE%B1-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li>
<li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li>
<li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).</li>
<li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size%2C+protein+composition%2C+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).</li>
<li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li>
<li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li>
<li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li>
<li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li>
<li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li>
<li>Klimentová, J., Stulík, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+methods%3A+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zgłaszania konfliktu interesów.

W tym miejscu przedstawiliśmy protokół prostego, szybkiego i powtarzalnego oddzielania subpopulacji bakteryjnych OMV. Chociaż technika ta jest stosunkowo prosta, istnieją pewne kroki, które należy wykonać bardzo ostrożnie, aby zapewnić skuteczną separację w kolumnie. Po pierwsze, ważne jest, aby żel był ładowany do kolumny ostrożnie i powoli, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Zaobserwowaliśmy, że pozostawienie żelu w temperaturze pokojowej na kilka godzin przed załadowaniem kolumny pozwala żelowi zrównoważyć się i minim...

Bakterie Gram-ujemne uwalniają pęcherzyki pochodzące z ich zewnętrznej błony, tak zwane pęcherzyki błony zewnętrznej (OMB), podczas całego wzrostu. Te OMV odgrywają ważną rolę w komunikacji międzykomórkowej, zarówno między bakteriami a gospodarzem, jak i między komórkami bakteryjnymi, przenosząc szereg ważnych biomolekuł, w tym DNA/RNA, białka, lipidy i peptydoglikany1,2. W szczególności rola OMV w patogenezie bakteryjnej została szeroko zbadana ze względu na ich wzbogacenie w niektóre czynniki wirulencji i toksyny3,4,5,6,7,8,9,10,11.
OMV mają rozmiary od 20 do 450 nm, w zależności od bakterii rodzicielskiej i etapu wzrostu, przy czym kilka typów bakterii uwalnia OMV o niejednorodnych rozmiarach8,12,13,14, które różnią się również składem białka i mechanizmem wnikania do komórek gospodarza12. H. pylori uwalniał OMV o średnicy od 20 do 450 nm, przy czym mniejsze OMV zawierały bardziej jednorodny skład białkowy niż większe OMV. Co ważne, zaobserwowano, że obie populacje OMV są internalizowane przez komórki gospodarza za pomocą różnych mechanizmów12. Ponadto wykazaliśmy, że Aggregatibacter actinomycetemcomitans uwalnia populację małych (<150 nm) OMV wraz z populacją dużych (>350 nm) OMV, przy czym OMV zawierają znaczną ilość wydzielanej toksyny białkowej, leukotoksyny (LtxA)15. Chociaż rola heterogeniczności OMV w procesach komórkowych jest wyraźnie ważna, trudności techniczne w oddzielaniu i analizowaniu różnych populacji pęcherzyków ograniczyły te badania.
Oprócz ich znaczenia w patogenezie bakterii, OMV zostały zaproponowane do wykorzystania w wielu zastosowaniach biotechnologicznych, w tym jako szczepionki i pojazdy dostarczające leki16,17,18,19,20. Do ich translacyjnego zastosowania w takich podejściach wymagane jest czyste i monodyspersyjne przygotowanie pęcherzyków. W związku z tym konieczne są skuteczne i wydajne metody separacji.
Najczęściej, wirowanie gradientu gęstości (DGC) jest używane do oddzielania niejednorodnych populacji pęcherzyków od resztek komórkowych, w tym wici i wydzielanych białek21; metoda została również opisana jako podejście do separacji subpopulacji OMV o niejednorodnych rozmiarach12,13,14. Jednak DGC jest czasochłonny, nieefektywny i bardzo zmienny między użytkownikami22 i dlatego nie jest idealny do skalowania. Natomiast chromatografia wykluczania wielkości (SEC) reprezentuje skalowalne, wydajne i spójne podejście do oczyszczania OMVs21,23,24. Odkryliśmy, że długa (50 cm), grawitacyjna kolumna SEC, wypełniona żelowym medium filtracyjnym, jest wystarczająca do skutecznego oczyszczania i oddzielania subpopulacji OMV. W szczególności zastosowaliśmy to podejście do rozdzielenia OMV A. actinomycetemcomitans na "duże" i "małe" subpopulacje, a także do usunięcia zanieczyszczenia białkami i DNA. Oczyszczanie zakończono w czasie krótszym niż 4 godziny, a także dokonano całkowitego oddzielenia subpopulacji OMV i usunięcia szczątków.

<table><tbody><tr><td>1-stopniowe filtry Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>Płytki immunologiczne ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Scientific</td><td>T13320</td><td>1,5 x 50 cm</td></tr><tr><td>Szklany czytnik płytek Econo-Column</td><td>BioRad</td><td>7371552</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 Pro Tecan</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0395-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy bezwodny (KH2PO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy bezwodny (Na2HPO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0404-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>VWR</td><td>0497-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tween(R) 20</td><td>Acros Organics</td><td>23336-2500</td><td></td></tr></tbody></table>

chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

Ściana komórkowa bakterii Gram-ujemnych składa się z wewnętrznej (cytoplazmatycznej) i zewnętrznej błony (OM), oddzielonych cienką warstwą peptydoglikanu. Podczas wzrostu błona zewnętrzna może błyszczeć, tworząc kuliste pęcherzyki błony zewnętrznej (OMV). Te OMV są zaangażowane w wiele funkcji komórkowych, w tym dostarczanie ładunku do komórek gospodarza i komunikację z komórkami bakteryjnymi. Ostatnio zaczęto badać potencjał terapeutyczny OMV, w tym ich zastosowanie jako szczepionek i nośników leków. Chociaż OMV pochodzą z OM, od dawna zdawano sobie sprawę, że ładunek lipidów i białek OMV różni się, często znacząco, od ładunku OM. Niedawno odkryto dowody na to, że bakterie mogą uwalniać wiele typów OMV i istnieją dowody na to, że rozmiar może wpływać na mechanizm ich wchłaniania przez komórki gospodarza. Badania w tej dziedzinie są jednak ograniczone ze względu na trudności w skutecznym oddzieleniu OMV o niejednorodnych rozmiarach. W tym celu tradycyjnie stosuje się wirowanie w gradionym spadku gęstości (DGC); Jednak ta technika jest czasochłonna i trudna do skalowania. Z drugiej strony, chromatografia wykluczająca ze względu na rozmiar (SEC) jest mniej kłopotliwa i nadaje się do niezbędnego przyszłego zwiększenia skali w celu terapeutycznego zastosowania OMV. W tym miejscu opisujemy podejście SEC, które umożliwia powtarzalne oddzielanie pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach, wykorzystując jako przypadek testowy OMV wytwarzane przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans, których średnica waha się od mniej niż 150 nm do ponad 350 nm. Pokazujemy separację "dużych" (350 nm) OMV i "małych" (<150 nm) OMV, weryfikowaną za pomocą dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Zalecamy techniki oparte na SEC zamiast technik opartych na DGC do oddzielania pęcherzyków o niejednorodnych rozmiarach ze względu na łatwość użycia, odtwarzalność (w tym między użytkownikami) i możliwość zwiększenia skali.

Rycina 2 przedstawia reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą tej metody. OMVs produkowane przez szczep JP2 A. actinomycetemcomitans zostały najpierw oczyszczone z supernatantu hodowli przy użyciu ultrawirowania15. Wcześniej ustaliliśmy, że szczep ten produkuje dwie populacje OMVs: jedną o średnicy około 300 nm i drugą o średnicy około 100 nm15. Aby rozdzielić te populacje OMV, oczyszczono próbkę zgodnie z opisanym powyżej protokołem ...

Pęcherzyki bakteryjne odgrywają ważną rolę w patogenezie i mają obiecujące zastosowania biotechnologiczne. Niejednorodność pęcherzyków komplikuje analizę i użytkowanie; Dlatego konieczna jest prosta, powtarzalna metoda oddzielania pęcherzyków o różnych rozmiarach. Tutaj pokazujemy zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości do oddzielania heterogenicznych pęcherzyków wytwarzanych przez Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

Chromatografia wykluczania wielkości jest użytecznym podejściem do rozdzielania subpopulacji pęcherzyków bakteryjnych o niejednorodnych rozmiarach oraz do usuwania kwasów nukleinowych i białek z supernatantów bakteryjnych. Chromatografia wykluczania wielkości jest tańsza, szybsza i bardziej powtarzalna niż inne techniki separacji, w tym ultrawirowanie w gradiencie gęstości. Wykazaliśmy potencjał tego podejścia przy użyciu pęcherzyków A.actinomycetemcomitans, ale spodziewamy się, że można je zastosować również do innych heterogenicznych populacji pęcherzyków bakteryjnych.Należy upewnić się, że wszystkie roztwory buforowe i perełkowe zostały prawidłowo odgazowane oraz należy powoli pipetować roztwór, bez wprowadzania pęcherzyków, ale na tyle szybko, aby kulki były jednorodne bez wysychania. Na początek użyj szklanego pręta, aby wymieszać butelkę z żelowym medium filtracyjnym i wlej objętość wymaganą do napełnienia kolumny plus około 50% nadmiaru do szklanej butelki. Poczekaj, aż kulki opadną i zdekantuj nadmiar płynu.Zawiesić kulki w buforze elucyjnym do końcowego roztworu około 70% żelu i 30% buforu i odgazować roztwór w próżni. Zamontuj kolumnę na stojaku pierścieniowym w pozycji pionowej i napełnij kolumnę buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki przed opróżnieniem bufora, aż pozostanie tylko około jednego centymetra. Następnie ostrożnie odpipetować kulki żelu do kolumny, jednocześnie opróżniając nadmiar buforu, aby zapobiec osiadaniu kulek do momentu, gdy kolumna zostanie upakowana na wysokość około dwóch centymetrów poniżej dna zbiornika kolumny.Przed załadowaniem próbki należy odgazować bufor elucyjny w próżni. Przemyć kolumnę około dwukrotnością objętości buforu elucyjnego. Gdy bufor dotrze do górnej części warstwy żelu, ostrożnie dodaj dwa mililitry próbki pęcherzyków błony zewnętrznej o stężeniu od 100 do 200 nanomolowych na litr na wierzchu warstwy żelu, nie naruszając powierzchni i pozwól próbce wejść do żelu.Powoli dodawać bufor elucyjny do kolumny, nie naruszając warstwy żelu i umieścić 50-mililitrową probówkę pod kolumną. Aby zapobiec wysychaniu kolumny, należy jednocześnie dodać bufor elucyjny do górnej części kolumny. Po zebraniu 20 mililitrów eluatu umieść stojak z 1,5 mililitrowymi probówkami pod kolumną.Zbierz w sumie 96 jednomililitrowych frakcji w każdej tubie. Podczas pobierania próbek należy w sposób ciągły dodawać bufor elucyjny do kolumny. Aby oczyścić kolumnę, przepuścić przez kolumnę jedną objętość 0,1 molowego wodorotlenku sodu, a następnie dwie objętości buforu elucyjnego w kolumnie.Aby zmierzyć stężenie lipidów, należy odpipetować 50 mikrolitrów każdej frakcji do 96-dołkowej płytki. Dodaj 2,5 mikrolitra barwnika lipofilowego do każdej studzienki. Po 15 sekundach zmierz intensywność kwitnienia.Aby zmierzyć stężenie interesującego białka, dodaj 100 mikrolitrów każdej frakcji do poszczególnych dołków płytki immunologicznej ELISA. Po trzech godzinach w temperaturze 25 stopni Celsjusza zdekantuj zawartość płytki. Umyj płytkę pięć razy 200 mikrolitrami buforu myjącego ELISA na jedno mycie, dekantując płytkę po każdym myciu.Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zdekantować płytkę i dodać 100 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze blokującym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zdekantować płytkę i umyć ją pięciokrotnie buforem do płukania ELISA, jak pokazano.Po ostatnim płukaniu dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego w buforze do płukania ELISA do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć płytkę, jak pokazano, i dodać 100 mikrolitrów roztworu TMB do każdej studzienki na 15 do 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Kiedy pojawi się niebieski kolor, dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i zmierz absorbancję przy 450 nanometrach.Po oczyszczeniu kolumną wykluczającą wielkość supernatantu kultury A.actinomycetemcomitans, jak pokazano, zaobserwowano dwa wyraźne piki lipidowe, odpowiadające dużym i małym pęcherzykom błony zewnętrznej wytwarzanym przez ten szczep. Analiza ELISA frakcji próbki wykazała, że toksyna jest związana przede wszystkim z subpopulacją dużych pęcherzyków błony zewnętrznej. Analiza immuno blot dała podobne, ale bardziej hałaśliwe wyniki, co wskazuje, że to podejście jest mniej czułe niż ELISA.Jak zaobserwowano, ta technika chromatograficzna jest w stanie usunąć znaczne ilości wolnych białek z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej. Należy jednak zauważyć, że całkowite stężenie białka niekoniecznie koreluje ze stężeniem określonych białek. Ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność podczas pakowania i pracy kolumny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i zapobiec wysychaniu kolumny.Dynamiczne rozpraszanie światła, śledzenie cząstek i bictroskopia mogą być wykonywane po chromatografii wykluczania wielkości w celu określenia wielkości i innych cech oddzielonych pęcherzyków błony zewnętrznej.

size-exclusion-chromatography-to-analyze-bacterial-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Źródło: Watson, D. C., et.al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje izolację i koncentrację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pochodzących z zewnętrznej błony genetycznie zmodyfikowanych bakterii. Proces ten obejmuje hodowlę bakterii w celu uwolnienia EV, a następnie sekwencyjne etapy wirowania i filtracji w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Wreszcie, ultrafiltracja jest stosowana...

Izolacja i wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych pochodzących z błony zewnętrznej od bakterii

Źródło: Watson, D. C., et al. Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii. J. Vis. Exp. (2021)Ten film pokazuje zastosowanie chromatografii wykluczania wielkości z porowatymi kulkami żywicy do izolowania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu kultury bakteryjnej. Większe EV eluują się wcześnie, omijając pory żywicy, podczas gdy mniejsze białka dostają się do porów i wymywają później.

Izolacja bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej wielkość 

W tym filmie demonstrujemy technikę - chromatografię wykluczania wielkości - do oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej lub OMV pochodzących od bakterii. Pęcherzyki te są sferycznymi strukturami o rozmiarach nano i są dzielone na duże i małe subpopulacje na podstawie ich wielkości za pomocą chromatografii wykluczania wielkości.

Chromatografia wykluczania wielkości Separacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych bakterii: technika oddzielania heterogenicznej populacji pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych na podstawie ich wielkości

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii z wykrywaniem fluorescencji i wykluczenia wielkości w celu sprawdzenia stabilności białka błonowego z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) w Escherichia coli po solubilizacji detergentu. Białka wykazujące symetryczny pik w profilu wykluczenia wielkości z niewielką ilością wolnego GFP lub bez wolnej GFP wskazują na oczyszczone białka z minimalną degradacją i agregacją, które można następnie wybrać do analizy struktura-funkcja.

Chromatografia wykluczająca wielkość z detekcją fluorescencji: technika identyfikacji integralności fluorescencyjnych białek błonowych po rozpuszczaniu detergentu

Ten film demonstruje technikę chromatografii wykluczającej rozmiar (SEC) do oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z filtratu hodowlanego Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Technika ta wykorzystuje porowatą kolumnę wypełnioną żywicą w celu uzyskania oczyszczonych frakcji EV. Porowate cząsteczki selektywnie pozwalają mniejszym białkom wnikać do porów, co skutkuje wolniejszą elucją. Jednocześnie pojazdy elektryczne są wykluczone z wnikania do porów ze względu na ich większy...

Technika chromatografii wykluczającej wielkość do oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych prątków

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

Protokół tutaj pokazuje, że pęcherzyki zewnątrzkomórkowe mogą być odpowiednio oddzielone od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych za pomocą chromatografii wykluczającej rozmiar.

Chromatografia wykluczająca wielkość do oddzielania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych od kondycjonowanych pożywek do hodowli komórkowych

Ten protokół opisuje chromatografię wykluczania rozmiaru, łatwą i powtarzalną technikę wzbogacania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych Mycobacterium tuberculosis z supernatantów hodowli.

Mycobacterium tuberculosis (prątki gruźlicy) Wzbogacanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą chromatografii wykluczania wielkości

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Ten protokół opisuje izolację małych dodatkowych pęcherzyków z murzyniego mięśnia szkieletu i szpiku kostnego z wykorzystaniem trawienia enzymatycznego i chromatografii wykluczającej rozmiar, umożliwiającą powtarzalne odzyskiwanie frakcji wzbogaconych w pęcherzyki z tkanek o złożonej strukturze i niskim wydajności, do dalszej analizy molekularnej.

Izolacja małych zewnątrzkomórkowych wezykuł od mysiej tkanki kostnej i szpiku kostnego przez chromatografię wykluczającą na podstawie wielkości

Poznaj chromatografię wykluczania wielkości do analizy niejednorodnych pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Ta metoda skutecznie usuwa kwasy nukleinowe i białka z nadnatrętów bakteryjnych.

Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Przeglądaj więcej filmów