Chromatografia wykluczania wielkości do analizy niejednorodności pęcherzyków błony zewnętrznej bakterii

Chromatografia wykluczania wielkości jest użytecznym podejściem do rozdzielania subpopulacji pęcherzyków bakteryjnych o niejednorodnych rozmiarach oraz do usuwania kwasów nukleinowych i białek z supernatantów bakteryjnych. Chromatografia wykluczania wielkości jest tańsza, szybsza i bardziej powtarzalna niż inne techniki separacji, w tym ultrawirowanie w gradiencie gęstości. Wykazaliśmy potencjał tego podejścia przy użyciu pęcherzyków A.actinomycetemcomitans, ale spodziewamy się, że można je zastosować również do innych heterogenicznych populacji pęcherzyków bakteryjnych.

Należy upewnić się, że wszystkie roztwory buforowe i perełkowe zostały prawidłowo odgazowane oraz należy powoli pipetować roztwór, bez wprowadzania pęcherzyków, ale na tyle szybko, aby kulki były jednorodne bez wysychania. Na początek użyj szklanego pręta, aby wymieszać butelkę z żelowym medium filtracyjnym i wlej objętość wymaganą do napełnienia kolumny plus około 50% nadmiaru do szklanej butelki. Poczekaj, aż kulki opadną i zdekantuj nadmiar płynu.

Zawiesić kulki w buforze elucyjnym do końcowego roztworu około 70% żelu i 30% buforu i odgazować roztwór w próżni. Zamontuj kolumnę na stojaku pierścieniowym w pozycji pionowej i napełnij kolumnę buforem elucyjnym, aby zwilżyć ścianki przed opróżnieniem bufora, aż pozostanie tylko około jednego centymetra. Następnie ostrożnie odpipetować kulki żelu do kolumny, jednocześnie opróżniając nadmiar buforu, aby zapobiec osiadaniu kulek do momentu, gdy kolumna zostanie upakowana na wysokość około dwóch centymetrów poniżej dna zbiornika kolumny.

Przed załadowaniem próbki należy odgazować bufor elucyjny w próżni. Przemyć kolumnę około dwukrotnością objętości buforu elucyjnego. Gdy bufor dotrze do górnej części warstwy żelu, ostrożnie dodaj dwa mililitry próbki pęcherzyków błony zewnętrznej o stężeniu od 100 do 200 nanomolowych na litr na wierzchu warstwy żelu, nie naruszając powierzchni i pozwól próbce wejść do żelu.

Powoli dodawać bufor elucyjny do kolumny, nie naruszając warstwy żelu i umieścić 50-mililitrową probówkę pod kolumną. Aby zapobiec wysychaniu kolumny, należy jednocześnie dodać bufor elucyjny do górnej części kolumny. Po zebraniu 20 mililitrów eluatu umieść stojak z 1,5 mililitrowymi probówkami pod kolumną.

Zbierz w sumie 96 jednomililitrowych frakcji w każdej tubie. Podczas pobierania próbek należy w sposób ciągły dodawać bufor elucyjny do kolumny. Aby oczyścić kolumnę, przepuścić przez kolumnę jedną objętość 0,1 molowego wodorotlenku sodu, a następnie dwie objętości buforu elucyjnego w kolumnie.

Aby zmierzyć stężenie lipidów, należy odpipetować 50 mikrolitrów każdej frakcji do 96-dołkowej płytki. Dodaj 2,5 mikrolitra barwnika lipofilowego do każdej studzienki. Po 15 sekundach zmierz intensywność kwitnienia.

Aby zmierzyć stężenie interesującego białka, dodaj 100 mikrolitrów każdej frakcji do poszczególnych dołków płytki immunologicznej ELISA. Po trzech godzinach w temperaturze 25 stopni Celsjusza zdekantuj zawartość płytki. Umyj płytkę pięć razy 200 mikrolitrami buforu myjącego ELISA na jedno mycie, dekantując płytkę po każdym myciu.

Dodaj 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji zdekantować płytkę i dodać 100 mikrolitrów pierwszorzędowego przeciwciała w buforze blokującym do inkubacji przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia zdekantować płytkę i umyć ją pięciokrotnie buforem do płukania ELISA, jak pokazano.

Po ostatnim płukaniu dodać 100 mikrolitrów przeciwciała drugorzędowego w buforze do płukania ELISA do każdej studzienki na jedną godzinę inkubacji w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Pod koniec inkubacji umyć płytkę, jak pokazano, i dodać 100 mikrolitrów roztworu TMB do każdej studzienki na 15 do 30 minut inkubacji w temperaturze pokojowej. Kiedy pojawi się niebieski kolor, dodaj 50 mikrolitrów roztworu zatrzymującego do każdej studzienki i zmierz absorbancję przy 450 nanometrach.

Po oczyszczeniu kolumną wykluczającą wielkość supernatantu kultury A.actinomycetemcomitans, jak pokazano, zaobserwowano dwa wyraźne piki lipidowe, odpowiadające dużym i małym pęcherzykom błony zewnętrznej wytwarzanym przez ten szczep. Analiza ELISA frakcji próbki wykazała, że toksyna jest związana przede wszystkim z subpopulacją dużych pęcherzyków błony zewnętrznej. Analiza immuno blot dała podobne, ale bardziej hałaśliwe wyniki, co wskazuje, że to podejście jest mniej czułe niż ELISA.

Jak zaobserwowano, ta technika chromatograficzna jest w stanie usunąć znaczne ilości wolnych białek z preparatów pęcherzyków błony zewnętrznej. Należy jednak zauważyć, że całkowite stężenie białka niekoniecznie koreluje ze stężeniem określonych białek. Ważne jest, aby zachować szczególną ostrożność podczas pakowania i pracy kolumny, aby uniknąć pęcherzyków powietrza i zapobiec wysychaniu kolumny.

Dynamiczne rozpraszanie światła, śledzenie cząstek i bictroskopia mogą być wykonywane po chromatografii wykluczania wielkości w celu określenia wielkości i innych cech oddzielonych pęcherzyków błony zewnętrznej.